formación y evolución de pigmentos de tipo piranoantociano

1 Dora Blanco Vega 2013

Formación y Evolución de Pigmentos de Tipo

Piranoantociano en la Elaboración de Vinos

Tintos y Rosados

Tesis Doctoral

Dora Blanco Vega

Octubre 2013

Justifiación y Objetivos.




ÍNDICE

1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS PAG 3

2. ANTECEDENTES PAG 7

2.I. El vino rosado PAG 9

2.I.1. Definición PAG 11

2.I.2. Formas de elaboración PAG 12

2.I.2.1. Vinificación en blanco PAG 12

2.I.2.2. Vinificación parcial PAG 12

2.I.2.2. Elaboración de Clarete PAG 13

2.I.3. Mezclas de tintos y blancos PAG 14

2.II. Compuestos fenólicos PAG 15

2.II.1. Transferencia de antocianos PAG 17

2.II.2. Clasificación PAG 20

2.II.2.1 Compuestos fenólicos no flavonoideos PAG 21

2.II.2.1.1. A. Fenólicos PAG 21

2.II.2.1.1.1. A. Hidroxibenzóicos PAG 21

2.II.2.1.1.2. A. Hidroxicinámicos PAG 22

2.II.2.1.2. Estilbenos PAG 23

2.II.2.2. Compuestos fenólicos flavonoideos PAG 26

2.II.2.2.1. Antocianos PAG 26

2.II.2.2.2. Taninos PAG 28

2.II.2.2.2.1. Degradación PAG 32

2.II.2.2.3. Flavonoles PAG 33

2.II.2.2.4. Flavononoles y Flavonas PAG 35

2.III. El color del vino tinto PAG 37

2.III.1 Los antocianos y sus propiedades PAG 39

2.III.2. Color y Copigmentación PAG 46

2.III.2.1. Descripción PAG 46

2.III.2.2. Copigmentación intermolecular PAG 49

2.III.2.2.1. C. Homomolecular PAG 49

2.III.2.3. Copigmentación intramolecular PAG 50

2.III.2.4. Factores que afectan a la copig. PAG 51

2.III.2.4.1. Concentración PAG 51

2.III.2.4.2. Temperatura PAG 52

2.III.2.4.3. pH PAG 52

2.III.2.4.4. Disolvente PAG 52



2.III.2.4.5. Sales y fuerza iónica PAG 53

2.III.2.4.6. Naturaleza del copigmento PAG 53

2.III.3. Formación de nuevos compuestos PAG 53

2.III.3.1. Condensación A-F PAG 53

2.III.3.2. Condensación mediada por aldehido PAG 56

2.III.3.3. Condensación con otros aldehidos PAG 60

2.III.3.4. Condensación con ácido glioxílico PAG 61

2.III.4. Piranoantocianos PAG 62

2.IV. Los piranoantocianos y el color del vino PAG 63

2.IV.1. Definición PAG 65

2.IV.2. Tipos PAG 65

2.IV.2.1. T. Vitisinas PAG 66

2.IV.2.2. T. Vinilfenol-piranoantociano PAG 70

2.IV.2.3. T. Vinilflavanol-piranoantociano PAG 74

2.IV.2.4. T. Portisinas PAG 76

2.IV.3. Nuevas moléculas PAG 78

2.IV.4. Propiedades de los piranoantocianos PAG 79

2.V. Técnicas de análisis y espectroscópicas PAG 83

2.V.1. HPLC PAG 85

2.V.2. Espectroscópia UV-Vis PAG 87

2.V.3. Espectroscópia Masas PAG 91

2.V.4. Espectroscópia RMN PAG 96

2.V.4.1. Heteronucleares 2 D. PAG 98

2.V.4.2. Efecto NOE. PAG 99

3. BIBLIOGRAFÍA PAG 103

4. INDICE DE FIGURAS PAG 123

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN PAG 127

CAPÍTULO I. PAG 129

CAPÍTULO II PAG 169

CAPÍTULO III PAG 205

CAPÍTULO IV PAG 235

CAPÍTULO V PAG 275

DISCUSIÓN GENERAL PAG 321

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS PAG 341

6. CONCLUSIONES PAG 351



JUSTIFICACIÓN Y

OBJETIVOS



1.-JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DE NUESTRO ESTUDIO

La evaluación de las propiedades organolépticas de los vinos, es decir, todo lo

que se puede percibir por los sentidos acerca de sus cualidades determina su grado de

aceptación o rechazo por el consumidor.

El vino es una bebida que se elabora para el disfrute de los sentidos y dentro de

las propiedades organolépticas, el color es una de las primeras por las que el

consumidor juzga la calidad de un vino, ya que el primer sentido que interviene en

esta valoración es la vista y da una impresión acerca de él que va a influir sobre las

siguientes apreciaciones. Por tanto, el color es un factor muy importante, que tiene

muy en cuenta la industria vitivinícola.

Actualmente cualquier bodega sabe que esa primera impresión es muy

importante y cada vez se cuida más la imagen del vino en todos sus aspectos, antes

de abrirlo en el exterior, en la botella, con su aspecto, color, tamaño, se elige la forma

de “vestirla” con etiquetas, contra etiquetas y capsulas. Y más adelante una vez

abierta la botella, es cuando tendremos el primer contacto con el vino, empezando por

el color, si vemos un vino con un color oscuro y profundo nos hará pensar en un vino

recio y fuerte, con sensaciones astringentes en boca, y una permanencia y un

retrogusto largo. Si el vino tiene poco color nos llevará a pensar en una estructura

más ligera y un retrogusto más corto y suave.

Cuando el catador prueba el vino, relaciona estos colores estableciendo un

paralelismo con los sabores, así un color rojo recordará a cerezas, fresas, frambuesas

o un color ocre a especias o frutas desecadas, sí esta asociación entre colores y sabor

siempre ha sido importante, en los últimos años, el color del vino tinto ha despertado

un interés aún mayor, por un lado por su contribución al disfrute del vino por el

sentido de la vista, y por su asociación con el gusto, y en segundo lugar porque al

estar relacionada la cantidad de materia colorante con ciertas propiedades

beneficiosas del vino para la salud, (compuestos cardiosaludables como el resveratrol

y otros antioxidantes y la recuperación de la importancia de la dieta mediterránea) el

consumidor identifica un vino con mucho color con un vino saludable.

Además y muy importante está el factor económico, actualmente el precio de la

uva en las bodegas y cooperativas ya no se asigna solo por el grado alcohólico sino

que también interviene la intensidad de su coloración, esto hace que el interés para



saber que factores intervienen en el color del vino, y si es posible controlar y modificar

estos factores para que nos permitan saber que evolución en el color del vino se

puede esperar según la variedad, edad y tipo de elaboración, ha logrado que se haya

incrementado el interes y que aumente el número de investigaciones así como el

desarrollo tecnológico en este campo.

El vino tinto es un medio muy complejo, que evoluciona durante su

almacenamiento y envejecimiento. Con el tiempo, el color del vino joven cambia de

rojo-azulado hacia el color rojizo de vinos maduros y la astringencia decrece. Los

cambios de color son debido a la conversión gradual de los pigmentos de antocianos

extraídos del hollejo de las uvas en diversos derivados a través diferentes

mecanismos de reacción. Los antocianos están sujetos a equilibrios entre diversas

formas estructurales en medios acuosos, de manera que sólo a pH bastante ácidos

predominan las formas catiónicas flavilio, de color rojo, mientras que a valores bajos

de acidez, como los que existen en el vino y en otros alimentos, se encuentran

fundamentalmente en forma de estructuras hidratadas incoloras.

los antocianos en forma de catión flavilio son pigmentos muy reactivos y sus

propiedades de color son modificadas de manera significativa por reacciones de

oxidación y envejecimiento, por reacción con bisulfito que produce un blanqueamiento

y por los cambios de pH,

Por otro lado solo una pequeñísima parte de los antocianos de la uva son

detectadas en vinos envejecidos, detectándose otras nuevas moléculas que también

contribuyen al color. En primer lugar los pigmentos poliméricos, macromoléculas que

resultan de las interacciones entre las antocianinas y otros compuestos, especialmente

flavan-3-oles como catequinas y procianidinas (taninos condensados) y en segundo

lugar los piranoantocianos resultado de la adición nucleófila de algunas moléculas a las

antocianinas seguidas de ciclación y oxidación. Estos producen un cambio de color en

los vinos envejecidos hacia el rojo-naranja y además estabilizan el color del vino.

En los últimos años está cobrando importancia también la elaboración de vinos

rosados, son quizá uno de los tipos de vinos más delicados, cuya calidad aromática y

cromática decaen con mayor celeridad, siendo escasos los casos de vinos rosados que

resistan un envejecimiento de más de 1-2 años. Entre las características que más



rápido evolucionan en los vinos rosados se encuentra su color, con una tendencia a

virar hacia tonos anaranjados con el tiempo. Esta tonalidad anaranjada se puede

relacionar con la formación de pigmentos antociánicos de naturaleza polimérica (las

uniones entre antocianos y taninos) y también con la formación de pigmentos del tipo

piranoantociano, generados por reacción entre los antocianos originales de la uva con

derivados del ácido hidroxicinámico, existen bastantes indicios de que pueden jugar un

papel importante en el color de los vinos rosados, incluso al poco tiempo de su

elaboración, sin esperar un envejecimiento prolongado.

En vista del interés, que el color del vino en general y la presencia y aportación

que a este hacen los pigmentos piranoantociánicos en particular, planteamos esta

Tesis Doctoral, con el fin de contribuir a la demanda de datos que existe actualmente

sobre la composición en piranoantocianos en vinos rosados y tintos comerciales, que

nos permita constituir una amplia base de datos de referencia sobre estas sustancias,

y así poder evaluar su contribución al color mostrado por estos pigmentos, y estudiar

cómo influye su presencia para estabilizar el color durante el envejecimiento del vino,

también nos permitirá evaluar la efectividad de algunas técnicas de elaboración

encaminadas a favorecer la formación de piranoantocianos en el vino.

Así mismo, se pretende contribuir al estudio de los factores que afectan a la

formación y evolución de piranoantocianos en vinos tintos y rosados, estudiando vinos

experimentales a lo largo del proceso de elaboración y de almacenamiento hasta llegar

al momento de su consumo, para lograr esto hemos enfocado la investigación desde

varios puntos:

De forma específica, los objetivos que se pretenden alcanzar con esta Tesis

son:

1. Determinar el contenido de los distintos tipos de piranoantocianos en los

vinos tintos y rosados elaborados en Castilla-La Mancha, para crear una amplia base

de datos sobre el contenido de estas sustancias en los vinos.

2. Evaluar las posibles diferencias en el contenido de piranoantocianos de los

vinos en función de la variedad de uva.

3. Investigar la evolución del contenido y tipología de los piranoantocianos en

los vinos a lo largo del tiempo de elaboración y almacenamiento de éstos.



4. Analizar cualitativa y cuantitativamente el contenido en antocianos, y

piranoantocianos presentes en un amplio grupo de muestras de vinos tintos

comerciales.

5. Realizar un estudio pormenorizado en el laboratorio sobre la formación de

los piranoantocianos del tipo vitisina y los hidroxifenilpiranoantocianos.


ANTECEDENTES

Apartado I

“EL VINO ROSADO”

Antecedentes: Vinos Rosados.


APARTADO I. LOS VINOS ROSADOS

2.I.1 DEFINICIÓN DE VINO ROSADO

El vino rosado se define por su color. Es un tipo intermedio entre el vino blanco

y el vino tinto, entre el vino elaborado sin maceración y el elaborado con maceración.

Del vino tinto tiene las variedades de uva empleadas en una pequeña cantidad de

pigmentos, Del vino blanco tiene la constitución general, su ligereza, su afrutado y una

cierta analogía en las técnicas de la vinificación.

Por otra parte, algunos vinos rasados se parecen bastante a los vinos tintos;

carnosos y bastante coloreados, se elaboran con maceración de hollejos limitada y se

suavizan con la fermentación maloláctica. Otros se parecen más a los vinos blancos, y

al estar menos macerados, son más frescos y conservan su acidez málica. Los

primeros contienen taninos y carecen de ácido málico, mientras que los segundos

contienen ácido málico y pocos taninos.

Es difícil establecer una definición tecnológica de los vinos rosados. No se

puede basar exclusivamente en su origen o en los métodos de vinificación.

Teóricamente pueden proceder de la extracción parcial de uva tinta o de la extracción

total de uva gris o rosada.

La mayoría de los vinos rosados son secos, pero algunas regiones producen

también vinos rosados dulces muy apreciados.

La fama de los vinos rosados se explica por su apariencia atractiva, por el gusto

de las bebidas frescas, por la búsqueda de vinos más afrutados, por el hecho además

de que el vino rosado puede acompañar toda una comida. Pero se debe matizar, ya

que si bien hay grandes vinos tintos o blancos sólo algunos vinos rosados adquieren el

calificativo de gran clase. Puede ser a causa de las dificultades de su elaboración y de

su débil comportamiento frente al envejecimiento. No obstante, el vino rosado es uno

de los tipos de vino que más se podrían beneficiar de los progresos de la tecnología

enológica. Los diferentes vinos rosados se beben jóvenes; raramente se mejoran

envejeciéndolos.



2.I.2. FORMAS DE ELABORACIÓN DE VINOS ROSADOS

Los vinos rosados se elaboran siguiendo dos tipos genéricos y tecnologías:

2.I.2.1 Vinos rosados por vinificación en blanco de uvas tintas

Se elaboran con uvas tintas tratadas como si fueran blancas en las operaciones

de estrujado, escurrido y prensado, pero sin las precauciones de limitación de la

maceración que, por lo general, se toman cuando se trata de la vinificación en blanco.

Por otra parte, casi siempre es necesario, para conseguir una intensidad colorante

suficiente, emplear el mosto de prensa. Se practica un sulfitado moderado, de acuerdo

con el estado de la uva y para no reducir demasiado la intensidad del color, pero el

desfangado apenas se emplea si la vendimia es sana. El resto de las operaciones no

plantea problemas especiales y reúne las preocupaciones generales de la elaboración

de los vinos blancos, es decir, baja temperatura de fermentación y protección contra

las oxidaciones. La fermentación maloláctica, total o parcial, puede interesar o no.

2.I.2.2. Vino rosados de maceración parcial (sangrado)

Son los llamados “vinos de café” o “vinos de una noche”. Su elaboración se inicia

como la de un vino tinto, se carga una cuba de vendimia estrujada, despalillada o no,

y sulfitada. La fermentación se inicia después de algunas horas y los orujos se elevan.

Al mismo tiempo, el color se intensifica por extracción de los antocianos, extracción

más o menos rápida según las variedades y el contenido en antocianos da las uvas

debido al grado de maduración y condiciones climatológicas o/y edafológicas. Cuando

se considera que el color es suficiente, sin olvidar la tendencia a disminuir por

polimerización durante la fermentación y después del sulfitado, se procede al descube

parcial o sangrado. El sangrado suele realizarse veinticuatro horas después del

encubado, cuando la densidad relativa aún es de 1.050- 1.070. Por rebla general sólo

se trasiega una parte del depósito, el resto continúa vinificándose en tinto. A veces el

depósito se recarga con vendimia fresca sobre los orujos, práctica que no es muy

recomendable, ya que produce vinos tintos duros (vinos de doble pasta).



La fermentación del mosto rosado continúa después del descube, un poco lenta

debido a la separación de los orujos, y se termina con el depósito. Antes de trasegar

casi siempre se intenta conseguir la fermentación maloláctica.

2.I.2.3. Elaboración de vinos claretes

Este sistema de vinificación se puede considerar un sistema intermedio entre la

vinificación en blanco y la vinificación en tinto, pero no exactamente como una

vinificación en rosado como anteriormente se ha descrito. El vino denominado

“clarete” o “aloque” es típico de Castila-La Mancha, sobre todo de la zona de

Valdepeñas, en cuya D.O. aparece recogido bajo el nombre de “Tinto Valdepeñas”,

diferenciándose de los vinos rosados.

Se trata de vinos con una graduación entre 11-13% (11-14% para tintos; 10-

13% para blancos: 10.5-13% para rosados en la D.O. Valdepeñas) que se pueden

obtener:

a partir de mostos con mezcla de uvas tintas (Cencibel) y

blancas(Airén)

o de sus mostos cuya fermentación se hace parcialmente en presencia

de los orujos de la uva tinta

El porcentaje mínimo de la uva de la variedad Cencibel debe ser del 25%. Este

tipo de vinos obedece al hecho de que en estas zonas la uva blanca Airén es la

mayoritaria (en torno al 80% tras la última reconversión del viñedo) y al hecho de que

la vendimia de la variedad tinta Cencibel es anterior a la vendimia de la variedad

blanca Airén, con la cual se solapa. Cuando se reciben ambos tipos de uva en la

bodega, el mosto de uva blanca se mezcla con uvas tintas estrujadas y despalilladas, o

bien al finalizar la elaboración de los vinos tintos, se aprovechan los orujos de la uva

tinta añadiéndole mosto de uva blanca. De esta mezcla surgen unos vinos ligeros,

neutros, de aroma sutil, cuyas cualidades se aprecian mejor durante su juventud.



2.I.3. Mezcla de vinos blancos y tintos para la elaboración de vinos rosados

La Comisión Europea pretende dar vía libre a la elaboración de vinos rosados

mezclando vinos tintos y blancos, donde será aplicable a los vinos que procedan al

menos en un 25% de uvas de variedades tintas. Procedimiento que hasta la fecha

estaba prohibido en la mayoría de países comunitarios salvo en Francia, sólo para

elaborar el famoso champagne rosé.

Esta nueva normativa cuya finalidad era poder hacer frente a la competencia de

los vinos del Nuevo Mundo, no ha sido bien recibida por los bodegueros que elaboran

vinos rosados de calidad con los métodos tradicionales. Los bodegueros italianos,

franceses y españoles manifiestan que la elaboración de vino rosado conlleva un

proceso muy específico con el que se obtiene un producto genuino y nada tiene que

ver con los vinos rosados obtenidos por la mezcla de vinos tintos y blancos.

La denuncia que realizan los bodegueros es que se va a adulterar el mercado y los

consumidores que adquieran vino rosado no sabrán qué procedimiento se ha

empleado para su desarrollo, algo que no ha ocurrido hasta ahora, ya que las mezclas

estaban prohibidas. Frente a la competencia del Nuevo Mundo se debe trabajar en la

relación calidad-precio y mostrar al consumidor las diferencias entre un vino rosado

desarrollado mediante métodos tradicionales y un vino fruto de la mezcla de vinos

blancos y tintos.

Los bodegueros creen que se trata de un paso atrás, la Unión Europea pretende

potenciar la competitividad y aumentar mercado a costa de la calidad y la tradición. En

cualquiera de los magníficos vinos rosados que se elaboran se han utilizado las más

avanzadas técnicas de vinificación pero siempre han mantenido su parte rústica, una

conjugación que da lugar a vinos muy expresivos en boca y en nariz. De hecho,

durante los últimos años los vinos rosados han ido adquiriendo un papel más

importante que podría truncarse con la nueva normativa.

Apartado II

“COMPUESTOS FENÓLICOS”

Antecedentes: Compuestos Fenólicos.


2.II. COMPUESTOS FENÓLICOS.

2.II.1. TRANSFERENCIA DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE LA UVA AL VINO.

Para estudiar el color del vino es fundamental conocer el contenido de

compuestos fenólicos de las uvas con las que se ha elaborado.

En la mayoría de las variedades de uva tinta utilizadas para la elaboración de

vinos (Vitis vinifera, L.), los pigmentos que proporcionan el color se encuentran de

forma exclusiva en las pieles u hollejos, y ocasionalmente también se encuentran en la

pulpa de las variedades denominadas tintoreras. En el caso de los vinos tintos y

rosados, el color guarda una estrecha relación con su composición en compuestos

fenólicos: de manera directa, con los pigmentos rojos originales de la uva, los cuales

dependerán a su vez, de factores como la variedad, estado de madurez en el

momento de la recolección, condiciones de cultivo, condiciones climáticas, etc. Y de

forma indirecta, ya que en el vino aparecerán nuevos pigmentos procedentes de las

etapas fermentativas y otra serie de compuestos que resultan de la evolución durante

la vinificación y el envejecimiento, de los materiales fenólicos presentes originalmente

en la uva.

Dentro de los compuestos fenólicos los antocianos son los que tienen una mayor

importancia en el color del vino, se puede considerar que la transferencia de

antocianos monómeros de la uva al vino es un equilibrio de reparto de estas

sustancias entre dos fases inmiscibles, una sólida (el hollejo de las uvas) y otra líquida

(el mosto-vino en fermentación). Como en todo proceso de reparto entre fases, el

equilibrio alcanzado dependerá de la afinidad de las sustancias a repartir por las dos

fases entre las que se transfieren.



Figura 1 Perfiles de antocianos monómeros (cromatografía HPLC) característicos de las uvas tintas de la variedad Cencibel (A) y de los vinos varietales elaborados con ellas (B). Las siglas DEL, CIA, PET, PEO y MAL se corresponden con los 3-monoglucósidos de delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina, respectivamente, mientras que A- y C- hacen referencia a los derivados acetilados y cumarílicos, respectivamente, de los 3-monoglucósidos de antocianidinas anteriores.

La solubilidad de los antocianos monómeros en el medio acuoso que es el

mosto-vino en fermentación, es la fuerza motriz que inicialmente determina su

transferencia durante la vinificación. Puesto que esta solubilidad no es la misma para

los distintos grupos de antocianos monómeros (no acilados, acetilados y cumarílicos),

se entiende por qué la proporción en que se encuentran los antocianos monómeros en

las uvas (los llamados perfiles de antocianos monómeros), que es una característica

varietal, no se transfiere exactamente a los vinos, en los que se suele observar una

disminución significativa de la proporción de los derivados cumarílicos de los

DEL

DEL

CIA

CIA

PET

PET

PEO

PEO

MAL

MAL

A-DEL

A-DEL

A-CIA

A-CIA

A-PET

A-PET

A-PEO

A-PEO

C-DEL

C-DEL

A-MAL

A-MALC-

CIA

C-PET

C-PET

C-PEO

C-PEO

C-MAL

C-MAL

C-CIA

A) HOLLEJOS CENCIBEL

B) VINOS CENCIBEL

DEL

DEL

CIA

CIA

PET

PET

PEO

PEO

MAL

MAL

A-DEL

A-DEL

A-CIA

A-CIA

A-PET

A-PET

A-PEO

A-PEO

C-DEL

C-DEL

A-MAL

A-MALC-

CIA

C-PET

C-PET

C-PEO

C-PEO

C-MAL

C-MAL

C-CIA

DEL

DEL

CIA

CIA

PET

PET

PEO

PEO

MAL

MAL

A-DEL

A-DEL

A-CIA

A-CIA

A-PET

A-PET

A-PEO

A-PEO

C-DEL

C-DEL

A-MAL

A-MALC-

CIA

C-PET

C-PET

C-PEO

C-PEO

C-MAL

C-MAL

DEL

DEL

CIA

CIA

PET

PET

PEO

PEO

MAL

MAL

A-DEL

A-DEL

A-CIA

A-CIA

A-PET

A-PET

A-PEO

A-PEO

C-DEL

C-DEL

A-MAL

A-MALC-

CIA

C-PET

C-PET

C-PEO

C-PEO

C-MAL

C-MAL

C-CIA

A) HOLLEJOS CENCIBEL

B) VINOS CENCIBEL



antocianos monómeros (Figura 1). Ello no es obstáculo para que los perfiles de

antocianos monómeros mostrados por los vinos tintos varietales aún continúen siendo

una herramienta válida para la diferenciación varietal, al menos durante los 3-4

primeros años de envejecimiento de los vinos en los que aún es posible encontrar

antocianos monómeros en cantidades suficientes para su cuantificación.

La transferencia de los demás compuestos fenólicos también está sometida a

este tipo de equilibrios de reparto. En término promedio, se consigue transferir al vino

un 60% de los compuestos fenólicos totales presentes en las uvas, mientras que sólo

se consigue transferir un 38% de antocianos monómeros, y el porcentaje disminuye

hasta el 20% para los taninos, que son los compuestos fenólicos menos solubles en

medio acuoso.

Son numerosos y muy diversos los factores que se han probado a modificar y

que aún se prueban, para intentar mejorar los porcentajes de transferencia de los

antocianos monómeros durante la vinificación:

a) Factores prefermentativos:

- Disminución del pH del mosto

- Aumento de la cantidad de SO2 añadido

- Variación de la temperatura previa a la fermentación (criomaceración,

termovinificación, flash-expansión)

- Adición de enzimas pectolíticos

b) Factores fermentativos:

- Duración y tipo de maceración (bazuqueos, remontados, deléstage,

fermentadores rotatorios, fermentadores Ganimede, etc)

- Uso de agentes clarificantes

Pero a pesar de la diversidad de factores ensayados, hasta la fecha no se ha

podido establecer un método universal para la mejora del color del vino tinto. Puede

ser por la falta de conocimiento que aún existe sobre todo lo que ocurre, a nivel

molecular, en los procesos implicados en la transferencia de color del vino y en otros

procesos que interfieren con éstos y que implican a los pigmentos y otros compuestos

fenólicos en disolución, una vez que se encuentran en el mosto-vino en fermentación.

Además, muchos de los factores ensayados no son selectivos en cuanto a la



transferencia de antocianos monómeros, y aunque consiguen un aumento efectivo del

color del vino, pueden provocar efectos secundarios indeseables, como un aumento de

la astringencia por una transferencia excesiva de cierto tipo de taninos de las pepitas

de las uvas.

2.II.2. CLASIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS.

Los compuestos fenólicos son unos metabolitos secundarios de la uva, cuya

biosíntesis parece responder a una serie de necesidades específicas de la viña, como

pueden ser la protección frente a la radiación UV, la defensa frente a ataques fúngicos,

o el rechazo/reclamo para animales. Estos compuestos fenólicos de la uva juegan un

papel fundamental en la calidad del futuro vino, sobre todo en la calidad sensorial

(color, astringencia, cuerpo), en las posibilidades de crianza del vino en barricas de

roble y de envejecimiento en botella, así como en las propiedades cardiosaludables

asociadas al consumo moderado de vino.

Estos compuestos pueden ser clasificados en compuestos no flavonoideos y

flavonoideos (Boulton y col., 1998; Cheynier y col., 2003; Jackson, 2000; Ribéreau-

Gayon y col., 2000; Hidalgo Togores, 2003).

2.II.2.1. Compuestos fenólicos no flavonoideos:

2.II.2.1.1. Ácidos fenólicos:

2.II.2.1.1.1. Ácidos hidroxibenzoicos

2.II.2.1.1.2. Ácidos hidroxicinámicos

2.II.2.1.2. Estilbenos

2.II.2.2. Compuestos fenólicos flavonoideos:

2.II.2.2.1. Antocianos

2.II.2.2.2. Flavan-3-oles (taninos)

2.II.2.2.3. Flavonoles



2.II.2.1.1. ÁCIDOS FENÓLICOS

Estos ácidos fenólicos, en la uva y en el vino, se pueden encontrar en forma

tanto de ácidos hidroxibenzoicos (C6-C1), como de ácidos hidroxicinámicos (C6-C3),

diferenciándose entre sí por la sustitución del anillo bencénico.

2.II.2.1.1.1. ACIDOS HIDROXIBENZOICOS

Ácidos hidroxibenzoicos R2 R3 R4 R5

Ácido p-hidroxibenzoico H H OH H

Acido protocatéquico H OH OH H

Acido vainíllico H OCH3 OH H

Acido Gálico H OH OH OH

Acido Siríngico H OCH3 OH OCH3

Acido Salicílico OH H H H

Acido Gentísico OH H H OH

Figura 2. Estructura de los principales ácidos hidroxibenzoicos presentes en la uva y el vino.

Dentro de los ácidos hidroxibenzoicos, los ácidos Salicílico y Gentísico se

encuentran solo como traza, pero el ácido Gálico está en gran proporción 95mg/L

(Cabanis et al. 2003). Estos ácidos no están libres sino que normalmente se

encuentran combinados con azucares o formando esteres con los flavonoles. El ácido

Gálico y su dímero el ácido Pelágico también se encuentran en la madera del género



Quercus pudiendo pasar al vino si se hace crianza en barrica, esto también ocurre con

los ácidos Vainíllico y Siríngico en vinos criados en madera de roble (Puech et al

2003).

En la uva los ácidos fenólicos son generalmente hidroxicinámicos, encontrándose

en las células del hollejo y en menor medida en la pulpa, en general en forma de

ésteres tartáricos.

2.II.2.1.1.2. ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS

Figura 3. Ácidos hidroxicinamoil tartáricos.

Durante el proceso de vinificación estos esteres se pueden hidrolizar

coexistiendo tanto las formas libres como combinadas, en el vino. También el uso de

enzimas en la vinificación puede producir esta hidrólisis (Dugelay y col., 1993). La

presencia de los ésteres tartáricos y la ausencia de ésteres del ácido quínico (los

denominados ácidos clorogénicos) son unas de las características más específicas del

género Vitis y nos podría ayudar a diferenciarlo de otros géneros.

El análisis comparado de los contenidos en ésteres hidroxicinámicos, muestra

concentraciones en la uva más elevadas en el hollejo que en la pulpa (de 2 a 100 más

según la cepa), de forma que en el hollejo, las concentraciones varían de 0.06 a 0.78

mg/g de hollejo, para el ácido caftárico, y de 0 a 0.3 mg/g para el ácido cutárico,

mientras que el ácido fertárico se encuentra en escasa cantidad (< 0.06 mg/g),



aunque estas cantidades también variarán según las cepas en el género Vitis. La

concentración de los ésteres hidroxicinámicos disminuye durante el desarrollo de la

baya y se estabiliza en la madurez enológica.

El estudio de estos ácidos es muy importante por que aunque no aportan

directamente color ni sabor al vino son los precursores, por un lado, de muchos

compuestos volátiles que se obtienen por la acción enzimática de la descarboxilasa,

que transforma los ácidos p-Cumárico y Ferúlico en 4-vinilfenol y 4-vinilguayacol, los

cuales pueden conferir al vino olores calificados como poco agradables, “a farmacia”,

ligados a notas de ahumado, de bosque, caucho quemado, pimienta, almendra tostada

(Bayonove y col., 2003), también olores a clavo, especiado, caucho (Boido, 2002;

Bayonove y col., 2003) y a disolventes o medicinas (Dugelay y col., 1993). Y Además

la presencia de estos vinilfenoles influye indirectamente en las propiedades

organolépticas del vino, puesto que dan lugar a la formación de etil-fenol y etil-

guayacol por efecto de la actividad vinil-reductasa presente en ciertas levaduras como

Brettanomyces, o en algunas bacterias lácticas normalmente del género Lactobacillus;

aportando al vino aromas a cuero, animal, olor a sudor de caballo (Chatonet y col.,

1995; Couto y col.; 2006).

Y por otro lado y mucho más importante para nuestro trabajo, los ácidos

hidroxicinámicos y sus derivados 4-vinilfenoles pueden influir en el color de los vinos

tintos, puesto que son capaces de reaccionar con los antocianos y originar algunos

compuestos de tipo piranoantociánico objeto de este estudio, estos compuestos

aportan tonalidades naranjas a los vinos (Rentzsch et al., 2007a y 2007b). Estas

interacciones son de tipo covalente, pero también se pueden producir interacciones no

covalentes (fenómenos de copigmentación) entre los antocianos y los ácidos

hidroxicinámicos que también tienen importancia en el color de los vinos tintos,

2.II.2.1.2. ESTILBENOS

Destaca la presencia en la uva de otros compuestos fenólicos como el

resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilbeno), principalmente en su configuración trans, y de

su derivado glucosilado, conocido con el nombre de piceido (Figura 4).



Figura 4. Resveratrol.

En Vitis vinifera y Vitis lanbrusca, la presencia de resveratrol se observa en el

hollejo mientras que no se encuentra en las semillas. El contenido de trans-resveratrol

en el hollejo, en la madurez, es del orden de 20 μg por g de materia fresca. Esta

concentración en el hollejo varía según las cepas, siendo la Pinot Noir particularmente

rica en este compuesto. El resveratrol juega un papel muy importante en la resistencia

de ciertas bayas de uva a los ataques fúngicos.

También existen otros compuestos derivados del resveratrol, uno es un

homólogo superior del resveratrol, con un grupo OH más en la posición 3´; su

nombre es piceatannol y su 3-O-glucósido se denomina astringin. El grupo OH extra

hace que estos compuestos muestren sus máximos de absorción UV a 302 y 321 nm

(Püssa et al., 2006), mientras que el resveratrol los muestra a 306 y 316 nm. Otro

compuesto importante es el derivado glucosilado del reveratrol aislado en vinos

Reisling en el año 2000, trans-resveratrol-2-C-glucósido (Baderschneider y

Winterhalter, 2000), y que se diferencia del piceido en que la posición del glucósido es

en el C-2. Por último, el resveratrol tiene capacidad de formar oligómeros

(Baderschneider y Winterhalter, 2000; Vitrac et al., 2001; Püssa et al., 2006), y se

han encontrado algunos dímeros (pallidol, ε y δ-viniferin, parthenocissin), y más

recientemente un trímero (α-viniferin) (Cantos y col., 2002) y un tetrámero

(hopeaphenol) (Guebailia et al., 2006).

Todos estos compuestos están siendo muy estudiados por sus efectos

anticancerígenos y cardio saludables.



Figura. 5 Estilbenos y sus derivados.



2.II.2.2. COMPUESTOS FENÓLICOS FLAVONOIDEOS

Los compuestos flavonoideos están caracterizados por un esqueleto base de 15

átomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenilbenzopirona o 2-fenilbenzopirano (Figura

6).

Figura 6. Estructuras de la 2-fenilbenzopirona y 2-fenilbenzopirano.

Esta gran familia está dividida en varias subclases que se distinguen por el

grado de oxidación de su anillo de pirano. Los compuestos flavonoideos en sentido

estricto, basados en la estructura 2-fenilbenzopirona, están principalmente

representados en la uva por los flavonoles, mientras que en un sentido más amplio

comprenden igualmente a los antocianos y a los flavan-3-oles. Se encuentran también

en la uva otros grupos de menor importancia, como los dihidroflavonoles

(flavanonoles), y en las hojas, las flavonas.

2.II.2.2.1. LOS ANTOCIANOS

Los antocianos (3-monoglucósidos de antocianidinas), acilados o no en la

posición 6 de la glucosa; (Figura 7.) son unos compuestos fenólicos, que se

encuentran localizados en el hollejo y en las 3 ó 4 primeras capas celulares del

hipodermo, contribuyendo al color de las especies tintas. Estos pigmentos se

encuentran también en la pulpa en las cepas tintoreras. A nivel subcelular, se

encuentran en la vacuola, dónde pueden estar incluidas en los orgánulos

“especializados” definidos como antocianoplastos.



Estos compuestos son los principales responsables del color de los vinos tintos.

Y se trata quizá de la clase de compuestos fenólicos de la uva más estudiados y mejor

conocidos.

La estructura de los antocianos comprende dos anillos bencénicos unidos por un

heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico denominado ión flavilio. Bajo la forma

glicosídicas se denominan antocianinas, bastante más estables que la forma aglicona o

antocianidinas.

Figura 7 Antocianos monómeros (3-monoglucósidos de antocianidinas) presentes en las uvas y vinos de las variedades de Vitis vinifera.

En la naturaleza el 90 por ciento de todos los antocianos pertenecen a una de las

seis antocianidinas (pelargonidina, cianidina, peonidina, petunidina, delfinidina y

malvidina) que difieren primero en el número de hidroxilos (OH) y grupos metoxilos

(OCH3) en el anillo B, segundo por el número la posición y la naturaleza de las osas y

tercero por el número de ácidos que esterifican los azucares (Figura 7.). Según

algunos estudios realizados en diferentes cepas de Vitis vinífera sobre la composición

antociánica, el contenido global varía desde 500 mg/kg hasta 3000 mg/kg y los

niveles de cada antociano cambian individualmente para cada variedad.



La distribución de las seis antocianidinas más comunes en las plantas es la

siguiente: cianidina (50 %), pelargonidina (12 %), delfinidina (12 %), peonidina

(12 %), petunidina (7 %) y malvidina (7 %). El antociano más ampliamente

distribuido en la mayoría de las frutas es la cianidina-3-glucósido (Kong, 2003). Sin

embargo, los glicósidos de malvidina son los antocianos característicos de la uva tinta

y de sus productos derivados (vino, zumo etc.) (Mazza et al., 1993).

Hasta hace poco tiempo en Vitis vinífera solo se distinguían cinco tipos de estas

moléculas (cianidina, peonidina, petunidina, delfinidina y malvidina) No obstante,

estudios recientes han revelado la presencia de antocianos con esqueleto de

pelargonidina (R1 = R2 = H) en zumos elaborados con uvas híbridas y americanas

(Wang y col., 2003a) encontrándose estos antocianos en cantidades bastante menores

que los que derivan de las otras cinco antocianidinas, y también se encuentran en

vinos de la variedad Garnacha Tintorera (Noelia Castillo y col. 2009).

También, en contra de lo que se pensaba de que en la V vinifera solo se

encuentraban los 3-monoglucósidos mientras que en otras especies del mismo

género, como Vitis Riparia, Vitis Lambrusca o Vitis Rupestris, los antocianos también

aparecían como diglucósidos, con dos moléculas de glucosa en las posiciones 3 y 5, y

que predominan sobre los 3-glucósidos presentes (Ribérau-Gayon, 1982), el empleo

de técnicas analíticas cada vez más sensibles, como la cromatografía HPLC acoplada a

un detector de espectrometría de masas, está permitiendo encontrar trazas de

antocianos del tipo 3,5-diglucósido en uvas de variedades V. vinifera y en sus vinos

(Alcalde-Eon y col., 2006) (Noelia Castillo y col. 2009)

2.II.2.2.2. TANINOS

Los taninos naturales de la uva y del vino son principalmente procianidinas. Su

estructura se basa en polímeros más o menos complejos de los flavan-3-oles o 3-

flavanoles.

Los flavan-3-oles monómeros están formados por dos anillos bencénicos unidos

por un heterociclo oxigenado saturado, pudiendo encontrarse cuatro isómeros: (+)-

catequina, (-)-epicatequina, (-)-catequina y (+)-epicatequina. Los más

abundantes son los dos primeros, así como también los derivados de la epicatequina

en forma de éster gálico. Los taninos son complejos derivados de los compuestos



anteriores, como las procianidinas dímeras, oligoméricas y polímeras. Las

procianidinas oligoméricas son moléculas de 3 a 10 unidades de flavanoles y las

polímeras están formadas por más de 10 unidades de flavanoles, alcanzando un peso

molecular superior a 3000.

Figura 8. Estructura de los flavan-3-oles monómeros de la uva.

Los taninos u oligómeros y polímeros de flavan-3-oles, tienen una característica

principal que es su capacidad para unirse a sustancias como las proteínas,

polisacáridos, alcaloides, radicales libres e iones metálicos. Se han realizado distintos

estudios para ver la capacidad que tienen estos compuestos para combinarse con

proteínas y se ha visto que esta aumenta con la polimerización de los taninos de

dímeros a heptámeros, grado a partir del cual, esta capacidad comienza a disminuir

(Lea, 1992), aunque otros estudios más recientes realizados por Vidal et al (2003)

parecen sugerir que al menos la capacidad para unirse a proteínas salivares, que son

las responsable de la sensación de astringencia, aumenta con el peso molecular del

tanino sin límite de tamaño.

También son importantes por su capacidad de interactuar con las proteínas, y

otros polímeros de los vegetales como celulosa, peptinas y otros polisacáridos

precipitándolos, tal como ocurre en el curtido de pieles; además, estos taninos son

capaces de liberar antocianidinas, por ruptura de las uniones intermonoméricas



(interflavan), de los polímeros de taninos, en medio ácido y en caliente, lo que es el

origen del término proantocianidinas, con el que también se les denomina.

Figura 9. Estructura de las proantocianidinas de la uva (R=H, OH).

En las siguientes figuras podemos ver una representación de taninos

condensados, los cuales tienen la capacidad de dar lugar a antocianidinas por

calentamiento en medio ácido mineral. En estas condiciones, el enlace interflavánico

se rompe, liberando el compuesto sencillo correspondiente a la unidad inferior

mientras que la superior forma un carbocatión muy reactivo, que puede ser captado

por un nucleófilo o por oxidación dar una antocianidina



Figura 10. Reacción de hidrólisis de un tanino condensado, liberando la unidad inferior

intacta y la superior o superiores en forma de carbocatión.

Los grupos mayoritarios que están presentes en las uvas son las procianidinas

procedentes de la catequina y la epicatequina y las prodelfinidinas derivada de la

epigalocatequina. Estas formas polímeras pueden comprender un número muy elevado

de unidades, ya que los grados medios de polimerización medidos son del orden de 10

en las semillas y de 30 en el hollejo de ciertas variedades de uva. Los contenidos en

flavan-3-oles de las semillas son habitualmente superiores a los de los hollejos, ya se

trate de monómeros, oligómeros o de polímeros. Pero según las distintas variedades

de uva analizadas, la contribución del hollejo al contenido global de la baya puede ser

más importante que la de las semillas y los contenidos globales, al igual que los

grados medios de polimerización y las proporciones de las diferentes unidades

constitutivas también pueden variar. Sin embargo, los taninos que provienen de los

hollejos se distinguen de los de semillas por la presencia de unidades de

epigalocatequina, con un grado medio de polimerización más elevado y una menor

proporción de unidades galoiladas.

El efecto que tienen los antocianos sobre los alimentos es el de conferirles

amargor y astringencia. El amargor es una sensación del sentido del gusto, las

proantocianidinas mas amargas son las tetrámeras al ir aumentado o disminuyendo su

grado de polimerización disminuye el amargor (Lea, 1992). La astringencia es una

sensación táctil en la cual se percibe sequedad y rugosidad en toda la cavidad bucal.

Pero ya hemos visto que existen diferencias entre las observaciones realizadas por



distintos autores con relación al grado de tamaño de los taninos que podría causar la

máxima astringencia. En el vino los antocianos son responsables directos de

propiedades sensoriales como el cuerpo, y la astringencia, e indirectos de otras como

el color.

2.II.2.2.2.1. Procesos de degradación de los flavan-3-oles.

De manera general, los mecanismos de degradación oxidativa de polifenoles

transcurren a través de la formación de quinonas de gran reactividad como productos

intermedios, independientemente de que la reacción oxidativa tenga carácter químico

o enzimático, facilitada por la acción de polifenoloxidasas (Singleton, 1987; Cheynier

et al., 1988, 1989; Macheix et al., 1991; Nicolas et al., 1993). En los fenoles se

produce la migración parcial de la densidad electrónica del átomo de oxígeno de los

grupos hidroxilos hacia el anillo aromático, aumentando la acidez de los grupos

hidroxilos y facilitando la pérdida del protón (H+), de esta forma, resulta un anión

fenolato cuya autooxidación es muy rápida, el producto de oxidación del fenolato, por

pérdida de un solo electrón, es un radical libre de estructura semiquinona. Cuando dos

grupos hidroxilos están en carbonos adyacentes del anillo aromático en compuestos

fenólicos, se producirá una segunda oxidación por pérdida del otro electrón hacia una

ortoquinona (figura 11.), este patrón de hidroxilación se encuentra en el anillo B de los

flavanoles (catequinas y proantocianidinas derivadas), compuestos especialmente

dados a sufrir este tipo de reacciones.

A pH ligeramente ácidos, como los existentes en el vino, estas reacciones de

oxidación ocurrirán muy lentamente, ya que las cantidades de fenolato formado serán

mínimas.



Figura 11. Oxidación de ortodifenoles.

Las quinonas son especies muy reactivas altamente oxidantes, por lo que si no

son rápidamente reducidas son capaces de intervenir en reacciones de condensación

con compuestos nucleofílicos, en las que pueden estar implicados otros polifenoles

(figura 12.).

Figura 12. Reducción y condensación de las quinonas (Hua Li 2008).

2.II.2.2.3. Flavonoles

Los flavonoles son una clase de compuestos fenólicos localizados en los hollejos

de las uvas Vitis vinifera, implicados también en mecanismos de protección de la



planta frente a la radiación UV, tienen una fuerte absorbancia a las longitudes de

onda propias de la radiación UV-A (325-400 nm) y UV-B (280-325 nm) (Figura 13).

En lo que respecta al color de los vinos, los flavonoles son pigmentos amarillos

que contribuyen directamente en el color de los vinos blancos, pero en vinos tintos los

flavonoles son enmascarados por los pigmentos rojos, los antocianos. Sin embargo, la

importancia de los flavonoles es que son unos de los compuestos fenólicos

involucrados en el fenómeno de copigmentación del vino tinto (Boulton y col., 2001). Y

además, los flavonoles han sido identificados como unos de los mejores compuestos

fenólicos con actividad antioxidante del vino, especialmente en vinos blancos (Burda y

Olezsek, 2001; De Beer y col., 2005; Montoro y col. 2005), este efecto antioxidantes

no es tan importante en vinos tintos, en los que son superados normalmente por

otros compuestos fenólicos mas abundantes, tales como flavan-3-oles y antocianos

(Gardner y col., 1999; Fernández-Pachón y col., 2004; De Beer y col., 2006).

Los más importantes que se han encontrado en vinos de uvas V. vinifera son los

derivados 4’-hidroxi, 3’,4’-dihidroxi y 3’,4’,5’- trihidroxi, conocidos como kaempferol,

quercetina, y miricetina, y también la isoramnetina, producto de la metoxilación de el

3’-hidróxido de quercetina. De la misma manera que isoramnetina es el producto de la

metoxilación de quercetina, el producto de metoxilación en el C-3’ de miricetina es

conocido como laricitrina, al igual que el 3’, 5’-dimetoxil derivado de miricetina es

denominado siringetina.

En la uva, los flavonoles sólo existen como 3-O-glicósidos; sin embargo, en los

vinos se pueden hallar junto con los flavonoles 3-O-glicósidos, las agliconas libres

correspondientes, como resultado de la hidrólisis ácida que ocurre durante la

elaboración del vino y su envejecimiento.



Figura 13. Estructura del esqueleto flavonoide de los flavonoles hallados en uvas Vitis

Vinifera.

2.II.2.2.4. Flavanonoles y Flavonas

Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el hollejo

de la uva blanca, como son la astilbina (3-ramnosido del dihidroquercetina) y la

engelatina (3-ramnosido del dihidrokaempferol). Sus concentraciones son del orden de

9 mg/kg de materia fresca para la astilbina y0.6 mg/kg para la engelatina. Estas

mismas moléculas han sido igualmente descubiertas en los raspones, por

espectrometría de masas.

Apartado III

“EL COLOR DEL

VINO TINTO”

Antecedentes: El color del vino.


2. III. EL COLOR DEL VINO TINTO

2.III.1. LOS ANTOCIANOS Y SUS PROPIEDADES

Los antocianos en las uvas se encuentran únicamente como antocianos

monómeros, no ligados a otras moléculas. Pero en cuanto la uva es prensada y

empieza a fermentar se ponen en contacto, todos los compuestos fenólicos en un

medio acuoso; Por un lado y debido al pH del vino (3-4), van a coexistir una gran

cantidad de isomeros de los antocianos monómeros originales, dependiendo de

factores como el pH, SO2, temperatura etc., y por otro lado está la presencia de

otros compuestos fenólicos como taninos, ácidos hidroxicinámicos y otras

moléculas producidas por las levaduras y/o bacterias, y por último puede haber

otros compuestos extraídos de la madera en el caso de los vinos que tienen

crianza en barrica, esta gran cantidad de variables hace que se vayan a producir

muchos cambios de propiedades y color durante la elaboración y envejecimiento

del vino, dependiendo de las reacciones químicas que predominen y las

condiciones en el medio, y que además este color evolucione a lo largo del tiempo.

En el vino se van a dar tres tipos de equilibrios: el acido-base o

transferencia de protones, el de hidratación y el de tautomería de ciclo-cadena

(Brouillard y Delaporte 1977), citados por (Brouillard 1982), siendo todas estas

reacciones reversibles (Ribéreau Gayon et al., 1998a), según las condiciones del

medio.



Figura 14. Color y equilibrios en disolución acuosa de los antocianos monómeros.

La coloración roja la producen principalmente los cationes flavilio. En función

de las condiciones del medio, estos cationes están en equilibrio con diferentes

isomeros y este equilibrio se encontrara desplazado hacia unas formas u otras, sí el

Ph es ácido predomina el catión flavilio (AH+), a pH cercano a la neutralidad la forma

que predomina es la anhidrobase quinoidal (A) de color azulado violáceo, y con un pH

entre 3 y 6 se forman las pseudobases carbinol incoloras, y en equilibrio con estas, las

pseudobases calconas incoloras o ligeramente amarillentas, y que cuando sufren

oxidación pasan de manera irreversible hacia ácidos fenólicos incoloros, produciéndose

una destrucción del color.

