UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMERICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

EAP de Farmacia y Bioqumica

CTEDRA DE QUMICA ANALTICA INSTRUMENTAL

Mesa: 2

Docente: Mg. Norma Anglica Carlos Casas

Alumnos:

Acua Alayo, Manuel Antonio 13040089

Castro Rojas, Elizabeth 13040129

Hijar Lpez, Julio Armando 13040011

Miranda Zevallos, Wilfredo Daniel 13040110

Palma Albino, Cleni Teodora 13040019

Santa Cruz, Luca del Pilar 13040062

Vsquez Quispe, Kelly Lizbet 13040030

Grupo de laboratorio: Viernes // 8:00 am. 2:00 pm.

Ciclo acadmico: 2014-II

1. OBJETIVO

Aplicar el mtodo espectrofotomtrico para la determinacin cuantitativa de un

principio activo por medio de la formacin de complejos coloreados.

2. MARCO TERICO

El anlisis cuantitativo utilizando la espectrofotometra UV-visible se puede

realizar a travs de una solucin patrn de concentracin conocida seguido del

anlisis del compuesto desconocido. La concentracin de la muestra

desconocida se calcular mediante la expresin siguiente:

= (

)

Donde: C = concentracin del problema

Cs = concentracin del patrn

Ap = absorbancia que presenta la muestra

As = absorbancia que presenta la muestra patrn

En este caso el clculo de la concentracin del problema depende del hecho de

que problema y patrn se vean sometidos a un tratamiento experimental

idntico. Adems ha de asumirse que existe proporcionalidad lineal entre la

absorbancia y la concentracin, en el intervalo de concentraciones objeto de

estudio; es decir, que si la solucin problema posee una concentracin doble

que la solucin patrn, deber por tanto, mostrar doble valor de absorbancia

que el patrn. Es frecuente utilizacin de dicha ecuacin en qumica clnica,

como ejemplo tenemos la determinacin de cido rico por el mtodo

propuesto.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Materiales, equipos y reactivos

Espectrofotmetro UVvisible, celdas de vidrio y de cuarzo

Pipetas volumtricas de 1,0; 2,5; 5,0 mL al centsimo, vasos de

precipitados, fiolas de 10 mL.

Framicetina al 1% (FRAMIDEX), nitroprusiato de sodio al 10%, acetona,

tetraborato de sodio (sol. saturada)

Fig. 1. Materiales y equipo. A. Espectrofotmetro UV-Vis. B. Celdas de vidrio. C. Fiola

de 10mL. D. Pipetas de 1, 5, 10mL. E. Vaso de precipitacin

3.2. Mtodos

Se dispone de tres fiolas 10mL cada una, marcando respectivamente

estndar (St), muestra problema (MP) y blanco (Bl).

Se midi 1mL de Framicetina al 1% (Framidex) y se coloc en la fiola St.

Para la segunda se agreg un volumen adecuado de Framicetina a la fiola

MP y en la ltima fiola se llen con 1mL de agua; ya que la Framicetina es

incolora, no se puede leer en el espectrofotmetro UV-Vis es por eso que

se le agrega otros compuestos para as poder colorearlo y tener una

lectura.

A B

D E

C

Para ello se pes 1g de nitroprusiato de sodio y se llev a una fiola de

10mL para as tener una solucin al 10%, tambin se prepar una solucin

sobresaturada de tetraborato de sodio disolviendo una cierta cantidad

hasta que dejara de disolver.

Despus a cada una de las fiolas se les agrega de manera ordenada lo

siguiente: 0.4mL de nitroprusiato de sodio al 10% que sirve para poder

darle color a la Framicetina formando un complejo color prpura, 0.8mL de

acetona que ayuda a la solubilidad del compuesto y 2mL de una solucin

sobresaturada de tetraborato de sodio que acta como un buffer; luego se

llena con agua destilada hasta el aforo y se homogeniza.

Fig. 2. Fiolas con sus respectivas soluciones. A. Fiola que contiene al blanco. B. Fiola

que contiene al estndar. C. Fiola que contiene a la muestra problema

Una vez obtenidas las tres soluciones se espera 15 minutos para que se

d la reaccin, pasado ese tiempo se procedi a realizar la lectura en el

espectrofotmetro modelo GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO

SCIENTIFIC a una longitud de onda ptima de 585nm, ubicando en la

posicin del blanco al blanco (agua destilada); en la posicin 1 al blanco

preparado; en la posicin 2 a la sustancia estndar y en la posicin 3 a la

muestra problema.

