FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR

Graciela M. Escandar

FLUORESCENCIA

luz incandescente

luz ultravioleta

FOSFORESCENCIA

1:00:00 1:00:30 1:10:40

RELAJACIÓN NO-RADIANTE LUMINISCENCIA

singlete singlete* triplete*

So

S1

S2

ABSORBANCIA

So

S1

S2

Fluorescencia molecular

Es un proceso de fotoluminiscencia en

que las moléculas se excitan por

absorción de radiación electromágnética.

La especie excitada posteriormente se

relaja hasta el estado fundamental, con

la liberación de su exceso de energía en

forma de fotones

ABSORCIÓN

CI

F

CS

CE

1 2 3 4

P

S2

S0

E N E R G í A

S1

T1

RV

DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski)

solvente

estructura

temperatura

LUMINISCENCIA EN SOLUCIÓN

concentración

tipo de transición

apagadores químicos

pH

Factores que influyen en la señal fluorescente

tipos de transición

estructura

n

Compuestos aromáticos, estructuras con dobles enlaces conjugados, anillos aromáticos fusionados. Rigidez. Sustituyentes

bifenilo

CH2

fluoreno

Factores que influyen en la señal fluorescente

Su aumento, disminuye la intensidad de fluorescencia por aumento de probabilidad de conversión externa

temperatura

solvente Efectos generales y específicos

Factores que influyen en la señal fluorescente

La fluorescencia de compuestos aromáticos con propiedades ácido-base es generalmente pH-dependiente

N NH H

NH H H H+

anilina

N

H HH

+

ion anilinio

pH

Apagamiento dinámico y estáticoapagadores

químicos

Factores que influyen en la señal fluorescente

F

EXCITACIÓN EMISIÓN

BANDAS DEL ESPECTRO

Corrimiento de Stokes

F

RAYLEIGH

RAMAN

FRAYLEIGH 2° orden

RAMAN2° orden

RAYLEIGHS0

S1

RAMAN RAMAN

BANDAS DEL ESPECTRO

IF = IA =

= (Io – IT) =

= Io (1– IT/Io) =

= Io (1 – e-2.303bC) =

IF = Io (1 – e-kbC)

ANÁLISIS CUANTITATIVO

= No fotones emitidos/No fotones absorbidos

= IF/IA

IF = Io (1– 1 + kbC) = Io kbC IF = KC

Recordando que: x x2 x3 1! 2! 3!

si x es muy pequeño: e-x = 1-x

+- -1e-x =

K

ANÁLISIS CUANTITATIVO

IF = Io (1 – e-kbC)

F

C

IF = KC

IF vs C (a bajas concentraciones de analito)

ANÁLISIS CUANTITATIVO

ESPECTROFLUORÍMETRO

monocromador

monocromador

M

fotomultiplicador de muestrafotomultiplicador

de referencia amplificador

dispositivo de lectura

atenuador del haz

fuente

OBTENCIÓN DE ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN

1) Obtención del espectro de absorbancia para determinar la longitud de onda de absorción

F

EXCITACIÓN EMISIÓN

2) Fijar el monocromador de excitación a esta y obtener el espectro de emisión

3) Fijar el monocromador de emisión a la seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro de excitación.

CAUSAS DE DESVÍO DE LINEALIDAD

F

C

Término lineal

Lineal+cuadráticoLineal+cuadrático+cúbico

Si kbC es grande (absorbancia 0.02)

IF = Io [kbc –

(kbc)2

2(kbc)3

6...-+ ]

IF = Io (1 – e-kbC)

FILTRO INTERNO

Producido por el propio analito (alta concentración)

- Variación de potencia de luz incidente en el trayecto- Autoapagamiento- Autoabsorción

Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el perfil de los espectros de excitación y/o emisión

Producido por otra sustancia

- Sustancia que absorbe en la región de de excitación o emisión del analito

FILTRO INTERNO

Excitación

Detección de la emisión

Alta concentración: la emisión disminuye en el trayecto de la luz incidente

Detección de la emisión

Baja concentración:emisión uniforme

Curva de calibración de sulfato de quinina

ppm

F

100 200 300

F

ppm0 2 4 6 8 10

Linealidad

Término cúbico o mayor

Filtro interno