O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'

OH

CALCONA cis (amarillo)

H2O

H+

H2O

H+

O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'

BASE CARBINOL (H-4) (incoloro)

HO

OH

OGlu

O

OH

R

R'

OH

CALCONA trans (amarillo)

H+

H+

O

OH

O

OH

OGlu

R

R'

BASE QUINOIDAL (azul)

O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'

CATIÓN FLAVILIO (rojo)

O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


H2O

H+H

+

H2O

(SO3H)

O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'

OH


O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'

OH


O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'

OH


H2O

H+

H2O

H+

O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


H2O

H+

H2O

H+

O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


HO

OH

OGlu

O

OH

R

R'

OH


HO

OH

OGlu

O

OH

R

R'

OH


HO

OH

OGlu

O

OH

R

R'

OH


H+

H+

O

OH

O

OH

OGlu

R

R'


H+

H+

O

OH

O

OH

OGlu

R

R'


O

OH

O

OH

OGlu

R

R'


O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'


O

OH

HO

OH

OGlu

R

R'


O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


H2O

H+H

+

H2O

O

OH

HO

OH

OGlu

OH

R

R'


H2O

H+H

+

H2O

(SO3H)



Además de estas perdidas o cambios de color debidas a las condiciones del

medio, los antocianos del vino también sufren reacciones de degradación originadas

por distintos agentes y que provocarían una perdida de coloración.

En primer lugar debido al catión flavilio, este al ser un híbrido de resonancia, en

el cual la carga positiva está deslocalizada por todo el heterociclo aromático, da lugar

a un catión oxonio heteroaromático, en el que la mayor densidad relativa de carga

positiva se localiza sobre los carbonos C2 y C4 (Brouillard et al., 1982; Strack et al.,

1994). Por eso, estas dos posiciones son las más reactivas y por tanto particularmente

susceptibles al ataque nucleofílico de compuestos como el SO2, el ácido ascórbico, el

peróxido de hidrógeno y el agua (Markaids, 1982; Delgado-Vargas et al. 2000; Bridle

y Timberlake, 1997).

En segundo lugar por la presencia de anhídrido sulfuroso en los vinos tintos, que

produce también una fuerte decoloración de los antocianos, mediante una reacción

totalmente reversible, que puede suponer una pérdida temporal de la intensidad de

color. Al pH del vino, la mayor parte del anhídrido sulfuroso libre se encuentra bajo la

forma de anión SO3H-, que se combina con los antocianos bajo la forma de catión

flavilio, produciéndose un complejo incoloro, pero transcurrido un cierto tiempo se

produce una descombinación de este compuesto cuando tiene lugar una reducción de

la fracción anhidro sulfuroso libre.

En tercer lugar se puede producir degradación térmica en los antocianos

monómeros; es importante señalar que todos estos factores están interrelacionados,

de echo, el proceso de degradación térmica se ve también influido por el pH del

medio, siendo más acusado a valores de pH más altos (Havlikova et al., 1985). La

radiación luminosa también acelera la degradación de los antocianos, probablemente

debido a la existencia de reacciones de tipo autooxidativo (Iacobucci et al., 1983;

Shenoy, 1993), pero este efecto degradativo de la luz parece ser inferior al del pH y

de la temperatura (Markakis et al., 1986; Sapers et al., 1987), y llega a ser

inapreciable cuando los valores de la temperatura son elevados (Attoe et al., 1981).



Figura 15. Mecanismo de degradación térmica de los antocianos. (1) Ácido Siríngico, (2)

ácido 2,4,6 trihidroxibenzoico (Salas et al., 2005)

Y por último la degradación de los antocianos debida a procesos oxidativos da

lugar a la apertura del heterociclo para formar, en medios neutros, un derivado

cumarínico, por la separación adicional del anillo B; en medios ácidos se ha propuesto



una reacción de tipo Baeller-Villiger, que llevaría a la ruptura del heterociclo, dando

lugar a productos incoloros (Hrazdina et al 1974) (figura 15). (Furtado et al., 1993;

Piffaut et al., 1994). De esta forma, se obtienen como productos principales 2,4,6

trihidroxibenzaldehído y un ácido fenólico correspondiente al ciclo B de la antocianidina

(p.ej., ácido siríngico si se trata de la malvidina)

Figura 16. Reacciones oxidativas de la degradación del 3-monoglucósido de Malvidina.



El principal mecanismo de degradación de los antocianos transcurre a través de

la formación del aglicón, mucho más inestable debido a la ausencia de sustitución en

posición C3. La acción de determinadas enzimas (glucosidasas) produce la separación

del azúcar, liberando el aglicón, que sufre una rápida degradación hacia productos

incoloros, favorecida por la acción del calor o de agentes oxidantes comunes como el

H2O2.

Vamos a ver ahora que factores influyen en la estabilidad de los antocianos:

primero se ha demostrado que la estabilidad en los antocianos aumenta con el número

de metoxilos en el anillo B, ya que protegen al carbono C2, de ataques nucleofilos

debido a un impedimento estérico, y por tanto disminuye al aumentar el número de

hidroxilos, y también que el grado de glicosilación aumenta la estabilidad.

Por otro lado también la presencia de acilación aumenta la estabilidad ya que

estos antocianos tienen mayor resistencia a la temperatura, a la luz, y a la

decoloración por SO2, se cree que esto es debido a la conformación plegada que

adoptan sobre todo los grupos acilos de longitud grande y que les protege de la

degradación, también influye la posición del resto de azúcar y la disposición espacial

del grupo acilo con el azúcar y el aglucón (Bridle y Timberlake 1997).

Una característica muy importante de los antocianos de la uva en los géneros

Vitis vinifera y que los distingue del resto de los antocianos de otras especies

vegetales, es que tienen libre el grupo OH de la posición 5 de su estructura de

antocianidina (señalado en la Figura 17.), esto permite la formación de los pigmentos

de piranoantocianos durante la elaboración, maduración y crianza del vino. En otros

géneros con esa posición ocupada por un azúcar (diglucósidos) la estabilidad del color

y la variación de este, evoluciona mucho peor pues no se pueden dar las reacciones

de cicloadición que originan estos piranoantocianos y que nos permiten estabilizar el

color.



Figura 17. Antociano monómero.

En cuanto a su aportación al color del vino, los antocianos monómeros son unos

pigmentos de color rojo y poseen unos cromóforos muy potentes (el coeficiente de

absorción molar a 520 nm para el 3-monoglucósido de malvidina, a pH 1.5, es de

27000 g-1Lcm-1) y además incrementan su intensidad colorante al formar complejos

de copigmentación.

Junto con los antocianos monómeros, la uva también aporta al vino otros

compuestos fenólicos, en su mayoría incoloros, en lo que respecta al color del vino

tinto, pero que están implicados en los fenómenos de transferencia de color de la uva

al vino durante la vinificación, y en la posterior evolución del color del vino tinto

durante su envejecimiento



2.III.2. COLOR Y COPIGMENTACION

2.III.2.1. Descripción

La copigmentación es un fenómeno que se da típicamente en medio acuoso y

que afecta a los antocianos monómeros en su forma de catión flavilio a la vez que a

otros compuestos fenólicos, normalmente no pigmentados (los copigmentos o

cofactores de copigmentación). Desde un punto de vista molecular, este fenómeno

consiste en la formación de un complejo de copigmentación de estequiometría 1:1, en

el que un pigmento (con estructura plana) se apila con un copigmento (también

necesita tener una estructura plana para ello), estableciéndose entre los anillos

aromáticos de ambos unas débiles interacciones por puentes de hidrogeno del tipo ∏-

∏ (Figura 18.) esto hace que el antociano quede protegido de la hidratación y que se

desplace el equilibrio hacia la formación del ión flavilio.

Figura 18. Formación de un complejo de copigmentación a partir de un pigmento (antociano monómero en su forma de catión flavilio) y de un copigmento (flavonol).

ANTOCIANO

OHO

OH

OH

R

R'

O Glu

OHO

OH

OH

R

R'

O Glicosa

O

COPIGMENTO

OHO

OH

OH

R

R'

OGlicosaO

OHO

OH

OH

R

R'

O

Glu

ANTOCIANO

OHO

OH

OH

R

R'

O Glu

OHO

OH

OH

R

R'

O Glicosa

O

COPIGMENTO

OHO

OH

OH

R

R'

OGlicosaO

OHO

OH

OH

R

R'

O

Glu



Se ha visto que estos complejos reaccionan con mucha facilidad con constantes

del orden 102-103, pero que también se pueden disociar muy fácilmente cuando

diluimos un vino (simplemente a una dilución de 1/20), o cuando aumentamos la

proporción de ciertos cosolventes en el medio acuoso, como el etanol o el ácido

acético.

Las moléculas que mejor actúan como copigmentos son los flavonoles, pero en

las uvas y por tanto en los vinos se encuentran en pequeñas cantidades (Bakowska et

al., 2004). Otros copigmentos de naturaleza fenólica, son los derivados del ácido

hidroxicinámico (ácidos caféico y p-cumárico), que también están en pequeñas

cantidades en el vino, mientras que los compuestos fenólicos más abundantes de los

vinos tintos, los flavan-3-oles (monómeros como la (+)-catequina y la (-)-

epicatequina, oligómeros como las proantocianidinas tipo B, y polímeros como los

taninos), son copigmentos poco efectivos, salvo quizás la (-)-epicatequina que puede

adoptar en disolución una disposición casi plana.

Figura 19. Efectos de la copigmentación de los antocianos monómeros en un vino joven de la variedad Cencibel. El efecto hipercrómico hace que el vino muestre un 20-40% más

1.7

(b) 530 nm

(a) 526 nm

400

1.4

1.1

0.8

0.5

0.2

500 600

Wavelength (nm)

AU

1.7

(b) 530 nm

(a) 526 nm

400

1.4

1.1

0.8

0.5

0.2

500 600

Wavelength (nm)

AU

VINO DILUIDO

(SIN COPIGMENTACIÓN)

VINO SIN DILUIR

(CON COPIGMENTACIÓN)

20-40% AUMENTO (13% alc.)

530 nm

526 nm

1.7

(b) 530 nm

(a) 526 nm

400

1.4

1.1

0.8

0.5

0.2

500 600

Wavelength (nm)

AU

1.7

(b) 530 nm

(a) 526 nm

400

1.4

1.1

0.8

0.5

0.2

500 600

Wavelength (nm)

AU

VINO DILUIDO

(SIN COPIGMENTACIÓN)

VINO SIN DILUIR

(CON COPIGMENTACIÓN)



530 nm

526 nm

530 nm530 nm

526 nm526 nm



de intensidad del color rojo (medido a 520 nm), y el desplazamiento batocrómico provoca que la longitud de onda del máximo de absorción visible aumente en 4 nm.

La formación del complejo de copigmentación provoca dos efectos que

habitualmente se observan asociados al fenómeno de la copigmentación:

a) Un efecto hipercrómico, es decir, un incremento de la intensidad del color

rojo mostrado por el vino tinto con copigmentación.

b) Un efecto batocrómico, es decir, un viraje hacia tonalidades más azuladas

del color rojo del vino tinto. (Brouillard, 1982; Liao y col., 1992; Davies y Mazza,

1993; Boulton y col., 2001). (Darías-Martín et al., 2001 y 2002; Schwarz et al., 2005)

Ambos efectos se suelen manifestar simultáneamente en los vinos tintos, sobre

todo en los jóvenes, en diverso grado según la composición fenólica y las relaciones

molares de copigmento/pigmento que de forma particular se den en un vino (Figura

19.).

La variación en el tono dependerá del antociano y del copigmento implicados,

lográndose una importante variedad de colores por la asociación entre un antociano y

diferentes copigmentos.

Como copigmentos pueden actuar moléculas distintas del antociano,

generalmente otros compuestos fenólicos, pero también otros antocianos o incluso

partes de la estructura del propio antociano. Se distinguen así tres tipos de

mecanismos de copigmentación.

Copigmentación intermolecular:

Son asociaciones que tiene lugar entre dos moléculas diferentes puede ser

Homomolecular o auto-asociación, cuando se produce entre distintas

moléculas de antociano.y Heteromolecular, sí tiene lugar entre antocianos y

otros compuestos (flavonoides no antocianos, aminoácidos, ácidos orgánicos…),

es la denominada simplemente copigmentación.

Copigmentación intramolecular:



Son asociaciones que se producen entre antocianidinas y sus residuos ácidos

aromáticos.

Un caso particular sería la complejación con metales. Ésta es sólo posible para

antocianos con grupos OH libres en posición orto del anillo B, tal es el caso de

cianidina, delfinidina y petunidina. Dado que malvidina 3-glucósido, antociano

mayoritario en el vino, no puede formar esos complejos, este tipo de copigmentación

no debería jugar un papel relevante en el color de la mayoría de los vinos.

2.III.2.2. Copigmentación intermolecular

En la mayoría de los casos, el proceso de copigmentación conduce a la

estabilización de las formas coloreadas del antociano, el catión flavilio y la base

quinoidal. Mazza et al. (1989) observaron que el efecto de copigmentación es mayor

cuando aumenta el grado de metoxilación y glicosilación en el antociano. Por tanto de

todos los antocianos monómeros la malvidina presenta el mayor efecto de

copigmentación al compararlo con otros antocianos (Mazza et al., 1990; Davies et al.,

1993; Eiro et al., 2002). El grado de hidroxilación también afectaría a la

copigmentación, ya que ésta es mayor para la cianidina que para la pelargonidina

(Eiro et al., 2002).

La diferente eficacia de los copigmentos puede deberse a diversos factores

estructurales, entre los que cabe mencionar el tipo de sustituyentes presentes y la

diferencias en la configuración o estereoquímica que se requieren para tener próximos

el copigmento y el pigmento. Baranac et al. (1996, 1997) determinaron que la

constante de copigmentación es mayor con morina que con quercetina y rutina, lo que

puede deberse a la posición de los grupos OH en el anillo B, que están en posición

meta en la morina (2´ y 4´) y en posición orto en quercetina y rutina (3´ y 4´).

2.III.2.2.1. Homomolecular o Auto-asociación

Asen et al. (1972) observaron por primera vez la existencia de fenómenos de

auto-asociación entre moléculas de antocianos. En medio acuoso y pH 3,16

observaron que al aumentar de la concentración de cianidina 3,5 diglucósido 100

veces (de 10-4 a 10-2M) aumentaba la absorbancia 300 veces y el espectro de la

disolución sufría un desplazamiento de la λ máxima de 507 a 502 nm.



Con concentraciones bajas de malvidina 5*10-5 M a pH neutro, la interacción

entre moléculas de antocianos es mínima, pero con concentraciones mayores 5* 10-3

M, se produce una fuerte interacción entre formas quinoidales del antociano, que

además aumentan su estabilidad en las disoluciones más concentradas, al hacerse

más lento el proceso de hidratación. Como consecuencia, en las disoluciones se

produce un marcado efecto hipercrómico que, dependiendo del antociano implicado,

en ocasiones se acompaña de un efecto batocrómico (en el caso de las disoluciones de

cianina, por ejemplo) o bien hipsocrómico (malvidina). El fenómeno debe ser de gran

importancia en la expresión del color de las flores, donde los antocianos se encuentran

en concentraciones mayores de 10-2 M (Hoshino et al., 1981a). Hoshino et al. (1982)

estudiaron la auto-asociación mediante RMN observando que la resonancia de los

protones de los núcleos aromáticos se vuelve más alta al aumentar la concentración

del antociano en la disolución. De esta forma demuestran las interacciones verticales

entre núcleos aromáticos.

Figura 20 Estructura de auto-asociación entre dos moléculas de antociano head to head (izq.) y head to tail (dcha.).

2.III.2.3. Copigmentación intramolecular

Este proceso tiene lugar en antocianos con estructuras complejas, en los que

uno o más azúcares están esterificados con ácidos generalmente cinámicos. En la



copigmentación intramolecular no va a haber molécula de copigmento sino que, una

parte de la molécula del antociano reacciona con la estructura plana del ión flavilio,

por lo que va a depender de los sustituyentes que posea dicho antociano.

El pKh de estos antocianos aumenta al ir los sustituyentes del antociano de

pequeños a grandes, especialmente en antocianos con cadenas más largas y lineales

que permiten mayor flexibilidad de la molécula. Cuanto más grande sea el

sustituyente mayor efecto batocrómico se observa. Otra característica de estas

moléculas altamente sustituidas es que se produce un aumento en el ε (coeficiente de

extinción molar) de la forma flavilio al compararla con los correspondientes derivados

mono y diglucósidos (Figueiredo et al., 1995).

Este tipo de antocianos es el más estable. La protección de la copigmentación

intramolecular es tal que algunos de los antocianos en medios ácidos débiles no se

hidratan. En ellos las posiciones 3´y 7 se encuentran sustituidas con cadenas que

favorecen una fuerte interacción Π-Π con el cromóforo central. Se forma así una

estructura de tipo sándwich, en el que la cadena del C-3´ se encuentra plegada sobre

la cadena en posición 7, y en medio de ellos se encuentra el cromóforo. Esta

estructura permite más protección frente a la hidratación del antociano que cuando las

cadenas están en posición 3 y 5, ya que el ácido se dobla sobre el cromóforo,

protegiendo las posiciones 2 y 4 del ataque del agua (Figueiredo et al., 1999).

2.III.2.4. Factores que afectan a la copigmentación

El efecto de copigmentación está influido por el pH, la temperatura, las

concentraciones de pigmento y de copigmento, el disolvente y las estructuras

moleculares de todos los compuestos implicados.

2.III.2.4.1. La Concentración.

Existe una concentración de antocianos mínima a partir de la cual se puede

observar el efecto de la copigmentación, que es de 3,5*10-5M (Asen, 1996). Sin

embargo en los copigmentos aunque no se han encontrado unos valores mínimos de

concentración para que interaccionen con el antociano, si se observa que la interacción

aumenta cuando aumenta su concentración (Asen et al., 1972; Scheffeldt et al.,

1978). Influye también la relación que exista entre las dos concentraciones .



2.III.2.4.2. La Temperatura.

Como en otros procesos exotérmicos en la copigmentación (Dangles et al.,

1992b), sucede que al aumentar la temperatura, los complejos que se forman son

menos estables, y se dan en una menor proporción (Cai et al., 1990; Wilska-Jeska et

al., 1996), ya que este aumento de temperatura da lugar a una rotura de la red

tetraédrica del agua y por tanto el número de puentes de hidrógeno se reduce,

haciendo el fenómeno de copigmentación menos eficiente (Brouillard et al., 1994).

2.III.2.4.3. El pH.

La copigmentación se produce de forma más eficaz con la forma hemiacetal de

los antocianos por tanto el pH más adecuado para que se produzca será entre 2 y 5,

(Williams et al., 1979). Si el pH es demasiado ácido entre 1 y 2 predomina el catión

flavilio, pero la alta concentración de protones hace que no se produzca la

copigmentación tan fácilmente aunque se sigue formando (Dangles, 1992a). Esta

interacción se manifiesta como un fuerte desplazamiento batocrómico (Alluis et al.,

2000) y como un descenso de la absorbancia en la longitud de onda de máxima

absorción, debido a que el coeficiente de extinción molar (ε) del complejo copigmento-

antociano es menor que el del antociano libre (Dangles, 1992b).

2.III.2.4.4. El Disolvente.

La reacción de copigmentación necesita un medio altamente organizado para

que está se produzca de forma eficaz, el medio acuoso permite las mejores

condiciones e influye directamente por la cohesión que presenta la red tetraédrica de

moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno;

Por tanto si introducimos otros disolventes en el medio que provoquen la

ruptura parcial de esta red, la eficacia de la copigmentación disminuirá

apreciablemente (Brouillard et al., 1989; Mazza et al., 1990; Brouillard et al., 1991).

Aun así, el proceso de copigmentación sigue produciéndose en mezclas mixtas donde

el agua permanece como el componente principal del medio.



2.III.2.4.5. Las Sales y la fuerza iónica.

La presencia en el medio de distintos iones como K+, Na+, Cl- etc., compiten

con el ión flavilio por las moléculas de agua, y pueden evitar la hidratación de éste

(Dangles et al., 1992). La adición de sales iónicas (NaCl, NaBr, NaI, NaClO4) a una

disolución con antocianos, aumenta el color de ésta debido a la formación de pares

iónicos entre el catión flavilio cargado positivamente y el anión, lo que hace que el

equilibrio se desplace hacia la formación de más iones flavilio y por tanto se produce

un efecto hipercrómico proporcional a la concentración de sales añadidas (Figueiredo

et al., 1994). Este efecto se percibe cuando la concentración de sales es mayor de 1

mol*L-1.

2.III.2.4.6. La Naturaleza del copigmento.

Los copigmentos pueden ser de naturaleza diversa: flavonoides, alcaloides,

aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleótidos, polisacáridos, metales etc. En general, los

mejores copigmentos son aquellos que contienen núcleos aromáticos y poseen cierta

planaridad, para poder acercarse y apilarse con los antocianos (Dangles et al., 1992).

2.III.3. Formación de nuevos compuestos

Otras reacciones que se pueden producir durante la elaboración y crianza de los

vinos tintos y que también modifican el color son: Condensación directa entre

antocianos y flavanoles, condensación mediada por acetaldehído, Condensación F-F

mediada por Glioxilico, y la formación de Piranoantocianos.

A continuación, se describen los diferentes mecanismos de reacción y los

productos resultantes de las mismas que se han descrito en los vinos o en disoluciones

modelo.

2.III.3.1. Condensación directa entre antocianos y flavanoles

Existen dos tipos posibles de reacciones de condensación determinadas por las

características de reactividad de antocianos y flavanoles:

A) Condensación antociano-flavanol (A-F).

Se produce por un ataque de las posiciones nucleofílicas C8 o C6 de un flavanol

sobre la posición electrofílica C4 del catión flavilio de un antociano, esto da lugar

xantilio



de color amarillo inicialmente a un flaveno, que puede luego deshidratarse y oxidarse

para dar un derivado (Jurd et al., 1965; Jurd, 1967; Jurd et al., 1970; Baranowski et

al., 1983; Liao et al., 1992; Santos-Buelga et al., 1995, 1999) o un producto incoloro

de condensación bicíclica (Bishop et al., 1984).

Figura 21. Mecanismo de condensación directa antociano-flavanol (A-F) (Cheynier, 2001).

La primera evidencia de formación de un producto incoloro de tipo A-F unido

bicíclicamente fue aportada por (Bishop y Nagel (1984), quienes en disoluciones

modelo lograron detectar e identificar por RMN un dímero malvidina 3,5- diglucósido

(C2-O-C7, C4-C8)-epicatequina. La formación de un producto similar en ensayos

realizados en disoluciones modelo que contenían malvidina 3-glucósido y (epi)

catequina fue posteriormente constada por Remy-Tanneau et al. (2003), realizando su

identificación mediante HPLC-ESI/MS y procedimientos de tiolisis.



B) Condensación flavanol-antociano (F-A):

Los enlaces interflavánicos de las proantocianidinas condensadas se pueden

romper en medio ácido, dando lugar a carbocationes que actúan como electrófilos y

que pueden reaccionar con las posiciones nucleofílicas C6 o C8 de la forma carbinol de

un antociano (figura 22).

Estos carbocationes también pueden reaccionar con otros flavanoles, generando

nuevas moléculas de proantocianidinas, que pueden conducir a un aumento del grado

medio de polimerización (Vidal et al., 2002).

Los compuestos de condensación F-A muestran un espectro de absorción

característico de antocianos, con λ máxima en la región del visible desplazada

batocrómicamente con respecto a los antocianos originales (Fossen et al., 2004;

González-Paramás et al., 2006).

Figura 22. Mecanismo de condensacion directa flavanol-antociano (F-A) (Cheynier,

2001).



La reacción de condensación no afecta a las posiciones C2 o C4 del antociano

por lo que los nuevos pigmentos F-A no están más protegidos frente al ataque del

agua que la forma monomérica del antociano (Salas et al., 2004).

El pH parece jugar un papel destacado en la formación de uno u otro tipo de

condensados. Salas et al. (2003) en soluciones modelo de pH 2,0 y 3,8 estudiaron la

reacción entre procianidina B2-3´´Ο-galato (Epicatequina-(4-8)-epicatequina-3´´Ο-

galato) y malvidina 3-glucósido. A pH 2,0 observaron que se producía la ruptura

interflavánica de la procianidina y la adición nucleofílica del flavanol o del antociano al

carbocatión liberado, formándose derivados de tipo (Ec)n-EcG (condensación FF) y

(Ec)n-malvidina 3-glucósido (condensación F-A). A pH 3,8, sin embargo, se producía la

adición nucleofílica de la procianidina al antociano generando el compuesto malvidina

3-glucósido–(Ec-EcG) (condensación A-F). La presencia de condensados de los tipos

anteriores ha sido puesta de manifiesto tanto en sistemas modelo como en vinos,

mediante tiolisis y espectrometría de masas (Remy et al., 2000; Salas et al., 2004;

Alcalde-Eon et al., 2004, 2006). En general, los productos tanto de tipo A-F como F-A

parecen estar más asociados a estructuras oligoméricas que a poliméricas (Remy et

al., 2000), aunque (Hayasaka y Kennedy (2003) detectaron masas moleculares de

polímeros de ambos tipos hasta un nivel de octámeros.

Recientemente este tipo de pigmentos ha sido encontrado en algunas frutas y

verduras, como fresas (Fossen et al., 2004), grosella (McDougall et al., 2005), maíz

morado, judías y uvas (González-Paramas et al., 2006), sugiriendo por tanto, que no

son sólo productos formados durante la vinificación y el envejecimiento, sino que

podrían encontrarse en las plantas de forma natural.

2.III.3.2. Condensación mediada por acetaldehído

El acetaldehído puede estar presente en el vino debido al metabolismo de las

levaduras durante la fermentación alcohólica (Romano et al., 1994) y/o a la oxidación

del etanol generalmente acoplada a reacciones de oxido-reducción de polifenoles

(Wildenradt et al., 1974).



El acetaldehído en forma de carbocatión reacciona con el flavanol en la posición

C6 o C8. Este producto flavanolacetaldehído pierde una molécula de agua y da lugar a

un nuevo carbocatión que puede atacar a otro flavanol o a un antociano en posición

C8 (figura 23). La condensación entre flavanoles puede ser a través de los carbonos

C6 y C8 y se obtienen 4 productos principales, C6-C8 (R y S), C6-C6, y C8-C8

(Fulcrand et al., 1996b; Saucier et al., 1997; Es-Safi et al., 1999ª). Los antocianos

sólo parecen estar ligados a este tipo de estructuras a través de su C8 (Es-Safi et al.,

1999b). En el caso de la reacción entre flavanoles se producen condensados incoloros

(Fulcrand et al., 1996b; Cheynier et al., 1997ª; Saucier et al., 1997ª, b, c; Es-Safi et

al., 1999ª, b), mientras que en la reacción con antocianos se forman pigmentos con

espectros de absorción cuya λmax en el visible se encuentra desplazada

batocrómicamente con relación a la de los antocianos originales, lo que les confiere un

tono más violáceo.

Esta tonalidad, puede ser debida a una mayor tendencia del núcleo antocianidina

a estabilizarse por desprotonación hacia la formación de la base quinoidal (Timberlake

et al., 1976).

Estos nuevos pigmentos resultan más estables al efecto del pH y a la

decoloración por SO2 que los antocianos libres, pero no son muy estables en

soluciones acuosas, produciéndose la ruptura del puente etilo entre la antocianina y el

flavanol, lo que da lugar a reorganizaciones estructurales de los compuestos

(Escribano-Bailón et al., 2001).

En disoluciones modelo de malvidina 3-monoglucósido y catequina en presencia

de acetaldehído se encontró que en la reacción se formaban dos pigmentos

mayoritarios (Roggero et al., 1987) de m/z[M]+ 809 (Bakker et al., 1993), que se

propuso que correspondían a dos enantiómeros por la existencia del carbono

asimétrico en el grupo etilo (Rivas-Gonzalo et al. 1995).



Figura 23. Mecanismo de las reacciones flavanol-antociano y flavanol-flavanol inducidas por el acetaldehído (Cheynier, 2001).

Los dímeros A-etil-F han sido detectados en vinos mediante ESI-MS. Se han

detectado señales de masas correspondientes a los dímeros etil-(epi) catequina de los

glucósidos y glucósidos acilados de malvidina, delfinidina, cianidina, peonidina,

petunidina. (Cheynier et al., 1997; Revilla et al., 1999; Vivar. Quintana, 1999, 2002;



Dante et al., 2002; Atanasova et al. 2002; Mateus et al., 2002; Alcalde-Eon et al.,

2006; Wang et al., 2003). También se ha descrito en el vino señales de dímeros y

trímeros del tipo flavanol-etil-flavanol (Cheynier et al., 1997ª; Saucier et al., 1997c).

Los compuestos dímeros pueden dar lugar a nuevos pigmentos más

polimerizados, por la incorporación de nuevas unidades que pueden llegar a precipitar

(Bakker et al., 1993; García Viguera et al., 1994; Escribano-Bailón et al., 1996; Es

Safi et al., 1999b). Los pigmentos polímeros pueden estar constituidos por varias

unidades de flavanol, pero no pueden estar constituidos por más de dos unidades de

antociano. Esto es debido a que sólo se produce la reacción en la posición C8 de los

antociano, por lo tanto, este proceso se detiene cuando los dos extremos de la cadena

se encuentran ocupados por una unidad de antociano (Es-Safi et al., 1999b).

Sin embargo, Atanasova et al. (2002b) demostraron que la reacción de

condensación por mediación de acetaldehído se puede dar implicando exclusivamente

antocianos, dando lugar a la formación de dímeros, trímeros y tetrámeros unidos por

puentes de etilo en sus formas flavilio, pseudobase carbinol y quinoidal, lo que sugiere

que no sólo la posición C8 del antociano es reactiva.

La velocidad de esta reacción es mayor en presencia de oxígeno y a pH ácido,

debido a que se favorece la formación del acetaldehído a partir del etanol y de su

catión respectivamente (García- Viguera et al., 1994; Rivas- Gonzalo et al., 1995; Es-

Safi et al., 1999ª; Atanasova et al., 2002ª). A temperaturas bajas (15ºC) los

polímeros se acumulan más lentamente que a temperaturas mas altas (32ºC), pero

son más estables en relación a su degradación y precipitación (Baranowski et al.,

1993; Rivas-Gonzalo et al., 1995).

En presencia de malvidina 3 monoglucósido, acetaldehído y diferentes

flavanoles, la velocidad de reacción de estos es mayor para la procianidina C1<

procianidina B1< procianidina B2< procianidina B2-3´´O-galato< procianidina B3<

epicatequina< catequina (Dallas et al., 1996; Es-Safi et al., 1996).



2.III.3.3. Reacciones mediadas por otros aldehídos

Otros aldehídos, como el isovaleraldehído, benzaldehído, propionaldehído,

isobutiraldehído, formaldehído o 2-metilbutiraldehído pueden dar lugar a pigmentos de

tipo antociano-alquil/aril-flavanol y a dímeros incoloros de tipo flavanolalquil/ aril-

flavanol. El espectro visible de los pigmentos muestra una λmax desplazada

batocrómicamente respecto a los antocianos originales, por lo que producen tonos

azulados (Pisarra et al., 2003). Estos aldehídos pueden provenir de la adición de

aguardiente vínico al mosto con el fin de parar la fermentación, este aguardiente

vínico, normalmente utilizado en sector vinícola de los vinos de Oporto, tiene

contenidos altos de estos aldehídos (30-150gm/L).

Estos compuestos parecen ser inestables en los vinos y sólo se han encontrado

trazas de ellos por HPLC-MS.

Sin embargo, podrían actuar de intermediarios en la formación de pigmentos

más estables como los aductos antociano-vinilflavanol (Pisarra et al., 2004, 2005).

Más recientemente Sousa et al (2007) detectaron en disoluciones modelo un nuevo

pigmento resultante de la reacción entre la malvidina 3-monoglucósido y catequina en

presencia de vainillinaldehído (principal aldehído presente en la madera de roble), que

fue caracterizado por RMN y HPLC-MS. Este pigmento presenta una λmax de absorción

en la región del visible a 549 nm, proporcionando un color violáceo, y posee una

mayor resistencia a la hidratación y al efecto decolorante del bisulfito en comparación

con el antociano de origen.

El mecanismo de formación de todos estos pigmentos es similar al de los de

condensación mediada por acetaldehído.

2.III.3.4. Condensación flavanol-flavanol mediada por ácido glioxílico

En disoluciones de vino sintético en las que se inducía mediante la incorporación

de hierro la oxidación de la catequina, Fulcrand et al. (1997) identificaron un dímero

incoloro resultante de la condensación entre unidades de catequina a través de un

puente carboximetilo, derivado del ácido glioxílico formado, a su vez, por la oxidación

del ácido tartárico. De acuerdo con estos autores, este compuesto actuaría como



intermediario hacia la posterior formación de pigmentos de tonalidad amarillenta

(λmax 410-460 nm) que habían sido detectados en disoluciones de xanteno en

sistemas modelo de vino (Santos-Buelga et al., 1995).

Para este tipo de pigmentos se habían propuesto estructuras de tipo lactona

formadas tras la pérdida de una molécula de agua del dímero carboxi metilo (Francia-

Aricha et al, 1998). Sin embargo, la caracterización estructural de uno de estos

pigmentos (NJ2) llevada a cabo por Es-Safi et al. (1999) puso de manifiesto que se

trata de sustancias con estructura de tipo xantilio (figura 24.), cuyo mecanismo de

formación pasa por la deshidratación de los compuestos incoloros catequina-

carboximetil-catequina para dar lugar a un compuesto tipo xanteno, que

posteriormente se oxidaría al xantilio.

Figura 24. Reacciones de los flavanoles con el ácido glioxílico (Es-Safi et al., 1999,

Cheynier 2001)

Además del pigmento NJ2, Es-Safi et al. (1999c, 2000) encontraron también la

formación en disoluciones hidroalcohólicas de su ésteres etílico y metílico (NJ3 y NJ3´

respectivamente); con λmax de 460nm, la esterificación de estos compuestos ocurre

en el dímero incoloro antes de la formación del cromóforo xantilio. Estas sales de

xantilio pueden verse involucradas en procesos de polimerización, habiéndose descrito

trímeros de las mismas con posible estructura quinoidal y λmax de ≈ 560 nm (Es-Safi

et al., 2000, 2003).



En disoluciones modelo con catequina, malvidina 3-monoglucósido y ácido

glioxílico, además de los dímeros incoloros catequina- carboximetil-catequina, se han

detectado dímeros coloreados formados por unidades flavanol y el antociano unidos

por un puente carboximetilo (Es-Safi et al., 2003). Sin embargo, en sistemas modelos

que contienen ácido tartárico y etanol, pero no ácido glioxílico añadido, sólo se

detectan los compuestos incoloros de condensación de flavanoles a través de puentes

carboximetilo y los correspondientes pigmentos amarillos derivados (Santos-Buelga et

al., 1999).

Tanto los aductos carboximetilo incoloros, como los derivados de tipo Xanteño y

las correspondientes sales xantilio se han detectado en fracciones de vino tinto por

HPLC/ESI-MS (Es-Safi et al., 2000b, c, 2003).

3.III.4. Piranoantocianos

Tradicionalmente se pensaba que los cambio de color que ocurría en los vinos

durante su elaboración y envejecimiento eran debidos principalmente a la formación

de pigmentos derivados de antocianos, con un carácter oligomérico y polimérico, al

reaccionar con los taninos del vino, pero a partir de 1996, Cameira-dos-Santos et al.

(1996) descubren unas nuevas sustancias que habían quedado retenidas en las

membranas para filtrar vinos tintos consiguen aislarlas y más tarde Fulcrand et al.

(1996) elucidan su estructura, como el resultado de una cicloadición de un resto de4-

vinilfenol sobre las posiciones C4 y OH en C5 de los antocianos, principalmente

malvidina-3-glucósido. Al formarse un nuevo anillo de pirano sobre la estructura del

antociano a estos nuevos compuestos se les denomino piranoantocianos.

Este tipo de pigmentos derivados de antocianos se caracterizan por poseer un

anillo pirano adicional en la estructura del antociano y un espectro de absorción en la

región del visible con su máximo desplazado hipsocrómicamente respecto de los

antocianos monómeros de los que provienen.

Apartado IV

“PIRANOANTOCIANOS”

Antecedentes: Piranoantocianos.


2. IV . LOS PIRANOANTOCIANOS Y EL COLOR DEL VINO.

2.IV.1. DEFINICIÓN

Se denominan así a un grupo nuevo de pigmentos que poseen en su estructura

molecular una nueva molécula de pirano formada por cicloadición entre el carbono 4 y

el hidroxilo del carbono 5, fue descubierta en 1996, Cameira-dos-Santos et al. (1996)

al analizar una serie de sustancias que habian quedado retenidas al filtrar unos vinos

tintos envejecidos, esa estructura con un nuevo anillo de pirano es la que da lugar al

nombre “piranoantocianos”. Al estudiarlas se descubre que las moléculas capaces de

reaccionar con los antocianos para dar lugar a estos nuevos pigmentos, deben tener

un doble enlace que les permita formar esa cicloadición.

Después de esto empiezan a descubrirse muchos otros pigmentos derivados de

los antocianos y con un nuevo anillo piránico que se pueden agrupar según el tipo de

molécula que produce la cicloadición en:

2.IV.2. TIPOS DE PIRANOANTOCIANOS

-piranoanticianos tipo vitisina

-Fenil-piranoantocianos

-vinilflavanol- piranoantocianos

-vinil-piranoantocianos

2.IV.2.1. PIRANOANTICIANOS TIPO VITISINA

La primera estructura de estos piranoantocianos que se identificó procedía de la

reacción del 3-monoglucósido de malvidina con el ácido pirúvico (un metabolito

secundario de las levaduras), a través de la forma enólica de este último (el enol es el

doble enlace polarizado) y luego descarboxilación, este compuesto fue descrito por

primera vez por Bakker y Timberlake (1997), y fue denominado Vitisina A.

Más tarde Fulcrand et al. (1998) proponen una nueva estructura que difiere

algo de la propuesta de Bakker et al. (1997) ya que posee un núcleo de malvidina



pero lleva unido al nuevo anillo de pirano un grupo carboxilo. Esta es la razón por la

cual a este tipo de pigmentos se les llama 5 carboxipiranoantocianos.

Figura 25. Mecanismo propuesto para la reacción entre el ácido pirúvico y la malvidina 3-glucósido (Fulcrand et al., 1998 a)

Luego fue aislado este tipo de compuestos y se caracterizo completamente su

estructura por un grupo francés compuesto por (Fulcrand, Benabdeljalil, Rigaud,

Cheynier & Moutounet, 1998 ; Benabdeljalil, Cheynier, Fulcrand, Hakiki, Mosaddak

&Moutounet, 2000). Y varios autores han confirmado la última estructura de la vitisina

A realizada por Fulcrand et al. (1998). mediante experimentos de RMN (Mateus,

Silva, Vercauteren, y De Freitas, 2001); (Schwarz, Quast, et al., 2003). En 2011 se

amplian los estudios de estos compuestos con RMN y espectrocopía UV-vis (2011

Oliveira, J.; Petrov, V.; Parola, A. J.; Pina, F.; Azevedo, J.; Teixeira, N.; Brás, N. F.;

Fernandes, P. A.; Mateus, N.; Ramos, F. J.; de Freitas).

Otro compuesto con características similares fue descubierto por (Bakker y

Timberlake 1997) que aislaron el producto de la reacción de la malvidina 3-glucósido y

el acetaldehído, y fue denominado vitisina B, y se obtuvo de vinos de Oporto. Este

pigmento tiene únicamente un hidrogeno como sustituyente del nuevo anillo de pirano

y por tanto presenta la estructura más simple de los piranoantocianos.



Figura 26. Reacción entre la malvidina 3-glucósido y el acetaldehído para dar la Vitisina B.

(Morata, Gómez-Cordovés, Colomo, & Suárez, 2003) estudian la formación de

piranoantocianos con los metabolitos procedentes de la fermentación de las levaduras,

como pueden ser el Pirúvico o el acetaldehído, que da lugar a la Vitisina B, todos

estos compuestos se forman por un mecanismo de adición que se puede generalizar a

todos los compuestos que presenten tautomería ceto-enólica (doble enlace

conjugado), y que muchos de ellos se forman durante la fermentación alcohólica.

Uno de los ejemplos de compuestos que presenta está tautomería es el

acetaldehído, que en los vinos es producido y liberado por las levaduras durante la

etapa fermentativa (Fleet y Heard, 1992, Liu y Pilone, 2000). En algunos tintos

fortificados, tales como vinos de Oporto, el acetaldehído también es incorporado a

través de destilados (que pueden contener grandes cantidades de acetaldehído y otros

aldehídos) (Bakker, 1986). La Vitisina B es por tanto detectada en mayor cantidad en

los vinos fortificados que en cualquier otros (Bakker et al., 1997).

Más adelante se hace estudios sobre (Morata a, M.C. Gómez-Cordovés b, F.

Calderón a, J.A. Suárez a 2006) la producción de ac. Pirúvico y acetaldehído por parte

de distintas levaduras y la importancia que tiene la concentración de estas en el vino

para la formación de vitisin A y B.

En 2007(Morata, Calderón et al 2007) realizaron nuevos estudios sobre la

formación de vitinas Ay B por adicion de ac. Pirúvico y acetaldehído y describieron su

comportamiento si se adicionaba en una sola dosis, en dosis sucesivas y si se producia

sinergia entre la dos reacciones; se vió que la adición de estas moléculas



incrementaba mucho la formación de vitisinas pero había que tener especial cuidado

con la adición de acetaldehído ya que podía hacer que disminuyese la presencia de

antocianos por la formación de compuestos de polimerización.

Más adelante (Joana Oliveira, Victor de Freitas, Nuno Mateus 2009) descubren

una nueva via de síntesis de vitisina B con el vinil-oxitrimetil-silano con un

rendimiento del 30 %.

Figura 27. propuesta de formación de vitisin B a partir del viniloxitrimetilsilano.

En estas reacciones la parte electrodonadora del doble enlace ataca a la

posición 4 del catión flavilio y este añillo se cierra por el ataque del OH del carbono 5

del catión flavilio sobre la parte electroaceptora del doble enlace, con una posterior

perdida de una molécula de agua y otra de CO2, el resultado final es la formación de

una nueva molécula con un nuevo anillo de piranosa.



En el año 2000 se descubre que este mecanismo también ocurre con otras

moléculas presentes en el vino pero que no proceden de la actividad de las levaduras

como puede ser acido α-cetoglutárico, acetona, diacetil etc. (Fulcrand et al., 1998;

Schwarz, Wabnitz, et al., 2003). Y (Benabdeljalil et al. (2000), Lu, Sun, and Foo

(2000) y describen un nuevo tipo de piranoantocianos que poseen un grupo metilo

añadido al anillo de pirano.

Más tarde (He, Santos-Buelga, Silva, Mateus, y De Freitas (2006) sintetizan y

describen la formación de estos piranoantocianos como la reacción entre el acido

acetoacético y la malvidin-3-glucosa y miden su máximo de absorción en 478nm.

Figura 28. Mecanismo de formación del metil piranoantociano a partir del ácido

acetoacético.

La característica común a todos estos compuestos es que resultan de la

reacción entre antocianos y pequeñas moléculas con un doble enlace polarizado ,

tienen el espectro desplazado hipsocromicamente con respecto al antociano de

referencia, ≈18-20nm, los de tipo vitisina A y entre 36 y 39 nm la vitisina B, lo que se

corresponde con compuestos más anaranjados, también presentan un hombro a 352-

370 nm característico de las antocianinas sustituidas en posición C4, y esto es lo que

le confiere una mayor resistencia a la hidratación y al ataque del SO2 y, por tanto

mayor estabilidad frente a los cambios de pH y una mayor intensidad de color en



comparación con los antocianos 3 glucósidos (Bakker et al., 1997). (Oliveira, Mateus

et al 2006)

Este tipo de compuestos no se han encontrado solo en vinos sino en zumos y

extractos de verduras y distintas frutas (Mónica Jordheim, Torgils Fossen, and øyvind

M. Andersen, 2006) (Michael Rentzsch, Peter Quast, Silke Hillebrand, Jutta Mehnert,

Peter Winterhalter, 2004)

2.IV.2.2. VINILFENOL-PIRANOANTOCIANOS

Paralelamente al descubrimiento de la Vitisina A en 1996, se detectan una nueva

clase de pigmentos (Cameira dos Santos et al. 1996). Y Un análisis más detallado

revela que estos nuevos pigmentos son los p-glucósidos y p-cumaroilglucósidos de

una aglicona desconocida con una masa molecular de m / z 447,5. La elucidación de la

estructura final de estos pigmentos de color rojo en el vino (Fulcrand et al., 1996)

mediante RMN presentaba una estructura que poseía un anillo adicional de pirano

entre C-4 y el grupo hidroxilo en C-5 de una molécula de malvidina, y que llevaba una

fracción de fenol, por eso se denominaron vinilfenolpiranoantocianos.

(Fulcrand, Benabdeljalil, Rigaud, Cheynier & Moutounet, 1998); (Benabdeljalil,

Cheynier, Fulcrand, Hakiki, Mosaddak & Moutounet, 2000) aislaron estos compuestos

y postularon la formación del 4 vinil fenol por vía de la descarboxilación del acido

cumárico que procedía de la actividad enzimática de la levadura. (Chatonnet,

Dubourdieu, Boidron, & Lavigne, 1993);(En 1981 Etievant et al), demostraron que

solo los ácidos cumárico y ferúlico se ven afectados por la actividad cinamato

descarboxilasa de las levaduras pero no así los ácidos caféico y sinápico, que también

daban lugar a reacciones de este tipo.



Figura 29. Formación de vinilfenoles a partir de ácidos hidroxicinámicos.

Mas tarde (Schwarz, Jerz & Winterhalter, 2003) aíslan el 4 vinylcatechol al que

se denomina Pinotin A y demuestran que estos piranoantocianos que tienen un

hidroxifenil sustituyente, no provienen solo de la descarboxilación enzimática de los

ácidos hidroxicinámicos, sino que pueden reaccionar directamente con esos mismos

ácidos. Estudiando esta reacción ven que se produce de forma muy rápida y se

completa en pocas horas. Otra curiosidad por parte de este compuesto es el

incremento de Pinotin A durante el almacenamiento de los vinos incrementándose su

contenido 10 veces más que en los vinos jóvenes, entre el 5 y 6 año de

almacenamiento (Lu, Foo, and Sun 2002) Y también descubren que solo los ácidos

cinámicos con sustituyentes donadores de electrones en el anillo aromático pueden

intervenir en este tipo de reacciones (p-cumárico, ferúlico, caféico y sinápico) ya que

sus grupos donadores estabilizan al ión carbenio formado.

Después de haberlos estudiado en disoluciones modelo estos compuestos se

logran sintetizadar en 2003 (Ha°kansson, A. E.; Pardon, K.; Hayasaka, Y.; de Sa, M.;

Herderich, M. Tetrahedron Lett. 2003)



Figura 30. Mecanismo de formación del Pinotin A.

En cuanto a la velocidad de reacción de los ácidos cinámicos frente a la

malvidina 3-monoglucósido es la siguiente: ácido caféico > ácido ferúlico ≈ ácido

sinápico > ácido p-cumárico. Se ha demostrado que la cinamato descarboxilasa no es

capaz de descarboxilar otros ácidos fenólicos distinto al p-cumárico y ferúlico

(Chatonnet et al., 1993), por lo que los piranoantocianos que contienen restos de

catecol y siringol se formarían siempre por el mecanismo propuesto por Schwarz et al.

(2003) haciendo intervenir directamente a los ácidos caféico y sinápico.



Esta nueva vía de formación de piranoantocianos, por reacción directa con los

ácidos hidroxicinámicos explicaría su presencia durante el almacenamiento de zumos

de fruta. (Hillebrand, Schwarz & Winterhalter, 2004); (Schwarz, Wray & Winterhalter,

2004).