A B C

4. RESULTADOS

4.1. Desarrollar los clculos previos. Detallar los clculos del

factor de dilucin (FD)

Se diluy la muestra problema, se tom 1 mL de muestra y se trasvas a

una fiola de 10 mL, por lo que el factor de dilucin (FD) es 10

1 se

trabaj con un estndar de concentracin conocida de 1000 g/mL.

Los datos dados por el espectrofotmetro UV-visible a =585 nm son los

siguientes:

Para la muestra en blanco (agua ms acetona y ms nitroprusiato

de Na) se obtuvo T% 60.7, pasando a absorbancia fue de

A=0.2168.

Para la solucin estndar se obtuvo T% 17.1, pasando a

absorbancia fue de As=0.767

Para la solucin problema se obtuvo T%17, pasando a absorbancia

fue de Ap= 0.770

Para hacer la aplicacin de la frmula primero debemos tener en cuenta

la absorbancia del estabilizador (Nitroprusiato de Na) y el solvente

(acetona), para eso debemos restar estas absorbancias a las del estndar

y de la muestra problema.

Absorbancia del estndar=As-A=0.767-0.2168=0.5502

Absorbancia de la solucin problema =Ap-A=0.770-0.2168=0.5532

4.2. Hacer los clculos de la concentracin de la Framicetina en

la forma farmacutica expresados en mg/Ml

Aplicando la frmula:

= (

)

= (0.5532

0.5502) 1000 /

= 1005.4525 /

Pero recordemos que hemos hecho una dilucin para eso multiplicamos

por el Factor de dilucin

= = 1005.4525

10

1

1

1000

= 10.054525 /

4.3. Concluya si la muestra se acepta o se rechaza por qu?

El fabricante nos dice que la concentracin de Framicetina (sulfato de

neomicina) en el frmaco es 10 mg/mL

Sacando el porcentaje con respecto a lo que nos da el fabricante con lo

que calculamos, nos da:

% =10.054525 /

10 / 100% = 100.54525%

La USP nmero 36 nos indica que el sulfato de neomicina, usado como

ungento oftlmico contiene el equivalente al no menos de 90.0% y no

ms del 135.0% de la cantidad declarada de neomicina1; por lo que

nuestra muestra es ACEPTADA ya que est dentro del rango permitido de

concentracin (90.0% < 100.54525% < 135.0%)

5. CUESTIONARIO

5.1. Desarrolle la ecuacin qumica del fundamento

5.2. Cul es la ventaja de esta forma de cuantificacin?

Se puede emplear en condiciones tales que la contribucin de los

interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se

puede realizar la oportuna correccin del error determinado por el

interferente2

5.3. En qu consiste un patrn externo? Ejemplos prcticos

Este mtodo de anlisis se aplica en la determinacin de un analito, en el

cual los componentes de la matriz de la muestra como tambin los

reactivos usados en la preparacin de la misma no interfieren en el

anlisis, es decir no se tiene un efecto de la matriz en la seal medida.

Tambin se puede emplear en condiciones tales que la contribucin de los

interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se

puede realizar la oportuna correccin del error determinado por el

interferente.

Los estndares de calibrado seleccionados deben aproximarse tanto en la

concentracin del analito como en su composicin de los diferentes

componentes qumicos, presentes en la matriz de la muestra. Este

requerimiento es aplicado en todos los mtodos de calibracin propuestos3

Ejemplo 1: Se tienen tres muestras de agua potable A, B y C de 10 mL

cada una, en la cual se debe cuantificar la cantidad de cobre presente por

absorcin atmica. Para ello, la muestra es filtrada, acidificada con cido

ntrico y se diluye a un volumen final de 25 mL.

Posteriormente, se mide la respuesta instrumental de cada muestra de

agua.

Adicionalmente, se prepara una serie de patrones de Cu en agua destilada

y desionizada que tambin se acidifica y se mide su respuesta instrumental

junto con una solucin blanco (solucin que no contiene analito). Los

resultados obtenidos se presentan en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados obtenidos con una serie de estndares de

Cu y la solucin blanco.

