Praparacion de Muestras:

Ana Cecilia Hernandez Reyes.Primer año de Odontologia.

Histologia.

Carnet: 201708431

se ocupa de los métodos utilizados para elaborar preparaciones permanentes de células y de tejidos con la

fi nalidad de analizarlos utilizando diversos tipos de microscopios.

Obtención de la muestra.

• Si proviene de un individuo vivo recibe el nombre de biopsia; la manera de tomarla puede ser excisional, incisional, por sacabocado, por aspiración, punción, raspado, etc. Cuando la toma de las muestras es de un cadáver, entonces se trata de una necropsia.

Fijación.

• Puede efectuarse mediante métodos químicos o físicos. Los físicos son principalmente la criofi jación a –70 ºC; para que sea efi caz debe ser instantánea a fi n de que evite la formación de cristales de hielo; actualmente se usa también el calentamiento en horno de microondas entre 45 y 50 ºC, aunque sólo en biopsias urgentes para un diagnóstico rápido y no defi nitivo. Sin embargo, aquí se alude solamente a la fi jación química. Esta parte del proceso evitará las modifi caciones que ocurren después de obtener el tejido e impedirá lo que se conoce como cambios post mortem.

Se hace con el fin de eliminar el exceso de formol.

Deshidratación. Se realiza por lo general con alcoholes en concentraciones crecientes.

Inclusión en parafina.Es posible cortar el tejido fi jado, pero dicho corte no es lo delgado que sí se puede hacer una vez impregnado con un medio. Este medio puede ser la parafi na, que es una mezcla de hidrocarburos sólidos que proporcionan una consistencia fi rme para hacer cortes sin que se distorsione la imagen del tejido y, por último, permitir el paso de la luz para ser observado en el microscopio óptico.

Lavado:

Corte.Por lo general se hacen de 3 a 5 micras, con micrótomos ya sean de rotación o de deslizamiento.

Tinción. Se utiliza para examinar al microscopio óptico, con detalle, los tejidos.

Montaje. Se utiliza para conservar las preparaciones de manera permanente, y en esta etapa se cubre el corte del tejido ya procesado, y adherido a un portaobjetos, con un cubreobjetos.

Etiquetado. En este paso se realiza la preparación de tal manera que se identifi que con precisión de qué material se trata.

Hematoxilina y eosina

• La combinación de estos dos colorantes tiñe los núcleos de azul, los citoplasmas en rosa, el músculo en tonos rojizos a rosados fucsia, los glóbulos rojos en naranja o rojo y la fi brina en rosa intenso: la hematoxilina tiñe los núcleos de azul oscuro y es el colorante natural más utilizado, el cual se extrae del palo de Campeche

Métodos tricrómicos

• Se emplean tres colorantes para teñir distintos componentes en diversos colores. Muchos métodos tricrómicos pueden utilizarse para poner de manifiesto la arquitectura general, resaltar las fibras de sostén o diferenciar el tejido conjuntivo de las fibras musculares, el colágeno y las fibras reticulares se tiñen en medios muy ácidos con colorantes ácidos. Entre ellas, la técnica más común es :• El tricrómico de Masson que requiere fijación o posfijación en Bouin, y

permite ver: a) Núcleos en negro. b) Músculo, citoplasma y queratina en rojo. c) Colágena en azul o verde dependiendo del contraste que se use.

• . El tricrómico de Gallego le sigue en importancia y permite observar: a) Núcleos en azul. b) Fibras elásticas en magenta. c) Eritrocitos en verde limón. d) Otras estructuras en verde. Tricrómico de Gomori se usa tanto para tejidos como para extendidos celulares y se visualizan: a) Fibras musculares en rojo. b) Colágeno en verde. c) Núcleos de azul a negro. d) Fibras elásticas, células β de los islotes pancreáticos y los gránulos de la hipófisis, en tonos que van desde el violeta hasta el morado.

• Para fibras elásticas se utiliza la tinción de Verhoeff que permite ver: a) Fibras elásticas negras. b) Núcleos en negro. c) Colágeno en rojo. d) Otras estructuras en amarillo.• Una modifi cación a la tinción de Mallory permite utilizarla

para tejido nervioso y permite observar: a) Núcleos, mielina y eritrocitos en rojo brillante. b) Tejido conjuntivo, astrocitos, moco, amiloide, matriz ósea, cartilaginosa y otras sustancias hialinas en diferentes tonos de azul. c) Fibras elásticas en rosa.