Más recientemente se ha comprobado que, en vinos tintos de la variedad

Garnacha, la formación de piranoantocianos derivados de los ácidos hidroxicinámicos

ocurre en dos etapas (Rentzsch y col., 2007 y 2008): durante la fermentación

alcohólica se forman pequeñas cantidades de los piranoantocianos derivados de los

ácidos p-cumárico y ferúlico, por vía enzimática que implicaría la hidrólisis de los

precursores (ácidos cutárico y fertárico, respectivamente) y la posterior

descarboxilación que originaría los muy reactivos 4-vinilfenoles; en una segunda fase,

tras la fermentación maloláctica y algunos meses de envejecimiento, se observa la

hidrólisis de los precursores de los ácidos cafeico, p-cumárico y ferúlico (ácidos

caftárico, cutárico y fertárico, respectivamente) y la reacción directa de éstos con los

antocianos. Por tanto la capacidad de cada cepa de levadura para producir mayor o

menor hidrólisis sería muy importante (Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J. A.

(2007).

El origen de los fenoles volátiles implica la acción secuencial de dos enzimas

sobre un ácido hidroxicinámico (p-cumárico, cafeico, o ácido ferúlico). En general se

supone que, primero,actua la hidroxicinamato descarboxila descarboxilando a estos

ácidos hidroxicinámicos y transformandolos en sus derivados de vinilo y, a

continuación, por una reductasa se reducen a derivados de etilo Por encima de ciertos

niveles, estos compuestos afectan negativamente a la calidad del vino, impartiendo

olores extraños a animal, cuero y sudor de "caballo".

(Blanca de las Rivas, Hector Rodriguez, Jose Antonio Curiel, Jose Maria Landete, and

Rosario Munoz J. Agric. Food Chem., 2009)

Todos estos compuestos presentan un desplazamiento hipsocrómico hacia

colores rojo anaranjados y una mayor estabilidad frente a la decoloración por So2 , y a

la hidratación que los antocianos monómeros de los que provienen (Sarni-Manchado et

al.).



2.IV.2.3. VINILFLAVANOL PIRANOANTOCIANOS

En 1997 otro equipo de investigadores (Francia-Aricha et al., 1997), descubren

en soluciones modelo, un nuevo tipo de pigmentos de la familia de los

piranoantocianos formados a partir de la Malvidina 3 glucósido con flavanoles,

vinilcatequina, vinilepicatequina y vinil procianidinas B2, a los que se denomina

Vinilflavanol-piranoantocianos.

Estos piranoantocianos se producen por la reacción entre el antociano

monómero con una molécula de vinil-flavanol, que puede provenir de la ruptura de

oligómeros de flavanol unidos por puentes de etilo, o por la deshidratación del aducto

inicial flavanol-etanol formado tras la reacción entre un flavanol y el acetaldehído,

(Mateus et al., 2002b). Estos procesos están muy influidos por el pH, y se ven

favorecidos cuando el pH no es excesivamente ácido, en el caso de pH más ácidos se

favorecería la formación de un catión etil-flavanol y de los pigmentos derivados

antociano-etil-flavanol (Rivas-Gonzalo et al., 1995). Tampoco puede descartarse que

los mismos deriven de una reorganización estructural de este último tipo de pigmentos

(antociano-etil-flavanol), tras la constatada fácil ruptura de su puente etilo (Escribano-

Bailón et al., 2001).



Figura 31. Formación de vinilflavanol-piranoantocianos.

Más tarde (Baker & Timberlake, 1997); (Cameira dos Santos, Brillouet,

Cheynier, & Moutounet, 1996) y (Francia-Aricha, Guerra, Rivas-Gonzalo, & Santos-

Buelga, 1997) ; (Fulcrand, Cameira dos Santos, Sarni-Manchado, Cheynier, & Favre

Bonvin, 1996), (Mateus, Silva, Santos-Buelga, Rivas-Gonzalo, Y De Freitas (2002) Y (

Mateus, Carvalho, et al. (2003). Elucidan la estructura de estos compuestos y

determinan su máximo de absorción entre 490 y 511 nm, demostrando que los

vinilflavanol piranoantocianos tienen también un desplazamiento hacia longitudes de

onda más bajas que los antocianos monómeros de los que proceden y por tanto dan

coloraciones rojo-anaranjadas en el vino.

Y en 2007 (Michael Rentzscha, Michael Schwarzb and Peter Winterhalter,2007)

consiguen sintetizar estos pigmentos a partir de la Malvidina 3 glucósido, haciéndola

reaccionar con vinilcatequina, vinilepicatequina y vinil procianidinas B2.



Ya en 2010(Jingren He, Alexandre R.F. Carvalho, Nuno Mateus, y Victor De

Freitas 2010) estudian la estabilidad producida en el color y los diferentes tipos de

espectros de flavanol-piranoantocianos, comparándolos con los antocianos

monómeros de los que proceden. En 2010 se estudiaron los equilibrios en la formación

de distintos flavanol-piranoantocianos (2010 Cruz, L.; Petrov, V.; Teixeira, N.; Mateus,

N.; Pina, F.; de Freitas).

2.IV.2.4. PORTISINAS

En la zona de Oporto en Portugal, en la desembocadura del rio Duero un grupo

de investigadores descubren en 1997 otro tipo distinto de piranoantocianos (Francia-

Aricha et al., 1997), que presentan una diferencia de color muy acusada respecto a los

demás piranoantocianos, ya que presentan un color azulado en condiciones acidas

(frente al rojo tracidional de los demás piranoantocianos). Al ser observados por

primera vez en vino de oporto envejecido, son llamados Portisinas.

Figura 32. Reacción entre la vitisina A y los ácidos hidroxicinámicos.

Los vinos de Oporto se elaboran deteniendo la fermentación mediante una

fortificación con aguardiente vínico, cuando la concentración de azucares es

aproximadamente el 50% de la inicial y se obtienen unos vinos con una graduación



alcohólica de 19º aproximadamente. Si analizamos estos vinos vemos que los

pigmentos predominantes y casi únicos son vitisinas, acetil-vitisinas , cumaroil-

vitisinas y además otros pigmentos derivados de estas, resultado de la unión de la

vitisina A con restos de vinil-flavanol (Romero et al 2000). o vinil-fenol

(Joana Oliveira, Victor De Freitas, Artur m. s. Silva, and Nuno Mateus,2007)

observan que las propiedades espectroscópicas de las portisinas son diferentes a los

demás piranoantocianos, el desplazamiento del máximo de absorción es hacia

longitudes de onda mayores 580 nm en el caso de la reacción con el vinil flavanol y

535 nm cuando la reacción se produce con vinil-fenol, lo que le da unos tonos

azulados característicos, y además mientras que los antocianos son constantemente

degradados durante el envejecimiento la concentración de estos piranoantocianos se

incrementa con la elaboración y el almacenamiento (Mateus, Oliveira, Haettich-Motta,

& De Freitas, 2004) ; (Mateus, Oliveira, Santos-Buelga, Silva, & De Freitas, 2004);

(Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga, & De Freitas, 2003); (Oliveira, Santos-

Buelga, Silva, De Freitas, & Mateus, 2006). (Romero & Bakker, 2000a); (Schwarz,

Hofmann, & Winterhalter, 2004); (Schwarz, Quast, von Baer, & Winterhalter, 2003).

Figura 33. Mecanismo propuesto para la formación de Portisina (Mateus et al 2003).

(Mateus, Silva, et al., 2003). Observan que la גmax es de 580 nm debido a la

alta densidad de electrones ∏ que les da una gran estabilidad. Más recientemente

(Mateus et al. (2006) aíslan estos compuestos en un vino tinto obteniendo el pigmento

derivado de la reacción de la vitisina A con vinilfenol, este grupo ilustra la gran



variedad de reacciones posibles entre los piranoantocianos y algunos otros derivados y

se espera que en un futuro próximo se descubran muchos de estos pigmentos.

En 2010 (Alexandre R. F. Carvalho, Joana Oliveira, Victor de Freitas, Nuno MateuS,y

Andre´ Melo.) estudian los cambios de color producidos por estos pigmentos cuando

pasan de estado liquido a sólido al ser congelados y atribuyen estos cambios a las

diferencias que sufren en las propiedades electrónicas y vibracionales por la

congelación.

2.IV.3. NUEVAS MOLÉCULAS.

El enfoque futuro de las investigaciones probablemente irá por la investigación

de nuevas moléculas, (Mateus et al. (2006) con la investigación sobre distintos tipos

de portisinas en vino tinto dada la gran variedad de reacciones posibles y por la

aplicación de estas al uso de estas sustancias como colorantes estables de alimentos.

Recientemente se han descubierto también una nueva clase de dímeros de

piranoantocianos que presentan un color turquesa y que se han formado a partir de la

reacción de un carboxipiranoantociano y un metilpiranoantociano (oxovitisinas), por

oxidación directa entre los dos, esto abre un campo para el estudio de nuevas

moléculas relacionadas con el color del vino. (Jingren He, Joana Oliveira, Artur

MS.Silva § Nuno Mateus And Victor de Freitas 2010) (Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva,

A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de Freitas, V.2010).



Figura 34. Mecanismo propuesto para la formación de piranoantocianos oxidados (Oxovitisinas) Jingren He, Joana Oliveira, Artur M. S. Silva, Nuno Mateus,

and Victor De Freitas 2010.

2.IV.4. PROPIEDADES DE LOS PIRANOANTOCIANOS

Con respecto al color de los piranoantocianos, este varía desde el rojo

anaranjado al azulado, dependiendo de su estructura, en compuestos tipo

hidroxifenilpiranoantocianos, vitisinas y vinilflavanol piranoantocianos, el máximo de

absorción disminuye (efecto hipsocrómico) y resultan tonos más anaranjados que el

antociano monómero del que provienen Oliveira, Mateus et al 2006. En el caso de las

portisinas las propiedades espectrocópicas son diferentes (Mateus, Oliveira, Haettich-

Motta, y De Freitas, 2004); (Mateus, Oliveira, Santos Buelga, Silva, y De Freitas,

2004) ; (Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos Buelga, y De Freitas, 2003); (Oliveira,

Santos Buelga, Silva, De Freitas, y Mateus, 2006), Ya que poseen efecto batocrómico

es decir que el máximo de absorción se ha desplazado a la derecha y genera colores

azulados en el vino envejecido.

Otra diferencia notable frente a los antocianos de los que provienen, es que

estos disminuyen su concentración durante el procesamiento y almacenamiento (por

su reactividad y por su degradación), mientras que los piranoantocianos aumentan su



concentración (Romero y Bakker, 2000a; Schwarz, Hofmann, y Winterhalter, 2004);

(Schwarz, Quast, von Baer, y Winterhalter, 2003).

Las investigaciones recientes sobre la contribución de los piranoantocianos al

color de los vinos tintos demuestran que existe una correlación entre la formación de

piranoantocianos y la degradación de las antocianinas con el cambio de color (Alcalde-

Eon, Escribano-Bailo'n, Santos Buelga, y Gonzalo Rivas, 2006); (García-Puente Rivas

et al, 2006; Gómez-Mıguez et al, 2006);(Medina, Boido, Dellacassa, y Carrau,

2005).sin embargo no hay que olvidar que a la vez que se degradan los antocianos y

se forman los piranoantocianos también se crean pigmentos poliméricos de echo en un

grado mucho mayor.

Los piranoantocianos también son distintos a los antocianos monómeros de los

que derivan en cuanto a su comportamiento frente al bisulfito y al pH , ya que no son

decolorables por el bisulfito y son bastante estables ante variaciones de pH. Esto es

porque tienen bloqueada la posición C-4 (zona muy reactiva) del anillo de pirano

flavonoideo. A esta posición es a la que se unen el ión bisulfito o el ión hidroxilo

(hidratación) cuando reaccionan con los antocianos monómeros. (Anders E.

Ha°kansson,a,b Kevin Pardon,a,c Yoji Hayasaka,a,c Maria de Saa,c and Markus

Herderich 2003) sintetizaron mediante la adición nucleófila de vinilfenoles a malvidina

3-glucósido.una serie de piranoantocianos yse caracterizaron por medio de

espectroscopia UV-vis las propiedades de color de los pigmentos, pudiendose

demostrar que los piranoantocianos conservan su color rojo a pH 3,6 y que fueron

resistentes al “blanqueo” por bisulfito.

Mientras que en las antocianinas se pierde casi el 80% de su intensidad de color

con el aumento de pH de 1 a 5 y dan como resultado la formación de la base incolora

carbinol (Mazza & Miniati, 1993), los piranoantocianos casi no cambian su intensidad

de color. A pH entre 1 y 2 la mayor parte de las características cromáticas son debidas

a los antocianos monómeros el color (C *), la luminosidad (L *), y el ángulo de tono

(ha, b) pero a partir de un pH de 5 esos antocianos están en su mayoría en forma

hemiacetálica o base carbinol, transparente, y gran parte del color es debido a los

compuestos piranoantocianicos (Oliveira, mateus et al 2006). Esta mayor estabilidad

se puede explicar por el efecto protector del nuevo anillo de pirano frente al ataque

nucleófilo del agua, lo que impide la formación de la base de carbinol.



Por otro lado al contrario que los pigmentos poliméricos de alto peso molecular,

que normalmente se encuentran en estado coloidal en el vino y tienen tendencia a

precipitar, los piranoantocianos son moléculas de un tamaño determinado y similar a

la de los antocianos monómeros de los que derivan y se mantienen disueltos en el

vino, por lo que tendrán poca tendencia a perderse en los precipitados de materia

colorante que se forman en los vinos tintos envejecidos, o a quedarse retenidos en los

filtros por los que se pasan los vinos antes de su embotellado.

Mientras los antocianos monómeros son unos pigmentos de color rojo y

poseen unos cromóforos potentes (el coeficiente de absorción molar a 520 nm para el

3-monoglucósido de malvidina, a pH 1.5, es de 27000 g-1Lcm-1) y que además

incrementan su intensidad colorante al formar complejos de copigmentación, los

piranoantocianos son de color rojo-anaranjado (máximos de absorción sobre 498-512

nm en medio acuoso a pH < 2), además los piranoantocianos poseen unos cromóforos

más débiles, con unos valores de coeficientes de absorción molar a 520 nm, a pH 1.5,

del orden de la mitad (o menos aún) de los correspondientes a los antocianos

monómeros de los que derivan (Håkansson y col., 2003). Por tanto, para

concentraciones molares iguales y en un medio muy ácido, los piranoantocianos

otorgan menor intensidad colorante y una tonalidad roja más anaranjada que los

correspondientes antocianos monómeros.

Figura 35. Mesomería entre los anillos piranósicos de los piranoantocianos.

Otra característica interesante de los piranoantocianos se deriva de la posibilidad

de mesomería que presenta el nuevo anillo de pirano fusionado al catión flavilio del

O

OH

OCH3

OCH3

O

HO

OGlu(ácido)

R

O

OH

OCH3

OCH3

O

HO

OGlu(ácido)

R



antociano original (Figura 34). La mesomería permite intercambiar la carga positiva

del catión flavilio entre los dos átomos de oxígeno de los dos anillos piranósicos, por lo

que los piranoantocianos poseen realmente un cromóforo distinto al de los antocianos

monómeros, y con distintas propiedades.

Apartado V

“TÉCNICAS

ESPECTROSCÓPICAS”

Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.


2. V. TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y ESPECTROSCÓPICAS

2.V.1. Cromatografía liquida de alta eficacia HPLC Actualmente la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es la técnica

cromatográfica más utilizada para la separación y el análisis de antocianos,

especialmente desde la introducción de los espectrofotómetros de diodos como

sistemas de detección asociados a la HPLC, que permiten obtener tanto el espectro de

absorción de los compuestos detectados, como registrar los cromatogramas a

diferentes longitudes de onda. Las fases estacionarias más utilizadas para la

separación de antocianos en HPLC son las fases reversas (RP-HPLC), especialmente los

soportes de gel de sílice unidos a restos C-18. En general, se utilizan gradientes

binarios, formados por un disolvente polar (generalmente una fase acuosa acidificada)

y otro menos polar, orgánico (acetonitrilo o metanol, en ocasiones también

acidificado).

Como los antocianos son compuestos de elevada polaridad, se necesitan una

proporción importante de fase acuosa para la elución de las fases estacionarias

reversas. Para una buena resolución de los picos es necesario un pH de elución

bastante ácido, de manera que se favorezca el desplazamiento de los equilibrios entre

formas de los antocianos hacia el catión flavilio; de este modo, los valores típicos de

pH de elución se encuentran generalmente por debajo de 2. Los modificadores de la

acidez más habituales son el ácido acético y el ácido fórmico; con este último se

obtiene generalmente mejor resolución. El ácido trifluoroacético es también

ampliamente utilizado, debido a las ventajas que ofrece por ser un ácido menos

corrosivo y que mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención (Lopes-Da-Silva

et al., 2002). Para obtener resultados reproducibles es también importante un control

de la temperatura, que debe permanecer estable durante la elución.

Tenemos varios factores que afectan a la separación de los antocianos en las

columnas de fase reversa y que están ampliamente descritos (Hebrero et al., 1988;

Hong et al., 1990a y 1990b; Strack et al., 1989). El orden de elución de los

compuestos en este tipo de columnas está íntimamente relacionado con la polaridad,

los compuestos más polares eluyen antes que los menos polares. La polaridad de los

antocianos depende de:



• El patrón de sustitución de la antocianidina en el anillo B. Los grupos hidroxilos

aumentan la polaridad, y por tanto la movilidad del compuesto, mientras que los

grupos metoxilo, disminuyen la polaridad y la retrasan. De tal manera que las

antocianidinas más comunes eluyen en el siguiente orden: delfinidina, cianidina,

petunidina, pelargonidina, peonidina y malvidina.

• La naturaleza, posición y número de azúcares unidos a las antocianidinas. La

glicosilación aumenta la polaridad. Si se consideran los 3-glicósidos más habituales

de una antocianidina, el orden de elución es el siguiente:

galactósido, glucósido, arabinósido, xilósido, ramnósido, en el caso de los

monoglucósidos, y soforósido, sambubiósido y rutinósido, en el caso de los

disacáridos.

Aunque los disacáridos se consideran, en general, más polares que los

monosacáridos, existen excepciones, por ejemplo, los rutinósidos son menos

polares que los glucósidos, pero más polares que los pentósidos. En general, la

movilidad aumenta al hacerlo el número de azúcares existentes en la estructura

del antociano. El orden de elución en los patrones de sustitución más habituales

es: 3,7-diglicósidos, 3,5-diglicósidos y 3-monoglicósidos.

• La acilación de los azúcares. La acilación de las moléculas de azúcar de los

antocianos implica una pérdida de la polaridad, y por tanto un aumento en los

tiempos de retención. La disminución de la polaridad depende del tipo de

sustituyente acilo. Para los residuos de ácidos alifáticos más comunes el orden es:

málico, acético, malónico, succínico. En el caso de la acilación con ácidos fenólicos

la disminución de la polaridad es mayor para los ácidos hidroxicinámicos de estos

el más polar es el acético, después el caféico y por último el cumárico. Sin

embargo en algunos de los piranoantocianos se observa un cambio en el orden de

elución del caféico y el acético, entre los piranoantocianos de tipo vitisina y los de

tipo hidroxifenil.

Los círculos corresponden a los piranoantocianos cafeilados, se puede apreciar que

en los pirnanoantocianos del tipo vitisinas el orden de elución es glucosilado,

acilado, cafeilado y cumarilado mientras que en los piranoantocianos derivados de



ac. Hidroxicinámicos (hidroxifenilpiranoantocianos) los derivados cafeilado y

cumarilado se han desplazado (tienen un menor tiempo de retención en la

columna), y llegan a solaparse e incluso a adelantar al derivado cafeilado.

Acetilacetato de Li

Pirúvico

Acetaldehido

Butanodiona

Caféico

Cumárico

Ferúlico

Sinápico

14.7 17.0

23.6

EIC 341

0

2

4

6

5x10

Intens.

15 20 25 30 35 40 Time [min]

18.8

20.5

21.8

24.2

EIC 399

0

1

2

7x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

20.2 22.3 27.3

24.2

EIC 355

0.0

0.5

1.0

6x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

25.3

28.3 EIC 397

0.5

1.0

6x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

0.5

32.034.3

36.6

EIC 463

0.0

0.5

1.07x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

34.9 37.3 39.4

0.436.8

EIC 447

0.0

0.5

7x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

36.839.0 40.7

38.6

EIC 477

0.0

0.5

7x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

37.5

38.8

39.5 40.6

EIC 507

0.0

0.5

1.0

7x10

15 20 25 30 35 40 Time [min]

Cromatrograma EIC de la Malvidina

Figura 36 Diagrama EIC de la pirano-malvidina formada con distintos compuestos.

2.V.1.2. Espectroscopia UV-VIS En la cromatografía en columna se coloca la fase estacionaria en el interior de un

tubo cilíndrico (columna) y se hace pasar la fase móvil (líquido o gas) a través de

ellas. Para el análisis de antocianos la fase móvil siempre es un liquido, porque estos

tienen una gran labilidad térmica y se degradarían si se calentasen para ser

volatilizados, la técnica de HPLC que es la más empleada hoy en día permite realizar



varios análisis en uno; Separando identificando y cuantificando los antocianos y

derivados presentes en una muestra, aunque esta no sea demasiado pura (vino

comercial). Los primero análisis con estas técnicas fueron realizados por Manley y

Shubiak (1975).aunque fue a partir de 1978 con Wolf y Nagel y con Williams y

colaboradores cuando esta técnica se desarrollo para el estudio de los antocianos. Se

emplean columnas de fase estacionarias C-18 (cadenas de 18 átomos de carbono

unidas entre si) reversas y detectores de diodos que nos proporcionan para cada

compuesto su espectro ultravioleta-visible ya que nos registran la absorbancia del

compuesto en un intervalo de longitudes de onda.

La espectroscopia de ultravioleta y visible fue una de las primeras técnicas utilizadas

de forma rutinaria para análisis de compuestos flavonoideos debido a la existencia de

dos bandas de UV / Vis característicos en flavonoides, una banda en el intervalo de

300 a 550 nm, y que surje del anillo B, y la banda II en los rangos de 240 a 285 nm,

derivados del anillo A . Por ejemplo, mientras que la banda I en flavonas y flavonoles

se encuentra en el rango 240-285 nm, en las flavanonas (sin instauración en el anillo

C) se encuentra en el rango 270 a 295 nm, por el contrario, el grupo II de flavonas y

flavanonas (sin grupo 3-OH) se encuentra a unos 303 -304 nm, y en los flavonoles 3-

hidroxilados se centra alrededor de 352 nm.

Reactivos, como el hidróxido de sodio y el tricloruro de aluminio, conducen a cambios

en la longitud de onda máxima de estas bandas debido a la desprotonación inducida

por grupos OH o Al3 en los grupos OH, y también se utilizan habitualmente para

estudiar la estructura de los flavonoides.

La espectrofotometría UV / Vis está siendo utilizada para estudiar antocianidinas,

que cambian su forma y su color según el pH, la concentración de los iones metálicos

y copigmentación (Giusti y Wrolstad, 2001), (Melo et al., 2000; Moncada et al, 2004).

Las características espectrales en el UV-Vis son muy útiles para la caracterización

de antocianos, especialmente para la caracterización de las antocianidinas. A valores

de pH ácidos, antocianos y antocianidinas presentan un máximo de absorción en la

región del visible entre 465 y 560 nm, y otro en la región de UV, alrededor de 270-

280 nm (Markham, 1982; Jackman y Smith, 1996). La absorbancia en el visible se



debe a la estructura central heterocíclica y a la conjugación de los dos anillos

bencénicos, además está influida por el pH y el solvente.

El número y los grupos funcionales del anillo B también presentan influencia en

dicha absorbancia. Los antocianos con menor número de sustituyentes en el anillo B

tienen el máximo de absorción a menor longitud de onda. La pelargonidina, con sólo

un grupo hidroxilo en el anillo B, es la que presenta un máximo de absorción más

bajo. Delfinidina, petunidina y malvidina, con tres grupos funcionales en dicho anillo,

tienen el máximo de absorción a una longitud de onda superior.

Figura 37. espectro UV-vis de los antocianos monómeros.

Esto ocurre tanto para los aglucones como para sus correspondientes glicósidos. A

medida que aumenta el número de grupos hidroxilo en el anillo B, el máximo de

absorción en el visible se desplaza batocrómicamente, lo que lleva, a un

desplazamiento del color hacia tonalidades más azuladas. La presencia de grupos

metoxilo en el anillo B produce un desplazamiento hipsocrómico, desplazamiento del

color hacia tonalidades rojas. (Rivas- Gonzalo et al., 2003).



La glicosilación también afecta a la longitud de onda del máximo en el visible, ya

que lo traslada hacia longitudes de onda más bajas, aproximadamente 10 nm, que su

respectivo aglucón. Los antocianos diglucósidos tienen sus máximos de absorción

desplazados hacia longitudes de onda menores que los correspondientes

monoglucósidos. Además, la glicosilación disminuye el coeficiente de absorción

molecular. Los 3-monoglucósidos, presentan un hombro en la región del visible

(aproximadamente 440 nm), que no aparece en los 3,5-diglucósidos. La pelargonidina

es una excepción ya que tanto el aglucón como sus mono y diglicósidos presentan un

hombro aproximadamente en esta zona. La acilación de los azúcares provoca un ligero

desplazamiento en el máximo de absorción en el visible hacia longitudes de onda más

elevadas ( Alcalde-Eon 2008).

Figura 38: Espectro UV-vis de los piranoantocianos formados por reaccion con ácido

pirúvico. Se observa la presencia de un hombro a 440 nm.

La absorbancia en la región del ultravioleta es debida a los grupos fenólicos y no

está influida por el pH. En general, la glicosilación no provoca cambios en esta zona

del espectro, aunque la presencia de grupos acilos puede provocar la aparición de un

máximo u hombro adicional en el espectro de UV-Vis. La acilación con ácidos

hidroxicinámicos (caféico, ferúlico y cumárico) produce un hombro a 310-330 nm en el



espectro de absorción del antociano característico del resto acilante. Los cambios en el

patrón de sustitución del anillo A tienden a reflejarse en la banda de absorción del

ultravioleta (Rivas-Gonzalo et al., 2003).

Figura 39: Cambios producidos en el espectro UV-vis de la malvidina debidos a la acilación.

2.V.3. Espectroscopia de masas Es una técnica que permite la determinación funcional y estructural de las

moléculas, con una elevada sensibilidad y límites de detección muy bajos. Una

muestra es ionizada en una fuente mediante la aplicación de elevadas energías de

ionización y los iones así formados (negativos o positivos) son separados mediante un

analizador con el objeto de determinar su relación masa/carga (m/z).

En general, para el análisis de antocianos, se utiliza el modo positivo (Lopes da

Silva et al., 2002; de Pascual-Teresa et al., 2002; Mateus et al., 2002; Alcalde-Eon et

al., 2004). A partir de la determinación de las masas de los iones moleculares [M+]

presentes en la muestra, e identificación de los fragmentos producidos por ruptura de

dichos iones, se obtiene la identificación de los compuestos de interés.

Una de las principales ventajas ofrecidas por este método es la pequeña cantidad

de muestra necesaria para el análisis. El desarrollo de una interfase de ionización a



presión atmosférica (API). La ionización se produce a través de una descarga en el

solvente en forma de aerosol, produce iones primarios derivados del disolvente que, a

su vez, ionizan el soluto (Prasain et al., 2004; de Hoffmann & Stroobant, 2007),

supuso un gran avance para el análisis de antocianos, debido a que facilitaba el

acoplamiento del detector de masas a un equipo HPLC, que permite la separación de

los compuestos. Es una técnica de gran utilidad en la identificación de taninos

condensados

Las antocianidinas en su forma catión flavilio son relativamente estables, por lo que no

es frecuente encontrar, en condiciones suaves de ionización, fragmentos de sus

estructura. Para provocar la fragmentación, se recurre a la CID (disociación inducida

por colisión) que permite la obtención de espectros masas-masas (MS-MS) (Rivas-

Gonzalo, 2003), que corresponden a fragmentos resultantes de la disociación del ión

molecular aislado previamente de modo selectivo en la cámara de ionización.

Así, es posible obtener espectros MSn, que facilitaran la elucidación de la identidad

de los compuestos en estudio. Por otra parte la mayoría de los espectrómetros de

masas permite el registro de un intervalo de masas deseado, en el modo full scan, o la

monitorización selectiva de un ión (modo SIM), e incluso es posible desarrollar un

modo MS-MS, monitorizando la reacción seleccionada (SRM) de tal manera que

aumenta la sensibilidad del método.

En los últimos años han aparecido diversos estudios sobre la fragmentación de los

antocianos en espectrometría de masas y se ha observado que se produce de acuerdo

a patrones que se repiten, lo cual resulta muy útil a la hora de identificar el compuesto

original. El aglucón antociánico es muy estable y no posee ningún enlace en el que la

ruptura se pueda realizar fácilmente, por eso cuando se trabaja en modo positivo, su

espectro presenta un catión intenso y muy poca fragmentación. Los antocianos, por su

parte, sufren la ruptura de los enlaces glicosídicos entre el anillo del ión flavilio y los

azúcares directamente unidos a él. Hay transferencia de un átomo de hidrógeno desde

un grupo OH del azúcar hasta los iones formados, y en función de que la sustancia sea

monoglucósido, diglucósido o biósido, el número y los tipos de fragmentos serán

diferentes. En el caso de los antocianos acilados, no se produce la ruptura de los

enlaces tipo éster y se pierde conjuntamente el azúcar y el ácido (Giusti et al., 1999).



En este sentido, la técnica más empleada es la que recurre a la ionización por

electrospray (ESI). Esta consiste en hacer pasar una solución del analito a través de

un capilar que es mantenido con un elevado potencial. El campo eléctrico que se

genera, provoca la formación de pequeñas gotas cargadas que pasan, a través de una

zona sometida a elevados potenciales y presión, hacia el analizador del

espectofotómetro, se puede aplicar directamente, por infusión de la muestra con una

jeringa con control de flujo, una corriente de líquido constante entra en el sistema, lo

que permite múltiples análisis que deben realizarse durante un período relativamente

grande de tiempo. Las gotitas disminuyen de tamaño por evaporación del solvente o

por “explosión coulombica” (subdivisión de las gotas debido a la elevada densidad de

carga). Se usa un gas envolvente para favorecer la nebulización de la solución. Se

produce una ionización suave, dando lugar a iones intactos a partir de moléculas

grandes y complejas, incluyendo los compuestos polares termolábiles y no volátiles. La

aplicación de HPLC-DAD-MS utilizando la ionización con electrospray ha facilitado la

identificación de los antocianos en numerosas fuentes, como por ejemplo uva tinta

(Favretto et al., 2000, citado en Rivas-Gonzalo, 2003), fresas (Lopes da Silva et al.,

2002, 2007), maíz morado (de Pascual-Teresa et al., 2002) y vinos tintos (Mateus et

al., 2002; Alcalde-Eon et al., 2004).

Este tipo de ionización no produce la fragmentación del compuesto, como ocurre

en otras ionizaciones. La elección de polaridad, negativa o positiva, está determinada

por la polaridad de los iones en disolución. Moléculas ácidas dan lugar a iones

negativos y molecular básicas a iones positivos. Esta técnica permite asignar

estructuras de compuestos de elevado grado de polimerización mediante la

interpretación de los esquemas de fragmentación de las molecular y de la carga de los

iones, que pueden estar monocargados o aparecer con cargas múltiples, permite

obtener espectros MS2 y MS3, correspondientes a la fragmentación del ión molecular

mayoritario.

La técnica de ionización ESI para el análisis de flavan-3-oles permite identificar el

compuesto además de por su señal m/z, (ión pseudomolecular) por el patrón de

fragmentación de la molécula, MSn. Generalmente la señal más abundante

corresponde a la pérdida de 152 unidades de masa (a.m.u) que se asocia a una

ruptura retro Diels-Alder (RDA). Otras dos rupturas características corresponden a la

fisión del heterociclo (heterociclic ring fission, HRF) y la del enlace interflavánico en el



caso de los oligómeros. En los polímeros es también frecuente la aparición de señales

correspondientes a los compuestos con cargas múltiples. Aunque bastantes

investigadores han recurrido a la MS en modo de ionización negativo (Cheynier et al.,

1997), en nuestro laboratorio se han obtenido buenos resultados empleando el modo

positivo.

Tabla 1. Perdidas de masa asociado con posibles reacciones metabólicas de los flavonoides adaptado de Prasain y Barnes, 2007

Un aspecto importante es establecer la posición relativa de la subunidades en los

oligómeros. Se ha indicado que la ruptura RDA tiene lugar de forma preferente en las

subunidades superiores (de Pascual-Teresa et al., 2000; Friedrich et al., 2000). De

esta forma, la identificación de los oligómeros puede conocerse a través de su ión

molecular y el patrón de fraccionamiento.

La mayoría de los equipos permiten el registro de un intervalo de masas deseado,

en el modo full scan, o la monitorización selectiva de un ión (modo SIM), e incluso

son capaces de desarrollar

la detección en modo MS-MS, monitorizando la reacción seleccionada (SRM), de tal

manera que se incrementa la sensibilidad.



La principal desventaja de estas dos técnicas es que algunos disolventes HPLC

interfieren con el proceso de ionización, y por lo tanto las separaciones

cromatográficas necesitan estar específicamente diseñadas para cada compuesto

(Prasain et al., 2004).

Combinando los datos del espectro uv-vis con los datos de masas tenemos una

asignación mucho más fiable de cada uno de los compuestos obtenidos.

En este ejemplo de formación de vinilcatecolpiranoantocianos por reacción en el

laboratorio de ácido caféico con extracto de hollejos podemos identificar y asignar

cada uno de los picos obtenidos, comprobando la fragmentación correspondiente a

cada uno de ellos.

Figura 40: Cromatograma de los vinilcatecolpiranoantocianos.

En el primer pico que asignamos como vinilcatecolpiranomalvidin-3-glucosa se

puede observar que el fragmento que se produce es la perdida de la glucosa 162

umas, en el segundo pico el fragmento pierde 204 umas propio de la perdida de

acetilglucosa, el cuarto pico asignado correspondería al derivado cafeoilado y se ve la

perdida del resto cafeilglucosa de 324 umas y el último pico asignado al derivado

cumarilado en el que se observa que la perdida corresponde a la cumaroilglucosa con

un peso molecular de 308 umas.



Figura 41: Espectro Ms/Msn de los vinilcatecolpiranoantocianos.

2.V.4. Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Es una técnica ampliamente utilizada en la dilucidación estructural de compuestos

químicos. Se empezaron los estudios de las estructuras flavonoides usando 1H-RMN

en 1960 (Markham y Mabry, 1975) y más tarde se aplicó también 13C-RMN, esta

técnica ha sido utilizada para la identificación completa de antocianos, a pesar de ello,

hay que tener en cuenta la complejidad de esos compuestos, debido sobre todo a la

presencia de azucares en la molécula, lo que hace necesario el uso de aparatos con

una buena resolución, para asignar correctamente las señales del protón y del carbono

al espectro de RMN. El método RMN se basa en el estudio del 1H hidrógeno y / o los

isótopos de carbono 13C, y depende de la intensidad de las interacciones entre los

diferentes átomos dentro de una molécula colocada en un campo magnético de alta

intensidad. Para que la interpretación del espectro obtenido en el análisis, en el caso

de utilizar la RMN de protón, no sea realmente complicada, es necesario utilizar un

medio ácido como DCl o CF3COOD, para desplazar el equilibrio, de tal manera que

sólo esté presente la forma flavilio (Rivas-Gonzalo, 2003).



Las técnicas de RMN bidimensionales, como COSY, TOCSY, NOESY, HMQC y HMBC,

sí las moléculas tienen interacciones homonucleares [correlación espectroscopía

(COSY) y el efecto Overhauser espectroscopia nuclear (NOESY)] y sí las interacciones

son heteronucleares [heteronuclear con una única correlación cuántica (HSQC) y

heteronuclear con correlación entre enlaces múltiples (HMBC)] para facilitar la

adquisición de la totalidad de la información estructural sobre una aglicona y el azúcar

sustituido correspondiente. En el caso de los diglicósidos, se obtiene la información

sobre la colocación de los enlaces interglicosídicos y las posibles sustituciones de

grupos acilo en los anillos de azúcar, y también se puede obtener la posición del

protón anomérico.

En estos espectros podemos ver que se producen distintas señales o “picos” entre

los protones que están acoplados el uno al otro, por lo general (2JHH), pero a veces

también cuando están separados tres y cuatro enlaces (3JHH y 4JHH); la intensidad

del acoplamiento afecta a la intensidad del pico. El experimentos DQF-COSY (Doble

Quantum Filtro COSY) es una mejora del experimento COSY en el que no acoplan las

señales de protones del disolvente, ya que estas podrían superponerse a las señales

producidas por el analito (Claridge, 1999).

Otra mejora es la espectroscopia de correlación total, el experimento TOCSY, que

crea correlaciones entre todos los protones en un sistema, siempre y cuando haya

acoplamientos entre todos los protones que intervienen, lo que es muy útil para

identificar los protones en anillos de azúcares. Todos los protones de un anillo de

azúcar tendrán una correlación con el resto de protones del mismo anillo, pero no con

los de otros anillos. La magnetización se transfiere a través de hasta 5 o 6 enlaces, y

es interrumpido por acoplamientos 1H-1H pequeños o nulos y por la presencia de

heteroátomos; también, el número de pasos de la transferencia se puede ajustar

cambiando el tiempo de bloqueo del giro (Fossen y Andersen, 2005). (Gheysen et al.,

2008). El experimento 1D TOCSY (también conocido como HOHAHA, homonuclear

Hartman-Hahn) es particularmente útil en compuestos con más de un resto de azúcar,

en el que se produce un solapamiento de estas señales, en este experimento, se

selecciona un pico y se estudia la magnetización es producida en cada paso para los

protones en el mismo sistema de giro, así se evitan las señales cruzadas, y se obtiene

la estructura de la muestra por el aumento de intensidad de la señal multiplete

(Fossen y Andersen, 2005).



1.V.4.1. Experimentos Heteronucleares en dos dimensiones 2D RMN

En los experimentos de RMN 2D heteronucleares se correlacionan los núcleos de

diferentes elementos. Las técnicas de mayor alcance son, sin duda, los experimentos

de protones de carbono 2D HMQC / HSQC (Heteronuclear Multiple Quantum

Coherencia / Heteronuclear Individual Coherencia cuántica) y HMBC (Heteronuclear

Correlación Múltiple Bond), ya que proporcionan los datos de protones y los datos de

RMN de carbono directamente.

HMQC y HSQC establecen una correlación entre los enlaces de los protones de la

molécula y los carbonos a los que están unidos (1JCH). Ambos métodos son mucho

más sensibles que los correspondientes experimentos en una dimensión de carbono 13

(1D 13C), mientras que en el experimento 1D la escasa concentración del isótopo

conduce a una baja relación señal-ruido, en el experimento 2D heteronuclear la

magnetización inicial se produce en los núcleos 1H altamente sensibles y se transfiere

luego a los átomos de 13C que están conectados a los protones, esto hace que la

señal sea mucho más intensa. Un experimento de RMN similar es 1H-13C HMBC

(heteronuclear Correlación enlace múltiple), en el que se analizan las interacciones de

largo alcance (normalmente 2JCH y 3JCH); HMBC suele ser más sensibles a las

correlaciones de 3 enlaces que a las correlaciones de 2 enlaces, pero esto depende de

las relaciones totales de señal-ruido y a los parámetros ajustables de cada uno de los

experimentos. Un experimento reciente, 2JCH, 3JCH-HBMC, fue diseñado para

diferenciar estos dos tipos de correlaciones (Claridge, 1999; Krishnamurthy, 2000;

Fossen y Andersen, 2005).

La aplicación de HBMC a los flavonoides, por lo general se ocupa de asignación de

átomos de C no protonados, tanto de las agliconas como de grupos acilo. A diferencia

de TOCSY, la transferencia HMBC no se detiene por heteroátomos, por lo que también

se puede utilizar para determinar los puntos de enlace de grupos tales como residuos

de azúcar. HMBC También es útil diferenciar a algunas clases de flavonoides, como

flavonas de auronas, que tienen similares los espectros 1H y 13C RMN pero muy

diferentes los espectros HMBC. Actualmente, sólo se utilizan las variantes mejoradas

de los experimentos de HSQC y HMBC, con mejora de gradiente (GE), debido a su

mayor sensibilidad y la capacidad de elucidación. Estos experimentos se han utilizado

para establecer la existencia de una fuerte unión intramolecular entre H los grupos 4-



oxo y 5-hidroxi en flavonoides (Exarchou et al, 2002;.. Kozerski et al, 2003).

Otros experimentos de RMN, usando nuevas técnicas 2D y 3D, han sido

desarrollado en los últimos años, y están empezando a ser utilizados para el análisis

de flavonoides. En particular, los experimentos 2D y 3D HSQC-TOCSY son capaces de

asignar todas las señales de 13C de los glucósidos de flavonoides poliglicosilados

(Fossen y Andersen, 2005).

2.V.4.2. Conectividad a través del espacio - el efecto Overhauser nuclear

(NOE)

Mientras que las técnicas de 2D son útiles para establecer la conectividad entre los

distintos átomos a través de los enlaces, el efecto de Overhauser nuclear (NOE), que

se pueden resumir como “El cambio de intensidad de la señal de RMN en un núcleo,

cuando un núcleo vecino está saturado", es útil en el establecimiento de

conectividades de átomos no unidos directamente pero conectados a través del

espacio. Los picos en un espectro NOESY 1H-1H (NOE espectroscopía) corresponden a

las correlaciones entre los protones que están cerca uno del otro en el espacio (hasta

4 $ Å $) pero no necesariamente conectados a través de enlaces, estas correlaciones

pueden surgir de las interacciones intermoleculares de protones, y ha sido utilizado

con éxito para establecer diferencias en confórmeros rotacionales, y establecer

asociaciones intermoleculares e incluso resolver estructuras del tipo proteinas-ligando

y ADN-ligando. Un experimento NOE 2D, ROESY (Rotating Overhauser

Espectroscopía Efect), se ha usado para establecer la estereoquímica de diversos

flavonoides (Claridge, 1999; Fossen y Andersen, 2005). (Jordheim et al., 2006).

son comúnmente utilizadas para la identificación de antocianos y sus derivados

tanto en fuentes naturales como en productos procesados. El acoplamiento de HPLC

con RMN es un buen método para la separación y la elucidación estructural de los

compuestos desconocidos en las mezclas, representa una potencial e interesante

técnica complementaria al HPLC-UV-MS en el análisis de polifenoles. Aplicaciones

recientes han demostrado la utilidad de esta técnica (Wolfender et al., 1998, 2002;

Bobzin et al., 2000).



La limitación de los métodos de RMN es que tienen menor sensibilidad en

comparación con otros métodos instrumentales. Para la obtención de espectros de

buena calidad que contengan toda la información estructural, se necesitan cantidades

relativamente altas de compuesto (más de 1 mg) por tanto son necesarias técnicas de

purificación, especialmente cuando se utilizan imanes de frecuencia media (300 MHz).

Los espectrómetros de RMN se pueden conectar en línea a los cromatógrafos de

líquidos (LC-RMN), dando así una poderosa herramienta para el estudio de mezclas

naturales de compuestos presentes en muestras complejas. Los datos estructurales

obtenidos a partir de espectros de masas también pueden ser importantes (MS), para

ayudar en la elucidación.

Los principales problemas en los inicios de está técnica se debían a una baja

sensibilidad de la RMN, a la presencia de disolventes protonados, que son utilizados en

la fase inversa del HPLC y que coincidían con algunas señales de protones de los

analitos, y a la posibilidad de realizar sólo experimentos de 1H-RMN.

La mayoría de estos problemas se han resuelto parcialmente en la última década.

La baja sensibilidad de las técnicas de RMN han sido abordadas de varias maneras.

Por un lado el uso de imanes de alto campo (desde 500 y hasta 750 a 900 MHz) en los

espectrómetros conectados al HPLC da unos resultados satisfactorios (Wolfender et al.,

2001). Otro método para aumentar la sensibilidad es un modo de "parada de flujo" del

sistema de LC-RMN, lo que permite un tiempo prolongado de adquisición de datos en

los espectros de RMN, de hasta varios días. En este método, el software de control de

todo el sistema apaga la bomba de HPLC en el momento en que un pico

cromatográfico es registrado por el detector (frecuentemente UV), y llega a la sonda

de RMN (Holt et al., 1998). Otra mejora han sido los diferentes experimentos de RMN

que se pueden realizar, incluyendo dos dimensiones 1H-13C HSQC y HMBC, estos

espectros se podrían obtener incluso utilizando 10 g de muestra (Wolfender et al.,

2001). También se ha mejorado en la preconcentración de la muestra, utilizando la

mayor fuerza de campo del RMN y la optimización de los parámetros de la columna,

esto ha permitido mejorar aún más el límite de detección, en un orden de magnitud

(Hansen et al., 1999). Las señales de los disolventes utilizados con mayor frecuencia

en los sistemas cromatográficos de fase inversa (CH3CN-D2O y CH3OD-D2O) puede

ser suprimida mediante el (agua WET supresión-mejorado a través de efectos t1)

técnica (Smallcombe et al., 1995).



La técnica LC-RMN se ha aplicado con éxito en varios laboratorios para los

estudios de compuestos flavonoides de diferentes especies de plantas (Wolfender et

al, 1997;. Hansen et al, 1999;. Lommen et al, 2000;. Vilegas et al, 2000;. Andrade

et al, 2002;. Queiroz et al, 2002;. Le Gall et al, 2003;. De Rijke y otros, 2004a;.

Waridel et al., 2004). En la mayoría de los casos, los datos de LC-RMN son apoyados

por los resultados obtenidos con diferentes tipos de experimentos LC-MS. Sin

embargo, a pesar de que la conexión directa de un HPLC con ambos espectrómetros

es posible, no se hace habitualmente por que se necesita agua deuterada como

disolvente para las técnicas de RMN, y en estas condiciones, algunos protones de las

moléculas de flavonoides (especialmente los grupos hidroxilo de la aglicona, y los

restos glicosídicos) se intercambian fácilmente con los átomos de deuterio, causando

un aumento aparente de la pesos moleculares de los analitos y produciendo

diferencias en los espectros de masas MS. En estos casos, se trabaja con H2O en lugar

de en el D2O en la fase móvil del LC-MS (Hansen et al., 1999).

BIBLIOGRAFÍA


BIBLIOGRAFÍA Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C. Separation of

pyranoanthocyanins from red wine by column chromatography. Anal. Chim. Acta 2004, 513, 305-318.

Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C. Changes in the

detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing. A comprehensive study. Anal. Chim. Acta 2006, 563, 238-254

Alcalde-Eon, C.; Boido, E.; Carrau, F.; Dellacassa, E.; Rivas-Gonzalo, J. C. (2006). Pigment profiles in monovarietal wines produced in Uruguay. American Journal of Enology and Viticulture, 57, 449-459.

Alcalde-Eon, C. (2008). Anthocyanin-derived pigments originated during wine making and aging,

and their contribution to wine colour. Ph. D. Thesis, University of Salamanca, Spain. Alluis, B (Alluis, B); Perol, N (Perol, N); El hajji, H (El hajji, H); Dangles, O (Dangles, O).

HELVETICA CHIMICA ACTA Volume: 83 Issue: 2 Pages: 428-443 (2000). Water-soluble flavonol (=3-hydroxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) derivatives: Chemical synthesis, colouring, and antioxidant properties

Anders E Håkansson, Kevin Pardon, Yoji Hayasaka, Maria de Sa, Markus Herderich 2003.

Structures and colour properties of new red wine pigments Pages 4887-4891 Asen, S., R.N. Stewart, and K.H. Norris. 1972. Co-pigmentation of anthocyanins in plant tissues

and its effect on color. Phytochemistry 11:1139-1144. Atanasova et al. (2002a) Effect of oxigenation on polyphenol changes occurring on the curse of

wine making. Anal. Chim acta.458, 15-27. Atanasova, V., Fulcrand, H., Cheynier, V., & Moutounet, M. (2002b). Effect of oxygenation on

polyphenol changes occurring in the course of wine-making. Analytica Chimica Acta, 458, 15e27

ATTOE, EL (ATTOE, EL); VONELBE, JH (VONELBE, JH) Source: JOURNAL OF FOOD SCIENCE

Volume: 46 Issue: 6 Pages: 1934-1937 (1981). PHOTOCHEMICAL DEGRADATION OF BETANINE AND SELECTED ANTHOCYANINS

Ayala, F.; Echávarri, J.F.; Negueruela, A.I. (1999). “A new simplified method for measuring the

color of wines”. III. “All wines and Brandies”. Am. J. Enol.Vitic., 50, 359-363 B. Baderschneider, P. Winterhalter, Isolation and characterization of novel benzoates,

cinnamates, flavonoids, and lignans from Riesling wine and screening for antioxidant activity. J. Agric. Food Chem. 49, 2788-2798 (2001).