Una vez que se calibra el instrumento, utilizando los estndares y

aplicando el mismo procedimiento, se miden las muestras de agua y se

registran los resultados que se presentan en la tabla 2.

Muestra Respuesta instrumental

A 0,39

B 0,45

C 0,41

Tanto los resultados obtenidos de las seales medidas correspondientes

a las soluciones estndares como a las muestras, deben corregirse

utilizando la medida del blanco. Luego se procede a realizar el anlisis

estadstico de la data experimental y la grfica correspondiente.

A partir de la grfica 1, se observa que la relacin entre la respuesta

instrumental y la concentracin de los estndares de cobre, muestran una

relacin lineal indicativo de que la respuesta instrumental es directamente

proporcional a la concentracin. Por ello, es posible relacionar la respuesta

del instrumento con el contenido de Cu en las muestras de agua, y la cual

puede expresarse por la ecuacin 1:

Seal analtica (y) = constante x conc. Est. + Seal Blanco (Ec.1)

Por mnimos cuadrados se obtiene:

Constante = 0,1 seal analtica/concentracin

Intercepto=5,5 E-17 seal analtica

Sustituyendo estos valores en la Ec.1 se obtiene

Cu(mg/L) Respuesta instrumental

0 0,001

1 0,1

2 0,2

3 0,3

4 0,4

5 0,5

6 0,6

7 0,7

Seal (y) = 0,1 x concentracin de Cu (mg/L) + 5,5E-17, la cual se utiliza

para determinar las concentraciones de Cu en las muestras de agua

potable analizadas, y que se presentan en la tabla 3.

Fig. 3. Curva de calibracin sencilla para el cobre

Tabla 3. Resultados del anlisis de las muestras de agua en concentracin

Nmero muestra Cu(mg/L)

A 9,75

B 11,25

C 10,25

* Resultados aplicando el factor de dilucin, al cual se someti inicialmente

las muestras de agua.

EJEMPLOS PRCTICOS

Determinar aproximadamente en las muestras a analizar los

intervalos de concentracin para cada componente de inters por

normalizacin.

Preparar estndares de concentraciones similares a los intervalos

en los que van a estar en el problema los componentes de inters.

Si el intervalo de concentraciones a determinar de un componente

es estrecho se pueden usar distintos volmenes de una nica

disolucin estndar.

Si el intervalo es amplio preparar disoluciones de distinta

concentracin para que los volmenes inyectados no sean muy

distintos.

Preparar una curva de calibrado para cada componente de inters

a determinar.

5.4. Determinar el valor de K de los datos obtenidos en la

preparacin de la curva de calibracin y observe si es

constante o no. Interprete AST/CST = K

En la solucin estndar (st):

Ast=0.5502

Cst=1000 /

=0.55320

1000 /= 5.532104

En la solucin problema (p):

Ap=0.5532

Cp=1005.4525 /

=0.5532

1005.4525 g/mL = 5.502104

El valor K de los datos obtenidos en la muestra estndar y problema son

casi constantes (no tiene una diferencia significativa), esto quiere decir que

la framicetina ser aceptada para su uso.

5.5. Cmo se puede calibrar la influencia de la matriz en el

mtodo?

Las interferencias multiplicativas o de la matriz son causadas por

componentes de la matriz que alteran la respuesta de la seal del

componente analito en una forma proporcional a la seal (por ejemplo

cambio en la pendiente de la lnea de calibracin)4

Una posibilidad para evitar el efecto matriz sera construir siempre la recta

de calibrado tomando una muestra parecida a la muestra problema pero

libre del constituyente a determinar (un blanco de muestra), y aadirle

cantidades conocidas del constituyente para formar soluciones patrn. Sin

embargo, esta aproximacin resulta, en numerosos casos, impracticable,

pues el efecto matriz puede variar de una muestra a otra y adems, no

siempre se puede disponer de una muestra sin el constituyente en

cuestin.