Métodos argénticos

• En condiciones apropiadas, determinados componentes biológicos reducen el nitrato de plata, que se precipita en forma de depósitos negros de plata metálica en el lugar donde se produce la reducción química, la cual requiere de la ayuda de agentes reductores. Si se modifi can las condiciones de la solución de nitrato de plata que se utilice, es factible emplearla para manifestar una amplia variedad de estructuras como membranas basales, fi bras reticulares y melanina.• a) Axones en negro. b) Neurofi brillas en negro.

• Otras técnicas para tejido nervioso No requieren el uso de sales de plata y facilitan la diferenciación de sus estructuras. A continuación se listan algunas. • El método de Luxol Fast Blue es un colorante soluble en

alcohol en el cual la base de la lipoproteína reemplaza la base del colorante y permite que el tejido se tiña. Es factible contrastarlo con reactivo de Schiff y es ampliamente utilizado para tejido nervioso

• Métodos para carbohidratos Ácido peryódico de Schiff (PAS) Algunos de los múltiples usos de la reacción incluyen: • 1. Demostración de fi bras reticulares y membranas basales.

2. Demostración de hongos. 3. Demostración de ciertos tipos de mucosustancias secretadas por el epitelio de varios órganos del tracto digestivo, respiratorio y genital femenino (cérvix).

• Técnicas que utilizan azul alciano • El azul alciano es un colorante básico polivalente soluble en

agua y tiñe en azul por la presencia de moléculas de cobre. En soluciones acuosas reacciona con compuestos que contienen grupos aniónicos, tales como mucosustancias ácidas, mucinas ácidas y ácido desoxirribonucleico (DNA); se utiliza con diferente pH.

• Métodos metacromáticos• Ciertos colorantes reaccionan con diferentes componentes

del tejido, tiñéndolos en diferente color al del colorante que originalmente había sido utilizado. Algunos ejemplos de este fenómeno ocurren con: azul de metileno, azul de toluidina, azure A, B, C, tionina, café de Bismarck, safranina, cristal violeta y violeta de metilo. En este grupo se encuentran el amiloide, los glucosaminoglucanos, los gránulos de las células cebadas, los mucopolisacáridos sulfatados, así como los ácidos nucleicos.

• Métodos para demostrar pigmentos• Los pigmentos son componentes identifi cables en las células

normales, aunque también en condiciones patológicas. Se clasifi can en dos grupos: a) Como artefactos, al fi jar el tejido; los más comunes son los que ocasionan precipitados: debido al formaldehído, al mercurio presente en fi jadores como Zenker y Helly, y depósitos por cromo presente en fi jadores como Orth, Müller y Kolmer, por mencionar algunos.

• b) Los que están presentes dentro de las células llamados pigmentos endógenos; entre ellos los más comunes son: hemoglobina (que es una proteína básica ligada al hierro de color rojizo), melanina (la cual consta de grupos que forman de manera natural polímeros complejos de color café-negros) y lipofuscina (cuya composición química es variable y compleja de color amarillo-café resultantes de la oxidación y polimerización de lípidos insaturados).

• Métodos para detectar ácidos nucleicos• Cuando el tejido se trata con ácido clorhídrico (fi gura 2-22),

el ácido ribonucleico (RNA) se degrada, pero el DNA mantiene mejor su estructura, por lo que es la técnica de preferencia para identifi car las fases en el ciclo celular, haciendo evidentes la posición de los cromosomas en el citoplasma durante la mitosis. Los cromosomas se observan de color magenta.•

• Métodos para demostrar microorganismos• Los microorganismos de importancia médica son

subdivididos en los siguientes grupos: a) Bacterias; organismos unicelulares cuya talla varía entre 0.2 y 5 micrómetros. b) Hongos; de los cuales existe una gran variedad y se clasifi can por su forma. c) Virus; organismos diminutos, la mayoría son visibles sólo mediante el microscopio electrónico. d) Protozoarios, mismos que parecen poseer estructuras muy simples pero tienen funcionalidad muy compleja.