Baranac, J.M., Petranovic, N.A., Dimitric-Markovic, J.M. (1996): Spectrophotometric study of

anthocyanin copigmentation reactions, J. Agr. Food Chem. 44 (5), 1333-1336. Baranac, J.M., Petranovic, N.A., Dimitric-Markovic, J.M. (1997a): Spectrophotometric study of

anthocyan copigmentation reactions 2. Malvin and the nonglycosidized flavone quercetin, J. Agric. Food Chem. 45 (5), 1694-1697.

Baranac J.M., Petranovic N.A., Dimitric-Markovic, J.M. (1997b): Spectrophotometric study of

anthocyanin copigmentation reactions.2. Malvin and the nonglycosidized flavone morin, J.

Agric. Food Chem. 45 (5), 1698-1700


Baranowski E L, Nagel C W 1983 Kinetics of malvidin-3-glucoside condensation in wine model

systems. J Food Sci 48 419-429. Bakowska, A (Bakowska, A); Oszmianski, J (Oszmianski, J Piacente, S (Piacente, S) JOURNAL OF

THE SCIENCE OF FOOD AND AGRICULTURE Volume: 84 Issue: 12 Pages: 1500-1506 (SEP 2004) Thermodynamic characteristics of copigmentation reaction of acylated anthocyanin isolated from blue flowers of ScutellariabaicalensisGeorgi with copigments

Bakker et al., 1993 Model wine solutions and compositions changes during aging. Vitis 32,11-

118. Bakker, J.; Timberlake, C. F. The Distribution of Anthocyanins in Grape Skin Extracts of Port Wine

Cultivars as Determined by High-Performance Liquid Chromatography. J. Sci. Food Agric. 1985a, 36, 1315-1324.

Bakker, J.; Timberlake, C.F. The distribution and content of anthocyanins in young port wines as

determined by high performance liquid chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 1985b, 36, 1325-1333.

Bakker, J.; Bridle, P.; Honda, T.; Kuwano, H.; Saito, N.; Terahara, N.; Timberlake, C. F. (1997).

identification of an anthocyanin occurring in some red wines. Phytochemistry, 44, 1375-1382.

Bakker, J.; Timberlake, C. F. (1997). Isolation, identification, and characterization of new color-stable anthocyanins occurring in some red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 35-43.

Bakker, J., & Timberlake, C. F. (1997). Isolation, identification and characterization of new color-

stable anthocyanins occurring in some red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 35e43.

Bayonove, C., Baumes, R., Crouzet, J., Güñata,Z. 2003. Aromas en enología: Fundamentos

científicos y tecnológicos. Coord. C. Flanzy. Ed. AMV, Mundiprensa. Madrid. p: 137-176. Benabdeljalil, C., Cheynier, V., Fulcrand, H., Hakiki, A., Mosaddak, M., & Moutounet, M. (2000).

Mise en e´vidence de nouveaux pigments forme´s par re´action des anthocyanes avec des me´tabolites de levure. Sciences des Aliments, 20, 203e220.

Bishop et al., 1984 Characterization of the condensation product of malvidin 3,5 diglucoside and

catechin Journal of Agricultural and Food Chemistry 32, 1022-1026. Boido, E. Modificaciones producidas por la fermentacion malolactica en la fraccion aromatica de

los vinos Tannat. Tesis Doctoral. 2002. Facultad de Quimica. Universidad de la Republica. Uruguay.

Boulton, R.B.; Singleton, V.L.; Bisson, L.F.; Kunkee, R.E. Principles and practices of winemaking.

Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg Maryland (Estados Unidos) 1998. Boulton y col., 2001 Boulton, R. The copigmentation of anthocyanins and its role in the colour of

redwine: a critical review. Am. J. Enol. Vitic. 2001, 52, 67-87. Bobzin SC, Yang STP, Kasten TP (2000). Application of liquid chromatography-nuclear magnetic

resonance spectroscopy to the identification of natural products, J. Chromatogr., B. Biomed. Sci. Appl., 748: 259-267.

Bridle, P.; Timberlake, C.F. Anthocyanins as natural food coloursselected aspects. Food

Chemistry. 1997, 58, 103-109.


Brouillard, R.; Dangles, O. Anthocyanin molecular interactions: the first step in the formation of

new pigments during wine aging. Food Chem. 1994, 51, 365–371. BROUILLARD, R. ald DELAPORTE, B. 1977. chemistry of anthocyanin pigments. 2. Kjnetic and

thermodynamic study of-proton tranifer, hydration and tautomeric reactions of malvidin 3- 'glucoside. J. Am. Chem. Soc. 99: 8461. Brouillard, R. Chemical structure of anthocyanins. En: Anthocyanins as Food Colors. 1a Edicion;

Markakis, P. (Editor). Academic Press, inc., Nueva York (Estados Unidos) 1982; p.1. Burda, S.; Olezsek, W. Antioxidant and antiradical activities of flavonols. J. Agric. Food Chem.

2001, 49, 2774-2779. Cabanis, J.C.; Cabanis, M.T.; Cheynier, V.; Teissedre, P.L. Tablas de composicion. En: Enología:

Fundamentos Científicos y Tecnológicos. 2ª Edicion; Flanzy, C. (Editor). AMV Ediciones, Ediciones Mundi-Prensa, Madrid (Espana) 2003; p.218.

CAI, Y (CAI, Y); LILLEY, TH (LILLEY, TH); HASLAM, E (HASLAM, E) JOURNAL OF THE CHEMICAL

SOCIETY-CHEMICAL COMMUNICATIONS Issue: 5 Pages: 380-383 (MAR 1 1990). POLYPHENOL ANTHOCYANIN COPIGMENTATION

Cameira dos Santos, P. J., Brillouet, J. M., Cheynier, V., & Moutounet, M. (1996). Detection and

partial characterisation of new anthocyanin-derived pigments in wine. Journal of the Science of Food and Agriculture, 70, 204e208.

Cantos, E.; Espín, J.C.; Tomás-Barberán, F.A. Varietal differences among the polyphenol profiles

of seven table grape cultivars studied by LC-DAD-MS-MS. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 5691-5696.

Castillo-Muñoz, N.; Gómez-Alonso, S.; García-Romero, E.; Hermosín-Gutiérrez, I. Flavonol

profiles of Vitis vinifera red grapes and their single-cultivar wines. J. Agric. Castillo-Muñoz N., Fernández-González M., Gómez-Alonso S., García-Romero E., Hermosín-

Gutiérrez I. Red-Color Related Phenolic Composition of Garnacha Tintorera (Vitis vinifera L.) Grapes and Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 7883-7891.

Cejudo-Bastante, M. J.; Hermosín-Gutiérrez, I.; Pérez-Coello, M. S. Micro-oxygenation and oak

chip treatments of red wines: Effects on colour-related phenolics, volatile composition and sensory characteristics. Part I: Petit Verdot wines. Food Chem. 2011, 124, 727-737Food Chem. 2007, 55, 992-1002.

Cejudo-Bastante, M. J.; Hermosín-Gutiérrez, I.; Pérez-Coello, M. S. Micro-oxygenation and oak

chip treatments of red wines: Effects on colour-related phenolics, volatile composition and sensory characteristics. Part II: Merlot wines. Food Chem. 2011b, 124, 738-748.

T. D. W. Claridge, “High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry”, Pergamon, 1999. Couto, J. A.; Campos, F. M.; Figueiredo, A. R.; How, T. A. Ability of lactic acid bacteria to produce

volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic. 2006, 57, 166–171. Cruz, L.; Petrov, V.; Teixeira, N.; Mateus, N.; Pina, F.; de Freitas, V. Establishment of the

Chemical Equilibria of Different Types of Pyranoanthocyanins in Aqueous Solutions: Evidence for the Formation of Aggregation in Pyranomalvidin-3-O-coumaroylglucoside-(+)-catechin. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 13232-13240.


Chatonet, P., Dubourdieu, D., Boidron, J.P. The influence of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts

and lactic acid bacteria on the ethylphenol content of red wines. American and Journal of Enology and Viticulture. 1995, 46, 463-468.

Chatonnet, P.; Dubourdieu, D.; Boidron, J. -N.; Lavigne, V. (1993). Synthesis of volatile phenols

by Saccharomyces cerevisiae in wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 62, 191–202.

CHEYNIER, V; OssE, C. ; RIGAUD, J . ; 1988 : Oxidation of grapes juice phenolic compounds in

model solution. J . Food Sci. 53, 1729-1732. Cheynier, V.; Moutounet, M.; Sarni-Manchado, P. Los Compuestos Fenólicos. In Enología.

Fundamentos Científicos y Tecnologicos, 2nd edition; Flanzy, C., Ed.; AMV Ediciones and Ediciones Mundi-Prensa: Madrid, Spain, 2003; 114-136.

Cheynier, V., Doco, T., Fulcrand, H., Guyot, S., Le Roux, E., Souquet, J. M., Rigaud, J., and

Moutounet, M. 1997. ESI-MS analysis of polyphenolic oligomers and polymers: New methods for analysing old plant polyphenols. Analusis 25:M32–37.

Dallas, C.; Ricardo da Silva, J. M.; Laureano, O. Products formed in model wine solutions

involving anthocyanins, procyanidin B2, and acetaldehyde. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2402–2407.

Dangles, O.; Saito, N.; Brouillard, R. Anthocyanin intramolecular copigment effect.

Phytochemistry. 1993, 34, 119-124. Dangles O., Saito N., Brouillard R., Kinetic and thermodynamic control of flavylium hydration in

the pelargonidin-cinnamic acid complexation. Origin of the extraordinary flower color diversity of Pharbitis nil. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 3125–3132

Dangles, O.; Brouillard, R. 1992a A SPECTROSCOPIC METHOD BASED ON THE ANTHOCYANIN

COPIGMENTATION INTERACTION AND APPLIED TO THE QUANTITATIVE STUDY OF MOLECULAR-COMPLEXES. R. JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY-PERKIN TRANSACTIONS 2 Issue: 2 Pages: 247-257 FEB 1992.

Dangles, O.; Brouillard, R..1992b. POLYPHENOL INTERACTIONS - THE COPIGMENTATION CASE -

THERMODYNAMIC DATA FROM TEMPERATURE-VARIATION AND RELAXATION KINETICS - MEDIUM EFFECT. CANADIAN JOURNAL OF CHEMISTRY-REVUE CANADIENNE DE CHIMIE Volume: 70 Issue: 8 Pages: 2174-2189. AUG 1992

Darias-Martín, J., Carillo, M., Dıaz, E., & Boulton, R. B. (2001). Enhancement of red wine colour

by pre-fermentation addition of copigments. Food Chemistry, 73, 217e220. Darias-Martin, J.; Martin-Luis, B.; Carrillo-Lopez, M.; Lamuela-Raventos, R.; Diaz-Romero, C.;

Boulton, R. Effect of caffeic acid on the color of red wine. Journal of Agricultural and Food

Chemistry. 2002, 50, 2062-2067. Davies, A.J.; Mazza, G. Copigmentation of simple and acylated anthocyanins with phenolic

compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1993, 41, 716-720. De Beer, D.; Joubert, E.; Gelderblom, W.C.A.; Manley, M. Antioxidant activity of South African

red and white cultivar wines and selected phenolic compounds: In vitro inhibition of microsomal lipid peroxidation. Food Chem. 2005, 90, 569-577

De Beer, D.; Joubert, E.; Marais, J.; Manley, M. Unravelling the total antioxidant capacity of

Pinotage wines: contribution of phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2897-2905.


De Freitas, V.; Mateus, N. Chemical transformations of anthocyanins yielding a variety of colours (Review). Environ. Chem. Lett. 2006, 4, 175-183.

De Hoffmann, E. & Stroobant, V. (2007) Mass Spectrometry – Principles and Applications (3rd

edition) Wiley, ISBN 978-0-470-03311-1, Great Britain. De las Rivas B, Rodríguez H, Curiel JA, Landete JM, Muñoz R. Molecular screening of wine lactic

acid bacteria degrading hydroxycinnamic acids. J Agric Food Chem 57, 490-494 (2009). De Pascual-Teresa, S., Santos-Buelga, C., & Rivas-Gonzalo, J. C. (2000). Quantitative

analysis of flavan-3-ols in Spanish foodstuffs and beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 5331–5337.

De Pascual-Teresa, S., Santos-Buelga, C., & Rivas-Gonzalo, J. C. (2002). LC–MS of anthocyanins

from purple corn cob. Journal of the Science of Food and Agriculture, 82, 1003–1006. Delgado-Vargas, F.; Jiménez, A.R.; Paredes- López, O. Natural pigments: carotenoids,

anthocyanins, and betalains – characteristics, biosynthesis, processing and stability. Crit. Rev. Food Sci Nutr. 2000, 40, 173-289 .

Determination of chromatic characteristics according to CIELab. International Organization of

Vine and Wine, Paris. Resolution Oeno 1/2006. Dugelay, I.; Gunata, Z.; Sapis, J.C.; Baumes, R.; Bayonove, C. Role of cinnamoyl esterase

activities from enzyme preparations on the formation of volatile phenols during winemaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1993, 41, 2092-2096.

Eiro, M.J.; Heinonen, M. Anthocyanin color behaviour and stability during storage: effect of

intermolecular copigmentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, 50, 7461-7466.

Escribano Bailón, T.; Dangles, O.; Brouillard, R. Coupling reactions between flavylium ions and

catechin. Phytochemistry 1996, 41, 1583-1592. Escribano-Bailon, T.; Alvarez-Garcia, M.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Heredia, F. J.; Santos-Buelga, C.

Color and stability of pigmentsderived from the acetaldehyde-mediated condensation between malvidin-3-O-glucoside and (+)-catechin. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1213-1217.

Es-Safi, N.; Fulcrand, H.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Competition between (+)-Catechin and

(−)-Epicatechin in Acetaldehyde-Induced Polymerization of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2096–2102.

Es-Safi, N. E.; Fulcrand, H.; Cheynier, V.; Montounet, M. Studies on the acetaldehyde-induced condensation of (-)-epicatechin and malvidin 3-O-glucoside in a model solution system. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2096-2102.

Es-Safi et al., 1999 Couplin reactions between flavilium ion and catechin. Phytochem 41, 1583-

1542. Es-Safi et al., 2000. Study of the reactions between (+) catechin and furfural derivaties in the

presence or absence of anthocyanins and their implication in fdo color change. J. Agric. Food Chem, 48, 5946.

Es-Safi et al., 2003. Implication of phenolic reactions in food organoleptic properties. J. food

Comp. anal. 16,535.553.


Etievant, P. X. (1981). Volatile phenol determination in wines. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 29, 65e67. Exarchou, V.; Troganis, A.; Gerothanassis, I.P.; Tsimidou, M. & Boskou, D. (2002) Do strong

intramolecular hydrogen bonds persist in aqueous solution? Variable temperature gradient 1H, 1H–13C GE-HSQC and GE-HMBC NMR studies of flavonols and flavones in organic and aqueous mixtures. Tetrahedron, 58, 37, 7423-7429.

Favretto, D.; Flamini, R. Application of electrospray ionization mass spectrometry to the study of

grape anthocyanins. American Journal of Enology and Viticulture. 2000, 51, 55-64. Fernández-Pachón, M.S.; Villaño, D.; García-Parrilla, M.C.; Troncoso, A.M. Antioxidant activity of

wines and relation with their polyphenolic composition. Anal. Chim. Acta 2004, 513, 113-118.

FIGUEIREDO, P (FIGUEIREDO, P); PINA, F (PINA, F). JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY-

PERKIN TRANSACTIONS 2 Issue: 4 Pages: 775-778 (APR 1994). FORMATION OF ANTHOCYANIN ION-PAIRS - A COPIGMENTATION EFFECT

FIGUEIREDO, P (FIGUEIREDO, P); PINA, F (PINA, F) Editor(s): Brouillard, R; Jay, M; Scalbert, A.

POLYPHENOLS 94 Book Series: COLLOQUES DE L INRA Volume: 69 Pages: 205-206 ( 1995). Co-pigmentation of anthocyanins through the formation of ion-pairs

Figueiredo, P.; George, F.; Tatsuzawa, F.; Toki, K.; Saito, N.; Brouillard, R. New features of

intramolecular copigmentation by acylated anthocyanins. Phytochemistry 1999, 51, 125–132

Fleet, G.H., Heard, G.M., 1993. Yeasts: growth during fermentation. In: Fleet, G.H. (Ed.), Wine

Microbiology and Biotechnology. Harwood Academic, Chur, Switzerland, pp. 27– 54. Fossen, T (Fossen, T); Rayyan, S (Rayyan, S); Andersen, OM (Andersen, OM). PHYTOCHEMISTRY

Volume: 65 Issue: 10 Pages: 1421-1428 DOI: 10.1016/j.phytochem.2004.05.003 Published: MAY 2004 Dimeric anthocyanins from strawberry (Fragariaananassa) consisting of pelargonidin 3-glucoside covalently linked to four flavan-3-ols

Fossen, T.; Slimestad, R.; Andersen, Ø. M. Anthocyanins with 4’-glucosidation from Red Onion,

Allium cepa. Phytochemistry 2003, 64, 1367-1374. Fossen, T. & Andersen, Ø.M. (2005) Spectroscopic Techniques Applied to Flavonoids, In:

Flavonoids – Chemistry, Biochemistry and Applications, Andersen ØM, Markham KR, (37-142) Taylor & Francis, 978-0-8493-2021-7, USA.

Francia-Aricha, E. M.; Guerra, M. T.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C. New Anthocyanin

Pigments Formed after Condensation with Flavanols. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 2262-

2266. Francia-Aricha, EM (Francia-Aricha, EM); Rivas-Gonzalo, JC (Rivas-Gonzalo, JC); Santos-Buelga,

C (Santos-Buelga, C). ZEITSCHRIFT FUR LEBENSMITTEL-UNTERSUCHUNG UND-FORSCHUNG A-FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY Volume: 207 Issue: 3 Pages: 223-228 (1998). Effect of malvidin-3-monoglucoside on the browning of monomeric and dimericflavanols

Friedrich, W., Eberhardt, A., & Galensa, R. (2000). Investigation of proanthocyanidins by HPLC

with electrospray ionisation mass spectrometry. European Food Research and Technology, 211, 56–64.


Hélène Fulcrand, Montserrat Dueñas, Erika Salas, and Véronique Cheynier. Phenolic Reactions

during Winemaking and Aging. Am. J. Enol. Vitic. 57:3 (2006), 289-297. Fulcrand, H.; Cameira dos Santos, P. -J.; Sarni-Manchado, P.; Cheynier, V.; Favre-Bonvin, J.

(1996). “Structure of new anthocyanin-derived wine pigments”. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 1, 735-739.

Fulcrand, H.; Es-Safi, N.; Doco, T.; Cheynnier, V.; Moutounet, M. LC-MS study of acetaldehyde

induced polymerisation of flavan-3-ols. Polyphenols Commun. (1996b) , 96, 203-204. Fulcrand et al. (1997) An oxidized tartaric acid residue as a new bridge potentially competing

with acetaldehyde in flavan-3-ol condensation. Phytochemistry 43, 223-227 Fulcrand, H., Benabdeljalil, C., Rigaud, J., Cheynier, V., & Moutounet, M. (1998). A new class of

wine pigments generated by reaction between pyruvic acid and grape anthocyanins. Phytochemistry, 47, 1401-1407.

Fulcrand, H.; Benabdeljalil, C.; Rigaud, J.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Phytochemistry 1998, 47,

1401–1407 Furtado et al., 1993 Photochemical and termal degradation of anthocyanidins J Photochem

Photobiol.75,113-118. Gao, L., Girard, B., Mazza, G. y Reynolds, A. G. (1997). Changes in anthocyanins and color

characteristics of pinot noir wines during different vinification processes. Journal of Agriculture and Food Chemistry 45, 2003-2008.

García-Puente Rivas, E., Alcalde-Eon, C., Santos-Buelga, C., Rivas-Gonzalo, J. C., & Escribano-

Bailón, M. T. (2006). Behavior and characterisation of the colour during red wine making and maturation. Analytica Chimica Acta, 563, 215e222.

García Viguera et al., 1994. The effect of PH on the formation of colored in model solution

contained anthocyanins,catechin and acetaldehyde Vitis 33, 37-40. Gardner, P.T.; McPhail, D.B.; Crozier, A.; Duthie, G.G. Electron spin resonance

(ESR) spectroscopic assessment of the contribution of quercetin and other flavonols to the antioxidant capacity of red wines. J. Sci. Food Agric. 1999, 79, 1011-1014.

Gheysen, K.; Mihai, C.; Conrath, K. & Martins, J.C. (2008) Rapid Identification of Common

Hexapyranose Monosaccharide Units by a Simple TOCSY Matching Approach. Chemistry – A European Journal, 14, 29, 8869-8878.

Giusti, M. M.; Rodríguez-Saona, L. E.; Wrolstad, R. E. Molar absorptivity and color characteristics

of acylated and non-acylated pelargonidin-based anthocyanins. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4631–4637.

Giusti, M.M. & Wrolstad, R.E. (2001) Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy, In: Current Protocols in Food Analytical Chemistry, R.E. Wrolstad (F.1.2.1-F.1.2.13) John Wiley & Sons Inc, ISBN 0471325651, USA.

Glories, Y. (1984). “La couleur des vins rouges”. “IIème partie. Mesure, origine et interpretation”.

Connaiss. Vigne Vin, 18, 253. Gómez-Míguez, M., González-Manzano, S., Escribano-Bailón, M. T., Heredia, F. J., & Santos-

Buelga, C. (2006). Influence of different phenolic copigments on the color of malvidin 3-glucoside. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 5422e5429.


González-Manzano, S.; Santos-Buelga, C.; Pérez-Alonso, J.J.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Escribano-

Bailón, M.T. Characterization of the mean degree of polymerization of proanthocyanidins in red wines using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4326-4332

Gonzalez-Paramas, A.M.; Lopes da Silva, F.; Martin-Lopez, P.; Macz-Pop, G.; Gonzalez-Manzano,

S.; Alcalde-Eon, C.; Perez-Alonso, J.J.; Escribano-Bailon, M.T.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Santos-Buelga, C. Flavanol-anthocyanin condensed pigments in plant extracts. Food Chemistry. 2006, 94, 428-436.

Guebailia HA, Chira K, et al. (2006). Hopeaphenol: the first resveratrol tetramer in wines from

North Africa. J. Agric. Food Chem. 54 (25): 9559-64. Håkansson, A.E.; Pardeon, K.; Hayasaka, Y.; Maria de Sa.; Herderich, M. (2003) “Structures and

colour properties of new red wine pigments”.44, 4887-4891. Hansen, S. H., Jensen, A. G., Cornett, C., Bjørnsdottir, Taylor, S., Wright, B., and Wilson, I. D.

“High-performance liquid chromatography on-line coupled to high-field NMR and mass spectrometry for structure elucidation of constituents of Hypericum perforatum L.” Anal. Chem. 71.22 (1999): 5235-5241

HAVLIKOVA, L (HAVLIKOVA, L); MIKOVA, K (MIKOVA, K). ZEITSCHRIFT FUR LEBENSMITTEL-

UNTERSUCHUNG UND-FORSCHUNG Volume: 181 Issue: 5 Pages: 427-432. (1985). HEAT-STABILITY OF ANTHOCYANINS

Hayasaka, Y.; Kennedy, J.A. Mass spectrometric evidence for the formation of pigment polymers

in red wine. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2003, 9, 210-220. Hebrero, E., Santos-Buelga, C., Rivas-Gonzalo, J.C., 1988. High performance liquid

chromatography-diode array spectroscopy identification of anthocyanins of Vitis vinifera variety Tempranillo. American Journal of Enology and Viticulture 39, 227–233.

Heier, A., Blaas, W., Droß, A., & Wittkowski, R. (2002). Anthocyanin analysis by HPLC/ESIeMS.

American Journal of Enology and Viticulture, 53, 78e86. He, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; De Freitas, V. Isolation and Structural

Characterization of New Anthocyanin-Derived Yellow Pigments in Aged Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9598-9603.

He, J.; Oliveira, J; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxovitisins: A New Class of Neutral

Pyranone-anthocyanin Derivatives in Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2010a, 58, 8814–8819.

He, J.; Carvalho, A. R. F.; Mateus, N.; de Freitas, V. Spectral Features and Stability of Oligomeric

Pyranoanthocyanin-flavanol Pigments Isolated from Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2010b, 58, 9249–9258.

He, J.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxidative formation and structural characterisation of new a-pyranone (lactone) compounds of non-oxonium nature originated from fruit anthocyanins. Food Chem. 2011, 127, 984-992.

Hermosín Gutiérrez, I.; García Romero, E. (2004). Antocianos de variedades tintas cultivadas en

La Mancha: perfiles varietales característicos de las uvas y de los vinos monovarietales, y su evolución durante la maduración de la uva. Alimentaria, 352, 127-139.

Hermosín Gutiérrez, I.; Sánchez-Palomo Lorenzo, E.; Vicario Espinosa, A. Phenolic composition

and magnitude of copigmentation in young and shortly aged red wines made from the cultivars Cabernet Sauvignon, Cencibel, and Syrah. Food Chem. 2005, 92, 269-283.


Hidalgo Togores, J. Tratado de enología (Tomo I). Ediciones Mundi- Prensa. Madrid (Espana)

2003. Hillebrand, S., Schwarz, M., & Winterhalter, P. (2004). Characterization of anthocyanins and

pyranoanthocyanins from blood orange (Citrus sinensis (L.) Osbec) juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 7331e7338.

Hong V, Wrolstad R E (1990a) Characterization of anthocyanin-containing colorants in fruit

juices by HPLC/photodiode array detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38 698-707.

Hong V, Wrolstad R E (1990b) Use of HPLC separation/photodiode array detection for

characterization of anthocyanins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38 708-715. HOSHINO, T., MATSUM0TO, u., G0T0, T. and HARADA, N. l9Bz. Evjdence for the self-association

of anthocyanins. IV. pMR spectroscopic evjdence for the vertjcal stack'ing of anthocyanin' molecules. Tetrahedron Lett. 23: 433.

HOSHIN0, T., MATSUMOTO, U. and G0T0, T. l98la. Self-assocjatjon of some anthocyanins in

neutral aqueous solution. Phytochem'istry 2 (g): 1981. HRAZDINA, G (HRAZDINA, G); FRANZESE, AJ (FRANZESE, AJ) Source: PHYTOCHEMISTRY

Volume: 13 Issue: 1 Pages: 225-229 DOI: 10.1016/S0031-9422(00)91299-8 Published: 1974. STRUCTURE AND PROPERTIES OF ACYLATED ANTHOCYANINS FROM VITIS SPECIES

Hua Li *, Anque Guo, Hua Wang. Mechanisms of oxidative browning of wine. Food Chemistry

108 (2008) 1–13 IACOBUCCI, GA (IACOBUCCI, GA); SWEENY, JG (SWEENY, JG) Source: TETRAHEDRON Volume:

39 Issue: 19 Pages: 3005-3038 DOI: 10.1016/S0040-4020(01)91542-X Published: 1983. THE CHEMISTRY OF ANTHOCYANINS, ANTHOCYANIDINS AND RELATED FLAVYLIUM SALTS

Jackson, R. S. Wine Science: Principles, Practice, Perception. 2ª Edicion. Ed. Academic Press, San

Diego (California) 2000. Jackman, R.L. & Smith, J.L. (1996). Anthocyanins and betalains. In: Natural food colourants

(edited by G.F. Hendry & J.D. Houghton). pp. 244–309. London: Blackie Academic & Professional

Jordheim, M.; Fossen, T.; Andersen, O.M. Preparative isolation and NMR characterization of

carboxypyranoanthocyanins. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 3572-3577 Jordheim, M.; Fossen, T.; Andersen, Ø. Characterization of Hemiacetal Forms of Anthocyanidin 3-

O-β-Glycopyranosides. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9340-9346.

Jordheim, M.; Fossen, T.; Songstadt, J. Andersen, Ø. Reactivity of Anthocyanins and

Pyranoanthocyanins. Studies on Aromatic Hydrogen–Deuterium Exchange Reactions in Methanol. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8261-8268.

Jurd, L. Review of polyphenol condensation reactions and their possible occurence in the aging of

wines. Am. J. Enol. Vitic. 1969, 20, 195–197. JURD, L. and WAIS_S, A. C.,_Jr. 1965. Anthocyanjns and related compounds- vI. .Fì,avyì-i-um,

salt-phlorogìucinol condensation prbducts. Tetrahedron 21: 1471.


JURD, L. 1967. - Anthocyanidins and related compounds-XI Catechinfì avyl i um sal t condensati

on reacti ons. Tetrahedron 23: 1057. Jurd, L.; Somers, T. C. The formation of xanthylium salt from proanthocyanidins. Phytochemistry

1970, 9, 419-427. Kong J.M., Chia L.S., Goh N.K., Chia T.F., Brouillard R., Analysis and biological activities of

anthocyanins. Phytochem., 2003, 64, 923–933. Kozerski, L.; Kamieński, B.; Kawecki, R.; Urbanczyk-Lipkowska, Z.; Bocian, W.; Bednarek, E.;

Sitkowski, J.; Zakrzewska, K.; Nielsen, K.T. & Hansen, P.E. (2003) Solution and solid state 13C NMR and X-ray studies of genistein complexes with amines. Potential biological function of the C-7, C-5, and C4'-OH groups. Organic and Biomolecular Chemistry, 1, 20, 3578-3585.

Krishnamurthy, V. (2000) 2J,3J-HMBC: A New Long-Range Heteronuclear Shift Correlation

Technique Capable of Differentiating 2JCH from 3JCH Correlations to Protonated Carbons. Journal of Magnetic Resonance, 146, 1, 232-239.

Lea PJ, Blackwell RD, Joy KW 1992 Ammonia assimilation in higher plants. In (K Mengel, DJ Pilbeam eds) "Nitrogen Metabolism of Plants", Clarendon Press, Oxford, pp 153-186.

Lea PJ, Miflin BJ 1974 An alternative route for nitrogen assimilation in higher plants.

Nature (Lond.) 251: 614-616. Le Gall G, Puaud M, Colquhoun IJ (2001) Discrimination between orange juice and pulp wash by

H-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy: Identification of marker compounds Liao, H.; Cai, Y.; Haslam, E. Polyphenol interactions. Anthocyanins: copigmentation and colour

changes in red wines. Journal of the Science of Food and Agriculture. 1992, 59, 299-305. Lommen, A., Godejohann, M., Venema, D.P., Hollman, P.C.H., Spraul, M., 2000. Application of

directly coupled HPLC–NMR–MS to the identification and confirmation of quercetin glycosides and phloretin glycosides in apple peel. Anal. Chem. 72, 1793–1797.

Lopes-da-Silva, F (Lopes-da-Silva, F); de Pascual-Teresa, S (de Pascual-Teresa, S); Rivas-

Gonzalo, J (Rivas-Gonzalo, J); Santos-Buelga, C (Santos-Buelga, C. EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY Volume: 214 Issue: 3 Pages: 248-253. MAR 2002. Identification of anthocyanin pigments in strawberry (cvCamarosa) by LC using DAD and ESI-MS detection.

Da Silva, FL (Lopes da Silva, Fatima); Escribano-Bailon, MT (Escribano-Bailon, Maria Teresa);

Alonso, JJP (Perez Alonso, JoseJoaquin); Rivas-Gonzalo, JC (Rivas-Gonzalo, Julian C.); Santos-Buelga, C (Santos-Buelga, Celestino). LWT-FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY Volume: 40 Issue: 2 Pages: 374-382 . (2007). Anthocyaninpigments in strawberry

Lu, Sun, and Foo 2000. Novel pyranoanthocyanins from black currant seed, Tetrahedron Letters, Volume 41, p.5975-5978, (2000

Lu, Y., Foo L. Y., and Wong Isolation of the first C-2 addition products of anthocyanins, H. ,

Tetrahedron Letters, Volume 43, p.6621-6624, (2002). Macheix, J. J.; Sapis, J. C.; Fleuriet, A. Phenolic compounds and polyphenoloxidase in relation to

browning in grapes and wines. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1991, 30, 441-486. MANLEY, CH (MANLEY, CH); SHUBIAK, P (SHUBIAK, P. CANADIAN INSTITUTE OF FOOD SCIENCE

AND TECHNOLOGY JOURNAL-JOURNAL DE L INSTITUT CANADIEN DE SCIENCE ET


TECHNOLOGIE ALIMENTAIRES Volume: 8 Issue: 1 Pages: 35-39 Published: 1975.

HIGH-PRESSURE LIQUID-CHROMATOGRAPHY OF ANTHOCYANINS Markakis, P. Stability of anthocyanins in food. En: Anthocyanins as Food Colors. 1a Edicion;

Markakis, P. (Editor). Academic Press, inc., Nueva York (Estados Unidos) 1982; p. 163. Markham, K.R. Techniques of Flavonoid Identification, Academic Press, London, 1982. Markham, K.R.; Chari, V.M. Carbon-13 NMR spectroscopy of flavonoids. En: The Flavonoids:

Advances in Research. Harbone, J.B.; Mabry, T.J. Eds., Chapman & Hall, London, 19, 1982.

MARKHAM, K. R. & MABRY, T. J. (1975) Ultraviolet-visible and proton magnetic resonance

spectroscopy of flavonoids, IN: Harborne J. B., MABRY, T. J. & MABRY, H. (Eds.). The Flavonoids, pp. 45–77. (London: Chapman and Hall).

Mateus, Silva, Vercauteren, y De Freitas, 2001. Occurrence of anthocyanin-derived pigments in

red wines. J. Agr Food Chem 49,4830-4840. Mateus, N.; de Freitas, V. (2001). Evolution and stability of anthocyanin-derived pigments during

port wine aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 5217-5222 Mateus et al., 2002. Identification of anthocyanin-flavanol pigment in red wine by NMR and Mass

spectrometry Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 2110-2116. Mateus, N., De Pascual-Teresa, S., Rivas-Gonzalo, J. C., Santos- Buelga, C., & De Freitas, V.

(2002 b). Structural diversity of anthocyanin- derived pigments in port wines. Food Chemistry, 76, 335e342.

Mateus, N., Carvalho, E., Carvalho, A. R. F., Melo, A., González- Paramás, A. M., Santos-Buelga,

C., et al. (2003). Isolation and structural characterization of new acylated anthocyanin-vinylflavanol pigments occurring in aging red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 277e282.

Mateus, N.; Silva, A. M. S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; de Freitas, V. A new class of

blue anthocyanin-derived pigments isolated from red wines. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1919-1923.

Mateus, N., Oliveira, J., Haettich-Motta, M., & De Freitas, V. (2004). New family of bluish

pyranoanthocyanins. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 299e305. Mateus, N.; Oliveira, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A. P. (2004). NMR

structure characterization of a new vinylpyranoanthocyanin-catechin pigment. Tetrahedron Letters, 45, 3455-3457.

Mateus, N.; Oliveira, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A. P. NMR structure

characterization of a new vinylpyranoanthocyanin-catechin pigment. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3455- 3457

Mateus, N.; Oliveira, J.; Pissarra, J.; González-Paramás, A.M.; Rivas-Gonzalo, J; Santos-Buelga,

C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A new vinylpyranoanthocyanin pigment occurring in aged red wine. Food Chem. 2006, 97, 689–695

Mazza, G.; Miniati, E. (1993). Anthocyanins in fruits, vegetables, and grains. Boca Raton, Florida,

USA: CRC Press. MAZZA, G SAAD, Z; ALBRECHTGARY, AM; CHEMINAT, A. BROUILLARD, R; JOURNAL OF THE

AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Volume: 111 Issue: 7 Pages: 2604-2610. MAR 29


1989. THE COPIGMENTATION REACTION OF ANTHOCYANINS - A MICROPROBE FOR THE

STRUCTURAL STUDY OF AQUEOUS-SOLUTIONS Mazza G., Brouillard R., The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solutions.

Phytochem., 1990, 29, 1097–1102. McDougall, G.J., Fyffe, S., Dobson, P., Stewart, D., 2005. Anthocyanins from red wine: their

stability under simulated gastrointestinal digestion. Phytochemistry 66, 2540e2548. Medina, Boido, Dellacassa, y Carrau, 2005 Yeats interaction with anthocyanins during red wine

fermentation. Am. J Enol. Vitic 56, 104-109. Melo, M.J.; Moura, S.; Roque, A.; Maestri, M. & Pina, F. (2000) Photochemistry of luteolinidin -

''Write-lock-read-unlock-erase'' with a natural compound. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 135, 1, 33-39

Monagas, M.; Bartolomé, B. Anthocyanins and anthocyanin-derived compounds. In Wine

Chemistry and Biochemistry; Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C., Eds.; Springer Science and Business Media: New York, NY, 2009; pp 439-462.

Moncada, M.C.; Fernandéz, D.; Lima, J.C.; Parola, J.; Lodeiro, C.; Folgosa, F.; Melo, J.M. & Pina, F. (2004) Multistate properties of 7-(N,N-diethylamino)-4′-hydroxyflavylium. An example of an unidirectional reaction cycle driven by pH. Organic & Biomolecular Chemistry, 2, 2802-2808.

Montoro, P.; Braca, A.; Pizza, C.; de Tommasi, N. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids isolated from different plant species. Food Chem. 2005, 92, 349-355

Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Colomo, B., & Suárez, J. A. (2003). Pyruvic acid and

acetaldehyde production by different strains of Saccharomyces cerevisiae: Relationship with vitisin A and B formation in red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 7402–7409.

Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J. A. (2007). Formation of vinylphenolic

pyranoanthocyanins by selected yeast fermenting red grape musts supplemented with hydroxycinnamic acids. International Journal of Food Microbiology, 116, 144-152.

Morimoto, S.; Nonaka, G.-I.; Nishioka, I. Tannins and Related Compounds. XXXVIII. Isolation

and Characterization of Flavan-3-ol Glucosides and Procyanidin Oligomers from Cassia Bark (Cinnamomum cassia BLUME). Chem. Pharm. Bull. 1986, 34, 633-642.

Negueruela, A.I.; Echávarri, J.F. (1983) “Colorimetría en vinos de Rioja”, Op. Pur, 16, 97-106. Nicolas et al., 1993. Polyphenols and enzymatic browning, p. 165-175 A. Scalbert (ed)

Polypholicphenomena INRA Editios, Paris.

Office International de la Vigne et du Vin (2003). Détermination par CLHP de neuf anthocyanes

principales dans le vin rouge et rosé. Resolution OENO 22/2003. Oliveira, J., Santos-Buelga, C., Silva, A., De Freitas, V., & Mateus, N. (2006). Chromatic and

structural features of blue anthocyaninderived pigments present in port wine. Analytica Chimica Acta, 563, 2-9.

Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. Reaction between 405 hydroxycinnamic

acids and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6349- 6356.


Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. Reaction between hydroxycinnamic acids

and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6349- 6356.

Oliveira, J.; Mateus, N.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. Equilibrium Forms of Vitisin B Pigments in

an Aqueous System Studied by NMR and Visible Spectroscopy. J. Phys. Chem. B 2009, 113, 11352-11358.

Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva, A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de Freitas, V.

Pyranoanthocyanin Dimers: A New Family of Turquoise Blue Anthocyanin-Derived Pigments Found in Port Wine. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5154–5159

Oliveira, J.; Mateus, N.; de Freitas, V. Synthesis of a new bluish pigment from the reaction of a

methylpyranoanthocyanin with sinapaldehyde. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 1996-2000. Oliveira, J.; Mateus, N.; Rodriguez-Borges, J. E.; Cabrita, E. J.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V.

Synthesis of a new pyranoanthocyanin dimer linked through a methyl-methine bridge. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 2957-2960.

Oliveira, J.; Petrov, V.; Parola, A. J.; Pina, F.; Azevedo, J.; Teixeira, N.; Brás, N. F.; Fernandes,

P. A.; Mateus, N.; Ramos, F. J.; de Freitas, V. Chemical behavior of methylpyranomalvidin-3-O-glucoside in aqueous solution studied by NMR and UV-vis spectroscopy. J. Phys. Chem. B 2011, 115, 1538-1545

Piffaut, B.; Kader, F.; Girardin, M.; Metche, M. Comparative degradation pathways of malvidin

3,5-diglucoside after enzymatic and thermal treatments. Fdo Chem. 1994, 50, 115-120. Pissarra, J.; Mateus, N.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; De Freitas, V. Reaction between

malvidin 3-glucoside and (þ)-catechin in model solutions containing different aldehydes. J. Food Sci. 2003, 68, 476–481.

Pissarra, J.; Lourenc-o, S.; González-Paramás, A. M.; Mateus, N.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M.

S.; de Freitas, V. Structural characterization of new malvidin 3-glucoside-catechin aryl/alkyl-linked pigments. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 5519–5526.

Pissarra, J.; Lourenco, S.; Gonzalez-Paramas, A. M.; Mateus, N.; Santos Buelga, C.; Silva, A. M.

S.; De Freitas, V. Isolation and structural characterization of new anthocyanin-alkyl-catechin pigments. Food Chem. 2005, 90 (1-2), 81–87.

Prasain, J.K.; Wang, C.-C. & Barnes, S. (2004) Mass spectrometric methods for the determination

of flavonoids in biological samples. Free Radical Biology & Medicine, 37, 9, 1324-1350. Pussa, T., Floren, J., Kuldkepp, P., Raal, A. Survey of grapevine Vitis vinifera stem polyphenols by

liquid chromatography-diode array detection-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006, 54, 7488-7494.

Queiroz E. F. Wolfernder J. L., Atindehou K. K. Traore D and Hostetmann K 2002 On line identification of the antifungal constituentas of Erythrina vogelii by liquid chromatography with tandem mass spectrometry, ultraviolet absorbance detection and nueclear magnetic resonance spectrometry combined with liquid chromatography micro flactionation J Chromatogr A 974: 123-134.

Remy, S.; Fulcrand, H.; Labarbe, B.; Cheynier, V.; Moutounet, M. First confirmation in red wine

of products resulting from direct anthocyanintannin reactions. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2000, 80, 745-751.

Remy-Tanneau, S.; Le Guerneve, C.; Meudec, E.; Cheynier, V. Characterization of a Colorless

Anthocyanin-Flavan-3-ol Dimer Containing Both Carbon-Carbon and Ether Interflavanoid


Linkages by NMR and Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry.

2003, 51, 3592-3597. Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I. Formation of Hydroxyphenyl-

Pyranoanthocyanins in Grenache Wines: Precursor Levels and Evolution during Aging. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4883-4888

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P. Pyranoanthocyanins: An overview on structures,

occurrence and pathways of formation. Trends Food Sci. Technol. 2007, 18, 526-534. Rentzsch, M; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Blanco-Vega, D.; Hermosín-Gutiérrez, I. “Survey on

the Content of Vitisin A and Hydroxyphenyl- Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines”. Food Chemistry 2009.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P; Blanco-Vega, D.; Hermosín-Gutiérrez, I. Survey on

the content of vitisin A and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines. Food Chem. 2010, 119, 1426-1434.

Revilla, I.; Perez-Margarino, S.; Gonzalez-San Jose, M.L.; Beltran, S. Identification of

anthocyanin derivatives in grape skin extracts and red wines by liquid chromatography with diode array and mass spectrometric detection. Journal of Chromatography A. 1999, 847, 83-90.

Ribéreau-Gayon, P.; Stonestreet, E. (1965). “Le dosage des anthocyanes dans le vin rouge. Bull”.

Soc. Chim. Fr, 9, 2649. Ribereau-Gayon, P. The anthocyanins of grapes and wines. En: Anthocyanins as Food Colors. 1a

Edicion; Markakis, P. (Editor). Academic Press, inc, Nueva York (Estados Unidos) 1982; p.209.

Ribéreau Gayon et al., 1998 Traité d`Oenologie. 2 Chimie du vin. Stabilitation et traitements.

Editions la Vigne. Paris. Ribereau-Gayon, P.; Dubourdieu, D.; Doneche, B.; Lonvaud, A. Handbook of Enology. Volumen 1.

The Microbiology of Wine and Vinifications. 1a Edicion. John Wiley & Sons, Chichester (Reino Unido) 2000. pp. 454.

Rivas-Gonzalo, J. C.; Bravo-Haro, S.; Santos-Buelga, C. Detection of Compounds Formed through

the Reaction of Malvidin 3-Monoglucoside and Catechin in the Presence of Acetaldehyde. J. Agric. Food Chem. 1995, 43, 1444-1449.

Rivas-Gonzalo JC. 2003. Analysis of anthocyanins. In Methods in Polyphenol Analysis, Santos-

Buelga C and Williamson G (eds). The Royal Society of Chemistry: Cambridge; 338–358. Rivas Gonzalo J C; Santos –Buelga, C; De Freitas V; Mateus N; Silva AMS; Journal of Agricultural

and Food Chemistry voume 51 Issue 7 Pages 1919-1923 Marzo 2003. anew class of blue

anthocyanin-derived pigments isolated from red wines. Roggero et al., 1987 Etude par CLHP de la reaction glucoside de malvidine.acétaldéhide composé

phénolique. Conn vigne vin 21,163-168. Romano, P., Suzzi, G., Turbanti, L., Polsinelli, M., 1994. Acetaldehyde production in

Saccharomyces wine yeasts. FEMS Microbiology Letters 118, 213–218. Romero, C.; Bakker, J. (2000 a). Effect of storage temperature and pyruvate on the kinetics of

anthocyanin degradation, vitisin A derivative formation, and color characteristics of model solutions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 2135-2141


Romero, C.; Bakker, J. (2001). Anthocyanin and colour evolution during maturation of four port

wines: Effect of pyruvic acid addition. Journal of the Science of Food and Agriculture, 81, 252-260

Salas, E.; Atanasova, V.; Poncet-Legrand, C.; Meudec, E.; Mazauric, J. P.; Cheynier, V.

Demonstration of the occurrence of flavanol–anthocyanin adducts in wine and in model solutions. Anal. Chim. Acta 2004, 513, 325–332.

Santos-Buelga, C., Bravo-Haro, S., & Rivas-Gonzalo, J. C. (1995). Interactions between catechin

and malvidin-3-monoglucosyde in model solutions. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A, 201, 269–274.

Santos-Buelga et al., 1999 Contribution to the identification of the pigments responsible for the

browing of the anthocyanin-flavanol solutions. Eur. Food Res. Thecnol. 209, 411-415. Sapers et al., 1987. Measurement of enzymatic browning at cut surfaces and in juice of raw apple

and pear fruits. J. food Sci 52, 1258. Sarni-Manchado, P.; Fulcrand, H.; Souquet, J. M.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Stability and color

of unreported wine anthocyanin-derived pigments. J. Food Sci. 1996, 61, 938–941 Saucier, C.; Bourgeois, G.; Vitry, C.; Roux, D.; Glories, Y. Characterization of (+)-catechin-

acetaldehyde polymers: A model for colloidal state of wine polyphenols. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1045-1049.

Saucier, C (Saucier, C); Guerra, C (Guerra, C); Pianet, I (Pianet, I); Laguerre, M (Laguerre, M);

Glories, Y (Glories, Y). PHYTOCHEMISTRY Volume: 46 Issue: 2 Pages: 229-234 DOI: 10.1016/S0031-9422(97)00268-9 Published: SEP 1997. (+)-Catechin-acetaldehyde condensation products in relation to wine-ageing

Saucier, C., Little, D., & Glories, Y. (1997). First evidence of acetalde-hyde-flavanol condensation

products in red wine. American Journal of Enology and Viticulture, 48, 370–374. Scheffeldt et al., 1978 Process for enhancing the sunlight stability of anthocyanic pigments J.

Food Sci., 43, 517. Schwarz, M.; Wabnitz, T. C.; Winterhalter, P. Pathway Leading to the Formation of Anthocyanin-

Vinylphenol Adducts and Related Pigments in Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2003b, 51, 3682-3687

Schwarz, M.; Jerz, G.; Winterhalter, P. Isolation and structure of pinotin A, a new anthocyanin

derivative from Pinotage wine. Vitis(2003), 42, 105-106 Schwarz, M.; Jerz, G.; Winterhalter, P. (2003a) “Isolation and structure of Pinotin A, a new

anthocyanin derivative from Pinotage wine”. Vitis 2003, 42, 105-106.

Schwarz, M.; Quast, P.; von Baer, D.; Winterhalter, P. (2003c). “Vitisin A content in Chilean wines from Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon and contribution to the color of aged red wines”. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 6261-6267

Schwarz, M., Wray, V., & Winterhalter, P. (2004). Isolation and identification of novel

pyranoanthocyanins from black carrot (Daucus carota L.) juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 5095-5101.