La mejor alternativa, sin embargo, para soslayar el efecto matriz es utilizar

la tcnica de las adiciones estndar, que consiste en la adicin de

cantidades conocidas y crecientes del constituyente a la propia muestra

problema, la lectura de las correspondientes respuestas instrumentales y

la posterior construccin de la recta de adiciones estndar. La posterior

cuantificacin del constituyente se realiza por extrapolacin de la recta de

calibrado al punto del eje de abscisas donde la respuesta es cero. El mayor

inconveniente de esta tcnica es que se necesita construir una recta de

adiciones estndar para cada muestra que se quiera analizar, lo cual

supone un incremento sustancial en el volumen de trabajo del laboratorio.

La separacin del elemento objetivo de los elementos de la matriz es una

forma eficiente de evitar tales problemas pero por lo general, ocupa mucho

tiempo y es costosa. Por lo tanto, se escogen otros enfoques para

minimizar las interferencias de la matriz tales como el mtodo del estndar

interno, la compatibilizacin de matrices o el mtodo de adicin de

estndar5

6. DISCUSIN

Para cuantificar por espectrofotometra hay tres maneras, de las cuales

necesitamos saber la longitud ptima, esta se obtiene de la curva espectral; con

esta longitud podemos usarla indirectamente para cuantificar; puesto que, este

dato es fundamental para hacer la curva de calibracin, y para hacer las lecturas

de absorcin respectivas. Para mejorar esta cuantificacin, se usa la

espectrofotometra de derivada, que tiene aplicacin para la investigacin

farmacutica y toxicolgica en cualquiera de sus reas de aplicacin para

contribuir al desarrollo de mejores medicamentos, tratamientos ms eficaces de

intoxicaciones y la prevencin de reacciones indeseables. Esta tcnica es

obtenida por diferenciacin de espectros ultravioleta y visible permite una

medicin muy exacta de la longitud de onda de mxima absorbancia y una

perfecta resolucin de los espectros, suministrando una informacin de la

sustancia analizada mucho ms completa que el espectro original, al tiempo

que permite eliminar las interferencias en las medidas, causadas por la

presencia en el medio de la matriz biolgica, de excipientes, disolventes6

Segn la revista IMBIOMET las concentraciones de los problemas se obtendrn

por procedimientos que dependen del tipo de relacin obtenida: a) si es lineal y

parte de cero, se determinar el factor de calibracin qumica (se le llama as

para distinguirlo de la calibracin instrumental), que es el inverso de la pendiente

de la recta, que a su vez es una constante y se denomina absortividad; al

multiplicar el factor por las absorbencias de los problemas se obtienen las

concentraciones buscadas. b) Si es una recta que no parte de cero, entonces

las concentraciones buscadas se calcularn por regresin lineal. c) Si la relacin

no es lineal, se debern aplicar otros modelos matemticos o en su defecto,

interpolar en la grfica correspondiente para obtener los resultados buscados.

Desafortunadamente, la comercializacin de juegos de reactivos ya preparados

ha propiciado una prctica mala de laboratorio, que es el uso del factor de

calibracin qumica (o cotangente), que proviene de un slo patrn de

concentracin conocida en sustitucin de las curvas de calibracin, olvidando

que esto slo es vlido cuando la relacin entre absorbencia y concentracin es

una lnea recta que parte de cero. Lo inconveniente de esta prctica es que se

desconozca el tipo de relacin geomtrica y los lmites de concentracin o

linealidad, en los que se cumple la ley de Beer. Adicionalmente se ignora el

hecho de que estos lmites pueden cambiar, dependiendo de las condiciones

de transporte y conservacin de los reactivos7

Se debe tomar en cuenta las interferencias que puede haber en una

cuantificacin por comparacin con un estndar. Idealmente, los estndares y

el blanco deberan contener exactamente la misma concentracin de todos los

elementos de la matriz que la muestra excepto para el analito. A menudo en la

prctica, esto no puede realizarse. Entonces, debe verificarse que no existan

interferencias que comprometan la exactitud del resultado analtico. Las

interferencias surgen debido a las diferencias en composicin de la muestra

analizada y de los estndares externos y los blancos utilizados para la

calibracin. Pueden subdividirse en interferencia por el blanco o aditiva e

interferencia por la matriz o multiplicativa. Una interferencia aditiva puede ser