Schwarz, M.; Hofmann, G.; Winterhalter, P. (2004). Investigations on anthocyanins in wines from

Vitis vinifera cv. Pinotage: Factors influencing the formation of pinotin A and its correlation with wine age. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 498-504


Schwarz, M.; Picazo-Bacete, J.J.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I. Effect of copigments

and grape cultivar on the colour of red wines fermented after the addition of copigments. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 8372-8381.

Shenoy, V.R. (1993). Anthocyanins - Prospective food colours. Current Science, 64, 575–579. Singleton, V. L. (1987). Oxygen with phenols and related reactions in musts, wines and model

systems: Observations and practical implications. American Journal of Enology and Viticulture, 38, 69–77.

Smallcombe, S. H. , Patt, S. L. & Keifer, P. A. (1995). WET solvent suppression and its applications to LC NMR and high-resolution spectroscopy. J Magn Reson A 117, 295-303.

Somers, T.C.; Evans, M.E. (1977). “Spectral evaluation of young red wines: anthocyanins

equilibria, total phenolics, free and molecular SO2, chemical age”. J. Sci. Food Agric, 28, 581

Sousa et al (2007) Structural and chromatic characterization of a new malvidin-3-glucoside-

vinillyl-catechin pigment. Food Chem 102, 1344-1352. Strack, D.; Heilemann, J.; Wray, V.; Dirks, H. Structures and accumulation patterns of soluble

and insoluble phenolics from Norway spruce needles. Phytochemistry 1989, 28, 2071-2078.

Strack, D.; Wray, V. The anthocyanins. En: The Flavonoids. Advances in research since 1986. 1a

Edicion; Harborne, J.B. (Editor). Chapman Hall. Londres (Reino Unido) 1994; p.1. Timberlake et al., 1976 Interaction between anthocyanins, phenolic compounds and acetaldehyde

and significance in red wines. Am J enol Vitic. 27, 97-105. Varidel, P, WolfenderJL, LACHAVANNE J B, and ostettman K 2004 Identification of the polar

constituents of Potamogeton species by HPLC-UV with post column derivation, HPLC-MSn and HPLC-NMR, and isolation of a new ent-labdane diglycoside, Phytochemistry 65: 2401-2410

Vidal, J.-C., Boulet, J.-C. and Moutounet, M. (2003). Les apports d’oxygène au cours des

traitements des vins. Bilan des observations sur site, 2ème partie. Revue Française d’Oenologie. 201:32–38.

Vidal, S., Cartalade, D., Souquet, J.M., Fuicrand, H. & Cheynier, V., 2002. Changes in

proanthocyanidin chain length in winelike model solutions. J. cientfficos y practicos. Mundi-Prensa, Madrid. Agric. Food Chem. 50, 2261-2266.

Vilegas et al. 2000. Application o fon-line C30 RP-HPLC-NMR for the análisis of flavonoids from leaf

extract of Mayatemus aquifolium, Phytochem Anal 11: 317-321. Vitrac, X., Castagnino, C., Waffo-Téguo, P., Delaunay, J. C., Vercauteren, J., Monti, J. P., Defeux,

G., and Mérillon, J. M. 2001. Polyphenols newly extracted in red wine from southwestern France by centrifugal partition chromatography. J. Agric. Food Chem. 49:5934–8.

Vivar-Quintana, A. M.; Santos-Buelga, C.; Francia-Aricha, E.; Rivas-Gonzalo, J. C. Formation of

anthocyanin-derived pigments in experimental red wines. Food Sci. Technol. Int. 1999, 5, 347- 352.

Vivar-Quintana, A. M., Santos-Buelga, C., & Rivas-Gonzalo, J. C. (2002). Anthocyanin-derived

pigments and colour of red wines. Analytica Chimica Acta, 458, 147e155.


Wang, H.; Race, E.J.; Shrikhande, A. J. Characterization of Anthocyanins in Grape Juices by Ion

Trap Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1839-1844.

Wildenradt, H. L. and Singleton, V. L. (1974). The production of aldehydes as a result of

oxidation of polyphenolic compounds and its relation to wine aging. American Journal of Enology and Viticulture. 25:119–126.

WILLIAMS, M (WILLIAMS, M); HRAZDINA, G (HRAZDINA, G). JOURNAL OF FOOD SCIENCE

Volume: 44 Issue: 1 Pages: 66-68 Published: 1979. ANTHOCYANINS AS FOOD COLORANTS - EFFECT OF PH ON FORMATION OF ANTHOCYANIN-RUTIN COMPLEXES

Wilska-Jeska, J.; Korzuchowska, A. 1996. Anthocyanins and chlorogenic acid copigmentation:

Influence on the color of strawberry and chokeberry juices. Zlebensm Unters Forsch 203: 38-42.

Wolfender, J.L., Ndjoko, K., Hostettmann, K., 1998. LC/NMR in natural products chemistry.

Current Organic Chemistry 2, 575– 596. Wolfender, J.-L., Ndjoko, K., Hostettmann, K., 2003. Liquid chromatography with ultraviolet

absorbance-mass spectrometric detection and with nuclear magnetic resonance spectrometry: a powerful combination for the on-line structural investigation of plant metabolites. Journal of Chromatography. A 1000, 437– 455.

ÍNDICE DE

FIGURAS


ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Perfiles de antocianos monómeros (cromatografía HPLC) característicos de las uvas tintas de la variedad Cencibel (A) y de los vinos varietales elaborados con ellas (B).

Figura 2 Estructura de los principales ácidos hidroxibenzoicos presentes en la uva y el vino. Figura 3 Ácidos hidroxicinamoil tartáricos. Figura 4 Resveratrol. Figura. 5 Estilbenos y sus derivados Figura 6 Estructuras de la 2-fenilbenzopirona y 2-fenilbenzopirano. Figura 7 Antocianos monómeros (3-monoglucósidos de antocianidinas) presentes en

las uvas y vinos de las variedades de Vitis vinifera. Figura 8. Estructura de los flavan-3-oles monómeros de la uva Figura 9. Estructura de las proantocianidinas de la uva (R=H, OH). Figura 10. Reacción de hidrólisis de un tanino condensado, liberando la unidad

inferior intacta y la superior o superiores en forma de carbocatión. Figura 11. Oxidación de ortodifenoles. Figura 12. Reducción y condensación de las quinonas (Dangles et al., 2006)

Figura 13. Estructura del esqueleto flavonoide de los flavonoles hallados en uvas Vitis Vinifera. Figura 14. Color y equilibrios en disolución acuosa de los antocianos monómeros. Figura 15. Mecanismo de degradación térmica de los antocianos. (1) Ácido Siríngico, (2) ácido 2,4,6 trihidroxibenzoico. Figura 16. Reacciones oxidativas de la degradación del 3-monoglucósido de

Malvidina. Figura 17. Antociano monómero. Figura 18. Formación de un complejo de copigmentación a partir de un pigmento (antociano monómero en su forma de catión flavilio) y de un copigmento (flavonol). Figura 19. Efectos de la copigmentación de los antocianos monómeros en un vino joven de la variedad Cencibel Figura 20 Estructura de auto-asociación entre dos moléculas de antociano head to

head (izq.) y head to tail (dcha.). Figura 21. Mecanismo de condensación directa antociano-flavanol (A-F). Figura 22. Mecanismo de condensacion directa flavanol-antociano (F-A). Figura 23. Mecanismo de las reacciones flavanol-antociano y flavanol-flavanol inducidas por el acetaldehído. Figura 24. Reacciones de los flavanoles con el ácido glioxílico. Figura 25. Mecanismo propuesto para la reacción entre el ácido pirúvico y la

malvidina 3-glucósido. Figura 26. Reacción entre la malvidina 3-glucósido y el acetaldehído para dar la Vitisina B. Figura 27. propuesta de formación de vitisin B a partir del viniloxitrimetilsilano. Figura 28. Mecanismo de formación del metil piranoantociano a partir del acido acetoacético.

Figura 29. Formación de vinilfenoles a partir de ácidos hidroxicinámicos. Figura 30. Mecanismo de formación del Pinotin A.

Figura 31. Formación de vinilflavanol-piranoantocianos. Figura 32. Reacción entre la vitisina A y los ácidos hidroxicinámicos. Figura 33. Mecanismo propuesto para la formación de Portísina (Mateus et al 2003).


Figura 34. Mecanismo propuesto para la formación de piranoantocianos oxidados

(Oxovitisinas).

Figura 35. Mesomería entre los anillos piranósicos de los piranoantocianos. Figura 36 Diagrama EIC de la pirano-malvidina formada con distintos compuestos. Figura 37. espectro UV-vis de los antocianos monómeros Figura 38: Espectro UV-vis de los piranoantocianos formados por reacción con ácido pirúvico.

Figura 39: Cambios producidos en el espectro UV-vis de la malvidina debidos a la acilación. Figura 40: espectro de los vinilcatecolpiranoantocianos Figura 41: Espectro Ms/Msn de los vinilcatecolpiranoantocianos.

RESULTADOS Y

DISCUSIÓN

CAPÍTULO I

Resultados y Discusión. Capítulo I.


CAPÍTULO I ANÁLISIS DE ANTOCIANOS Y PIRANOANTOCIANOS

EN VINOS ROSADOS

JUSTIFICACIÓN

Los vinos rosados basan su calidad en la conjunción de una serie de

características que quedan a medio camino entre un vino blanco y un vino tiento. Por

una parte, la presencia de aromas afrutados propios de vinos jóvenes elaborados a

baja temperatura (igual que en el caso de los vinos blancos afrutados), junto con el

aporte de aromas varietales a frutas de baya procedentes e los hollejos de las uvas

tientas con que se elaboran. Por otro lado, la característica coloración de estos vinos,

con una gama que pueden ir desde tonos rojo-violeta hasta naranjas.

Los vinos rosados son quizá uno de los tipos de vinos más delicados, cuya

calidad aromática y cromática decaen con mayor celeridad, siendo escasos los casos

de vinos rosados que resistan un envejecimiento de más de 1-2 años. Entre las

características que más rápido evolucionan en los vinos rosados se encuentra su color,

con una tendencia a virar hacia tonos anaranjados con el tiempo. Esta tonalidad

anaranjada se puede relacionar con la formación de pigmentos antociánicos de

naturaleza polimérica (las uniones entra antocianos y taninos) y también con la

formación de pigmentos del tipo piranoantociano, generados por reacción entre los

antocianos originales de la uva con derivados del ácido hidroxicinámico.

La formación de piranoantocianos en vinos tintos ha sido estudiada de una

forma más exhaustiva y parece cobrar gran importancia en vinos tintos muy

envejecidos. No obstante, la formación de este tipo de pigmentos en vinos rosados

apenas si se ha estudiado, y existen bastantes indicios de que pueden jugar un papel

importante en el color de los vinos rosados, incluso al poco tiempo de su elaboración,

sin esperar un envejecimiento prolongado.



Por eso en este capitulo se va a estudiar el contenido en pigmentos

antociánicos, con especial énfasis en los piranoantocianos, de vinos rosados

elaborados en Castilla La Mancha en las vendimias de 2006 y 2007 mediante análisis

cromatográfico por HPLC. Así mismo, se va a medir el color de estos vinos, en el

sistema CIELAB, y se va a indagar si existe alguna relación entre el color de un vino

rosado y su composición en pigmentos antociánicos.

Con el estudio del contenido en compuestos fenólicos y de las características

cromáticas en los vinos rosados elaborados en Castilla-La Mancha, se pretende

alcanzar los siguientes objetivos.

-Profundizar en el conocimiento de la composición fenólica de los vinos de

Castilla-La Mancha

-Analizar la posible relación del color de vinos rosados de Castilla-La Mancha con

su composición en compuestos fenólicos que pueden influir en éste.

-Evaluar la influencia de la variedad de uva y de la vendimia en las características

cromáticas y la composición fenólica de los vinos rosados.

EL COLOR DE LOS VINOS TINTOS Y ROSADOS Y MEDIDA DE ESTE

El color del vino es un factor de calidad muy importante, para todo tipo de

vinos (blancos, rosados y tintos). El color es uno de los aspectos organolépticos más

importantes de un vino, no sólo porque es la primera e inmediata imagen de éste,

sino también porque es un indicador de otros aspectos organolépticos, como su aroma

y su sabor. El color del vino también es indicativo de la edad de éste y de los procesos

a los que se ha visto sometido a lo largo de su elaboración y almacenamiento.

El color del vino se define mediante una serie de términos basados en medidas

de radiación, energía luminosa o en la sensación de color que se forma en la mente.

Conforme se fue desarrollando la espectrofotometría, la técnicas de medida de color

se fueron mejorando, culminando con las conclusiones de la Comisión internacional de



Iluminación (CIE) que proporcionaron los medios para definir el color de cualquier

líquido (medio transparente) de una forma mucho más exacta.

Las características cromáticas de un vino están definidas por su LUMINOSIDAD

y su CROMATICIDAD, cuya medida en las condiciones del método de referencia del

CIE supone realizar un barrido espectral amplio, midiendo las absorbancias a muchos

valores de longitud de onda y empleando complejas ecuaciones. No obstante la

Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) propuso para los vinos una

simplificación del método de referencia, basado en los valores de absorbancia de sólo

cuatro longitudes de onda discretas. Recientemente investigadores españoles han

propuesto una mejora del método simplificado, con otras longitudes de onda a las que

medir las absorbancias y nuevas ecuaciones de transformación, que pretenden

resolver las discrepancias observadas con el método OIV en vinos tintos muy

intensamente coloreados, Sin embargo, siguen utilizando habitualmente en bodega

otros parámetros como la Intensidad Colorante (IC) y la Tonalidad (T) para vinos

tintos, y la medida de la absorbancia a 420 nm para vinos blancos

Sistema CIE

Se trata del sistema estándar de medida del color con el cual se deben

comparar el resto de los sistemas. Fue propuesto por la CIE en 1931, basándose en la

teoría de la percepción tricromática. El sistema CIE especifica el color definido por tres

parámetros (X; Y; Z) llamados parámetros triestímulo, que representan la cantidad de

los tres colores primarios: rojo, verde y azul. Para calcularlos, la CIE recomienda

registrar el espectro entre 380 y 700 nm a intervalos de 1, 5 ó 10 nm y aplicar las

siguientes ecuaciones:

X = k∑τλLλyλΔλ

Y = k∑τλLλyλΔλ

Z = k∑τλLλyλΔλ



En el caso de que el color se deba a la transmisión de luz por un objeto, como

en el vino (τλ) es una transmitancia espectral de la muestra para cada longitud de

onda, (Lλ)

la emisión espectral de la muestra para esa misma λ, (xλ, yλ, zλ) son funciones

matemáticas de color relacionadas con el observador estándar elegido, y (Δλ) el

intervalo de medida. Para los vinos, la CIE propuso un método aproximado más simple

que permitía calcular los parámetros triestímulo (Tλ = transmitancia a una λ

determinada):

X= 0.42 T625 + 0.35 T550 + 0.21 T445

Y= 0.20 T625 + 0.63 T550 + 0.17 T495

Z= 0.24 T495 + 0.94 T445

Una vez obtenidos estos parámetros se calcula la proporción de cada uno de ellos:

X = X / (X+Y+Z)

Y = Y / (X+Y+Z)

Z = Z / (X+Y+Z)

Los valores resultantes (x, y, z) se denominan coordenadas tricromáticas. El

diagrama cartesiano donde se representa (x) e (y) se denomina diagrama de

cromaticidad donde cada punto (x, y) proporciona la cromaticidad de la muestra,

definida por la longitud de onda dominante (correspondiente a la percepción sensorial

del matiz) y por la pureza (correspondiente a la percepción de saturación). La tercera

dimensión la proporciona (z) que corresponde al porcentaje de luminosidad.

Sistema CIELAB

En el año 1971 la CIE desarrolló un nuevo espacio cromático a partir de

transformaciones no lineales de los valores triestímulo del sistema CIE de 1931. En

este nuevo sistema el espacio se define mediante coordenadas rectangulares (L*, a*,



b*) junto con otro espacio de coordenadas cilíndricas (L*, C*, h*). Las relaciones

entre las coordenadas CIELAD y las CIE son:

Los parámetros (x, y, z) son los valores triestímulo de la muestra y los valores

(x0, y0, z0) lo son del iluminante. El eje L*, representa la luminosidad. El eje a*, una

medida del componente rojo (valores positivos) y verde (valores negativos). El eje b*,

mide el componente amarillo (positivo) y azul (negativo). A partir de los valores de a*

y b* se calculan los valores psicométricos C* (cromaticidad) y h* (ángulo de tono),

relacionado con el término tonalidad o matiz de color:

C* = (a*2 + b*2)½

h* = arctg (b*/a*)

En este sistema las diferencias de color global entre dos muestras (∆E) se

calculan con la expresión:

∆E = [(∆L*)2 + (∆a*)2 + (∆b*)

161163

1

0

*

y

yL

3

1

0

3

1

0

* 500

y

y

x

xa

3

1

0

3

1

0

* 200

z

z

y

yb



PARTE EXPERIMENTAL

Muestras de vinos rosados

Las muestras de vinos comerciales fueron proporcionadas por el Consejo

Regulador de la Denominación de Origen “Mancha”, procedentes de las muestras que

se someten a cata para poder acogerse a esta D.O. Y también muestras de vinos de

bodegas colaboradoras.

Una vez recogidas las muestras, se tomó una alícuota que fue congelada hasta el

momento de su análisis, anotando todos los datos necesarios para identificar la

muestra, así como la fecha en que se guardó congelada.

Otras muestras fueron proporcionadas por el IVICAM (Instituto de la Vid y el Vino

de Castilla-La Mancha); las muestras fueron entregadas congeladas, en botes de

plástico de 25 ml las cuales procedían de las catas que habitualmente se realizaron en

esta institución a lo largo de los años 2006 y 2007.

Muestras

D.O.

Mancha

Variedad Año Localidad Provincia

1 TEMPRANILLO 2006 La Roda Albacete

2 no lo pone 2006 Pedro Muñoz Ciudad Real

3 no lo pone 2006 Santa cruz de la zarza Toledo

4 CABERNET SAUVIGNON 2006 Quintanar de la Orden Toledo

5 CABERNET SAUVIGNON 2006 Alcazar de San Juan Ciudad Real

6 CABERNET SAUVIGNON 2006 Villarrobledo Ciudad Real

7 TEMPRANILLO 2006 Noblejas Toledo


9 TEMPRANILLO 2006 Quintanar de la Orden Toledo

10 TEMPRANILLO 2006 Almagro Ciudad Real

11 TEMPRANILLO 2006 Tarazona de la mancha Albacete

12 TEMPRANILLO 2006 Manzanares Ciudad Real

13 TEMPRANILLO 2006 Villarrubia de los ojos Ciudad Real

14 CABERNET SAUVIGNON 2006 Tomelloso Ciudad Real

15 TEMPRANILLO 2006 Campo de Criptana Ciudad Real



16 TEMPRANILLO 2006 Socuéllamos Ciudad Real

17 TEMPRANILLO 2006 Las Mesas Cuenca

18 TEMPRANILLO 2005 Pedro Muñoz Ciudad Real

19 CENCIBEL/CABERNET

SAUVIGNON (50:50) 2006 Carrión Ciudad Real

20 TEMPRANILLO/SYRAH 2006 Villarrobledo Albacete

21 TEMPRANILLO 2006 Tomelloso Ciudad Real

22 no lo pone tradicional Villarrobledo Albacete

23 no lo pone tradicional Noblejas Toledo


25 no lo pone 2006 Puebla de Almoradiel Toledo

26 no lo pone tradicional Cinco Casas Ciudad Real

27 CENCIBEL tradicional Campo de Criptana Ciudad Real

28 TEMPRANILLO 2006 Villacañas Toledo







35 TEMPRANILLO-SYRAH 2006 Villarrobledo Albacete



38 no lo pone 2006 Corral de Almaguer Toledo


40 GARNACHA 2006 Villasequilla Toledo

41 no lo pone 2006 Socuéllamos Ciudad Real

42 CENCIBEL 2006 San Clemente Cuenca

43 SYRAH 2006 Tomelloso Ciudad Real

44 CENCIBEL 2006 Corral de Almaguer Toledo

45 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real


47 CENCIBEL 2006 Manzanares Ciudad Real

48 CENCIBEL 2006 Tarazona de la mancha Albacete


50 GARNACHA 2006 Villarrobledo Albacete

51 MERLOT 2006 Yepes Toledo


53 CENCIBEL 2006 Fuente de Pedro Naharro Cuenca

54 CENCIBEL 2006 Fuente de Pedro Naharro Cuenca

55 CENCIBEL 2006 Quintanar de la Orden Toledo




57 CENCIBEL 2006 Pedro Muñoz Ciudad Real



60 CENCIBEL 2006 Quintanar de la Orden Toledo

61 GARNACHA 2006 Manzanares Ciudad Real

62 CENCIBEL (no está claro en la

etiqueta) 2006 Tomelloso Ciudad Real




66 CENCIBEL 2006 Almagro Ciudad Real

67 CENCIBEL 2006 Noblejas Toledo



70 CENCIBEL 2006 Tarazona de La Mancha Albacete

71 GARNACHA 2006 Socuéllamos Ciudad Real



74 CENCIBEL 2006 La Roda Albacete


76 CENCIBEL 2006 La Roda Albacete

77 CENCIBEL 2006 Villarrobledo Ciudad Real

78 CABERNET SAUVIGNON 2006 Socuéllamos Ciudad Real


80 CENCIBEL 2006 Tomelloso Ciudad Real


82 TEMPRANILLO 2006 Villarrobledo Albacete

83 CABERNET SAUVIGNON 2006 Socuéllamos Ciudad Real

84 GARNACHA 2006 Villarta de San Juan Ciudad Real

85 GARNACHA 2006 Las Mesas Cuenca


87 semidulce (no pone variedad) 2007 Santa Cruz de la Zarza Toledo



90 CENCIBEL 2007 Villarrubia de los Ojos Ciudad Real


92 no lo pone 2007 Socuéllamos Ciudad Real


94 CENCIBEL 2007 Herencia Ciudad Real

95 no lo pone 2007 Corral de Almaguer Toledo




97 TEMPRANILLO-C.SAUVIGNON

(50:50) 2007 Carrión Ciudad Real

98 no lo pone 2007 Villalgordo del Júcar Albacete

99 CENCIBEL 2007 Villalgordo del Júcar Albacete

100 SYRAH 2007 Tomelloso Ciudad Real

101 TEMPRANILLO 2007 Ontur Albacete

102 GARNACHA 2007 El Povencio Cuenca

103 CABERNET SAUVIGNON 2007 Villarrobledo Albacete

104 no lo pone 2007 Puebla de Almoradiel Toledo

105 GARNACHA (agricultura

ecológica) 2007 Socuéllamos Ciudad Real


107 no lo pone 2007 Tomelloso Ciudad Real



110 TEMPRANILLO 2007 Noblejas Toledo

111 GARNACHA 2007 La Villa de don Fadrique Toledo

112 GARNACHA (agricultura

ecológica) 2007 Socuéllamos Ciudad Real


114 no lo pone 2007 Villarta de San Juan Ciudad Real

115 TEMPRANILLO-SYRAH 2007 Villarrobledo Albacete


117 no lo pone 2007 Noblejas Toledo

118 CENCIBEL 2007 Daimiel Ciudad Real



121 sin varietal 2007 El Toboso Toledo



Muestras

IVICAM

Variedad Año Localidad Provincia


239 GARNACHA-TEMPRANILLO 2006 Socuellamos Ciudad Real

240 BOBAL-TEMPRANILLO Villamalea Albacete

241 MONASTRELL 2006 Fuenteálamo Albacete

242 CABERNET SAUVIGNON-

SHIRAZ-GARNACHA 2006 Almansa Albacete


245 CENCIBEL Tarazona Albacete

246 SHYRAZ 2006 Ontur Albacete

248 SHYRAH 2006 Tomelloso Ciudad Real

249 TEMPRANILLO 2006 Valdepeñas Ciudad Real

250 BOBAL 2006 Villamalea Albacete


252 TEMPRANILLO 2006 Qintanar de la Orden Toledo

253 BOBAL 2006 Iniesta Cuenca

254 CENCIVEL-CABERNET

SAUVIGNON 2006 Carrión de Calatrava Ciudad Real

255 2006 Socuellamos Ciudad Real

256 TEMPRANILLO 2006 Socuellamos Ciudad Real






284 BOBAL 2006 Granja de Iniesta Cuenca

285 BOBAL 2006 Motilla del Palancar Cuenca

286 GARNACHA 2006 Casas de Fernando Alonso Cuenca

287 BOBAL 2006 Casas de Benitez Cuenca

288 BOBAL 2006 Iniesta Cuenca

289 2006 Sisante Cuenca

290 TEMPRANILLO 2006 Motilla del Palancar Cuenca

291 BOBAL 2006 Quintanar del Rey Cuenca

292 BOBAL 2006 Villarta Cuenca

293 BOBAL 2006 Castilleja de Iniesta Cuenca

294 MERLOT 2006 Monreal del llano Cuenca



Características cromáticas, Parámetros del Sistema CIELAB

Se calcularon las coordenada que describen el color (a*, b*, L*, C*, h*) a partir de

los valores triestímulo (X, Y, Z). Sin embargo no se van a utilizar las ecuaciones

simplificadas propuestas por la CIE en 1931 con iluminante C y observador estándar de 2º,

y aprobadas por la OIV, ya que Negueruela y Echávarri (1983) han confirmado que con

dicho método se pueden cometer importantes errores en el cálculo de las coordenadas del

color, especialmente en vinos de color intenso. Además la OIV ya expuso (1994) la

necesidad de cambiar dicho método usando el espacio CIELAB. Por ello se ha adoptado el

método propuesto por Ayala y col. (1997) para vinos tintos utilizando el iluminante D65 y

observador estándar de 10º, y que está en estos momentos siendo objeto de estudio por la

OIV para establecerlo como método de referencia internacional.

Las ecuaciones para el cálculo de los valores triestímulo propuestas por este autor

son:

X = 14.172 T440 + 28.583 T540 + 52.727610 – 0.462

Y = 9.005 T440 + 62.965 T540 + 28.168610 – 0.063

Z = 94.708 T440 + 15.889 T540 + 5.233610 + 1.777

El método consistiría en medir la absorbancia del vino a 440, 540 y 610 nm en

cubetas de 2 mm de espesor frente a agua como blanco. Las absorbancias obtenidas se

corregirían para 10 mm de espesor, se calcularían las transmitancias y se aplicarían las

expresiones anteriores para obtener los valores triestímulo.

A partir de éstos, y aplicando las ecuaciones correspondientes, se calcularían los

parámetros del sistema CIELAB.

Para realizar lo anterior debemos haber calibrado previamente los valores de pH de

los vinos al mismo nivel (en nuestro caso, pH = 3.6) ya que el color del vino (sobre todo del

tinto) depende del pH al que esté.



No obstante, este grupo de investigación está acumulando más medidas

experimentales de los parámetros CIELAB en vinos y cada cierto tiempo proponen unas

nuevas longitudes de onda de medida y unas nuevas expresiones mejoradas para el cálculo

de los valores triestímulo (Ayala y col, 1999). Así mismo, estos autores han puesto a punto

un programa (disponible en http://www.unizar.es/negueruela) que permite, a partir de las

absorbancias medidas a las longitudes de onda 450, 520, 570 y 630 nm, en cubetas de 2

mm para vinos tintos y rosados, y de 10 mm para vinos blancos y brandies, efectuar todos

los cálculos de manera rápida. Este será el método que emplearemos.

Antocianos decolorables por sulfurosos

El método de decoloración por SO2 se obtuvo mediante la preparación de dos

muestras (do y d ), para ello teníamos preparado anteriormente una muestra (A*) que

contenía 1 ml de vino, 1 ml de HCl 0,1% en etanol al 96% y 20 ml de HCl.

La primera muestra (do) se preparó añadiendo 10 ml de la muestra A* a 18 ml de

agua destilada.

Para la segunda muestra (d) tomamos otros 10 ml de A* a la que añadimos 14 ml

de agua destilada y 4 ml de SO2 en forma de bisulfato sódico (Na2 S2 O5) de densidad 1.24.

Ambas muestras (do y d ) se analizaron por espectrofotometría a 520 nm para los

cálculos posteriores.

Calculos:

Antocianos decolorables por sulfurosos.

Concentración (mg/l) = (do – d ) x 875

% Antocianos no decolorables por sulfurosos.

% A. no decolorables = (d/do) x 100

http://www.unizar.es/negueruela



Análisis por HPLC

La separación, identificación y cuantificación fue llevada a cabo en un equipo

HPLC Agilent 1100 Series System (Agilent, Waldbronn, Germany), equipado con detector

DAD (Agilent G1315B) y acoplado a un espectrómetro de masas-masas con trampa iónica

(Agilent, G2445C VL), con un sistema de ionización por electroespray (ESI-MSn), todo ello

acoplado a un software de procesamiento de datos (Agilent Chem Station versión B.01.03).

Los datos de espectros de masas fueron procesados con el software del Trap Agilent LC/MS

(versión 5.3).

El análisis de antocianos de los diferentes vinos no tuvieron ningún tratamiento

previo a la inyección en el cromatógrafo de líquidos de alta resolución, únicamente las

muestras fueron pasadas por filtros de membrana de poliéster con tamaño de poro de 0.20

-Nagel, Düren, Germany) y diluidas a la mitad con agua

Milli-Q, con el fin de disminuir el porcentaje de metanol contenido en el extracto de hollejo

de uva tinta y así mejorar la simetría de los picos cromatográficos.

Reactivos y eluyentes

Fase estacionaria: Se utilizó una columna cromatográfica de 250 mm de longitud x

4.6 mm de diámetro interno, con un relleno de fase inversa Zorbax Eclipse XDB-C18

(Agilent), con un tamaño de partícula de 5 nm; se utilizó una precolumna de 4.6 x

10 mm del mismo relleno. Durante el proceso cromatográfico la columna estuvo

termostatizada a 40º C.

Fase móvil: Se utilizaron dos disolventes diferentes:

Eluyente A: 3% acetonitrilo (Scharlau Analytical Sciences, HPLC) + 87% agua

bidestilada + 10% ácido fórmico (Panreac).

Eluyente B: 50% acetonitrilo (Scharlau Analytical Sciences, HPLC) + 40% agua

bidestilada + 10% ácido fórmico (Panreac).

Cada eluyente preparado se desgasificó con ultrasonidos durante unos minutos, con

el fin de eliminar las posibles burbujas que pudieran interferir en el cromatógrafo de



líquidos. No obstante, el equipo de HPLC dispone de una cámara de desgasificación previa a

las bombas de flujo.

Condiciones cromatográficas

Las condiciones cromatográficas fueron adaptadas del método de la OIV para

análisis de antocianos (OIV, 2003).

El gradiente utilizado se indica en la Tabla 3.

El volumen de inyección fue de 50 μL. El rango de longitudes de onda para la

detección fue de 200-600 nm.

Como patrón para la cuantificación de los picos cromatográficos, se utilizó

malvidina 3-glucósido (Extrasynthese, Genay, Francia).

La cuantificación de los antocianos se realizó usando los cromatogramas

obtenidos por el detector DAD a 520 nm de longitud de onda y empleando la curva de

calibrado del patrón mencionado.

Para la identificación, se utilizó un detector de masas-masas con ionización por

electroespray en modo positivo y con analizador de masas de trampa iónica (ESI-

MSn). El nitrógeno fue usado como gas nebulizador y de secado.

El modo de adquisición de datos se realizó en SCAN, entre 100 y 1200 m/z.

Los parámetros del detector de espectrometría de masas fueron los siguientes:

Flujo de N2: 11 mL/min

Temperatura de secado: 350º C

Presión del nebulizador: 65 psi

Voltaje del capilar: –2500V

Voltaje a la salida del capilar: 70V

Skimmer 1: 20 V

Skimmer 2: 6 V



La identificación de los diferentes compuestos se basó en las características

espectroscópicas en el UV-Vis y en los espectros de masas registrados, así como en el

orden de elución descrito en la bibliografía.

Análisis estadístico de los resultados obtenidos

El tratamiento estadístico de los datos se realizó empleando el Análisis de

Componentes Principales cuando no se impuso ningún criterio de clasificación previo a

las muestras. Los perfiles de antocianos según la variedad de uva empleada se abordó

por un análisis de comparación de medias ANOVA según el test de Student-Neuman-

Keuls, mientras que la estudio de diferenciación de los vinos de las variedades

Cencibel o Tempranillo, o en función de las vendimias 2006 o 2007, se realizó con un

análisis de comparación de medias de la “t” de Student. Se empleó el paquete de

programas de estadística SPSS 15.0 para Windows.

Resultados y discusión

En primer lugar, se van a presentar los resultados obtenidos para todos los

vinos analizados (130 muestras) con idea de obtener una visión global de cómo es el

color de los vinos rosados elaborados en La Mancha, así como su composición fenólica

relativa al color, debido a la escasez de datos que se dispone al respecto. A

continuación se explorará la posibilidad de diferenciar los vinos rosados, en cuanto a la

variedad de uva utilizada, en función de su color y de su composición fenólica; para

ello sólo se van a analizar los resultados obtenidos para 110 muestras de vinos

rosados, aquellas para las que la etiqueta indicaba claramente que eran vinos de una

sola variedad y para los que había más de una muestra. Por último, se va a estudiar si

las denominaciones varietales “Cencibel” o “Tempranillo”, en principio

correspondientes a sinonimias de la misma variedad de uva, realmente tiene un reflejo

en el color o en la composición fenólica de los vinos rosados, así como si la vendimia

en que los vinos fueron elaborados (2006 y 2007) supuso alguna diferencia en estos

vinos rosados.



Caractarísticas cromáticas y composición fenólica de los vinos rosados

elaborados en la mancha

Se han analizado un total de 130 vinos rosados elaborados en La Mancha.

Puesto que el vino rosado es un tipo de vino que no responde a una única definición

desde el punto de vista tecnológico y ya que no sabemos los detalles de elaboración

de cada uno de los vinos analizados, los primeros resultados que se van a exponer son

los valores medios (con sus desviaciones típicas) de los parámetros analíticos

relacionados con el color mostrado por estos vinos.

Las características cromáticas, en términos globales, de los vinos rosados

analizados fueron las siguientes:

a) En términos promedios los vinos rosados fueron bastante claros (L* = 93.94 ±

2.34), aunque algunos vinos individuales tuvieron un color bastante oscuro o

casi tan claro como algunos vinos blancos (rango de valores de L* entre

85.70-98.40).

b) El colorido (término que se relaciona con la predominancia de un único tipo de

pigmento) de estos vinos no fue muy alto (C* = 7.12 ± 2.33) y además osciló

dentro de un rango muy amplio (entre 2.66 y 14.03)

c) El ángulo de tono (una medida relacionada con el matiz o tono del color) osciló

dentro de un rango muy amplio de valores, encontrándose en un extremo

vinos rosados de un color rojo con tonos púrpuras (valor mínimo de h* =

6.99) y en el otro extremo, vinos rosados con un color naranja (valor máximo

de h* = 68.23), si bien la mayoría de los vinos rosados mostraron un color

netamente rojo (h* entre 15 y 45), con ligeros matices púrpuras o

anaranjados, según el caso (h* = 33.81 ± 11.77).

d) Las grandes diferencias observadas en el colorido de estos vinos rosados se

debieron fundamentalmente al amplio rango de valores mostrado por su

componente roja del color (valores de a* > 0), entre 1.00 y 13.92. De hecho,

estos dos parámetros cromáticos correlacionaron muy bien (Figura V.1).



e) Análogamente, las grandes diferencias encontradas para el ángulo de tono de

estos vinos rosados se debieron en parte a la gran variabilidad mostrada por la

componente amarilla del color (b* > 0), que osciló entre 0.60 y 7.52; no

obstante, la correlación entre estos dos parámetros cromáticos no fue muy

buena (Figura V.2), por lo que en la variación del valor de h* también tuvo

una influencia considerable el valor de a*.

Figura I.1. Correlación entre los parámetros cromáticos “colorido” (C*) y “componente roja del color” (a*) correspondientes a los vinos rosados analizados.

y = 0,9561x + 1,4714

R2 = 0,9146

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

Componente roja del color (a*)

Co

lori

do

(C

*)



Figura I.2. Correlación entre los parámetros cromáticos “ángulo de tono” (h*) y “componente amarilla-azul del color” (b*) correspondientes a los vinos rosados analizados.

En cuanto a las distintas fracciones de pigmentos antociánicos rojos, los

resultados obtenidos para los vinos rosados fueron:

a) El contenido en antocianos totales (AT) estuvo dentro del rango 7.33-116.35

mg/L (como malvidina 3-glucósido), con un valor medio de 36.63 ± 19.17

mg/L, que es un valor normal en vinos rosados (no suele superar los 50 mg/L;

Boulton, 2001).

b) Del total de antocianos presentes en los vinos rosados analizados, una

cantidad de entre 5.39-109.49 mg/L (como malvidina 3-glucósido), con un

valor medio de 31.96 ± 19.43 mg/L, fueron antocianos decolorables por

sulfuroso (ADS), es decir, no estables.

c) Entre los ADS se encuentran los antocianos monómeros (AM) procedentes de

la uva, que se encontraron en cantidades entre 2.27-99.82 mg/L (como

malvidina 3-glucósido), con un valor medio de 28.01 ± 21.54 mg/L.

d) Estos AM suponen en términos generales tres cuartas partes (76.47 %) de los

AT, un valor que se correspondió bastante bien con el porcentaje de



antocianos no decolorables por sulfuroso (%ANDS), con un valor medio de

16.00 ± 11.23 % y un rango de 1.11-51.54 %.

Los AM originarios de la uva aún son el grupo más numeroso de pigmentos de

color rojo que hay en los vinos rosados analizados. Así, el contenido en AM

correlacionó en general muy bien con el contenido en AT, salvo unos pocos casos

(Figura V.3.a). Pero esto no significa necesariamente que el color del vino rosado se

deba mayoritariamente a los AM, ya que conviene recordar en qué condiciones se

realizan las medidas de las distintas fracciones de antocianos (todas a pH muy ácido,

estando todos los antocianos en forma roja) y cuál es su contribución real al color del

vino rosado (se realiza a pH 3.6, un valor de referencia dentro del rango habitual de

3.5-4.0, al cual no todos los antocianos tienen por qué encontrarse en su forma roja).

El porcentaje de AM que están en la forma roja de catión flavilio es de tan sólo un 8-

10 % (Boulton, 1996), por lo que su contribución real al color del vino rosado está

muy mermada. En cambio, los pigmentos antociánicos son más estables y se ven

mucho menos afectados por las variaciones de pH y la decoloración por sulfuroso

(precisamente en esta última propiedad se basan las medidas de ADS y %ANDS), por

lo que puede afirmarse que este tipo de pigmentos contribuye en su totalidad al color

del vino sea cual sea el valor de pH al que se realice la medida. La suma del

porcentaje de AM, en relación al contenido en AT, y de %ANDS queda algo lejos del

100 % (76.47 + 16.00 = 92.47 %), ya que algunos de los nuevos pigmentos

formados en el vino, aunque son algo más estables que los AM, aún siguen siendo

decolorables por el sulfuroso como los AM (es el caso de las uniones tanino-

antociano). Conviene recordar que los AM fueron medidos por HPLC, una técnica que

no separa bien pigmentos derivados de antocianos por su unión con taninos. No

obstante, el contenido en AM correlacionó muy bien con el contenido en ADS (Figura

I.3.b), corroborando que la mayoría de los antocianos decolorables de los vinos

rosados eran antocianos monómeros originales de las uvas.



Figura I.3. Correlación entre los contenidos de distintas fracciones de antocianos a) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Totales; b) Antocianos Monómeros vs.

Antocianos Decolorables por Sulfuroso. Se han marcado las muestras que no correlacionan bien.

En los vinos rosados analizados pudieron detectarse piranoantocianos

derivados de la reacción de los AM con ácido pirúvico (un metabolito secundario de la

fermentación alcohólica) y con ácidos hidroxicinámicos (ácidos cafeico y p-cumárico).

Se sabe que la formación de la vitisina A ocurre en los primeros días de la elaboración

del vino, durante la fermentación alcohólica, y que suele ser el piranoantociano

mayoritario en vinos jóvenes y su cantidad se mantiene o disminuye lentamente

durante el envejecimiento, mientras que los piranoantocianos derivados del ácido

cumárico mv-3-glc-4-VP, se encuentran en pequeñas cantidades en los vinos jóvenes,

en los que no suele encontrase el derivado del ácido cafeico, mv-3-glc-4-VC, y ambos

van aumentando su concentración por vía química durante el almacenamiento.

Puesto que los vinos rosados son vinos jóvenes, no es de extrañar que en las

muestras analizadas el piranoantociano predominante fuese la vitisina A, detectándose

en todas las muestras analizadas, en una cantidad promedio de 0.46 ± 0.28 mg/L

(rango de 0.11-1.34). En cambio, los piranoantocianos derivados de ácidos

hidroxicinámicos no se encontraron en todas las muestras de vino analizadas: en 62

vinos de los 130 analizados se encontraron estos piranoantocianos, estando los dos

mayoritarios (mv-3-glc-4-VP y mv-3-glc-4-VC) en 44 de las muestras, mientras que

11 muestras sólo contenían mv-3-glc-4-VP y 7 muestras sólo contenían mv-3-glc-4-

VC. En las muestras de vino en que se hallaron estos piranoantocianos, el contenido



medio fue de: mv-3-glc-VP, 0.20 ± 0.20 mg/L (rango de 0.05-1.07); mv-3-glc-4-VC,

0.35 ± 0.50 mg/L (rango de 0.07-2.95). En 9 las muestras con mayor contenido en

piranoantocianos de este tipo, también pudieron detectarse los derivados acetilados de

ambos piranoantocianos (mv-3-acglc-4-VC y mv-3-acglc-4-VP) y el cumaroilado del

derivado del ácido cafeico (mv-3-cmglc-4-VC), en cantidades inferiores a las de sus

correspondientes derivados no acilados (mv-3-glc-4-VP y mv-3-glc-4-VC). Cabe

destacar que, al contrario de lo habitual en vinos tintos jóvenes, en los vinos rosados

no sólo se encontraron piranoantocianos derivados del ácido cafeico, sino que además

éstos fueron generalmente los mayoritarios (en 38 de las 44 muestras en que se

encontraron mv-3-glc-4-VC y mv-3-glc-4-VP, más las 7 muestras en que sólo se

encontró mv-3-glc-4-VC) frente a los derivados del ácido p-cumárico. Una posible

explicación de este comportamiento diferente puede basarse en dos hipótesis:

- En primer lugar, los vinos rosados, al elaborarse sin que en ellos se desarrolle

la fermentación maloláctica (reduce la acidez al descarboxilar al ácido málico

para dar ácido láctico) y tener un periodo muy corto de maceración con los

hollejos (en ellos hay iones potasio que hacen perder moléculas de ácido

tartárico por precipitación de sales insolubles de bitartrato de potasio, con la

consiguiente disminución de acidez) tienen un pH más ácido que los vinos

tintos, por lo que la hidrólisis de los ácidos hidroxicinamoil-tartáricos, que

libera a los ácidos hidroxicinámicos que luego reaccionarán con los AM, puede

ocurrir con más rapidez y en mayor extensión.

- En segundo lugar, la formación de piranoantocianos por reacción de los ácidos

hidroxicinámicos con los AM en vinos tintos está en competencia con la

reacción de estos mismos AM con los taninos, mayoritarios frente a los ácidos

hidroxicinámicos, por lo que en vinos tintos se suele observar un retraso en la

formación de estos piranoantocianos aún cuando la cantidad de ácidos

hidroxicinámicos libres sea importante. En cambio, en los vinos rosados

apenas hay taninos por su forma de elaboración (no se extraen taninos de las

pepitas y la extracción de taninos de los hollejos es muy limitada por el escaso

tiempo de maceración empleado).

Se encontró que la correlación entre los contenidos en ácidos cafeico y p-

cumárico respecto a sus correspondientes ésteres etílicos (Figura I.4) fue bastante

mejor que la encontrada entre los ácidos cafeico y p-cumárico respecto a los

correspondientes piranoantocianos a que dan lugar (Figura I.5). Puede sugerirse, por



tanto, que los ácidos cafeico y p-cumárico libres en los vinos rosados tienen una

mayor tendencia a reaccionar con el etanol para formar ésteres etílicos (cafeoato y

cumarato de etilo, respectivamente) que con los antocianos para formar

piranoantocianos (mv-3-glc-4-VC y mv-3-glc-4-VP, respectivamente). Y ello a pesar

de que en los vinos rosados los antocianos tienen pocos taninos con los que reaccionar

(¾ partes de los AT son aún AM); quizá la baja concentración en que se encuentran

los AM en los vinos rosados (no superior a 0.1 g/L) respecto al etanol (del orden de

80-100 g/L) haga que predomine la reacción de los ácidos cafeico y p-cumárico con el

etanol.

Figura I.4. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. cafeoato de etilo; b) Ácido p-cumárico vs. cumarato de etilo.

Figura I.5. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. mv-3-glc-4-VC;b) Ácido p-cumárico vs. mv-3-glc-4-VP.

y = 1,5174Ln(x) + 5,1305

R2 = 0,4194

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

Ácido cafeico (mg/L)

mv-3

-glc

-4-V

C (

mg

/L)

y = 0,7298Ln(x) + 3,1482

R2 = 0,2031

y = 2,3429x + 1,2857

R2 = 0,1702

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Ácido p-cumárico (mg/L)

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg

/L)

a) b)

y = 1,5174Ln(x) + 5,1305

R2 = 0,4194

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50


mv-3

-glc

-4-V

C (

mg

/L)

y = 0,7298Ln(x) + 3,1482

R2 = 0,2031

y = 2,3429x + 1,2857

R2 = 0,1702

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20


mv-3

-glc

-4-V

P (

mg

/L)

y = 1,5174Ln(x) + 5,1305

R2 = 0,4194

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50


mv-3

-glc

-4-V

C (

mg

/L)

y = 0,7298Ln(x) + 3,1482

R2 = 0,2031

y = 2,3429x + 1,2857

R2 = 0,1702

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20


mv-3

-glc

-4-V

P (

mg

/L)

a) b)

y = 0,2362x - 0,0653

R2 = 0,5286

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Cafe

oato

de e

tilo

(m

g/L

)

y = 0,2846x + 0,0585

R2 = 0,5727

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00


Cu

marato

de e

tilo

(m

g/L

)

a) b)

y = 0,2362x - 0,0653

R2 = 0,5286

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Cafe

oato

de e

tilo

(m

g/L

)

y = 0,2846x + 0,0585

R2 = 0,5727

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00


Cu

mara

to d

e e

tilo

(m

g/L

)

y = 0,2362x - 0,0653

R2 = 0,5286

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Cafe

oato

de e

tilo

(m

g/L

)

y = 0,2846x + 0,0585

R2 = 0,5727

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00


Cu

mara

to d

e e

tilo

(m

g/L

)

a) b)



Se estudió la posible correlación entre los valores de algunos de los

parámetros cromáticos y las distintas fracciones de antocianos presentes en los vinos

rosados. En general, estas correlaciones fueron muy pobres o inexistentes, y sólo se

observó cierta tendencia al aumento de la componente amarilla del color (b* > 0) para

aumentos en los valores del % ANDS (Figura I.6.a); muchos de los ANDS son uniones

antociano-tanino o piranoantocianos que muestran un color más anaranjado que rojo.

Como todos los ANDS son rojos al valor de pH del vino (el color se midió a pH = 3.6),

y la mayoría de ADS son AM que a pH 3.6 están sólo en un 8% en la forma roja de

catión flavilio, se encontró una correlación aceptable entre la suma de pigmentos rojos

a pH 3.6 (del tipo ANDS, multiplicando el % ANDS por el contenido en AT, más el 8%

de los del tipo ADS) y el valor de la componente roja del color (a*) a ese valor de pH

(Figura I.6.b).

Figura I.6. Correlación entre: a) %ANDS y componente amarilla del color; b) Suma de ANDS y

ADS (8% en forma roja a pH 3.6) y componente roja del color.

Diferenciación varietal en vinos rosados

Un total de 108 muestras de vinos rosados analizados correspondían a vinos

monovarietales, elaborados con una sola variedad de uva según se declaraba en su

etiqueta. De estos:

- Bobal: 9 muestras

- Cabernet Sauvignon: 13 muestras

- Cencibel: 24 muestras

- Garnacha: 14 muestras

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

Componente amarilla-azul del color (b*)

AN

DS

(%

)

a)

y = 0,6606x + 3,1739

R2 = 0,4148

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0


AN

DS

+ 8

%A

DS

(m

g/L

)

b)

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

Componente amarilla-azul del color (b*)

AN

DS

(%

)

a)

y = 0,6606x + 3,1739

R2 = 0,4148

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0


AN

DS

+ 8

%A

DS

(m

g/L

)

b)



- Merlot: 4 muestras

- Syrah: 6 muestras

- Tempranillo: 38 muestras

El conjunto de muestras, junto con sus parámetros analizados (características

cromáticas, fracciones de antocianos, perfil de antocianos monómeros,

piranoantocianos y derivados hidroxicinámicos) fue sometido al Análisis de

Componentes Principales (CP), para evaluar si las distintas muestras de vinos rosados

tenían alguna tendencia a agruparse según la variedad de uva de procedencia. El

resultado no fue muy satisfactorio, ya que con los 3 primeros CP sólo se pudo explicar

el 34.43 % de la varianza total del conjunto de datos (Tabla I.1).

Tabla I.1. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados monovarietales.

CP Variables más correlacionadas Loadings % Varianza Explicada

Acumulada

1 Luminosidad (L*) -0.914 11.53

Colorido (C*) 0.906

Componente roja del color (a*) 0.901

Vitisina A 0.759

2 Malvidina-3-t-cm-glucósido 0.862 22.98

Petunidina-3-t-cm-glucósido 0.821

Delfinidina-3-t-cm-glucósido 0.768

Ácido c-cutárico 0.740

Malvidina-3-c-cm-glucósido 0.712

3 ADS 0.939 34.43

AM 0.933

AT 0.925

% ANDS -0.721

Cuando las muestras de vinos rosados se representaron en el plano formado por

las dos primeras Componentes Principales (CP), se observó cierto grado de

diferenciación en función de la variedad de uva empleada (Figura V.7). En el Análisis

de CP no se hace una distinción previa de los vinos de una determinada variedad de



uva, pero al representar las muestras en el espacio definido por CP-1 y CP-2 sí se han

marcado los vinos de una misma variedad, para observar si se agrupaban o no.

Figura I.7. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2. Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y

se ha encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C,

Cencibel; CS, Cabernet Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.

Los vinos rosados de las variedades francesas (Cabernet Sauvignon, Merlot y

Syrah) se distinguieron entre sí fundamentalmente por sus características cromáticas,

que fueron las variables más correlacionadas con el CP-1: los vinos rosados de

Cabernet Sauvignon fueron más oscuros (menores valores de L*), con mayor colorido

BB CSCS

CCTT

MM

SS

GG

BB CSCS

CCTT

MM

SS

GG

BB CSCS

CCTT

MM

SS

GG



(C*) y una mayor componente roja del color (a*), mientras que los de Merlot fueron

más claros, con menor colorido y menor componente roja del color; en una situación

intermedia quedaron los vinos rosados de la variedad Syrah. La vitisina A también

contribuyó a separar estos vinos según su variedad, pero al ser un producto

relacionado con la fermentación alcohólica (el ácido pirúvico que reacciona con la

malvidina 3-glucósido es un producto secundario de la fermentación alcohólica) su

influencia debe tener más relación con las diferentes cantidades de malvidina 3-

glucósido que haya en estos vinos durante su fermentación. Un ligera diferencia en las

variables más correlacionadas con el CP-2 (fundamentalmente las proporciones

molares de ciertos antocianos monómeros individuales) permitieron distinguir los vinos

de Syrah de los de Merlot y Cabernet Sauvignon: los vinos de Syrah tuvieron mayores

proporciones de derivados trans-cumaroilados de los 3-glucósidos de malvidina

(también del minoritario isómero cis), petunidina y delfinidina, así como mayor

contenido en ácido t-cutárico. Como es bien sabido, los distintos vinos tintos

monovarietales pueden diferenciarse por sus perfiles característicos de antocianos

(Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004) y estos resultados sugieren que también

pueden hacerlo en los vinos rosados. Los vinos rosados de Cabernet Sauvignon

pudieron diferenciarse algo de los de Merlot y Syrah respecto a las variables más

correlacionadas con el CP-3 (Figura I.8), mostrando un menor contenido en AT, AM y

ADS, pero un mayor valor de %ANDS, por lo que puede afirmarse, aunando

resultados, que en los vinos rosados de Cabernet Sauvignon hay menos antocianos

pero éstos están más polimerizados y por ello son vinos de un color más oscuro y con

mayor contribución de la componente roja del color, que los vinos rosados de Merlot y

Syrah.

Los vinos rosados las variedades de uva españolas Bobal y Garnacha

presentaron unas características cromáticas bastante similares entre sí, y a su vez

muy similares a los de la variedad francesa Merlot, pero sí pudieron diferenciarse muy

bien de los vinos de las otras variedades francesas, Syrah y Cabernet Sauvignon,

sobre todo de los de Cabernet Sauvignon, que es la variedad francesa más extendida

por el mundo: los vinos rosados de variedades españolas fueron más claros, de menor

colorido y con menor contribución al color de la componente roja. Comparando los

vinos rosados de Garnacha y Bobal, los primeros tuvieron mayor proporción de

antocianos cumaroilados (variables asociadas al CP-2) que los primeros; en cambio los



vinos rosados de Bobal tuvieron un mayor contenido en antocianos y una proporción

menor de antocianos polimerizados, no decolorables por sulfuroso (variables asociadas

al CP-3; Figura I.8).

Figura I.8. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de uva empleada, en el plano formado por los Componentes

Principales 1 y 3.

BB

CSCSCC

TT

MM

SSGG

BB

CSCSCC

TT

MM

SSGG



Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y se ha

encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino

monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la

agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C, Cencibel; CS, Cabernet

Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.

Los vinos rosados de las variedades españolas Cencibel y Tempranillo

mostraron unas características cromáticas y una composición fenólica muy

heterogéneas, dispersándose por toda la representación gráfica de las muestras en el

plano definido por CP-1 y CP-2 (Figura I.7), por lo que sólo pudieron diferenciarse bien

de los vinos de la variedad Cabernet Sauvignon, sobre todo en las variables asociadas

al CP-1 y en el mismo sentido que los vinos de las otras variedades españolas. Sus

centroides estuvieron muy próximos, corroborando que los nombres “Cencibel” y

“Tempranillo” son realmente sinónimos de una misma variedad. En todo caso, podrían

tratarse de clones diferentes (Cencibel, originario de La Mancha; Tempranillo,

originario de La Rioja) pero las diferencias a nivel de clon no suelen manifestarse

apenas en cuanto a la composición química de las uvas y de los vinos resultantes. No

obstante, los vinos rosados de Tempranillo mostraron un ligera tendencia a contener

mayores proporciones de antocianos cumaroilados (variables asociadas al CP-3; Figura

I.8) que los de Cencibel.

Volviendo a la utilidad de los perfiles de antocianos monómeros de la uva

como criterio de diferenciación varietal de los distintos vinos rosados, los resultados

obtenidos sugieren que no son tan concluyentes como han demostrado serlo para

vinos tintos (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004). Los perfiles de antocianos

(cromatogramas de HPLC; detección a 520 nm) mostrados por los distintos vinos

rosados estuvieron claramente dominados por la malvidina 3-glucósido entre los

antocianos no acilados (Figura I.9) y, con la salvedad de los vinos de Merlot y de

Syrah, las proporciones de antocianos acilados (por ejemplo, los derivados acetilado y

cumaroilado de la malvidina 3-glucósido) fueron bajas. Ello explicaría la escasa

capacidad diferenciadora del origen varietal mostrada por los perfiles de antocianos de

los vinos rosados. Está bien establecido que los perfiles de antocianos son muy útiles

en la diferenciación varietal en el caso de uvas tintas y hay numerosos estudios que

así lo demuestran (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004; y numerosas



referencias citadas en este artículo). Cuando el perfil de antocianos se aplica a la

diferenciación varietal de vinos tintos se siguen obteniendo buenos resultados, pero

los perfiles varietales de los vinos muestran diferencias con los obtenidos de las uvas

de la variedad correspondiente, con un aumento generalizado de la proporción de

malvidina 3-glucósido y una disminución importante de las proporciones de antocianos

cumaroilados (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004); ello se ha explicado en

base a la mayor estabilidad de la malvidina respecto de las otras antocianidinas

(delfinidina, cianidina, petunidina y peonidina) y a la menor solubilidad en el medio

hidroalcohólico que es el vino, de los antocianos cumaroilados (eluyen mucho más

tarde en columnas de HPLC de fase inversa).



Figura I.9. Perfiles de antocianos monómeros (HPLC, detección a 520 n) característicos de los vinos rosados analizados. Dp, delfinidina; Cy, cianidina; Pt,



petunidina; Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; acglc, acetilglucósido; cmglc, cumaroilglucósido.

Lo que ha podido ocurrir en los vinos rosados es algo similar a lo que sucede

con los vinos tintos en relación a las uvas, pero acentuado por el escaso tiempo de

maceración empleado en la elaboración de vinos rosados y porque en el medio no hay

prácticamente etanol al no haberse iniciado la fermentación alcohólica, o ser sólo

incipiente, en el momento en que se separa los orujos para continuar vinificando en

blanco el mosto coloreado obtenido tras esta corta maceración. Al ser muy corto el

periodo de maceración en la elaboración de vinos rosados, la transferencia de los

antocianos mayoritarios de la uva (en variedades de Vitis vinifera suele ser la

malvidina 3-glucósido) al mosto puede verse favorecida en relación a los antocianos

minoritarios (la cinética de extracción predomina en los momentos iniciales, frente a

los equilibrios de reparto sólido/líquido); además, como el medio es acuoso

prácticamente al 100 %, los antocianos cumaroilados habrán visto disminuida su tasa

de transferencia al mosto. Por tanto, es previsible que en los vinos rosados, cualquiera

que sea la variedad de uva tinta empleada, el antociano mayoritario siempre sea la

malvidina 3-glucósido, y que las diferencias varietales de los perfiles de antocianos de

las uvas se transmitan en muy poca medida a los vinos rosados, resultando éstos

difícilmente diferenciables por sus perfiles de antocianos.

De forma más detallada, un análisis ANOVA de los perfiles de antocianos de los

vinos rosados clasificados por la variedad de uva de elaboración (Tabla I.2) permitió

establecer las siguientes conclusiones:

El antociano mayoritario de todos los perfiles fue la malvidina 3-glucósido

(media del 63.3 %); la proporción de este antociano en los vinos rosados de la

variedad Merlot fue la más baja (51.6 %), mientras que en los de la variedad Bobal

fue la más alta (69.4 %).

Los vinos rosados de Merlot también mostraron las menores proporciones de

delfinidina 3-glucósido (2.2 %) y de petunidina 3-glucósido (4.4 %), mientras que las

mayores proporciones de estos antocianos se encontraron en los vinos de Cencibel,

Tempranillo y Garnacha (4.8-5.1 % y 7.3-8.0 %, respectivamente).



Los vinos rosados de Merlot y de Syrah fueron los que mayor porcentaje de

antocianos acetilados mostraron (17.7-17.9 % para el derivado mayoritario, el de la

malvidina 3-glucósido; 5.4-9.7 % en el resto de variedades).

Los vinos rosados de variedades españolas de uva fueron los que mayores

proporciones en antocianos cumaroilados tuvieron, en especial los de Garnacha (4.6-

6.1 % para el derivado mayoritario, el de la malvidina 3-glucósido); los vinos de

variedades francesas, con la mitad que los españoles (2.2-3.6 %).

Efecto de la vendimia en la composición fenólica y las características

cromáticas de los vinos rosados de cencibel/tempranillo

La diferenciación que se hace entre vinos rosados de las variedades Cencibel y

Tempranillo no parece tener mucho fundamento en cuanto a que los vinos posean

unas características cromáticas o una composición fenólica muy distintas. No obstante,

realmente puede tratarse de dos diferentes clones de la misma variedad, habida

cuenta que cuando se ha llevado a cabo la última reestructuración de viñedo, un gran

número de nuevas plantaciones de uva tinta lo han sido de plantones de Tempranillo

procedente de viveros riojanos, ya que en nuestra región no había apenas viveristas

que dispusieran de plantones de Cencibel. Puesto que los diferentes clones de una

misma variedad pueden diferir en parámetros como vigor o productividad, algunas

diferencias pueden encontrarse a nivel de los compuestos fenólicos, en concreto los

antocianos, ya que se trata de productos del metabolismo secundario de la vid que

pueden afectarse por parámetros como los anteriormente citados.

Es por ello, que se decidió realizar un estudio más detallado de las muestras

de vino rosado de las variedades Cencibel y Tempranillo (62 muestras). El conjunto de

datos de estas muestras se sometió a un Análisis de Componente Principales y

también a un análisis de comparación de medias de la “t” de Student, para ver si

había diferencias significativas según la denominación varietal (Cencibel o

Tempranillo) o de la vendimia (2006 o 2007) en que fueron elaborados los vinos

rosados.



Como puede verse en la Figura I.10 (a), los centroides de los grupos de vinos

rosados de Cencibel y de Tempranillo estaban ligeramente separados a lo largo del eje

en el que se representa la CP-1, que tiene que ver fundamentalmente con las diversas

fracciones de antocianos (Tabla I.3). Aparentemente, los vinos rosados de Cencibel

tenían menor contenido en antocianos totales (AT) a la vez que menor contenido en

antocianos monómeros (AM) y decolorables por sulfuroso (ADS), por lo que la

proporción de antocianos no decolorables por sulfuroso (% ANDS) era lógicamente

mayor. No obstante, puede observarse cómo hubo una superposición importante de

muestras de ambos tipos de supuestamente distintas variedades (Cencibel y

Tempranillo).

Figura I.10. Representación de las muestras de vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2: a) Muestras marcadas por nombre de variedad (rojo, Cencibel; azul, Tempranillo); b) Muestras marcadas por vendimia (verde 2006; amarillo, 2007).

a) b)a) b)



Tabla I.2. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo.

CP Variables más correlacionadas Loadings % Varianza Explicada

Acumulada

1 ADS 0.954 13.54

AT 0.942

AM 0.941

% ANDS -0.756

2 Cafeoato de etilo 0.894 24.88

Cumarato de etilo 0.856

Ácido cafeico 0.825

Ácido p-cumárico 0.750

3 Malvidina-3-t-cm-glucósido 0.892 36.00

Petunidina-3-t-cm-glucósido 0.833

Delfinidina-3-t-cm-glucósido 0.789

El test de la “t” de Student corroboró los resultados anteriores (Tabla V.4);

además de en los parámetros anteriormente citados (AT, AM, ADS y %ANDS), otras

diferencias significativas fueron:

Mayor componente roja del color y menor ángulo de tono, para los vinos

rosados de Tempranillo.

Mayores proporciones molares de los derivados acetilados de los 3-glucósidos

de peonidina y malvidina, en los vinos rosados de Tempranillo.

Menor contenido de vitisina A, pero mayor contenido del piranoantocianos

derivado del ácido cafeico (mv-3-glc-4-VC), en los vinos rosados de Cencibel.

Menor contenido de ácido t-cutárico, pero mayor contenido de ácido ferúlico,

en los vinos rosados de Cencibel.



Tabla I.3. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel o de Tempranillo que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de

Student.

Parámetro Cencibel

(n = 25)

Tempranillo

(n = 37)

h* 41.89 30.60

a* 4.77 5.99

AT (mg/L)1 28.80 39.70

AM (mg/L)1 18.59 32.22

ADS (mg/L)1 24.44 35.54

% ANDS 19.90 13.91

Pn-3-acglc (% molar) 0.58 0.97

Mv-3-acglc (% molar) 5.33 7.39

Vitisina A (mg/L) 0.35 0.51

Mv-3-glc-4-VC (mg/L) 0.15 0.06

Ácido t-cutárico (mg/L) 6.90 8.79

Ácido ferúlico (mg/L) 0.57 0.37

1Como malvidina 3-glucósido. Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; ac, acetilglucósido; VC,

vinilcatecol. La vendimia de elaboración tuvo un efecto diferenciador en los vinos rosados

de las variedades Cencibel y Tempranillo, que fueron consideradas la misma variedad

para este análisis estadístico. Los vinos de la vendimia 2007 mostraron en general un

contenido en antocianos mayor (tanto AT como AM y ADS), y una menor proporción

de antocianos no decolorables por sulfuroso (% ANDS). Estas diferencias se evidencian

muy bien en la Figura V.10 (b), y el test de la “t” de Student corroboró estos

resultados, junto con otros adicionales que se comentan a continuación (Tabla V.5), y

que son bastante acordes con la mayor edad de los vinos rosados de la vendimia de

2006 y la evolución que sufren los pigmentos antociánicos con el tiempo:

La componente amarilla del color fue inferior en los vinos de la vendimia 2007.

Las proporciones molares de la petunidina 3-glucósido y su derivado

cumaroilado, y del derivado acetilado de la delfinidina 3-glucósido, fueron superiores

en los vinos de la vendimia 2007.

Los vinos rosados de la vendimia de 2006 tuvieron mayor contenido en ácido

cafeico libre y, consecuentemente mayores contenidos del piranoantociano que deriva



de este ácido (mv-3-glc-4-VC) y de su éster etílico; también el contenido en el éster

etílico del ácido p-cumárico fue superior en los vinos de la vendimia 2006.

Tabla I.4. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel y Tempranillo, clasificados por vendimia (2006 o 2007) que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de Student.

Parámetro Vendimia 2006

(n = 48)

Vendimia 2007

(n = 14)

b* 3.98 2.60

AT (mg/L)1 29.59 54.80

AM (mg/L)1 19.94 50.01

ADS (mg/L)1 25.06 51.66

% ANDS 19.22 6.38

Pt-3-glc (% molar) 7.77 8.93

Dp-3-acglc (% molar) 0.63 0.80

Pt-3-t-cmglc (% molar) 0.87 1.21

Mv-3-glc-4-VC (mg/L) 0.12 0.02

Ácido cafeico (mg/L) 1.87 1.06

Cafeoato de etilo (mg/L) 0.39 0.18

Cumarato de etilo (mg/L) 0.46 0.22

1Como malvidina 3-glucósido. Pt, petunidina; Dp, delfinidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; ac, acetilglucósido; VC, vinilcatecol.

BIBLIOGRAFÍA

Schwarz y col., 2003a Schwarz, M.; Jerz, G.; Winterhalter, P. Isolation and structure

of Pinotin A, a new anthocyanin derivative from Pinotage wine. Vitis 2003, 42, 105-

106.

Rentzsch y col., 2009 Rentzsch, M; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Blanco-Vega, D.;

Hermosín-Gutiérrez, I. Survey on the Content of Vitisin A and Hydroxyphenyl-

Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines. Food Chemistry 2009, en revision.



Schwarz y col., 2003b Schwarz, M.; Wabnitz, T. C.; Winterhalter, P. (2003). Pathway

leading to the formation of anthocyanin-vinylphenol adducts and related pigments in

red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 3682–3687

Rentzsch y col., 2007 (no 2008) Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.;

Hermosín-Gutiérrez, I. (2007). Formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in

Grenache wines: precursor levels and evolution during aging. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 55, 4883-4888.

Ayala y col., 1997 Ayala, F.; Echávarri, J.F.; Negueruela, A.I. A New Simplified Method

for Measuring the Color of Wines. I. Red and Rosé Wines. Am. J. Enol. Vitic. 1997, 48

(3), 357-363.

Boulton, R.B. (1996). A method for the assessment of copigmentation in red wines.

Presented at the 47th Annual Meeting of the ASEV, Reno, NV, June, 1996.

Boulton, R.B. (2001). The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of

red wine: A critical review. American Journal of Enology and Viticulture, 52, 67-87.

Hermosín Gutiérrez, I.; García Romero, E. (2004). Antocianos de variedades tintas

cultivadas en La Mancha: perfiles varietales característicos de las uvas y de los vinos

monovarietales, y su evolución durante la maduración de la uva. Alimentaria, 352,

127-139.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I. (2007). Formation

of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: precursor levels and

evolution during aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 4883-4888.

CAPÍTULO II

Resultados y Discusión. Capítulo II.


CAPITULO II . IDENTIFICATION, CONTENT AND DISTRIBUTION OF

ANTHOCYANINS AND LOW MOLECULAR ANTHOCYANIN-DERIVED PIGMENTS

IN COMMERCIAL RED WINES.

JUSTIFICACIÓN : En este capítulo vamos a realizar un estudio cualitativo y

cuantitativo en una muestra de 286 vinos comerciales, centrándonos en el contenido

en distintos pigmentos, antocianos monómeros, y todos los pigmentos derivados

producidos durante la fermentación y el envejecimiento, como son los

piranoantocianos tipos vitisina, los hidroxifenilpiranoantocianos,

flavanolpiranoantocianos, así como otros productos de condensación directa,

antociano-flavanol y de los aductos formados con puentes de etiliden-antociano-

flavanol.

Los vinos comerciales fueron donados por el Instituto de la Vid y el Vino de

Castilla la Mancha IVICAM y otras muestras se obtuvieron durante la Exposicion

Nacional de Vino (Fenavin 2009). Estas muestras de los años 2008 y 2009 se

congelaron a -20º C hasta su analisis. A partir de aquí contabamos con 199 vinos

jovenes de los años 2007-2009 y 87 vinos con más de tres años, con los que se ha

realizado el studio.



CAPITULO II . Identification, Content and Distribution of Anthocyanins and Low Molecular Anthocyanin-Derived Pigments in Commercial Red Wines

DORA BLANCO-VEGA†, SERGIO GÓMEZ-ALONSO‡§, AND ISIDRO HERMOSÍN-GUTIÉRREZ†‡*

† Escuela de Ingenieros Agrónomos de Ciudad Real, Universidad de Castilla-La Mancha, Ronda de Calatrava 7, 13071 Ciudad Real, Spain.

‡ Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Universidad de Castilla-La Mancha, Campus Universitario s/n, 13071 Ciudad Real, Spain.

§ Fundación Parque Científico y Tecnológico de Albacete, Paseo de la Innovación,

1, 02006, Albacete, Spain. *Corresponding author (Tel: +0034926295253; Fax: +0034926295351; E-mail:

[email protected]) ABSTRACT

A set of 286 red wine commercial samples has been analyzed with regard to

their content and distribution of red wine pigments: grape anthocyanins and low

molecular anthocyanin-derived pigments formed during winemaking and aging,

namely, direct and ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts, and several types

of pyranoanthocyanins (A- and B-type vitisins, hydroxyphenyl-, dihydroxyphenyl-,

methoxyhydroxyphenyl-, and flavanol-pyranoanthocyanins). Both young (1-2 years

old) and aged wines (up to 10 years old) were analysed and corresponded to both

single-cultivar and blend wines made from seven grape cultivars, four of them being

the widespread Tempranillo, Cabernet Sauvignon, Merlot, and Syrah cultivars. A total

of 90 low molecular red wine pigments were identified and up to 68 of them quantified

in most of the wine samples. The content of the different classes of red wine pigments

accounted for wide ranges of values, because of the diversity of the commercial wines

with regard to grape cultivar and age. Within youngest wines, those of Garnacha

cultivar were prone to account for high hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin

concentrations, being those pigments important contributors to their pool of low

molecular weight pigments. On the other hand, Cencibel and Tempranillo are clones of

the same grape cultivar and the similarity of the results obtained for both young wine



groups confirmed this narrow relationship. The aging had an effect of making uniform

the concentrations and molar percentages of every type of low molecular weight

pigments, and only slight differences among wine groups were found for B-type vitisins

(highest values for Syrah wines) and 10-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (highest

values for Merlot wines). For the aging series of Tempranillo wines, the ethylidene-

bridged flavanol-anthocyanin adducts were the most affected by disappearance during

aging. In contrast, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their contribution in

most of those aged wines.

Keywords: anthocyanin, flavanol-anthocyanin adduct, pyranoanthocyanin, red

wine pigment, vitisin

INTRODUCTION

Red wine colour has been, and still is, a matter of great interest for researchers

and a wide knowledge concerning the chemistry behind red wine colour has been

accumulated in the last three decades (Waterhouse & Kennedy, 2004; Monagas &

Bartolomé, 2009). Grape native anthocyanins are the original red colouring molecules

in red wine but they are very reactive (de Freitas & Mateus, 2006) and their

transformation into anthocyanin-derived pigments begins as soon as they are

extracted to fermenting must. The earliest anthocyanin-derived compounds that were

suggested were polymeric adducts formed by reaction between anthocyanins and

tannins, by both, direct reaction (direct adducts) and mediated by acetaldehyde

(ethylidene-bridged adducts). In addition, other structures of anthocyanin-derived

pigments have been discovered, especially those called pyranoanthocyanins, a class of

red wine pigment formed as early as during alcoholic fermentation and also over the

aging of the wine. Besides the first reported pyranoanthocyanins derived from some

yeast metabolites (vitisin A, from pyruvic acid, and vitisin B, from acetaldehyde), other

reported pyranoanthocyanin-forming reactants include non-phenolic (acetoacetic acid,

diacetyl) and phenolic compounds (hydroxycinnamic acids, 8-vinyl-flavan-3-ols)

(Rentzsch, Schwarz & Winterhalter, 2007a). Finally, some simple pyranoanthocyanins

(A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins, and 10-methyl-

pyranoanthocyanins) can be transformed into more complex pyranoanthocyanins

(Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga & de Freitas, 2003; Mateus, Oliveira,



Santos-Buelga, Silva & de Freitas, 2004; Mateus, Oliveira, Pisarra, González-Parmás,

Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga, Silva & de Freitas, 2006; Oliveira, de Freitas, Silva &

Mateus, 2007; Oliveira, Azevedo, Silva, Teixeira, Cruz, Mateus & de Freitas, 2010), or

give rise to other kinds of non-red pigments (He, Oliveira, Silva, Mateus & de Freitas,

2010a; He, Silva, Mateus & de Freitas, 2011).

Therefore, the actual colour shown by a red wine is the result of the summation

of many kinds of anthocyanins and anthocyanin-related pigments with different colour

properties (Rentzsch et al., 2007a). In a previous paper (Rentzsch, Schwarz,

Winterhalter, Blanco-Vega & Hermosín-Gutiérrez, 2010) a survey of the content of

vitisin A and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines revealed a great

variability in pyranoanthocyanin concentrations that were affected not only by the wine

age, but also by the addition of fresh young red wine just before bottling of aged

wines. However, there is scarce data about the complete contribution of each kind of

red wine pigment to its colour, mainly due to the difficulty in analyzing such a diversity

of chemical structures. The very detailed description of red wine pigments seems to be

still an analytical challenge as they involves at least the previous fractionation of

different kinds of pigments and the use of HPLC-MS/MS for the accurate analysis of

separated fractions (Alcalde-Eon, Escribano-Bailón, Santos-Buelga & Rivas-Gonzalo,

2004; Alcalde-Eon, Escribano-Bailón, Santos-Buelga & Rivas-Gonzalo, 2006). In

addition, HPLC analysis of red wine pigments based on the use of C-18 and other

reversed-phase stationary phases only offer good separations for anthocyanins and

low molecular anthocyanin-derived pigments, whereas the polymeric pigments appear

as an unresolved broad peak (a hump) and they are usually estimated by non-specific

spectrophotometric methods. In this context, the recent report on the

chromatographic and spectral properties for complete series of the expected vitisin-

type and hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins could help in the identification and

quantification of such kind of low molecular anthocyanin-derived red wine pigments

(Blanco-Vega, López-Bellido, Alía-Robledo & Hermosín-Gutiérrez, 2011).

The aim of our work has been the analysis of a wide set of Spanish red wines by

HPLC-DAD-ESI-MS/MS with regard to identification and quantification of different red

pigments, including native grape anthocyanins and low molecular anthocyanin-derived

pigments formed during winemaking and aging, namely, several types of

pyranoanthocyanins (A- and B-type vitisins, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, and



flavanol-pyranoanthocyanins), and both direct and ethylidene-bridged flavanol-

anthocyanin adducts. The selected samples were both young (1-2 years old) and aged

wines (up to 10 years old) and corresponded to both single-cultivar and multi-cultivar

wines made from ten grape cultivars, four of them being the widespread Tempranillo,

Cabernet Sauvignon, Merlot, and Syrah cultivars. The data were processed in order to

ascertain the content and distribution of such pigments in commercial red wines

according to grape cultivar and age.

MATERIALS AND METHODS

Chemicals

All solvents were of HPLC supergradient quality and water was of MilliQ® quality.

Malvidin 3-glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard

for quantification of anthocyanins and flavanol-anthocyanin adducts. Some previously

obtained standards of pyranoanthocyanins were available for quantification (Rentzsch

et al., 2010): vitisin A (10-carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside) and vitisin B

(pyranomalvidin 3-glucoside) were used for quantification of A- and B-type vitisins,

respectively; pinotin A (10-(3”,4”-dihydroxyphenyl)-pyranomalvidin 3-glucoside, or

10-DHP-pymv-3-glc) was used for 10-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived

from both caffeic and ferulic acids (10-DHP- and 10-MHP-pyranoanthocyanins,

respectively); and 10-(4”-hydroxyphenyl)-pyranomalvidin 3-glucoside (10-HP-pymv-3-

glc) was used for quantification of 10-HP-pyranoanthocyanins derivatives and also for

10-flavanol-pyranoanthocyanins.

Red Wine Samples

Commercial red wine samples (n = 286) were all from Controlled Origin

Appellations and were supply by the Institute for Vine and Wine of Castilla-La Mancha

(IVICAM, Castilla-La Mancha Regional Government), and also collected from the

Spanish National Wine Exposition (FENAVIN, 2009). The wines were collected during

the years 2008 and 2009, and immediately frozen at -20 ºC until analysis. Samples

from years 2006 and 2007, collected in 2008, and samples from years 2007 and 2008,

collected in 2009, were considered as young wines (n =199). Aged wine samples were

those 3 or more years old (n = 87, although only 84 samples were considered for

ANOVA). The analysis of all the samples was developed between October 2009 and

March 2010.



Analysis of Low Molecular Red Wine Pigments by HPLC-DAD-ESI-MS/MS

HPLC separation and identification of anthocyanins and low molecular

anthocyanin-derived red wine pigments were performed on an Agilent 1100 Series

system (Agilent, Germany), equipped with DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL

(G2445C VL) electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS) system, and

coupled to an Agilent Chemstation (version B.01.03) data-processing station. The

mass spectra data were processed with the Agilent LC/MS Trap software (version 5.3).

The wine samples were injected (50 μL) after filtration (0.20 nm, polyester membrane,

Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) on a reversed-phase column

Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm; 5 nm particle; Agilent, Germany),

thermostated at 40 ºC. We used the same chromatographic system and conditions

previously described (15). Briefly, the solvents were water/acetonitrile/formic acid

(87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.63

mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min,

50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For identification, ESI-MS/MS was

used employing the following parameters: positive ion mode; dry gas, N2, 11 mL/min;

drying temperature, 350 ºC; nebulizer, 65 psi; capillary, -2500 V; capillary exit offset,

70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan range, 50-1200 m/z. Identification was

mainly based on MS/MS data but also on the comparison of chromatographic and

spectral (UV-vis and MS/MS) data with those previously reported in the same

chromatographic system (Rentzsch et al., 2010; Blanco-Vega et al., 2011; Cejudo-

Bastante, Hermosín-Gutiérrez & Pérez-Coello, 2011a) and also obtained with authentic

standards. Quantification was performed using DAD-chromatograms extracted at 520

nm and calibration curves of the above mentioned standards; in the case of co-eluting

compounds, extracted ion chromatograms at m/z values of their corresponding

molecular ions were obtained for helping quantification.

Statistical Data Analysis

The total content and the distribution of each kind of red wine pigment

(anthocyanins, pyranoanthocyanins, and anthocyanin-flavanol adducts) were subjected

to ANOVA test (Student-Newman-Keuls test, α = 0.05; SPSS version 17.0, SPSS Inc.)

looking for significant differences. On one hand, the young and aged red wine samples

were separately compared after grouping by grape cultivar (Cabernet Sauvignon,

Cencibel, Garnacha, Merlot, Petit Verdot, Syrah, Tempranillo, and blends of Cabernet



Sauvignon and Tempranillo). On the other hand, wines of the grape cultivar

Tempranillo were also compared with regard to their age (ANOVA, Student-Newman-

Keuls test, α = 0.05).

RESULTS AND DISCUSSION

Identification of Low Molecular Weight Red Wine Pigments

Native grape anthocyanins (anthocyanidin 3-glucosides, acylated or not)

together with 6 types of anthocyanin-derived red pigments formed in wine were

identified. The latter anthocyanin-derived pigments belonged to the main low

molecular red wine pigment groups known as flavanol-anthocyanin adducts and

pyranoanthocyanins.



(A) anthocyanins (B) vitisin-type pyranoanthocyanins

O+HO

O-(acyl)glucose

OH

R1

O

R3

R2

O+HO

O-(acyl)glucose

OH

R1

O

R2

OH

R3

O+HO

O-(acyl)glucose

OH

R1

OH

R2

(C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins

O+HO

O-glucose

OH

R1

OH

R2

OHO

OH

OH

OH

OH

(D) (4→8)-f lavanol-anthocyanin adducts

O+HO

O-(acyl)glucose

OH

R1

OH

R2

O HO

OH

OH

OH

OH

HC-CH3

(E) 8,8-ethylidene f lavanol-anthocyanin adducts

(F) 10-f lavanol-pyranoanthocyanins

O+HO

O-(acyl)glucose

OH

R1

O

R2

OHO

OH

OH

OH

OH

R3

Figure II. 1. Structures of anthocyanins and anthocyanin-derived low molecular red wine pigments found in analysed wine samples: A) grape native anthocyanins; B) vitisin-type anthocyanins (R3 = COOH, A-type vitisins or 10-carboxy-



pyranoanthocyanins; R3 = H, B-type vitisins or simply pyranoanthocyanins); C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (R3 = H, 10-(4’’’-hydroxyphenyl)-pyranoanthocyanins or 10-HP-pyranoanthocyanins; R3 = OH, 10-(3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or 10-DHP-pyranoanthocyanins; R3 = OCH3, 10-(3’’’-methoxy-4’’’-hydroxy)phenyl-pyranoanthocyanins or 10-MHP-

pyranoanthocyanins); D) (4 →8)-flavanol-anthocyanin adducts (direct adducts); E)

8,8-ethylidene-flavanol-anthocyanin adducts (acetaldehyde-mediated or ethylidene-bridged adducts); F) flavanol-pyranoanthocyanins (R = H, from monomeric flavanols; R = 8-flavanyl, from B-type procyanidin dimers). For all structures: R1 and R2 = H, OH, OCH3; acyl = acetyl, p-coumaroyl, caffeoyl

Specifically, direct adducts formed by linkage between the 4 position of one

monomeric flavanol unit and the 8 position of an anthocyanin unit ((4 →8)-flavanol-

anthocyanin adducts), as well as the acetaldehyde-mediated adducts formed by

linkage of the 8 positions of both flavanol and anthocyanin units (8,8-ethylidene-

flavanol-anthocyanin adducts) were found.

With regard to pyranoanthocyanins, the following types were identified: A-type

vitisins (10-caboxy-pyranoanthocyanins) derived from the reaction between

anthocyanins and pyruvic acid produced by yeast during alcoholic fermentation; B-type

vitisins (pyranoanthocyanins, in a strict sense) formed by reaction of anthocyanins

with acetaldehyde, produced by both yeast metabolism and over aging in the presence

of oxygen (e.g., oak barrel aging but also microoxygenation aging); 10-

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins produced by reaction of anthocyanins with

hydroxycinnamic acids or their decarboxylation products (4-vinyl-hydroxyphenols);

and 10-flavanol-pyranoanthocyanins, very likely formed by reaction of 8-vinyl-

flavanols (the breaking products of polymerized flavanols mediated by acetaldehyde)

with anthocyanins. The identification of all the above mentioned types of low molecular

red wine pigments was mainly based on their UV-vis and MS spectral data (Table 2),

that matched with those obtained from authentic standards or previously reported

data (Rivas-Gonzalo, Bravo-Haro & Santos-Buelga, 1995; Francia-Aricha, Guerra,

Rivas-Gonzalo & Santos-Buelga, 1997; Es-Safi, Fulcrand, Cheynier & Moutounet,

1999; Salas, Atasanova, Poncet-Legrand, Meudec, Mazauric & Cheynier, 2004;

Alcalde-Eon et al., 2006; He, Santos-Buelga, Mateus & de Freitas, 2006; Cruz,

Teixeira, Silva, Mateus, Borges & de Freitas, 2008; He, Carvalho, Mateus & de Freitas,

2010b; Nixdorf & Hermosín-Gutiérrez, 2010; Cejudo-Bastante et al., 2011a; Cejudo-

Bastante, Hermosín-Gutiérrez & Pérez-Coello, 2011b; Blanco-Vega et al., 2011).



Table II. 2. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the whole set of studied samples of commercial wines (n = 286). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo; TEMP/CBSV, blends of tempranillo and cabernet sauvignon. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).



Assignation of well-known anthocyanins, vitisin-type pyranoanthocyanins and

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins did not represent a challenge.

A total of 68 low molecular red wine pigments were identified and quantified in

most of the wine samples, although not all compounds were detected in each wine

sample. Thus, young and aged red wine chromatographic profiles corresponding to red

pigments (DAD-chromatograms obtained at 520 nm) showed remarkable differences

(Figure II.2). In young red wines, the main pigments were the native grape

anthocyanins and the occurrence of vitisin-type pyranoanthocyanins was easily

detected, especially vitisin A and their derivatives; in addition, some direct and

acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin adducts were found.



mAU

0

250

500

750

1000

1250

min5 10 15 20 25 30 35 40

A) Syrah, 1 year old

1

2

34

5

6 8 9

10

1112

13 14

1615

717

26

18

36 38 39

B) Cabernet Sauvignon, 3 years oldmAU

0

50

100

150

200

min5 10 15 20 25 30 35 40

1 34

68

9

10

14 16

2618

36 38 39

5

37

2524

21

40

19

4120

43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

4849 50

D) Merlot,3 years oldmAU

0

50

100

150

200

250

min5 10 15 20 25 30 35 40

1

34 10

16

26

18

36

3839

5

37

25

24 2140

19

41

20

43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

4849 50

28

65 66

55 56

67

27

68

42

44

51 52

5453

57 58

6059

61 62

6463

22

23

C) Garnacha, 3 years oldmAU

0

20

40

60

80

100

120

min5 10 15 20 25 30 35 40

1

3

4

10

16

26

18

36

38

39

5

37

25

2421

40

19 41

20 43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

48

49 5028

65 66

55 56

44

61

52

57

27

23

Figure II 2. Chromatographic profiles of anthocyanins and anthocyanin-derived pigments (DAD, detection at 520 nm) of different red wines: A) young Syrah wine; B) three-years old Cabernet Sauvignon wine; C) three-years old Garnacha wine; D) three-years old Merlot wine. Peak numbering (Table 2): 1-17, anthocyanins; 18-25, A-type vitisins; 26-28, B-type vitisins; 29-35, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins; 36-37, direct flavanol-anthocyanin adducts; 38-44, ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts; 45-68, flavanol-pyranoanthocyanins.

In aged wines, the relevance of anthocyanins was decreased in very variable

proportions and an increasing formation of acetaldehyde-mediated flavanol adducts

was observed, in addition, the loss of linearity of the base line accompanied the

decrease of anthocyanins, thus appearing a broad chromatographic hump occupying

the most of running time that usually is attributed to polymeric pigments.



mAU

0

250

500

750

1000

1250

min5 10 15 20 25 30 35 40

A) Syrah, 1 year old

1

2

34

5

6 8 9

10

1112

13 14

1615

717

26

18

36 38 39

B) Cabernet Sauvignon, 3 years oldmAU

0

50

100

150

200

min5 10 15 20 25 30 35 40

1 34

68

9

10

14 16

2618

36 38 39

5

37

2524

21

40

19

4120

43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

4849 50

D) Merlot,3 years oldmAU

0

50

100

150

200

250

min5 10 15 20 25 30 35 40

1

34 10

16

26

18

36

3839

5

37

25

24 2140

19

41

20

43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

4849 50

28

65 66

55 56

67

27

68

42

44

51 52

5453

57 58

6059

61 62

6463

22

23

C) Garnacha, 3 years oldmAU

0

20

40

60

80

100

120

min5 10 15 20 25 30 35 40

1

3

4

10

16

26

18

36

38

39

5

37

25

2421

40

19 41

20 43

45

29 30

35

31

32 33 34

47

46

48

49 5028

65 66

55 56

44

61

52

57

27

23

No doubt, the most remarkable feature shown by many of the aged wines was

the almost complete disappearance of anthocyanins and the increasing detection of

hydroxyphenyl- and flavanol-pyranoanthocyanins, giving rise to a high number of

chromatographic peaks over the aforementioned chromatographic hump (peaks 29-35

and 45-68, respectively). Unfortunately, some of the anthocyanin-derived pigments

partially co-eluted or were very minor, thus a complete identification and quantification

really need time-consuming previous separation steps (Alcalde-Eon et al., 2006). An

exhaustive list of tentatively identified red wine pigments comprised up to 90

compounds and is given Table 1.



Table II. 1.Chromatographic (peak number as in Figure 2; retention times) and mass spectral (MS, molecular ion; MS/MS, fragment ions) data corresponding to the low molecular red pigments identified in commercial red wine samples.



Direct adducts between flavanol monomers and malvidin 3-glucoside were

detected at m/z 781 (Table 2). The MS2 fragmentation pattern showed that loss of

glucose was the main fragmentation (m/z 619), together with less probable

fragmentations: the loss of water (m/z 601); the Retro-Diels-Alder fission of flavanol

unit (RDA, m/z 467); the Heterocycle-Ring-Fission (HRF, m/z 493); and a fragment

ion at m/z 373 that has been previously reported but its origin still remains unknown

(Salas et al., 2004; Alcalde-Eon et al., 2006). According to previous data (Salas et al.,

2004), the occurrence of the HRF fragment ion confirmed that adduct linkage involved

the C-4 position of the flavanol unit and the C-8 position of the anthocyanin unit and

that tentative assignation of peaks 1 and 2 could be (4 →8)-(–)-epicatechin-malvidin 3-

glucoside and (4 →8)-(+)-catechin-malvidin 3-glucoside, respectively.

In the case of acetaldehyde-mediated adducts between flavanols and

anthocyanins, the four possible isomers of 8,8-ethylidene-(epi)catechin-malvidin

glucoside (m/z 809) were detected, together with one acetylated and two p-

coumaroylated derivatives (m/z 851 and 955, respectively). For non-acylated

derivatives, the loos of the flavanol unit and subsequent loss of the glucose give rise to

the most intense signals in MS2 experiments (m/z 357), whereas for acylated

derivatives the most intense signal corresponded to the loss of only the flavanol unit

(m/z at 561 and 665, respectively) and subsequent loss of acylated glucose was

relatively handicapped (signal at m/z 357 was the second most intense). The

aforementioned data were in agreement with previous works (Rivas-Gonzalo et al.,

1995; Alcalde-Eon et al., 2006; Cruz et al., 2008; Cejudo-Bastante et al., 2011a and



2011b). Trace of acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin adducts involving

flavanol dimers (B-type procyanidins) and/or non-malvidin based anthocyanins were

also observed, but their occurrence was mainly punctual and we decided not to

consider them in this study. Similarly, we did not quantify other series of ethylidene-

bridged flavanol-anthocyanin adducts derived from anthocyanidins other than

malvidin, which were found in some wine samples but they accounted as very minor

and co-eluting compounds.

27.6

29.6 30.731.3

31.8

19.520.020.818.6

A) UV Chromatogram, 520 nm

27.631.3B) EIC 805 +All MS

29.6

31.8C) EIC 847 +All MS

30.7

31.8

D) EIC 951 +All MS

18.6

19.5

F) EIC 1135 +All MS20.020.8

E) EIC 1093 +All MS

50

100

150

200

Intens.

mAU

0

1

2

3

4

x106

0.5

1.0

1.5

x106

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0x106

2

4

6

x105

0

1

2

3x105

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Time [min]

10-(epi)catechin-pymv-3-glc

10-(epi)catechin-pymv-3-acglc

10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc

10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc

10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc

Figure II . 3. Expanded chromatograms of the elution zone corresponding to 10-flavanol-pyranoanthocyanins of aged Merlot wine: A) DAD-chromatogram (detection at 520 nm); Extracted Ion Chromatograms (EIC) at the m/z values corresponding to: B) 10-



(epi)catechin-pymv-3-glc; C) 10-(epi)catechin-pymv-3-acglc; D) 10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc; E) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc; F) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc. Abbreviations: (epi)catechin, both (–)-epicatechin or (+)-catechin; pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-glucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.

With regard to flavanol-pyranoanthocyanins, there is very little scientific data

dealing with the occurrence and concentration of this type of anthocyanin-derived

pigments in wine samples (Alcalde-Eon et al., 2006). We were able to tentatively

identify 21 compounds of this type, comprising the following compounds (Figure 3):

the complete series of derivatives involving (+)-catechin and (–)-epicatechin with the

non-acylated, acetylated, and p-coumaroylated derivatives of three anthocyanidins

(malvidin, peonidin, and petunidin); the partial series formed from (+)-catechin and (–

)-epicatechin with delphinidin 3-glucoside; and four derivatives involving flavanol

dimers (B-type procyanidins) and non-acylated and acetylated malvidin.

The MS2 spectra of 10-flavanol-pyranthocyanins (Figure 4) from flavanol

monomers showed as main signal that coming from the loss of the sugar moiety (m/z

643 in the case of malvidin-based derivatives), together with the less probable RDA

fragment ions from the flavanol residue (direct fragmentation form molecular ions:

m/z 653, 695 and 799 for non-acylated, acetylated and p-coumaroylated malvidin-

derivatives, respectively; subsequent fragmentation after sugar loss: m/z at common

value of 491) in agreement with reported data (He et al., 2006; Cruz et al., 2008) that

also helped in the assignation of the elution order as (–)-epicatechin and (+)-catechin

derivatives. The UV-vis data of these compounds (Figure 5) gave additional evidence

to the suggested structure: firstly, their respective UV-vis resembled very much those

of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (Blanco-Vega et al., 2011), because they

shared very similar chromophores; secondly, their maximum absorbance wavelength

matched with reported data for non-acylated derivatives (He et al., 2010b) and

showed the expected coincidence in the case of non-acylated and acetylated

derivatives; finally, p-coumaroylated derivatives showed an expected additional

absorbance band attributable to the p-coumaroyl residue around 314 nm.



491.2

643.2

653.2

+MS2(805.7), 31.3 min

491.2

643.2

695.2

+MS2(847.8), 29.6 min

491.2

643.1

799.2

+MS2(951.8), 30.7 min

641.2803.2

931.3+MS2(1093.8), 18.6 min

641.2

845.2

931.2+MS2(1135.8), 20.0 min

2

4

x106

Intens.

0.5

1.0

1.5

2.0

x106

0.5

1.0

1.5

x106

1

2

3

4

5x105

0.0

0.5

1.0

1.5

x105

200 400 600 800 1000 m/z

-162 (glc)-152 (RDA)

-162 (glc) -152 (RDA)

-204 (acglc)

-204 (acglc) -152 (RDA)

-308 (cmglc)

-308 (cmglc) -152 (RDA)

-162 (glc)

-162 (glc) -290 (terminal flavanol)

-290 (terminal flavanol)

-152 (RDA)

-152 (RDA)

-204 (acglc)



-204 (acglc)

A)

B)

C)

D)

E)

Figure II. 4. MS/MS fragmentation patterns of: A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc; D) 10-flavanol-dimer-pymv-3-glc; E) 10-flavanol-dimer-pymv-3-acglc. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.



nm250 300 350 400 450 500 550

Norm.

0

10

20

30

40

50

C) 10-catechin-pymv-3cmglc (lmax = 507 nm)

262

285 295314

400

470

A) 10-epicatechin-pymv-3glc (lmax = 506 nm)

B) 10-catechin-pymv-3acglc (lmax = 506 nm)

Figure II. 5. On-line DAD spectra of : A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc. Visible maximum absorbance is indicated for each compound. Abbreviations: pymv,

pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.

In contrast, the flavanol-pyranoanthocyanin derivatives involving B-type

procyanidins did not show the RDA fragment ions but those coming from the loss of

the terminal flavanol unit (loss of 290 amu). The latter compounds were firstly

proposed on the basis of their molecular ions (Francia-Aricha et al., 1997) and further

confirmed by MS2 data (He et al., 2006) that matched with our results. Together with

previously reported fragment ions corresponding to the independent losses of the

sugar and the terminal flavanol units (m/z 931 and 803 for non-acylated derivatives;

m/z 931 and 845 for acetylated derivatives) we also observed the signal corresponding

to the combined losses of both units (common fragment ion at m/z 641).