causada por los componentes de la matriz que producen una seal no

compensada independiente de la concentracin de analitos8 9

En la USP 36 se especifica los rangos de valores para el sulfato de neomicina

en diferentes preparados, por ejemplo para una suspensin tica se acepta para

valores entre 90% a 130%, para una crema o ungento con hidrocortisona se

acepta el rango de 90% a 135%, as para un ungento de sulfato de neomicina

con gramicidina se acepta un rango de 90% a 140%. En contraste con nuestros

resultados. Una solucin oftlmica de sulfato de neomicina y fosfato sdico de

dexametasona se acepta un rango de 90% a 130% y no de 90% a 135% como

en nuestro caso.1

Todos los resultados analticos dependen de la medida final de una propiedad

fsica o qumica del analito. Las valoraciones o titulaciones se encuentran entre

los mtodos analticos ms precisos. En una valoracin, el analito reacciona con

un reactivo estandarizado mediante una reaccin de estequiometria conocida.

La cantidad de reactivo estandarizado necesario para alcanzar la condicin de

equivalencia se relaciona con la cantidad de analito presente. Por tanto, la

valoracin es un tipo de comparacin qumica10

En nuestra prctica, analizamos el contenido declarado de la Framicetina

haciendo uso del mtodo externo en espectroscopia y comparndola con otra

muestra de Framicetina a la misma concentracin, lo cual nos arroj una

diferencia de 0.5% de concentracin con respecto al estndar, lo cual nos indica

y corrobora la correcta concentracin de la Framicetina con respecto a lo

declarado en concentracin y adems nos permite observar de manera practica

la aplicacin del mtodo externo.

7. CONCLUSIONES

Concluimos que debe verificarse que no existan interferencias que

comprometan la exactitud del resultado analtico, para ello se minimizan

utilizando el mtodo del estndar interno, la compatibilizacin de matrices o el

mtodo de adicin de estndar.

Se concluy que el rango de porcentaje de aceptacin de un frmaco (USP) no

es el mismo para otro frmaco, as tenga el mismo principio activo, es decir, el

rango de aceptacin cambia con respecto a todos los componentes del frmaco

(principio activo y excipientes)

El mtodo del patrn externo nos permite realizar anlisis con mayor exactitud

ya que solo se trabaja con 2 muestras y el error instrumental se omite ya que

ambas se pueden analizar bajo las mismas circunstancias.

Se aplic el mtodo de Espectrofotomtrico para la determinacin cuantitativa

de un principio activo como es la Framicetina en una solucin oto-oftalmica por

medio de la formacin de complejos coloreados donde participaron el

nitroprusiato de sodio, acetona y tetraborato de sodio respectivamente.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

(1) The United States Pharmacopeial Convention. USP 36 NF 31.

Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica Formulario Nacional.

Vol. 3; 2013 p. 4893

(2) D. C. Harris, Anlisis qumico cuantitativo, 6ta Edicin, Reverte, Espaa

2007

(3) B. Welz, Atomic Absorption Spectrometry, 2da Edicin, VCH, Alemania,

1985

(4) ANALISIS DE MINERALES Y ELEMENTOS TRAZA EN ALIMENTOS

[Acceso el 11 de setiembre del 2014]. Disponible en:

http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s22.htm

(5) EVALUACIN DE MTODOS [Acceso el 11 de setiembre del 2014].

Disponible en: www.seqc.es/dl.asp?175.145.205.255.15.

(6) Farhat. La aplicacin de la espectrofotometra de derivada al anlisis de

benzodiazepinas en medios qumicos, biolgicos y formas farmacuticas

diversas. Universidad de Granada. (Acceso 6 de Setiembre del 2014).

2002 Disponible en: http://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=12144.

(7) Alva S. Elvia M. Cabaas C. Programa de evaluacin de la calidad entre

laboratorios. Revista IMBIOMET. Brito LAB-acta 2000; 12:85-92

(8) Skoog, D. West, D. Introduccin a la qumica analtica. 1 ed. Barcelona:

Editorial Revert S.A.; 1986 p. 502

(9) Hernandez H. Lucas. Introduccin al anlisis instrumental. 1ed. Espaa.

Editorial Ariel. 2002. p 413

(10) Campillo Seva N. Introduccin al anlisis qumico. Anlisis Bioquimico.

Universidad de Murich. 2012. pp 8.