Content and Distribution of Different Classes of Red Wine Pigments

The content of the nine different classes of red wine pigments considered in this

work accounted for wide ranges of values (Table 2), because of the diversity of the

selected set of commercial wines with regard to grape cultivar and age. It was usual to

find wine samples where low molecular weight anthocyanin-derived pigments were



very minor and even some of them were not detected. The average values (range and

mean values ± standard deviation) found for the whole samples set (n = 286) were:

native grape monomeric anthocyanins, 0.3-505.0 and 93.3 ± 80.2 mg/L, as malvidin

3-glucoside equivalents (mv-3-glc); flavanol-anthocyanin direct adducts, 0.00-3.19

and 1.24 ± 0.59 mg/L, as mv-3-glc; flavanol-anthocyanin ethylidene-bridged adducts,

0.00-8.70 and 1.14 ± 1.20 mg/L, as mv-3-glc; A-type vitisins, 0.71-49.16 and 7.84 ±

6.25 mg/L, as vitisin A; B-type vitisins, 0.00-16.44 and 1.31 ± 1.87 mg/L, as vitisin B;

10-DHP-pyranoanthocyanins, 0.00-21.24 and 1.54 ± 2.58 mg/L, as 10-(3’,4’-

dihydroxyphenyl-pyranomalvidin-3-glucoside (10-DHP-pymv-3-glc); 10-HP-

pyranoanthocyanins, 0.00-6.82 and 0.71 ± 0.89 mg/L, as 10-(4´-hydroxyphenyl)-

pyranomalvidin-3-glucoside (10-HP-pymv-3-glc); 10-MHP-pyranoanthocyanins, 0.00-

1.27 and 0.11 ± 0.24 mg/L, as 10-DHP-pymv-3-glc; and 10-flavanol-

pyranoanthocyanins, 0.00-12.36 and 0.74 ± 1.45 mg/L, as 10-HP-pymv-3-glc.



Tabla II. 3. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofyoung commercial wines (1-2 years old; n = 199). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).



With regard to the youngest wines (1 and 2 years old), the average content of

monomeric anthocyanins reached 122.6 ± 78.7 mg/L (as mv-3-glc). In spite of the

great variability shown by the content of monomeric anthocyanins, some significant

differences were found according to the grape variety (Table 3): the lowest content

was for Garnacha wines (71.2 ± 56.4 mg/L) and the highest one for Petit Verdot wines

(160.8 ± 94.1 mg/L). Concentrations of different pigments were re-calculated as

μmol/L for comparison.



0%

20%

40%

60%

80%

100%

mo

lar

pe

rce

nta

ge

10-flavanol-pyant

10-MHP-pyant

10-HP-pyant

10-DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

ethylidene adducts

direct adducts

0

50

100

150

200

250

300

350

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)

monomeric anthocyanins

anthocyanin-derived pigments

A)

B)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

mo

lar

pe

rce

nta

ge

10-flavanol-pyant

10-MHP-pyant

10-HP-pyant

10-DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

ethylidene adducts

direct adducts

0

50

100

150

200

250

300

350

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)monomeric anthocyanins


A)

B)

FigureII. 6. Low molecular weight pigment content of 1 and 2 years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins

and anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; GAR, Garnacha; MER, Merlot; PV, Petit Verdot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; pyant, pyranoanthocyanins.



On this molar basis (Figure 6A), monomeric anthocyanins contributed to low

molecular red pigments with the significantly lowest percentage in Garnacha wines

whereas the significantly highest percentages were reached in Tempranillo wines (77.5

and 90.3 %, respectively). The other single-variety wines showed intermediate

pigment distribution, although Merlot (79.1 % of monomeric anthocyanins) and

Cencibel (88.5 % of monomeric anthocyanins) wines were closer to Garnacha and

Tempranillo wines, respectively. A detailed analysis of the content and contribution of

each type of anthocyanin-derived pigments (Table 3 and Figure 6B) revealed the

following significant findings: direct flavanol-anthocyanin adducts accounted for the

highest concentrations and molar percentages in Cencibel wines, whereas the lowest

concentrations were found in Garnacha and Petit Verdot wines, the latter also showing

the lowest molar percentage of that pigment type; ethylidene-bridged flavanol-

anthocyanin adducts reached the highest concentration and molar percentage in Petit

Verdot and, although some differences were evidenced in the concentrations found in

the other wines (Cencibel and Garnacha wines accounting for the lowest contents), no

significant differences were shown by their respective molar percentages; the contents

of A-type vitisins were not significantly different among wines grouped by grape

cultivar, however, molar percentages of these pigments were lower in Garnacha wines

and higher in Cencibel, Merlot, Syrah and Tempranillo wines; nor concentrations nor

molar percentages of B-type vitisins significantly differed among single-cultivar wines;

with regard to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, Garnacha wines stood out by the

highest concentration and molar percentage, especially for the major 10-DHP-

pyranoanthocyanins and, in a lesser extent, 10-HP-pyranoanthocyanins; finally, 10-

flavanol-pyranoanthocyanins accounted for the highest concentrations in the French

varieties Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, and Syrah wines, the highest molar

percentages being found in Merlot wines.

All these results suggested, in one hand, that Garnacha wines are prone to

account for high hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin concentrations, being those

pigments important contributors to low molecular weight pigments in the young wines

from this grape cultivar. This conclusion is in agreement with the fact that Garnacha is

one of the grape cultivars richer in hydroxycinnamic acid derivatives, which are the

precursor reactants to form hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (Rentzsch, Schwarz,

Winterhalter & Hermosín-Gutiérrez, 2007b). On the other hand, Cencibel and



Tempranillo are clones of the same grape cultivar and the similarity of the results

obtained for both wine groups confirmed this narrow relationship.

Aged wines (3 or more years old) accounted for expected low concentrations of

monomeric anthocyanins (Table 4; average of 25.5 ± 22.9 mg/L, as mv-3-glc). In

addition, the molar percentages of these native grape red wine pigments decreased up

to 56.6-82.0 % without significant differences among diverse grape cultivars (Figure

7A). The aging had an effect of making uniform the concentrations and molar

percentages of every type of low molecular weight pigments, and only slight

differences among wine groups (Table 4 and Figure 7B) were found for B-type vitisins

(highest values for Syrah wines) and 10-HP-pyranoanthocyanins (highest values for

Merlot wines). As for youngest wines, aged wines from Cencibel and Tempranillo

presented quite similar content and distribution of red pigments.

In the case of Tempranillo wines, the significant decrease of monomeric

anthocyanins in aged wines was accompanied by the parallel decrease in the

concentration of total low molecular weight pigments and the increase of molar

percentage of anthocyanin-derived pigments within them, reaching an average molar

percentage of 55 % of the total pigment content in wines aged for seven or more

years.



Table II. 4. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofaged commercial wines (2 or more years old; n = 84). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD)corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; MER, merlot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test;α= 0.05).



0%

20%

40%

60%

80%

100%

mo

lar

pe

rce

nta

ge

10-flavanol-pyant

10-MHP-pyant

10-HP-pyant

10-DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

ethylidene adducts

direct adducts

0

20

40

60

80

100

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)



A)

B)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

mo

lar

pe

rce

nta

ge

10-flavanol-pyant

10-MHP-pyant

10-HP-pyant

10-DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

ethylidene adducts

direct adducts

0

20

40

60

80

100

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)



A)

B)

Figure II. 7. Low molecular weight pigment content of 3 or more years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric

anthocyanins and anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; MER, Merlot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; TEMP/CBSV, blends of Tempranillo and Cabernet Sauvignon; pyant, pyranoanthocyanins.



(Figure 8A). Ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts were the most

affected by disappearance during aging (Figure 8B), maybe due to the reported

instability of the ethylidene linkage (Escribano-Bailón, Álvarez-García, Rivas-Gonzalo,

Heredia & Santos-Buelga, 2001; Mateus, Pascual-Teresa, Rivas-Gonzalo, Santos-

Buelga & de Freitas, 2002; Cejudo-Bastante et al., 2011a). In contrast,

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their contribution in most aged wines

(Figure 8B), in agreement with reported data suggesting their continuous formation

over aging and their higher stability compared to monomeric anthocyanins (Rentzsch

et al., 2007a, 2007b and 2010.

A)

B)

0

15

30

45

60

75

0

100

200

300

400

500

600

mo

lar

pe

rce

nta

ge (%

)

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)

Total pigment concentration

% Anthocyanin-derived pigments

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

mo

lar

pe

rce

nta

e (%

)

Flavanol-pyant

MHP-pyant

HP-pyant

DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

Ethyliden adducts

Direct adducts



A)

B)

0

15

30

45

60

75

0

100

200

300

400

500

600

mo

lar

pe

rce

nta

ge (%

)

con

cen

trat

ion

(mm

ol/

L)

Total pigment concentration

% Anthocyanin-derived pigments

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

mo

lar

pe

rce

nta

e (%

)Flavanol-pyant

MHP-pyant

HP-pyant

DHP-pyant

B-type vitisins

A-type vitisins

Ethyliden adducts

Direct adducts

Figure II. 8. Low molecular weight pigment content of Tempranillo wines according to their age: A) concentrations (μmol/L) of total pigments and molar percentage of

anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: pyant, pyranoanthocyanins.

LITERATURE CITED

Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C. Separation of pyranoanthocyanins from red wine by column chromatography. Anal. Chim. Acta 2004, 513, 305-318.

Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C. Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing.

A comprehensive study. Anal. Chim. Acta 2006, 563, 238-254.

Blanco-Vega, D.; López-Bellido, F. J.; Alía-Robledo, J. M.; Hermosín-Gutiérrez, I. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of Pyranoanthocyanins Pigments Formed in Model Wine. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 9523-9531.

Cejudo-Bastante, M. J.; Hermosín-Gutiérrez, I.; Pérez-Coello, M. S. Micro-

oxygenation and oak chip treatments of red wines: Effects on colour-related phenolics, volatile composition and sensory characteristics. Part I: Petit Verdot wines. Food Chem. 2011a, 124, 727-737.



Cejudo-Bastante, M. J.; Hermosín-Gutiérrez, I.; Pérez-Coello, M. S. Micro-oxygenation and oak chip treatments of red wines: Effects on colour-related phenolics,

volatile composition and sensory characteristics. Part II: Merlot wines. Food Chem. 2011b, 124, 738-748.

Cruz, L.; Teixeira, N.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; Borges, J.; de Freitas, V. Role of Vinylcatechin in the Formation of Pyranomalvidin-3-glucoside-(+)-Catechin. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 10980-10987.

de Freitas, V.; Mateus, N. Chemical transformations of anthocyanins yielding a variety of colours (Review). Environ. Chem. Lett. 2006, 4, 175-183.

Escribano-Bailón, T.; Álvarez-García, M.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Heredia, F. J.; Santos-Buelga, C. 2001. Colour and stability of pigments derived from the acetaldehyde-mediated condensation between malvidin-3-O-glucosides and (+)-catechin. J. Agric. Food Chem., 49, 1213-1217.

Es-Safi, N.; Fulcrand, H.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Competition between (+)-

Catechin and (−)-Epicatechin in Acetaldehyde-Induced Polymerization of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2096–2102.

Francia-Aricha, E. M.; Guerra, M. T.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C. New Anthocyanin Pigments Formed after Condensation with Flavanols. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 2262-2266.

He, J.; Santos-Buelga, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Isolation and quantification

of oligomeric pyranoanthocyanin-flavanol pigments from red wines by combination of column chromatographic techniques. J. Chromatogr. A 2006, 1134, 215–225.

He, J.; Oliveira, J; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxovitisins: A New Class of Neutral Pyranone-anthocyanin Derivatives in Red Wines. J. Agric. Food Chem.

2010a, 58, 8814–8819.

He, J.; Carvalho, A. R. F.; Mateus, N.; de Freitas, V. Spectral Features and Stability of Oligomeric Pyranoanthocyanin-flavanol Pigments Isolated from Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2010b, 58, 9249–9258.

He, J.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxidative formation and structural characterisation of new -pyranone (lactone) compounds of non-oxonium nature originated from fruit anthocyanins. Food Chem. 2011, 127, 984-992.

Mateus, N.; Oliveira, J.; Pissarra, J.; González-Paramás, A.M.; Rivas-Gonzalo, J; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A new vinylpyranoanthocyanin pigment occurring in aged red wine. Food Chem. 2006, 97, 689–695.

Mateus, N.; Oliveira, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A. P.

NMR structure characterization of a new vinylpyranoanthocyanin-catechin pigment. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3455-3457.

Mateus, N.; Pascual-Teresa, S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; De Freitas, V. 2002. Structural diversity of anthocyanin-derived pigments in port wines. Food Chem., 76, 335-342.



Mateus, N.; Silva, A. M. S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; de Freitas, V. A new class of blue anthocyanin-derived pigments isolated from red wines. J. Agric.

Food Chem. 2003, 51, 1919-1923.

Monagas, M.; Bartolomé, B. Anthocyanins and anthocyanin-derived compounds.

In Wine Chemistry and Biochemistry; Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C., Eds.; Springer Science and Business Media: New York, NY, 2009; pp 439-462.

Nixdorf, S. L.; Hermosín-Gutiérrez, I. Brazilian red wines made from the hybrid grape cultivar Isabel: Phenolic composition and antioxidant capacity. Anal. Chim. Acta 2010, 659, 208-215.

Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva, A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de Freitas, V. Pyranoanthocyanin Dimers: A New Family of Turquoise Blue Anthocyanin-Derived Pigments Found in Port Wine. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5154–5159.

Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. Reaction between hydroxycinnamic acids and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins. J.

Agric. Food Chem. 2007, 55, 6349-6356.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P. Pyranoanthocyanins: An overview on structures, occurrence and pathways of formation. Trends Food Sci. Technol. 2007a, 18, 526-534.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I. (2007b). Formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: precursor levels

and evolution during aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 4883-4888.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P; Blanco-Vega, D.; Hermosín-Gutiérrez, I. Survey on the content of vitisin A and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins

in Tempranillo wines. Food Chem. 2010, 119, 1426-1434.

Rivas-Gonzalo, J. C.; Bravo-Haro, S.; Santos-Buelga, C. Detection of Compounds Formed through the Reaction of Malvidin 3-Monoglucoside and Catechin in the Presence of Acetaldehyde. J. Agric. Food Chem. 1995, 43, 1444-1449.

Salas, E.; Atanasova, V.; Poncet-Legrand, C.; Meudec, E.; Mazauric, J. P.; Cheynier, V. Demonstration of the occurrence of flavanol–anthocyanin adducts in wine and in model solutions. Anal. Chim. Acta 2004, 513, 325–332.

Waterhouse, A. L.; Kennedy, J. A. Red Wine Color: Revealing the Mysteries; ACS Symposium Series 886; Waterhouse, A.L., Kennedy, J.A., Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 2004.

Acknowledgements

The authors thank Spanish Ministerio de Economía y Competitividad for financial support (project AGL2011-29708-C02-02). Author Gómez-Alonso, S., thanks the

Fondo Social Europeo and the Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha for co-funding his contract through the INCRECYT program.

CAPÍTULO III

Resultados y Discusión. Capítulo III.


CAPÍTULO III. Survey on the Content of Vitisin A and

Hydroxyphenyl-Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines.

1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

Los cambios de color que se producen durante la elaboración y el envejecimiento

del vino, son debidos a la concentración de antocianos y otros compuestos fenólicos

derivados de la uva, pero también a la presencia de otras moléculas de bajo peso

molecular producidas en la fermentación o extraídas de las barricas en la crianza.

Con el descubrimiento en 1996, Fulcrand, H.; Cameira dos Santos, P. -J.;

Sarni-Manchado, P.; Cheynier, V.; Favre-Bonvin, J. (1996), de la existencia de unos

nuevos pigmentos en vinos envejecidos y la importancia que estos tenían en cuanto al

color y a la estabilidad de ese color en el tiempo se habían empezado a estudiar estos

compuestos de forma exhaustiva. Mientras que los antocianos (que ya habían sido

muy estudiados y se disponían de muchos datos) de la uva empiezan rápidamente a

disminuir su concentración y desaparecen casi completamente después de 5 o 6 años,

los piranoantocianos aumentaban su concentración después de la fermentación y se

podían detectar en vinos envejecidos.

Estos nuevos pigmentos están mucho menos estudiados en cuanto a su

contenido y desarrollo, y por tanto la finalidad del presente trabajo ha sido determinar

la concentración de estos pigmentos en series de vinos comerciales durante 29 años,

en distintas bodegas de la zona, sobre todo en la variedad tempranillo que es la

mayoritaria de Castilla la Mancha.

Se han analizado vinos de nueve bodegas con añadas que van desde 1979 y

2007 y encontramos una gran variabilidad en cuanto a la concentración de

piranoantocianos.

Resultados y Discusión: Capítulo III.


Vitisin A, 0-10.76 mg/L ; pinotin A, 0-4.26 mg/L; y malvidin 3-glucoside-4-

vinylphenol, 0.03-1.37 mg/L . Vitisin A y malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol ya están

presentes en vinos con uno o dos años de crianza, pero pinotin A solo es detectable en

los dos primeros años y luego desaparece. Vitisin A tiende a disminuir su

concentración y sin embargo hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins aumentan la

concentración durante la crianza.

Por otro lado se había visto la tendencia en el aumento y el descenso de la

concentración, parecía sufrir saltos bruscos en algunos vinos comerciales y se pensó

en la posibilidad de que esos vinos hubieran sufrido un “refresco” por parte de vinos

jóvenes. Estos “refrescos” están permitidos siempre que la adición no sea mayor del

15%.

Como objetivo de este trabajo se planteo el hacer un seguimiento de la

concentración de los antocianos, piranoantocianos y ácidos hidroxicinámicos en vinos

tintos de la variedad tempranillo, estos fueron cedidos por distintas bodegas

colaboradoras de Castilla la Mancha y se logró contar con muestras desde el año 1979

al año 2007.

Las muestras de cada bodega tenían un tipo de elaboración similar a lo largo

del tiempo y esto nos permitiría evaluar y comparar los datos de las concentraciones

de las distintas moléculas y relacionar esto con el color, la estabilidad de ese color y la

edad del vino.

También se hicieron una serie de experimentos de “refrescos” para ver como

modificaban estos la concentración de los distintos pigmentos y la evolución del color

que se podría esperar, además de comprobar si esos refrescos podrían explicar esas

variaciones anómalas en cuanto a la concentración de antocianos y piranoantocianos

en algunos vinos comerciales.



TOMA DE MUESTRAS

El ensayo para el análisis de las series verticales, que nos permitan hacer un

estudio sobre los cambios de color observados en un mismo vino (variedad, forma de

elaboración etc) a lo largo del tiempo, se llevó a cabo con las bodegas Vinícola de

Castilla (Manzanares) con botellas desde el año 79 al 2007, con distintos vinos

proporcionados por la D.O. Rivera del Jucar, con vinos de Casa Gualda desde el año 98

al 2005, con muestras de Los Teatinos del 94 al 2007,vinos de Cinco Almudes del 97 al

2004, Con vinos de Valdepeñas Corcovo del 96 al 2007, Ojos del Guadiana (Villarrubia

de los Ojos)del 99 al 2007, y Señorío de Guadianeja (Manzanares) del 93 al 2006.

Estas botellas fueron cedidas por todas las bodegas para el estudio y contamos con

dos botellas disponibles por cada año. Se hicieron muestras por duplicado de cada

una de ellas.

Para determinar el contenido en antocianos y piranoantocianos tanto de las

series de vino como de los experimentos de refresco elaborados, se prepararon unos

viales de dos ml, que fueron pasados por filtros de membrana de poliéster con tamaño

de poro de 0.20 μm (Chromafil PET 20/25, Machery-Nagel, Düren, Germany) antes de

la inyección en el HPLC.

Por último, y con el fin de evaluar la importancia y la evolución de la formación

de piranoantocianos en los vinos tintos cuando se le añaden refrescos de vinos más

jóvenes, se elaboraron algunos vinos experimentales mezclando vinos de distintas

variedades o/y de distinta edad: mezclas Cencibel joven con Garnacha (rico en ácidos

hidroxicinámicos) de 1 año; mezclas Cencibel envejecido (reserva) con Cencibel joven.

Para los refrescos se utilizaron vinos de Petit Verdot y Cencibel de la cooperativa

Aquilices de Miguelturra del año 2007.

Estos vinos se irán analizando a lo largo del tiempo (toma de muestra

cuatrimestral). Se someten a fermentación acelerada y se toman medidas cada

semana.



Keywords: ageing, hydroxycinnamic acids, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol,

red wine colour, Tempranillo, pyranoanthocyanin, pinotin A, vitisin A

1. Introduction

The actual colour of a red wine is the result of a combination of different physical

and chemical processes which sometimes overlap, and begin to develop as soon as

anthocyanins are extracted from grape skins to fermenting must. After the maceration

period, and also during and after alcoholic fermentation, anthocyanins and other

phenolic wine constituents react to a great variety of new monomeric, oligomeric and

polymeric compounds. Next to the physical phenomenon of copigmentation, which is



partly responsible for colour enhancement, the contribution of polymeric anthocyanin-

derived pigments to the colour of red wine is very important, especially in aged wines.

The study of the pigments contributing to red wine colour emerged around fifty years

ago and has attracted a great attention especially within the last decade. The initially

suggested anthocyanin-derived wine pigments were tannin-anthocyanin polymeric

pigments that could explain the precipitation of colouring matter observed during red

wine storage and ageing. However, wine polymeric pigments represent a

heterogeneous and not well-characterized group of reaction products. Another group

of anthocyanin-derived wine pigments correspond to monomeric and oligomeric

pigments that are formed in great numbers by the reaction of anthocyanins and

molecules of low molecular weight. The latter pigment group is easier to study, and

nowadays the following classification can be suggested: non-acylated and acylated

native anthocyanins; anthocyanins acylated with lactic acid; dimeric anthocyanins;

flavanol-anthocyanin direct and acetaldehyde-mediated reaction pigments; flavanol-

dimeric anthocyanin direct reaction pigments; and pyranoanthocyanins (Alcalde-Eon,

Escribano-Bailón, Santos Buelga & Rivas-Gonzalo, 2004 and 2006; Alcalde-Eon, Boido,

Carrau, Dellacassa & Rivas-Gonzalo, 2006; Alcalde-Eon, 2008).

Among the newly formed red wine pigments, the class of pyranoanthocyanins

plays an increasing role during wine ageing because these relatively small molecules

remain in solution, in contrast to the classical flavanol-anthocyanin polymeric pigments

that tend to precipitate. In addition, most pyranoanthocyanins differ from their

anthocyanin precursors, especially in their colour. With the exception of the so-called

portisins, most pyranoanthocyanins show a hypsochromically shifted maximum of

absorption in comparison to native grape anthocyanins (Rentzsch, Schwarz &

Winterhalter, 2007a). This shift causes a red-orange colour of pyranoanthocyanins in

contrast to the red-purple colour of genuine anthocyanins, like malvidin 3-glucoside.

Moreover, the newly formed pyran ring stabilizes the colour of pyranoanthocyanins at

varying pH values, and hardly any loss of red colour intensity is observed within the

pH range 1 to 5. Under the same conditions the genuine grape anthocyanins lose up

to 90% of their initial colour (Mazza & Miniati, 1993). A further difference between

grape anthocyanins and pyranoanthocyanins is related to their development during

storage. Anthocyanins reach a maximum in concentration after 2-3 days of skin

maceration and, afterwards, they are constantly degraded until an almost complete



disappearance after several years of ageing. In contrast to this, the greatest amount

of pyranoanthocyanins is produced during processing and storage of red wines

(Romero & Bakker, 2000; Schwarz, Hofmann & Winterhalter, 2004; Schwarz, Quast,

von Baer & Winterhalter, 2003a; Rentzsch, Schwarz, Winterhalter & Hermosín-

Gutiérrez, 2007b).

Pyranoanthocyanins result from the reaction of a native grape anthocyanin and

molecules bearing a polarizable double bond. Pyranoanthocyanin structures are diverse

and several pathways have been proposed for their formation (Rentzsch et al., 2007a).

Some relevant pyranoanthocyanins emerge from the reaction of anthocyanins and

yeast metabolites, such as pyruvic acid (e.g. vitisin-type pyranoanthocyanins; 1 in

Figure 1) or hydroxycinnamic acids (e.g. hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins; 2 in

Figure 1).

O

OCH3

OCH3

OH

O

HO

R1

OGlc

O

OCH3

OCH3

OH

O

HO

OH

OGlc

R2

1 2

R3

Figure III.1. Chemical structure of wine pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside: 1, vitisin-type pyranoanthocyanins (R1 = COOH, vitisin A; R1 = H, vitisin B); 2, hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins (R2 = R3 = H, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol or mv-3-glc-4-VP; R2 = H and R3 = OH, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol or pinotin A; R2 = H and R3 = OCH3, malvidin 3-glucoside-4-vinylguaiacol or mv-3-glc-4-VG).



In the latter case, formation of these hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins seems

to develop in part during fermentation through yeast-mediated decarboxylation of

hydroxycinnamic acids (Fulcrand, Cameira dos Santos, Sarni-Manchado, Cheynier &

Favre-Bonvin, 1996) and, more prominent, by direct reaction of free hydroxycinnamic

acids (Schwarz, Wabnitz & Winterhalter, 2003; Schwarz, Picazo-Bacete, Winterhalter &

Hermosín-Gutiérrez, 2005) after release from their respective tartaric acid esters

(Rentzsch et al., 2007b).

Published data about the content and development of pyranoanthocyanins in

commercial wines is scarce (Schwarz et al., 2004; Schwarz et al., 2003a; Rentzsch et

al., 2007b). The initial aim of this work was to make a survey on the concentrations of

some of the most occurring pyranoanthocyanins (vitisin A and the hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins pinotin A and malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol) in a wide set of

commercial wines elaborated using grapes of the Vitis vinifera Tempranillo variety, the

most common Spanish red grape variety. As a consequence of the preliminary results

we obtained, a second objective of our work was to evaluate the effect of ageing (a

period of 1-10 years was covered) in the content of pyranoanthocyanins in wines,

paying special attention to some factors that can influence the levels of

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in aged Tempranillo wines, namely, the occurrence

of their respective precursor molecules (free hydroxycinnamic acids) and the addition

of young red wines to aged wines (the enological practice known as “refreshment”). To

help achieving the latter objective, a vertical series of Tempranillo wines elaborated in

the same cellar over a period of 29 years was considered as reference for anthocyanin

evolution during ageing, and also experiments of refreshment and further accelerated

ageing were performed.

2. Materials and Methods

2.1. Chemicals and Wine Samples

All solvents were of HPLC quality and all chemicals of analytical grade (> 99%).

Water was of MilliQ® quality. The HPLC commercial standards used for quantification

were: malvidin 3-glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany); and caffeic and

p-coumaric acids (Merck, Darmstadt, Germany). Wine samples were divided into two



sets: the first was a vertical series of wines supplied by one individual cellar (Vinícola

de Castilla S. A., Manzanares, located in the southern middle Spanish region called La

Mancha) elaborated with similar quality grapes and winemaking conditions and

covering the vintages period 1979-2007 (48 samples with the exception of years 1981,

1982, 1985, 1988 and 1992); the second wine set corresponded to commercial wines

purchased at local wine stores which were produced also in the winemaking region of

La Mancha. The sampling of the commercial wines (106 samples) covered a wide

range of ageing times, from the youngest wines (1 year old) up to the oldest available

wines (10 years old). Owing that the set of commercial wines were collected and

analyzed at three different times (September 2005, September 2006, and November

2008) the wine samples were grouped by age, that is, by calculating the difference in

years between analysis time and vintage of elaboration.

Only red wines subjected to Origin Denomination control with a declaration as

“Tempranillo (or its synonym Cencibel) wines” were selected; a control which implies

that at least 85% of the wine has to be made from Tempranillo grapes.

Table III.1. Mean values and standard deviations (MV±SD) for the content (mg/L) of pyranoanthocyanins and related compounds (their precursors, malvidin

3-glucoside, free and bound hydroxycinnamic acids) in commercial Tempranillo wines grouped by age.

a,b Different letters in the same row indicate significant differences according to the test of Student-Newman-Keuls (α =0.05



2.2. Wine Refreshment Experiments

Young wine (vintage 2007; 150 mL) was added to old Tempranillo wine (vintage

2002; 850 mL) and then were gently homogenized. Two different young wines were

assayed, one was a Tempranillo wine and the other was a Petit Verdot wine. After that,

the resulting refreshed Tempranillo wine was distributed in 25 mL dark glass bottles,

flushed with nitrogen for avoiding air in the headspace, and sealed. The refreshed

wines were submitted to an accelerated ageing process following a described

procedure (Ugliano, Siebert, Mercurio, Capone & Henschke, 2008), consisting in

maintaining them in darkness at 30ºC in an oven set at this temperature. Samples for

HPLC analysis were taken in triplicate each week for HPLC analysis.

2.3. Identification and Quantitative Analysis of Anthocyanins,

Pyranoanthocyanins, and Hydroxycinnamic Acid Derivatives by HPLC with

Electrospray Ionization Multiple Mass Spectrometry (HPLC-ESI-MSn)

HPLC separation, identification and quantification of Tempranillo wine phenolics

were performed on an Agilent 1100 Series system (Agilent, Germany), equipped with

DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL (G2445C VL) electrospray ionization mass

spectrometry (ESI-MSn) system, and coupled to an Agilent Chem Station (version

B.01.03) data-processing station. The mass spectra data were processed with the

Agilent LC/MS Trap software (version 5.3). The wine samples were injected (50 μL)

after filtration (0.20 μm, polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel,

Düren, Germany) on a reversed-phase column Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250

mm; 5 μm particle; Agilent, Germany), thermostatized at 40 ºC. The chromatographic

conditions were adapted from the OIV method for analysis of anthocyanins in red

wines (Office International de la Vigne et du Vin, 2003). The solvents were

water/acetonitrile/formic acid (87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B),

and the flow rate was 0.63 mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min,

6%; 15 min, 30%; 30 min, 50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For

identification, ESI-MSn was used employing the following parameters: positive ion

mode; dry gas, N2, 11 mL/min; drying temperature, 350ºC; nebulizer, 65 psi;

capillary, -2500 V; capillary exit offset, 70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan



range, 50-1200 m/z. For quantification, different DAD-chromatograms were extracted

at 520 nm (malvidin 3-glucoside, mv-3-glc), 510 nm (vitisin A and hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins), and 320 nm (hydroxycinnamic acid derivatives). Vitisin A and

pinotin A used as reference standards were prepared as previously described, by

reaction of mv-3-glc with pyruvic acid (Schwarz et al., 2003a) or isolation from

Pinotage wine (Schwarz, Jerz & Winterhalter, 2003), respectively. Malvidin 3-

glucoside-4-VP (mv-3-glc-4-VP) used as standard was isolated from the reaction

mixture of mv-3-glc with p-coumaric acid using similar conditions as described for the

synthesis of pinotin A (Schwarz & Winterhalter, 2003).

2.4. Statistical Data Analysis

ANOVA analysis of the wine data grouped by age was performed (Student-

Newman-Keuls test, α = 0.05; SPSS version 10.0, SPSS Inc.) in order to look for

significant differences. The wine data were also submitted to Principal Components

Analysis (SPSS version 10.0, SPSS Inc.) to test the possibility of grouping, paying

attention to its composition in pyranoanthocyanins and also their precursors.



3. Results and Discussion

3.1. Tempranillo Wine Vertical Series

Reversed-phase HPLC can successfully separate red wine pigments which are not

of polymeric nature. Usually, the HPLC-chromatogram at 520 nm of a young

Tempranillo red wine is strongly dominated by native grape anthocyanins. Additionally

some minor peaks that correspond to pyranoanthocyanins, especially those derived

from pyruvic acid (vitisin A) and acetaldehyde (vitisin B), are detectable.

Figure III.2. Changes in anthocyanins and pyranoanthocyanins of Tempranillo

wines during aging: a), 2 years old wine; b), 4 years old wine; c), 7 years old wine. Peak assignation: mv, malvidin; glc, glucoside; ac, acetyl; cm, p-coumaroyl; VP,

vinylphenol; VG, vinylguaiacol.



The ageing induces a decrease in the anthocyanin concentration in Tempranillo

wines while, simultaneously, an increasing importance of hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins can be observed (Figure 2b). It is common that, after an ageing

time of 5-7 years, the anthocyanins are completely degraded and the chromatogram is

usually dominated by pyranoanthocyanins (Figure 2c). Analyzing a vertical series of

wines elaborated in the same winery over 29 years, the native malvidin 3-glucoside

(mv-3-glc) almost disappeared in wines 6 or more years old (Figure 3a), accounting

for 55-57 mg/L in the first year of ageing (vintage 2007) and then strongly decreasing

its concentration below 15 mg/L for wines 2-5 years old (vintages 2006 to 2002).

However, relatively high concentrations of mv-3-glc were found for some wines of the

vintage 2003 and all the wine samples of the vintage 2002 which could be very likely

explained by the typical variations found in biological materials and also as a result of

the many conditions that can influence the content of anthocyanins in wine (for

instance, some years the same vineyards can notably vary in the content of grape

anthocyanins due to unexpected variations in grape maturation process). Regarding

the content of pyranoanthocyanins in the wines of this vertical series, the general

trend found for vitisin A was a decrease over ageing of its content that was frequently

interrupted by various temporary maxima and minima (Figure 3b), in close accordance

to the behaviour reported for a similar vertical series of Chilean Cabernet Sauvignon

wines (Schwarz et al., 2003a). In the case of the hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins

malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-glc-4-VC, or pinotin A; Figure 3c) and

malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP; Figure 3d), their concentrations

initially tended to show a strong increase within the first two years of ageing (wines

from vintages 2007 and 2006) reaching the highest values found for pinotin A (17.7

mg/L) and mv-3-glc-4-VP (3.8 mg/L), and continued with an abrupt decrease over the

next two years of ageing (wines from vintages 2005 and 2004) that further tended to

a new increase during the next 11 years of ageing (wines from vintages 2003 to 1993;

concentrations increased up to 9.9 and 2.9 mg/L for pinotin A and mv-3-glc-4-VP,

respectively), although this trend suffered two interruptions with minima values (wines

from the vintages 1999 and 1995).



FigureIII.3. Tempranillo wine vertical series. Variation with wine age of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-

vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

Finally, wines older than 15 years showed the lowest concentrations of both

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (around 1-2 mg/L and 0.3-0.7 mg/L for pinotin A

and mv-3-glc-4-VP, respectively) and they did not change so much over the rest of the

next 14 years of ageing (wines from vintages 1992 to 1979). The trend shown by the

content of both pinotin A and mv-3-glc-4-VP over the ageing was quite similar, but a

remarkable difference was the relative initial value of their concentrations: pinotin A

was almost a trace compound (less than 1 mg/L) in 1 year old wines (vintage 2007),

whereas mv-3-glc-4-VP already accounted in the first year of ageing for remarkable

concentrations (mean value of 1.6 mg/L) and only a few wines (vintages 2006, 2005,

1997, 1994 and 1993) showed higher values than this initial concentration.

0

10

20

30

40

50

60

19791983198719911995199920032007

vintage

mv-3

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(m

g/L

)

0

1

2

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4

5

19791983198719911995199920032007

vintage

viti

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A (

mg/L

)

0

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mg/L

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vintage

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mg/L

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vintage

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mg/L

)

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3

4

19791983198719911995199920032007

vintage

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg/L

)

a)

d)c)

b)



3.2. Vitisin A Content in Tempranillo Wines

Commercial Tempranillo wines showed a great variability in the content in

pyranoanthocyanins (Table 1). Concentrations of the different pyranoanthocyanins

detected were (range and mean value, in mg/L): vitisin A, 0-10.76 (2.43); pinotin A,

0-4.26 (0.92); and mv-3-glc-4-VP, 0.03-1.37 (0.32). These wide concentration ranges

led to no significant differences when the content of pyranoanthocyanins were

statistically analyzed by the ANOVA test of Student-Newman-Keuls with regard to the

wine age (Table 1). Also the Principal Component Analysis of the data failed in

grouping of the wine samples by age (data not shown).

The pyranoanthocyanin vitisin A is formed during alcoholic fermentation by a

reaction of pyruvic acid with malvidin 3-glucoside (mv-3-glc). Although the occurrence

of vitisin A in wine was first reported in 1997 (Bakker et al., 1997; Bakker &

Timberlake, 1997), there is still very little data available on its content in commercial

wines and also its evolution during ageing. In the case of Tempranillo wines, only a

few papers have reported concentrations of vitisin A around 0.5-6.0 mg/L in 6-30

months old wines (Revilla & González-San José, 2001a and b). The reported vitisin A

content for other commercial and experimental wines is usually within the

aforementioned range (Schwarz et al., 2003a; Asenstorfer, Markides, Illand & Jones,

2003), with exception of young Port wines that reached up to 9.5-15.4 mg/L of vitisin

A, due to a special winemaking technique (Romero & Bakker, 2001; Mateus & de

Freitas, 2001). Therefore, the content of vitisin A in most of the wines that were

analyzed in our investigation (the 48 samples of the vertical series, and 96 commercial

samples out of 106) was within a typical range (i.e. between 0-5.61 mg/L), while only

10 of the commercial wine samples showed unexpected high values (6.38-10.76

mg/L).

With regard to the degradation rate of vitisin A during wine ageing, the results

reported for a vertical row of Chilean Cabernet Sauvignon wines (wines from the same

cellar covering 16 years of ageing) showed that maximum concentrations of vitisin A

were reached within the first year of storage, when pyruvic acid is still available as

only was produced during alcoholic fermentation by yeast. After this period, vitisin A

concentration slowly decreased from 5 to 1 mg/L (Schwarz et al., 2003a). The results



found for the vertical series of Tempranillo wines were in this line, although the vitisin

A concentration range was lower than that found for Chilean Cabernet Sauvignon

wines, starting around 3 mg/L for 1 year old wines and finishing around 0.2 mg/L after

29 years of ageing. In contrast, the set of commercial Tempranillo wines did not show

clearly this trend (Table 1) and relative maximum concentrations of vitisin A were

detected not only in 1 year old wines (mean value of 3.21 mg/L), but also in 4 year

(mean value of 3.99 mg/L) and 8 year (mean value of 2.99 mg/L) old wines. However,

in the aforementioned study the general decline of vitisin A in Chilean Cabernet

Sauvignon wines was also interrupted by various temporary fluctuations (Schwarz et

al., 2003a) as also observed in our Tempranillo vertical series of wines (Figure 3b).

With the exception of the maxima found in 4 and 8 years old commercial Tempranillo

wines, the concentration of vitisin A showed a slight tendency to decrease over three

ageing periods, i.e. 1-3, 4-7 and 8-10 years of ageing (Table 1), although the

observed high standard deviations suggest the need of further confirmation. One likely

explanation for this observation is that the commercial Tempranillo wines were

produced in different cellars using different yeast strains and winemaking techniques,

resulting in different amounts of pyruvic acid which is required for the formation of

vitisin A (Monagas, Gómez-Cordovés & Bartolomé, 2007). Together with variations in

the initial contents of native grape anthocyanins, these different conditions result in

different initial concentrations of vitisin A that can explain the observed maxima. In

relation to the latter, the attempt to correlate the content of vitisin A to the

concentration of mv-3-glc in the wines of our study was not successful (R2 value of

0.2661), as the initial concentration of vitisin A and mv-3-glc remained unknown. This

indicates that the current content of vitisin A in a wine is the result of several factors.

A correlation of the vitisin A content with wine age appears to be inherently hampered

by the varying initial composition of wines. In addition, the lack of an extensive

database of vitisin A content in wines and the necessary studies dealing with the

factors affecting the kinetics of degradation of vitisin A (i.e. temperature, redox

potential, interaction with other wine constituents) makes the interpretation of the

significance of vitisin A content in a single wine not yet possible.

3.3. Hydroxyphenyl-Pyranoanthocyanins Content in Tempranillo Wines



In relation to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, it is noticeable that pinotin A

was not detectable in many of the one year old wines and only traces appeared in

several of the one and two years old wines (Table 1). Most of the Tempranillo wine

samples contained pinotin A in concentration below 2.5 mg/L (100 samples of

commercial wines and 27 samples of the vertical series wines), and the rest of the

samples showed higher concentrations, ranging within 2.6-5.7 mg/L (6 samples of the

commercial wines and 13 samples of the vertical series wines); moreover, 8 of the

wines of the vertical series contained very high amounts of pinotin A, within the range

of 6.1-17.8 mg/L. The only data available for comparison is that of commercial

Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). In these wines high contents of pinotin A within

the range 0.15-17.93 mg/L and mean values of 2.6-5.3 mg/L were detected that were

explained by the naturally high contents of caffeic acid in this grape variety. The

results obtained for the analyzed Tempranillo wines supported the hypothesis that

pinotin A is almost exclusively produced after the release of caffeic acid from its

tartaric ester (Rentzsch et al., 2007b), as an acceptable linear correlation was found

for the contents of both pinotin A and its precursor, caffeic acid, a similar correlation

was found for the vertical series wines (R2=0.6804;)

Figure III.4. Correlation of free hydroxycinnamic acid concentration (mg/L) to the corresponding concentration (mg/L) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines: a) caffeic acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-

R2 = 0,6232

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5

pinotin A (mg/L)

caffe

ic a

cid

(mg/

L)

R2 = 0,4641

0

10

20

30

0,0 0,5 1,0 1,5

mv-3-glc-4-VP (mg/L)

p-c

oum

aric

aci

d (m

g/L)

a)

b)

R2 = 0,6232

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5

pinotin A (mg/L)

caffe

ic a

cid

(mg/

L)

R2 = 0,4641

0

10

20

30

0,0 0,5 1,0 1,5

mv-3-glc-4-VP (mg/L)

p-c

oum

aric

aci

d (m

g/L)

a)

b)



glc-4-VC, or pinotin A); b) p-coumaric acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

This confirmed the results of previous studies carried out with Pinotage wines,

that pointed out that the formation of pinotin A in aged wines (≤ 5 years) largely

depends on the caffeic acid concentration (Schwarz et al., 2004). It is also important

to note that, despite the similar mean concentrations found for caffeic acid in

commercial Tempranillo wines over the ageing time (9-18 mg/L; Table 1), the

formation of pinotin A was not remarkable in the first and second year of ageing.

Unlike p-coumaric acid, caffeic acid is not decarboxylated by an enzymatic side activity

of the yeast (Chatonnet, Dubordieu, Boidron & Lavigne, 1993), which is the main

reaction pathway for formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in young wines;

however, Morata, González and

Suárez-Lepe (2007) recently reported on the formation of pinotin A in red musts

supplemented with caffeic acid which were fermented by selected yeast strains

possessing intermediate and high hydroxycinnamate decarboxylase activity and the

formation of pinotin A by the enzymatic pathway during alcoholic fermentation must

be carefully revised. The observed slow development of pinotin A could be due to the

fact that the reaction partner of caffeic acid to form pinotin A, i.e. the anthocyanin mv-

3-glc, is likely involved in other competing reactions like pigment polymerization. This

may be one reason why the correlation of the concentration of pinotin A with the

combined concentrations of caffeic acid and mv-3-glc did not improve so much (data

not shown), as compared to the correlation of pinotin A to caffeic acid concentration

alone.

In contrast to pinotin A, mv-3-glc-4-VP was already present in the youngest

Tempranillo wines. To our knowledge, this is the first time that data on the

concentration of mv-3-glc-4-VP has been reported for commercial Tempranillo wines.

Previously reported data mainly corresponded to experimental wines. Concentration of

mv-3-glc-4-VP in commercial Tempranillo wines rarely exceeded 1.0 mg/L (only 3

samples out of the 106 commercial samples contained mv-3-glc-4-VP within the range

1.1-1.4 mg/L) and the most of the youngest wines (1 and 2 years old) showed

concentrations below 0.3 mg/L, a value rather similar to the 0.30-0.36 mg/L reported



for Grenache wines after completion of malolactic fermentation (Rentzsch et al.,

2007b). However, the Tempranillo wines of the vertical series showed higher contents

of mv-3-glc-4-VP (29 samples contained less than 1.0 mg/L, and the content of the

other 19 samples ranged within 1.1-3.8 mg/L), as also observed for the content of

pinotin A. These results can be explained by an initial formation of this

pyranoanthocyanin via enzymatic decarboxylation of p-coumaric acid during the

alcoholic fermentation, followed by a direct reaction of released p-coumaric acid over

the ageing time (its mean concentration significantly increased from 2.3-4.5 mg/L to

4.6-9.5 mg/L; Table 1). Our results suggest that mv-3-glc-4-VP is formed after

enzymatic decarboxylation of p-coumaric acid, during alcoholic fermentation, reaching

concentrations not higher than 0.3 mg/L. This concentration is increased during ageing

by the pure chemical formation of mv-3-glc-4-VP when p-coumaric acid is released

from coutaric acid. However, the maximum concentration of mv-3-glc-4-VP detected is

around 3.8 mg/L in Tempranillo wines, an amount significantly lower than the

maximum value found for pinotin A (17.7 mg/L) in the same wines. These values

correspond to the proportions of the precursor p-coumaric and caffeic acids and their

bound forms (coutaric and caftaric acids, respectively) that are present in these wines

(Table 1). Due to the two different pathways of formation of mv-3-glc-4-VP, the

correlation between the concentrations of this hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin and

its precursor, the p-coumaric acid, was poor in both sets of commercial wines (Figure

4b) and vertical series wines (R2 = 0.4580; data not shown). The formation of mv-3-

glc-4-VP in aged wines seems, obviously, not to be solely under the control of p-

coumaric acid concentrations, as its initial concentration is determined by enzymatic

activity. As found for pinotin A, the formation of mv-3-glc-4-VP was poorly influenced

by mv-3-glc concentration (data not shown).

3.4. Refreshment Experiments of Aged Tempranillo Wine

On the basis of the hypothesis of formation of hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins by direct reaction of hydroxycinnamic acids with anthocyanins,

their content in Tempranillo wines is expected to increase with ageing time, as it has

been demonstrated for Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). This was the initial

trend shown in commercial Tempranillo wines, but unexpected maxima content of

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins appeared in 4 years old wines, followed by a new



decrease and a further slight increase (Table 1). Associated with this unexpected

maxima, there was a high content of mv-3-glc in 4 years old wines and, in a lesser

extent, in 7 years old wines (Table 1), opposite to the normal trend of evolution for

anthocyanins during wine ageing as indicated the study of the vertical series of

Tempranillo wines (Figure 3a). The latter results can partly be explained by higher

initial values of the precursors, but more likely is the use of a winemaking technique

referred as to the “refreshment” of old wines; that is the addition of young red wines

to aged wines with the aim of improving some sensory properties. This assumption is

backed up by the observed high concentration of mv-3-glc (more than 50 mg/L) found

in several of the wines of 4 year old, or older.

For supporting the refreshment hypothesis, we carried out experiments of

addition of young wine (vintage 2007) to Tempranillo aged wines (vintage 2002). The

aged Tempranillo wine contained mv-3-glc in trace amounts and only free caffeic and

p-coumaric acids were observed.

Table III. 2. Composition (mg/L) in pigments and hydroxycinnamic acids

of the aged and young wines used in the experiments of refreshment.

Wine Tempranillo

2002

Tempranillo

2007

Petit Verdot

2007

mv-3-glc 0.90 52.90 50.80

vitisin A 0.79 6.49 13.90

pinotin A 25.44 0.99 7.64

mv-3-glc-

4-VP 1.74 1.36 1.55

caftaric

acid n.d. 23.11 5.87

coutaric

acid n.d. 8.41 1.60

caffeic acid 13.94 9.99 41.52

p-coumaric acid 8.90 5.59 13.23



this wine already contained vitisin A and also important amounts of pinotin A

and mv-3-glc-4-VP. No further formation of pinotin A and mv-3-glc-4-VP was

expectable in this aged wine due to the lack of one of the reactants, the grape native

anthocyanins (e.g., mv-3-glc). Two different young wines were assayed, one was a

Tempranillo young wine and the other was a Petit Verdot young wine, because a

single-variety wine subjected to Origin Denomination must contain at least 85% (v/v)

of the wine of the respective grape variety, but there is no restriction about the rest of

15% of wine volume. Both young wines contained high amounts of mv-3-glc, and their

contents in free hydroxycinnamic acids and also in pyranoanthocyanins was the

expected for young wines, especially in the case of Tempranillo young wine (Table 2).

Figure III.5. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Tempranillo wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c)

pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

(m

g/L

)

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

Weeks

viti

sin

A (

mg/L

)

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8

Weeks

pin

otin

A (

mg/L

)

0

1

2

3

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg/L

)

a)

d)c)

b)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

(m

g/L

)

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

Weeks

viti

sin

A (

mg/L

)

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8

Weeks

pin

otin

A (

mg/L

)

0

1

2

3

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg/L

)

a)

d)c)

b)



To accelerate the ageing process, refreshed wines were kept in darkness at

30ºC in an oven for several weeks. In both cases a constant decline in mv-3-glc

concentration was observed during ageing (Figures 5a and 6a). It could be expected

that the disappeared mv-3-glc were reacted with the free caffeic and p-coumaric acids,

but no immediate increase of the contents of pinotin A and mv-3-glc-4-VP were

observed. Moreover, a characteristic delay in the increase of the content of these two

hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins were observed, two weeks in the case of aged

Tempranillo wine refreshed with young Tempranillo (Figures 5c and 5d) and up to four

weeks in the case of the wine refreshed with young Petit Verdot wine (Figures 6c and

6d), thus suggesting a different response of the refreshment treatment according to

the compositional differences (regarding competing substances reacting with mv-3-glc)

between the added young wines.

Figure III.6. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Petit Verdot wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

(m

g/L

)

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

Weeks

viti

sin

A (

mg/L

)

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8

Weeks

pin

otin

A (

mg/L

)

0

1

2

3

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg/L

)a)

d)c)

b)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

(m

g/L

)

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

Weeks

viti

sin

A (

mg/L

)

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8

Weeks

pin

otin

A (

mg/L

)

0

1

2

3

0 2 4 6 8

Weeks

mv-3

-glc

-4-V

P (

mg/L

)a)

d)c)

b)



pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

After this delay, the concentrations of pinotin A and mv-3-glc-4-VP increased

during ageing, reaching a maximum after 5-6 weeks of ageing (the concentrations at

this moment were two-fold of the initial ones for each hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins).

The subsequent evolution of the concentration of both hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins was different according to the added young wine: They were

decreasing in the case of the wine refreshed with young Tempranillo wine, whereas

remained almost constant in the case of wine refreshed with young Petit Verdot. The

aforementioned results were in agreement with the results reported for Pinotage wines

(Schwarz et al., 2004), which clearly indicated that high amounts of mv-3-glc present

in young wines are rapidly consumed by various competing reactions (i.e. formation of

polymeric flavanol-anthocyanin pigments) and only a very small percentage is

converted into hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (i.e. pinotin A). The over-

proportional production of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins commences when

interfering reactions become less likely due to a lower concentration of the reactants,

such flavanols and anthocyanins, while the hydroxycinnamic acids concentrations

remains rather stable, or even increases, throughout the ageing process. An increase

of mv-3-glc concentration in Tempranillo aged wines by means of the previously

mentioned “refreshment”, introduces a very efficient competitor in the formation of

polymeric pigments, thus helping to maintain the current concentrations of pinotin A

and mv-3-glc-4-VP present in wines. The refreshment treatment and its influence on

pyranoanthocyanin development make it impossible to use the hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanin concentration for the determination of the age of commercial

Tempranillo wines, as reported for Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). Finally,

vitisin A content in refreshed wines was also affected by the addition of the young wine

(Figures 5b and 6b), as occurred to pinotin A and mv-3-glc-4-VP. However, a slight

decrease in vitisin A content was observed in the first week of ageing and the

maximum contents reached were only one and a half of the initial concentrations. The

results suggest that added young wine can also be a source of pyruvic acid that can

lead to the formation of vitisin A, as discussed for the formation of pinotin A and mv-3-

glc-4-VP. Free pyruvic acid is present in wines and is very likely that this alcoholic



fermentation metabolite accounted for higher concentrations in young wines as

compared to aged wines. Moreover, the increase of the concentration of vitisin A in red

wines by means of pyruvic acid addition has been reported (Romero et al., 2000;

Mateus et al., 2001). The initial decrease in vitisin A content could be connected to the

formation of portisin-type pigments, a class of pyranoanthocyanin pigments formed by

reaction of vitisin A with both flavanols in the presence of acetaldehyde and free

hydroxycinnamic acids, as it has been recently reported (Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo,

Santos-Buelga & de Freitas, 2003; Mateus, Oliveira, Santos-Buelga, Silva & de Freitas,

2004; Oliveira, de Freitas, Silva & Mateus, 2007).

4. Conclusion

In this survey we have contributed to the so far only scarce data available for

pyranoanthocyanin contents in 1-10 year old commercial wines elaborated using

grapes of the Vitis vinifera Spanish Tempranillo variety. The results show a great

variability in the concentrations found for the most common pyranoanthocyanins

(vitisin A, pinotin A and mv-3-glc-4-VP).

Vitisin A is formed from pyruvic acid, a yeast metabolite only produced during

alcoholic fermentation, and malvidin 3-glucoside (mv-3-glc). Vitisin A was already

present in high amounts in youngest wines (1-3 years old) and its concentration

tended to decrease with wine age, although various temporary maxima at 4 and 8

years interrupted this trend. In addition, no correlation of vitisin A content with the

concentration of mv-3-glc was found. These results suggest that the current content of

vitisin A in a wine is the result of several factors which still remain unclear, making the

interpretation of the significance of the vitisin A content in a single wine not yet

possible.

No pinotin A was detectable in many of the 1 year old wines and several of the 2

year old wines. In contrast, mv-3-glc-4-VP was already present in 1 year old wines.

Both hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their concentration during the

ageing period as a consequence of not only the releasing of their respective precursors

(i.e. caffeic and p-coumaric acids), but also the availability of anthocyanins which were

not involved in competing reactions (i.e. polymeric pigment formation). Supporting the



latter was the unexpected high concentrations of pinotin A and mv-3-glc-3-VP found in

several of the detected “refreshed” wines (more than 4 year old wines having a mv-3-

glc concentration higher than 50 mg/L due to the addition of younger wine in order to

improve their sensory properties after a long ageing period). Confirmation of the

effects of refreshment on wine pyranoanthocyanins contents were obtained by model

refreshment experiments consisting in the addition of young wines to aged wines (ratio

of 15:85, v/v) and submitting the refreshed wines to an accelerate ageing. A

characteristic delay was observed previous to the increase in the content of not only

pinotin A and mv-3-glc-4-VP, but also vitisin A.

Acknowledgments

This work was financially supported by the Instituto de la Viña y el Vino de

Castilla-La Mancha (Project PREG-05-024).

Abbreviations

mv-3-glc, malvidin 3-glucoside

mv-3-glc-4-VP, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (pyranoanthocyanin resulted

from the reaction of malvidin 3-glucoside and p-coumaric acid)

pinotin A or mv-3-glc-4-VC, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol

(pyranoanthocyanin resulted from the reaction of malvidin 3-glucoside and caffeic

acid)

vitisin A (pyranoanthocyanin resulted from the reaction of malvidin 3-glucoside

and pyruvic acid).



References

Alcalde-Eon, C. (2008). Anthocyanin-derived pigments originated during wine

making and aging, and their contribution to wine colour. Ph. D. Thesis, University of

Salamanca, Spain.

Alcalde-Eon, C.; Boido, E.; Carrau, F.; Dellacassa, E.; Rivas-Gonzalo, J. C.

(2006). Pigment profiles in monovarietal wines produced in Uruguay. American Journal

of Enology and Viticulture, 57, 449-459.

Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C.

(2004). Separation of pyranoanthocyanins from red wine by column chromatography.

Analytica Chimica Acta, 513, 305-318.

Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C.

(2006). Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and

ageing. A comprehensive study. Analytica Chimimica Acta, 563, 238-254.

Asenstorfer, R. E.; Markides, A. J.; Illand, P. G.; Jones, G. P. (2003). Formation

of vitisin A during red wine fermentation and maturation. Australian Journal of Grape

and Wine Research, 9, 40-46.

Bakker, J.; Bridle, P.; Honda, T.; Kuwano, H.; Saito, N.; Terahara, N.;

Timberlake, C. F. (1997). Identification of an anthocyanin occurring in some red wines.

Phytochemistry, 44, 1375-1382.

Bakker, J.; Timberlake, C. F. (1997). Isolation, identification, and

characterization of new color-stable anthocyanins occurring in some red wines. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 45, 35-43.

Chatonnet, P.; Dubourdieu, D.; Boidron, J. -N.; Lavigne, V. (1993). Synthesis of

volatile phenols by Saccharomyces cerevisiae in wines. Journal of the Science of Food

and Agriculture, 62, 191–202.



Fulcrand, H.; Cameira dos Santos, P. -J.; Sarni-Manchado, P.; Cheynier, V.;

Favre-Bonvin, J. (1996). Structure of new anthocyanin-derived wine pigments. Journal

of Chemical Society, Perkin Transactions 1, 735-739.

Mateus, N.; de Freitas, V. (2001). Evolution and stability of anthocyanin-derived

pigments during port wine aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49,

5217-5222.

Mateus, N.; Oliveira, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A. P.

(2004). NMR structure characterization of a new vinylpyranoanthocyanin-catechin

pigment. Tetrahedron Letters, 45, 3455-3457.

Mateus, N.; Silva, A. M. S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; de Freitas,

V. (2003). A new class of blue anthocyanin-derived pigments isolated from red wines.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 1919-1923.

Mazza, G.; Miniati, E. (1993). Anthocyanins in fruits, vegetables, and grains.

Boca Raton, Florida, USA: CRC Press.

Monagas, M.; Gómez-Cordovés, C.; Bartolomé, B. (2007). Evaluation of different

Saccharomyces cerevisiae strains for red winemaking. Influence on the anthocyanin,

pyranoanthocyanin and non-anthocyanin phenolic content and colour characteristics of

wines. Food Chemistry, 104, 814-823.

Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J. A. (2007). Formation of vinylphenolic

pyranoanthocyanins by selected yeast fermenting red grape musts supplemented with

hydroxycinnamic acids. International Journal of Food Microbiology, 116, 144-152.

Office International de la Vigne et du Vin (2003). Détermination par CLHP de

neuf anthocyanes principales dans le vin rouge et rosé. Resolution OENO 22/2003.



Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. (2007). Reaction between

hydroxycinnamic acids and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 6349-6356.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P. (2007a). Pyranoanthocyanins: An

overview on structures, occurrence and pathways of formation. Trends in Food Science

and Technology, 18, 526-534.

Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I. (2007b).

Formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: precursor levels

and evolution during aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 4883-

4888.

Revilla, I.; González-Sanjosé, M. L. (2001a). Effect of different oak woods on

aged wine color and anthocyanin composition. European Food Research and

Technology, 213, 281-285.

Revilla, I.; González-Sanjosé, M. L. (2001b). Evolution during the storage of red

wines treated with pectolytic enzymes: New anthocyanin pigment formation. Journal of

Wine Research, 12, 183-197.

Romero, C.; Bakker, J. (2000). Effect of storage temperature and pyruvate on

the kinetics of anthocyanin degradation, vitisin A derivative formation, and color

characteristics of model solutions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48,

2135-2141.

Romero, C.; Bakker, J. (2001). Anthocyanin and colour evolution during

maturation of four port wines: Effect of pyruvic acid addition. Journal of the Science of

Food and Agriculture, 81, 252-260.

Schwarz, M.; Hofmann, G.; Winterhalter, P. (2004). Investigations on

anthocyanins in wines from Vitis vinifera cv. Pinotage: Factors influencing the



formation of pinotin A and its correlation with wine age. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 52, 498-504.

Schwarz, M.; Jerz, G.; Winterhalter, P. (2003). Isolation and structure of pinotin

A, a new anthocyanin derivative from Pinotage wine. Vitis, 42, 105-106.

Schwarz, M.; Picazo-Bacete, J. J.; Winterhalter, P.; Hermosín-Gutiérrez, I.

(2005). Effects of copigments and grape cultivar on the color of red wines fermented

after the addition of copigments. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 8372-

8381.

Schwarz, M.; Quast, P.; von Baer, D.; Winterhalter, P. (2003a). Vitisin A content

in Chilean wines from Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon and contribution to the

color of aged red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 6261-6267.

Schwarz, M.; Wabnitz, T. C.; Winterhalter, P. (2003). Pathway leading to the

formation of anthocyanin-vinylphenol adducts and related pigments in red wines.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 3682–3687.

Schwarz, M.; Winterhalter, P. (2003). A novel synthetic route to substituted

pyranoanthocyanins with unique colour properties. Tetrahedron Letters, 44, 7583-

7587.

Ugliano, M.; Siebert, T.; Mercurio, M.; Capone, D.; Henschke, P. A. (2008).

Volatile and color composition of young and model-aged Shiraz wines as affected by

diammonium phosphate supplementation before alcoholic fermentation. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 56, 9175-9182.

CAPíTULO IV

CAPÍTULO IV. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of

Pyranoanthocyanins Pigments Formed in Model Wine.

JUSTIFICACIÓN

A partir del descubrimiento en 1996 de una nueva clase de pigmentos formados

durante la elaboración y envejecimiento de los vinos y su importancia en cuanto al

color final y la contribución a la estabilidad de este, se han realizado numerosos

experimentos para conocer y cuantificar estas nuevas moléculas. Sin embargo se

habían centrado en las vías de reacción y no se tenian muchos datos para caracterizar

en profundidad cada uno de ellos.

En este trabajo vamos a intentar monitorizar por HPLC_DAD_ESI-MS/MS, la

formación de distintos piranoantocianos, en concreto los del tipo vitisina y los

derivados de ácidos hidroxicinámicos, a partir de un extracto de hollejo de Shiraz, por

un lado con diferentes metabolitos productos de la fermentación como son el

acetaldehído, ácido pirúvico, ácido acetoacético y diacetilo, para obtener los

piranoantocianos del tipo vitisina . Y por otro lado con distintos acidos hidroxicinámicos

como el ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido caféico y ácido sinápico para obtener

los hidroxifenil-piranoantocianos.

El ácido pirúvico y el acetaldehído reaccionan rápidamente. El primero está

presente en una concentración alta y es un subproducto de la fermentación por

levaduras y reacciona rapidamente para dar lugar a pigmentos de tipo

piranoantociano, el segundo reacciona rápidamente pero conduce sobre todo a dar

polímeros de condensación.

Por el contrario el ácido acetoacético y el diacetilo reaccionan muy despacio y con

un rendimiento muy bajo a la hora de producir piranoantocianos.

Los ácidos hidroxicinámicos reaccionan progresivamente y no favorecen la

formación de pigmentos poliméricos.

La formación de hidroxifenil-piranoantocianos se incrementa con el número de

grupos hidroxilos/metoxilos presentes. Los sustituyentes del C-10 afectan mucho al

Resultados y Discusión. Capítulo IV.


máximo de absorción en el visible de estos compuestos, por otro lado los sustituyentes

del anillo B o la acilación tienen un efecto mucho menor.

El 10-metil-piranoantocianin formado a partir del ácido acetoacético se encontró

también como producto secundario de la formación de los 10-carboxipiranoantocianos.

Por último se probó con la molécula de diacetilo, que es un subproducto de la

fermentación maloláctica y consta de un doble enlace, para comprobar la posibilidad

de que reaccionara con los antocianos monómeros dando un pigmento del tipo

piranoantociano, se pudo observar la formación del 10-acetilpiranoantociano por

análisis UV-VIS y MS y también se constato su presencia en vinos comerciales.

Se hacía necesario profundizar en el conocimiento y estudio de estos nuevos

pigmentos, los piranoantocianos, ver cómo y en qué condiciones se formaban, cuales

aparecían primero y como contribuía cada uno de ellos al color final en los vinos, que

modificaciones en el color era posible esperar según predominara un pigmento u otro,

que estabilidad tenían a los largo del tiempo etc.

Nos centramos, en este trabajo, en dos tipos de piranoantocianos los del tipo

vitisina y los hidroxifenilpiranoantocianos en un intento de caracterizarlos y conseguir

una base de datos que permita un análisis cualitativo y cuantitativo de cada uno de

ellos.

METODO DE TRABAJO

El análisis de los piranoantocianos por HPLC presentaba ciertos problemas de

índole técnico. En primer lugar, se trata de sustancias que se producen en pequeñas

cantidades (normalmente del orden de algunos mg/L), y en segundo lugar los

cromatogramas típicos de antocianos aparecen mezclados con los antocianos

monómeros. Normalmente, las vitisinas aparecen en la zona en la que también eluyen

los antocianos monómeros acilados, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos

suelen hacerlo algo después de sus correspondientes antocianos acilados. Además, los

piranoantocianos eluyen en la misma zona en la que lo hacen los pigmentos

poliméricos, lo que originan picos con poca definición, apareciendo una “joroba” o



“montaña” cromatográfica que desvirtúa la línea base del cromatograma, y que

dificulta la obtención de espectros UV-Vis y de MS/MS limpios.

Por esa razón, lo primero que se hizo fue examinar y experimentar con los

diferentes métodos de aislamiento de la fracción de piranoantocianos que se conocían,

algunos de ellos modificados, y evaluar cual era más eficaz en la separación de las

distintas fracciones, para su posterior análisis.

Entre los métodos más recientes y de mayor eficacia, cabe destacar la

cromatografía en columna con relleno de Toyopearl HW-40S con elución mediante

alcohol o acetona, estas columnas han sido utilizadas para la separación de catequinas

y proantocianidinas en extractos de plantas (Lea et al., 1974; Morimoto et al., 1986).

Estos métodos son efectivos para separar polifenoles de bajo peso molecular. La

separación tiene lugar por adsorción y por tamaño de partícula, exclusión, y se basa

en el establecimiento de puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo y carbonilo

de los polifenoles y los grupos aceptores en el gel. La fuerza de interacción depende

del número de hidroxilos fenólicos de la molécula, así los polifenoles polímeros se

absorben más fuertemente que los monómeros.

Como desorbente se usa la acetona que es mejor desorbente que el alcohol.

Partimos de la muestra de vino previamente acidificada (pH = 1) y decolorada con

bisulfito sódico y la eluimos con etanol (95%): agua (80:20) y metanol: agua (80:20)

(Alcalde Eon, 2008).

Otra variante de este método que se ensayó y que se intentó poner a punto, es el

empleo de los cartuchos de extracción en fase sólida MCX (que combina fase reversa e

intercambio iónico) empleados en el aislamiento de la fracción de flavonoles del vino,

pero adaptando las condiciones empleadas por Alcalde Eon (2008) al uso de este tipo

de cartuchos. Así, la muestra acidificada y decolorada con bisulfito se inyectará en los

cartuchos MCX, que se eluirán con metanol para eliminar los compuestos fenólicos

neutros y ácidos, más los pigmentos antociánicos decolorados (carácter neutro); se

espera que queden retenidos en estas condiciones los piranoantocianos, que más

tarde se recuperarán empleando metanol alcalinizado con amoniaco.



MUESTRAS

Se elabora un vino experimental sintético con el extracto de hollejos de uvas

tintas para intentar eliminar todos los compuestos fenólicos excepto los antocianos

monómeros. De esta forma podemos controlar mucho mejor las reacciones que tienen

lugar y lograr que no existan interferencias con otros compuestos de manera que los

cromatogramas sean lo más claro posibles.

Extracción de los compuestos fenólicos de los hollejos de uvas tintas.

Se procedió a la extracción de compuestos fenólicos de los hollejos, de uvas de

la variedad Syrah, consiguiendo extraer el total de los antocianos monoméricos sin

provocar la hidrólisis de sus derivados acetilados.

Se tomaron de 100 a 150 gramos de uvas sanas que se prensaron entre los

dedos para eliminarles la pulpa y la granilla correspondiente. Posteriormente, los

hollejos obtenidos se lavaron con agua (Milli-Q) y se secaron dos veces prensándolos

suavemente entre papel de filtro. De los hollejos secos obtenidos se pesaron 20 g, a

los que se les añadieron 150 ml de una mezcla extractora compuesta por

CH3OH/H2O/HCOOH (50:48.5:1.5) (Gao y col., 1997). A continuación, los hollejos se

homogeneizaron con trituradora durante dos minutos, tras lo cual se centrifugó a

2500g durante 10 minutos a 5º C. Una segunda extracción de los hollejos de la uva

supuso la recuperación de al menos el 99% del contenido fenólico de la uva, como se

confirmó por HPLC tras realizar extracciones sucesivas (hasta cinco). El sobrenadante

fue guardado a -18º C hasta proceder a su inyección en el cromatógrafo de líquidos de

alta eficacia (HPLC).

Los hollejos de vino tinto se analizaron posteriormente, por inyección directa del

extracto de hollejos, tras diluir éste a la mitad con agua Milli-Q.

Aislamiento de los antocianos en los extractos de hollejo de uva tinta

Con el fin de separar los antocianos de los flavonoles en los extractos de hollejo

de uva tinta y poder caracterizar sin interferencias cada uno de los compuestos

formados, se recurrió a la técnica de extracción en fase sólida con cartuchos Oasis

MCX (Waters Corp., Milford, MA; cartuchos de 6 cm3 de capacidad y rellenos con 500

mg de adsorbente) que contienen una mezcla de fase inversa y material de

intercambio catiónico, permitiendo el aislamiento de los flavonoles del extracto de



hollejo de las variedades tintas. Para facilitar el tratamiento de varias muestras

simultáneamente, se usó un colector de vacío (Supelco).

Las muestras necesitaron alguna preparación previa a la separación. Así, se

tomaron 1.5 ml y se diluyó con HCl 0.1 M hasta un volumen final de 12.5 ml, con el

fin de llevar el extracto de hollejo desde un 50% hasta un 6% de metanol. Se eligió

diluirlo con HCl 0.1 M porque permite conseguir en la muestra de extracto fenólico un

pH suficientemente bajo en el cual se favorece la forma de catión flavilio de los

antocianos, y de este modo se asegura una eficaz retención de todos los compuestos

fenólicos en el relleno mencionado anteriormente.

El procedimiento de separación fue adaptado de González-Manzano y col. (2006)

para permitir la reutilización de los cartuchos. El proceso fue el que se indica a

continuación:

Acondicionamiento del cartucho: Se pasó a través del cartucho 5 ml de

metanol para arrastrar compuestos de polaridad intermedia que pudieran estar

contaminando el relleno del cartucho. A continuación, se lavó con 5 ml de agua

bidestilada.

Carga de la muestra: La muestra de extracto diluida se hizo pasar a través del

cartucho, controlando el flujo gota a gota, para asegurar la retención de todos

los compuestos fenólicos, que son medianamente apolares. De forma adicional,

los antocianos quedaron retenidos por intercambio iónico. A continuación, se

realizó un lavado pasando 5 ml de HCl 0.1 M y 5 ml de agua bidestilada.

Extracción de flavonoles: La fracción de flavonoles fue eluida pasando 3 x 5

ml de metanol. Esta fracción también contiene otros polifenoles neutros o ácidos

(flavan-3-oles o taninos y derivados de ácidos hidroxicinámicos,

respectivamente).

Extracción de antocianos: Los antocianos, fijados al cartucho por intercambio

catiónico, fueron extraídos usando 3 x 5 ml de amoniaco al 2% en metanol al

80%.

Regeneración del cartucho: El material de intercambio catiónico fue

regenerado pasando 3 x 5 ml de ácido clorhídrico al 2% en 80% de metanol.

Posteriormente, se acondicionó el cartucho con metanol y agua, permitiendo su

reutilización al menos cuatro o cinco veces más.

Elaboración del vino experimental.

El eluato que contiene los antocianos fue llevado hasta sequedad en un

rotavapor a 40º C y luego elaboramos un vino sintético con un 14% de etanol, una



concentración de tartárico de 5gr/l y una concentración de antocianos de 800gr/l, se

filtra y se lleva a pH 3.6 y se congela hasta su utilización.

Se van a investigar distintos factores que pueden tener incidencia en la

formación de piranoantocianos, en especial hidroxifenilpiranoantocianos y

piranoantocianos tipo vitisina. Por un lado, efectos como el pH y el de la temperatura

de almacenamiento y también se estudiaran la rapidez y el grado de la reacción a lo

largo del tiempo.

Con estos vinos experimentales no se pretende esclarecer qué factores

enológicos pueden influir en la formación de cierta gama de piranoantocianos como la

formación de vitisinas, que exigiría probar distintas cepas de levaduras que se

diferenciaran en su capacidad de producción de metabolitos como el acetaldehído, el

ácido pirúvico o el acetilacetato. No obstante, esta idea se tratará con el grupo de

microbiología enológica para planear futuros experimentos en este sentido



Keywords: pyranoanthocyanins, red wine, fermentation metabolites, diacetyl,

hydroxycinnamic acids, LC-MS, UV-vis, vitisina

INTRODUCTION

In the last two decades the knowledge on anthocyanin-related red wine colour

chemistry has been importantly increased (1). The earliest anthocyanin-derived

compounds that were proposed and further found to occur in wine were polymeric

pigments formed by reaction between anthocyanins and tannins. In addition, other

structures of anthocyanin-derived pigments have been discovered, especially those

called pyranoanthocyanins. Pyranoanthocyanins are a class of red wine pigment

formed as early as during alcoholic fermentation and also over the ageing of the wine.

The general pathway of formation of pyranoanthocyanins involves an anthocyanin and

a compound having a polarisable double bound (pyranoanthocyanin precursor) that

react to give rise to a new pyrano ring fused to the anthocyanin molecule (2).



Figure IV.1. General structures of vitisin-like pyranoanthocyanins (A) and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (B). Structure features: labeling of aromatic

rings; substituent at C-10 (R4 in D-ring for vitisin-like pyranoanthocyanins; R4 and R5 in E-ring for hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins); B-ring substituent (R1 and

R2); and type of acylation of the glucosidic moiety.

The first reported pyranoanthocyanins were those derived from some yeast

metabolites (vitisin A from pyruvic acid, and vitisin B from acetaldehyde) but the list of

possible non-anthocyanin reactants has notably increased including non-phenolic and

phenolic compounds. In recent years, some pyranoanthocyanins with the simplest

structures (A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins, and 10-methyl-

pyranoanthocyanins) have been identified as the starting point for the formation of

more complex pyranoanthocyanins (3-7), or their transformation into other kinds of

non-red pigments (8,9).

The contribution of pyranoanthocyanin to total red wine colour is still a matter of

controversy, and one of the reasons for that is only few pyranoanthocyanins have been

usually detected and quantified and there are only scarce data about their

(A) vitisin-like pyranoanthocyanins (B) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins

R4 = R5 = H

R4 = OH; R5 = H

R4 = OCH3; R5 = H

R4 = R5 = OCH3

10-p-hydroxyphenyl:

10-catechyl:

10-guaiacyl:

10-syringyl:

R4 = H

R4 = CH3

R4 = COOH

R4 = COCH3

10-H:

10-methyl:

10-carboxy:

10-acetyl:

pyranocyanidin (pyrcy):

pyranopeonidin (pyrpn):

pyranodelphinidin (pyrdp):

pyranopetunidin (pyrpt):

pyranomalvidin (pyrmv):

R1 = OH; R2 = H

R1 = OCH3; R2 = H

R1 = R2 = OH

R1 = OH; R2 = OCH3

R1 = R2 = OCH3

pyranoanthocyanidin

structure

A

B

C

D

A

B

C

D

E

3

10 10

glucosidic moiety: R3 = H, acetyl, p-coumaroyl, caf feoyl

9

4

2

5

6

7

8

4a

8a

3’’’

4’’’

5’’’



concentrations in wine (10). Moreover, the unambiguous identification of the different

pyranoanthocyanin types has been usually confirmed after isolation of the reaction

product between only the main grape and wine anthocyanin (malvidin 3-glucoside)

and the corresponding precursor, following the most favourable reaction conditions.

However, the best pH and solvent conditions for the aforementioned synthesis

reactions did not necessarily match to those of real wine (11-13). Because of the

complex mixture of anthocyanins occurring in red wine, it is expected the formation of

a great diversity of wine pyranoanthocyanins, and interesting identification data for

many of them is available (14,15). However, as far as we know, there is not a

systematic study of the chromatographic and spectral properties covering all the

expected pyranoanthocyanin series according to the reactant precursor.

The aim of our work has been the contribution to a database of chromatographic

(HPLC) and spectroscopic (DAD-UV-vis and MS/MS) data for a wide variety of most

known kinds of pyranoanthocyanins that can be formed in wine. We developed the

reactions between red grape skin extracts and pyranoanthocyanin precursors in a

model wine medium (13% alcohol, v/v, and pH 3.5). We selected Syrah grapes

because their comparable proportions of both non-acylated and different acetylated

and p-coumaroylated anthocyanins. With regard to pyranoanthocyanin precursors, we

tried the reaction with known compounds of both non-phenolic (pyruvic acid,

acetaldehyde, and acetoacetic acid) and phenolic (p-coumaric, caffeic, ferulic and

sinapic acids) types. Finally, we also assayed a non-previously reported possible

precursor, diacetyl, a secondary product of lactic acid bacteria metabolism.


Chemicals

All solvents were of HPLC quality and water was of MilliQ® quality. Malvidin 3-

glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard for

quantification of anthocyanins in red grape skin extracts. The following reagents were

used as precursors for the formation of wine pyranoanthocyanins in model reactions:

pyruvic acid (≥ 97%, Aldrich), acetaldehyde (≥ 99.5%, Fluka), lithium acetoacetate (≥

90%, Fluka), 2,3-butanedione (≥ 99.0%, Fluka), caffeic acid (≥ 95%, Merck), p-



coumaric acids (≥ 98.0%, Fluka), ferulic acid (≥ 99.0%, Fluka), and sinapic acid (≥

99.5%, Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germany).

Red Grape Skin Extracts

An amount of 1500 g of healthy red grapes (V. vinifera Cabernet Sauvignon, Petit

Verdot, and Syrah cultivars), collected at technological maturity (estimated alcoholic

strength of 13%, v/v), was finger pressed to remove the pulp and the seeds. The

remaining skins were washed three times in water (Milli-Q) and softly dried twice by

patting them between sheets of filter paper. The dried skins were extracting with 1000

ml of a mixture 50:48.5:1.5 (v/v) of methanol/water/formic acid (16), using a

homogenizer (Heidolph DIAX 900) for 2 min and the resulting slurry was centrifuged at

2500g at 5 ºC for 15 min. After evaporation of methanol under reduced pressure (40

ºC) the remaining aqueous solution was freeze-dried and the dried extract was stored

(-18 ºC) until use.

Model Reactions of Formation of Wine Pyranoanthocyanins

Wine pyranoanthocyanins formation was mimicked in model reactions using the

grape skin extract containing anthocyanins and the corresponding reagent. Freeze-

dried grape skin extract was dissolved in model wine (13% ethanolic water with 5 g/L

of tartaric acid) up to reach an anthocyanin concentration of 800 mg/L (as malvidin 3-

glucoside) and the pH was then adjusted to 3.5. Syrah grape skin extract was used for

all the model reactions, whereas Cabernet Sauvignon and Petit Verdot grape skin

extracts were only used for repetitions of the reaction with pyruvic acid. The different

reagents for inducing the formation of wine pyranoanthocyanins were individually

added in a molar ratio 10:1 with regard to anthocyanins. Every model reaction was

maintained at 30 ºC in 60 mL screw-cap amber-glass bottles without headspace and

was performed in triplicate. All the reactions were performed in triplicate. Monitoring of

the reactions was extended over 9 weeks and samples of 2.5 mL were weekly picking

for HPLC analysis. For avoiding oxidation, after each sampling small glass balls were

added to replace the taken volume of reaction mixture, thus eliminating bottle

headspace.



Analysis of Pyranoanthocyanins by HPLC-DAD-ESI-MS/MS

HPLC separation and identification of pyranoanthocyanins were performed on an

Agilent 1100 Series system (Agilent, Germany), equipped with DAD (G1315B) and

LC/MSD Trap VL (G2445C VL) electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS)

system, and coupled to an Agilent Chem Station (version B.01.03) data-processing

station. The mass spectra data were processed with the Agilent LC/MS Trap software

(version 5.3). The wine samples were

polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) on a

reversed-phase column Zorbax Eclipse XDB-

Agilent, Germany), thermostated at 40 ºC. The chromatographic conditions were

adapted from the OIV method for analysis of anthocyanins in red wines (17) and the

detection wavelength was 510 nm. The solvents were water/acetonitrile/formic acid

(87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.63

mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min,

50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For identification, ESI-MS/MS was

used employing the following parameters: positive ion mode; dry gas, N2, 11 mL/min;

drying temperature, 350 ºC; nebulizer, 65 psi; capillary, -2500 V; capillary exit offset,

70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan range, 50-1200 m/z. Some previously

obtained (10) standards of vitisin A (10-carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside), pinotin

A (10-catechyl-pyranomalvidin 3-glucoside) and 10-p-hydroxyphenyl-pyranomalvidin

3-glucoside were available for comparison and identification.


Formation of Pyranoanthocyanins

Figure 1 show the different pyranoanthocyanin structures formed in the studied

model reactions. It is possible to classify these pyranoanthocyanins into two basic

types of structures: on one hand, those pyranoanthocyanins having non-phenolic

substituent at C-10, the so-called vitisin-like pyranoanthocyanins derived from the

reaction of fermentation metabolites (acetaldehyde, pyruvic acid, acetoacetic acid, and

diacetyl) with anthocyanins; on the other hand, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or

pyranoanthocyanins having an hydroxyphenyl-like moiety linked to C-10 as they were

formed by reaction between anthocyanins and hydroxycinnamic acids present in wine

(p-coumaric, caffeic, ferulic, and sinapic acids). Common names have been given to



some pyranoanthocyanins (e.g. vitisin A, vitisin B and pinotin A for the compounds

formed by reaction of malvidin 3-glucoside with pyruvic acid, acetaldehyde and caffeic

acid, respectively). We suggest the following rules for naming these compounds: the

basic structure formed by the rings A-B-C-D could be named as the pyrano-derivative

of a given anthocyanidin (pyranoanthocyanidin; for instance, pyranomalvidin); the

glucosidic moiety linked to the C-3 position (ring C; 3-glucoside or 3-(6”-

acyl)glucosides) and the residue linked to the C-10 position (ring D) are then indicated

as substituent of the basic pyranoanthocyanidin structure (e.g., 10-carboxy-

pyranomalvidin 3-glucoside for the aforementioned vitisin A, or pyranomalvidin 3-

glucoside for vitisin B); in the case of pyranoanthocyanins derived from

hydroxycinnamic acids the substituent at C-10 could be named as p-hydroxyphenyl

(from p-coumaric acid; with 4´´´-hydroxyphenyl as the C-10 substituent), catechyl

(from caffeic acid; the residue resembles cathecol, with 3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl as the

C-10 substituent), guaiacyl (from ferulic acid; the residue resembles guaiacol, with a

3’’’-methoxy-4’’’-hydroxyphenyl as the C-10 substituent), and syringyl (fron sinapic

acid; the residue resembles syringol, with 3’’’,5’’’-dimethoxy-4’’’-hydroxyphenyl as the

C-10 substituent); following these rules, pinotin A could be named as 10-guaiacyl-

pyranomalvidin 3-glucoside.

With the exception of the vitisin-like pyranoanthocyanins derived from diacetyl (10-

acetyl-pyranoanthocyanins), all the aforementioned types of compounds have been

previously detected in model reactions and wines, especially those structures based on

malvidin 3-glucoside. We are now reporting on the chromatographic and spectral (UV-

vis and ESI-MS/MS) characteristics of almost all the possible structures that can be

formed from each individual anthocyanin on the basis of the anthocyanidin B-ring

substitution pattern and also the acylation or not of the glucosidic moiety. The

selection of Syrah grape skin extract facilitated our objective because this grape

cultivar contained high proportions of acylated anthocyanins (malvidin-based

anthocyanins showed a molar distribution of 41.4% non-acylated, 21.4% acetylated,

33.2% p-coumaorylated, and 1.0% caffeoylated derivatives).

The formation of pyranoanthocyanins in model red wine followed two different

trends: vitisin-like pyranoanthocyanins reached maximum yields in the first 1-2 weeks

of reaction and further decayed, the initial anthocyanins being continuously decreasing

until total disappearance; in contrast, the formation of hydroxyphenyl-



pyranoanthocyanins was progressively increasing over time and parallel to

anthocyanin decreasing that not always totally disappeared after 9 weeks. In addition,

remarkable differences in the yield of the reactions were observed in both cases.

Moreover, the pyranoanthocyanin set formed from the same anthocyanidin structure

(e.g., malvidin-type in their non-acylated and acylated forms) showed similar

proportions than that initially found for the set of non-acylated and acylated

anthocyanin precursors in grape skin extract (e.g., the set of 3-glucoside, 3-(6”-

acetyl)glucoside, 3-(6”-p-coumaroyl)glucoside, and 3-(6”-caffeoyl)glucoside of

malvidin) for all the reactions assayed. Therefore, the type of acylation of the sugar

moiety linked to the anthocyanidin did not seem to exert an appreciable effect on the

rate of formation of pyranoanthocyanins, although deeper investigation is needed to

confirm this suggestion.

In parallel, we developed a control experiment using the same model wine but in the

absence of any added reagent. We observed a disappearance of anthocyanins

following a second order polynomial evolution trend. The anthocyanin decrease was

not total after the reaction time considered (34% of the initial anthocyanins still

remained after 7 weeks of reaction) and developed without formation of any of the

studied pyranoanthocyanins (see supporting information). In this control experiment,

the decrease of anthocyanins was likely due to the formation of polymeric pigments

following condensation of anthocyanins with mainly flavan-3-ols. In fact, direct

condensation adduct of malvidin 3-glucoside and catechin were detected at m/z 781

(15), and precipitation of insoluble red-colored matter was observed.

Among vitisin-like pyranoantocyanin precursors, pyruvic acid reacted quickly and

afforded the highest yield after 1 week (around 63%, based on the peak area of 10-

carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside with regard to the peak area corresponding to

malvidin 3-glucoside at the beginning of the reaction) and all the expected reaction

products were detected by ESI-MS/MS.



Table IV. 1. HPLC retention times (min) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).

pyranoanthocyanin structure*

10- H 10-carboxy 10-acetyl 10-methyl

pyrdp-3-glc

pyrdp-3-acglc

pyrdp-3-cfglc

pyrdp-3-cmglc

pyrcy-3-glc

pyrcy-3-acglc

pyrcy-3-cfglc

pyrcy-3-cmglc

pyrpt-3-glc

pyrpt-3-acglc

pyrpt-3-cfglc

pyrpt-3-cmglc

pyrpn-3-glc

pyrpn-3-acglc

pyrpn-3-cfglc

pyrpn-3-cmglc

pyrmv-3-glc

pyrmv-3-acglc

pyrmv-3-cfglc

pyrmv-3-cmglc

11.9

13.9

nd

20.0

14.5

nd

nd

22.5

16.3

18.4

nd

23.6

18.8

21.5

23.3

26.6

20.2

22.3

24.2

27.3

10.9

12.1

14.1

16.5

13.4

15.2

16.1

19.5

15.0

16.5

18.1

20.6

17.6

19.7

21.0

23.9

18.7

20.5

21.9

24.5

14.0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

18.1

20.4

nd

24.8

20.2

23.1

nd

27.3

22.1

24.5

nd

28.3

14.8

17.1

nd

nd

17.5

20.1

nd

25.5

19.1

21.4

nd

26.7

21.7

24.5

26.1

29.6

23.0

25.4

27.1

30.2

*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin;

pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside;

cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.



Then, the concentration of 10-carboxy-pyranoanthocyanins was decreasing up to

one fifth of the maximum yield after 9 weeks and the initial anthocyanins practically

disappeared (0.5% remaining anthocyanins).

Figure IV.2. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of pyruvic acid in a model red wine made from Syrah grape skin extract, after 1 day (A), 1 week (B), and 9 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc, and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caffeoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of malvidin 3-glucoside; peaks 1-4 are the corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins derived from the

reaction between pyruvic acid and the aforementioned malvidin-type anthocyanins.

Although the reactions with acetoacetic acid and diacetyl also developed with a quick

and almost total disappearance of anthocyanins (less than 1% of initial concentrations

min10 15 20 25 30

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

mv-3-glc

mv-3-acglc

mv-3-cmglc

mv-3

-cfg

lc

43

21

(A)

min10 15 20 25 30

mAU

0

500

1000

1500

2000 4

3

2

1(B)

min10 15 20 25 30

mAU

0

400

800

1200

1600

4

3

1

2

(C)



remained after 9 weeks, on the basis of peak areas at 510 nm), they gave rise to poor

yields (maximum yields around 2-3% after 1 week) and their reaction products were

almost not detectable after 9 weeks, being several of the expected compounds not

detectable if they derived from minor anthocyanins (Table 1). In the case of the

reaction with acetaldehyde, the quick and total disappearance of anthocyanins was

accompanied by an increase of polymeric pigments (broad and non-resolved

chromatographic peak eluting in the time frame of 15-35 min, similar to that found in

very old red wines; data not shown) with a scarce formation yield of B-type vitisins

(maximum of only 0.3% after 2 weeks, on the basis of peak areas at 510 nm, and

total disappearance after 8 weeks) and non-detection of some minor expected

products. The latter results could likely be connected with the using of grape skin

extracts that also contained flavan-3-ols which can easily react with anthocyanins by

mediation of acetaldehyde (1). In fact, we were able to detect the formation of some

of the possible adducts of malvidin-type anthocyanins with (epi)catechin linked by

ethyl bridge (anthocyanin-flavan-3-ol condensation adducts mediated by

acetaldehyde) in the first steps of the reaction with acetaldehyde, that originated

signals in MS conditions for their molecular ions at m/z 809 (adduct from malvidin 3-

glucoside), 851 (adduct from malvidin 3-(6”-acetyl)glucoside), and 955 (adduct from

malvidin-(6”-p-coumaroyl)glucoside), that further fragmented in the MS/MS conditions

as previously reported (19).

With regard to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin formation reactions, the highest

yield was reached by sinapic acid (66% after 6 weeks, based on peak areas at 510

nm, that decreased to the half after 9 weeks with total disappearance of

anthocyanins), followed by caffeic acid (yield of 43% after 9 weeks, with one fourth of

initial anthocyanins still remaining), ferulic acid (maximum yield of 22% after 6 weeks

that decreased to the half after 9 weeks with total disappearance of anthocyanins),

and p-coumaric acid (maximum yield of 18% after 9 weeks with the half of the initial

anthocyanins still remaining). These results were in agreement with previously

reported moderate enhancement of kinetics of reaction of di- (caffeic and ferulic acids)

and tri-substituted (sinapic acid) hydroxycinnamic acids compared to that of the

mono-substituted one (p-coumaric acid) towards malvidin 3-glucoside (12). With the

exception of few of the very minor expected compounds (mainly 3-(6”-caffeoyl)-

glucosides), most of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins could be detected by ESI-

MS/MS, even in the case of the less reactive p-coumaric acid.



Table IV. 2. HPLC retention times (nm) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).


10-p-hydroxyphenyl 10-catechyl 10-guaiacyl 10-syringyl

pyrdp-3-glc

pyrdp-3-cfglc

pyrdp-3-acglc

pyrdp-3-cmglc

pyrcy-3-glc

pyrcy-3-cfglc

pyrcy-3-acglc

pyrcy-3-cmglc

pyrpt-3-glc

pyrpt-3-cfglc

pyrpt-3-acglc

pyrpt-3-cmglc

pyrpn-3-glc

pyrpn-3-cfglc

pyrpn-3-acglc

pyrpn-3-cmglc

pyrmv-3-glc

pyrmv-3-cfglc

pyrmv-3-acglc

pyrmv-3-cmglc

25.6

27.5

nd

30.6

28.9

nd

nd

34.0

30.5

32.8

32.9

35.5

33.9

36.2

36.6

38.8

35.0

37.3

37.5

39.5

22.5

nd

24.2

26.8

25.8

27.6

27.9

30.3

27.3

29.2

29.4

32.2

30.6

32.9

33.2

35.5

31.7

33.9

34.2

36.3

26.7

28.5

28.6

31.0

30.1

32.1

32.3

34.5

31.7

33.5

33.9

35.9

35.1

37.0

37.6

39.3

36.1

38.0

38.4

40.0

27.9

nd

29.5

31.4

31.3

nd

33.3

34.9

33.0

34.4

35.0

36.6

36.4

38.1

38.7

40.0

37.5

39.0

39.5

40.6



Chromatographic Behaviour of Pyranoanthocyanins

Under the reverse-phase chromatographic conditions used, the vitisin-like

pyranoanthocyanins showed the following behaviour (Table 1): the substituent at C-10

position in D-ring conditioned the polarity of the pyranoanthocyanin structure, thus

eluting in the increasing order of 10-carboxy- (A-type vitisins), 10-H- (B-type vitisins),

10-acetyl-, and 10-methyl-pyranoanthocyanins; for each kind of vitisin-like structure,

the increasing elution order according to the glucosidic moiety was the same found for

anthocyanins, namely, 3-glucoside, 3-(6”-acetyl)-glucoside, 3-(6”-caffeoyl)-glucoside,

and 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; every vitisin-like pyranoanthocyanin derived from

6”-non-acylated anthocyanins eluted after their corresponding anthocyanidin 3-

glucoside; in contrast, the vitisin-like pyranoanthocyanins derived from 6”-acylated

anthocyanins eluted before their corresponding anthocyanidin 3-(6”-acyl)-glucoside,

being acetyl, caffeoyl or p-coumaroyl the acyl group. The aforementioned behaviour

led to the elution of all the possible vitisin-like pyranoanthcyanins derived from a

specific anthocyanidin structure within the time frame comprised between the

chromatographic peaks corresponding to the anthocyanidin 3-glucoside and its 3-(6”-

p-coumaroyl)-glucoside, thus introducing a great complication on the chromatographic

profile, as it is depicted in (Figure 2B) for the 10-carboxy-pyranoanthocyanins (A-type

vitisins) derived from malvidin-type anthocyanins. In the latter example, malvidin-type

anthocyanins eluted within the time frame of 16.8-31.3 min, whereas their

corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins eluted within 18.8-24.4 min, and their

respective 10-H-, 10-acetyl- and 10-methyl-pyranoanthocyanins did within 20.2-27.3,

21.7-28.3, and 22.8-30.2 min, respectively. The accumulation of chromatographic

peaks corresponding to the vitisin-like pyranoanthocyanins was especially high

between the peaks corresponding to each pair of non-acylated and acetylated

anthocyanidin 3-glucosides.

In contrast, each hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin was always less polar and

eluted later than its corresponding anthocyanin from which derived (Table 2).

Moreover, each hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series eluted after the anthocyanin

series from which derived; for instance malvidin-type anthocyanins eluted within the

frame time of 16.8-31.3 min whereas the 10-catechyl-pyranoanthocyanins did within

32.0-36.60 min. However, a change in the elution order according to the glucosidic

moiety was observed for all the hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series: 3-(6“-



caffeoyl)-glucosides eluted earlier than 3-(6”-acetyl)-glucosides, when the elution

order was the reverse for their respective anthocyanins under the same conditions. As

seen for vitisin-like pyranoanthocyanins, the structure of the hydroxyphenyl

substituent at C-10 of D-ring (the new E-ring) importantly conditioned the polarity and

the elution order of the resulting pyranoanthocyanin: for a specific anthocyanin-

derived hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series, the first eluting compound was

always the 10-catechyl derivative (from caffeic acid), following by the 10-p-

hydroxyphenyl (from p-coumaric acid), the 10-guaiacyl (from ferulic acid) and the 10-

syringyl (from sinapic acid) derivatives.

On-line DAD UV-vis Spectra of Pyranoanthocyanins

The two kinds of considered pyranoanthocyanins contain different chromophores

having characteristic on-line UV-vis spectra, as it is depicted in (Figure 3A) for the 3-

glucosides of 10-carboxy-pyranomalvidin and 10-catechyl-pyranomalvidin, and

showing visible absorption maxima that were hypsochromically shifted with regard to

their corresponding original anthocyanin (malvidin 3-glucoside).



Figure IV.3. DAD on-line UV-vis spectra of: malvidin 3-glucoside (mv-3-glc) vs. its 10-carboxy- and 10-catechyl-pyranoanthocyanin derivatives (A); different vitisin-

nm250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

1000

mv-3-glc

10-carboxy-pyrmv-3-glc (vitisin A)

10-catechyl-pyrmv-3-glc (pinotin A)

nm250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

1000

10-acetyl-pyrmv-3-glc

10-carboxy-pyrmv-3-glc

pyrmv-3-glc

10-methyl-pyrmv-3-glc

nm250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

1000

10-p-hydroxyphenyl-pyrmv-3-glc

10-catechyl-pyrmv-3-glc

10-guaiacyl-pyrmv-3-glc

10-syringyl-pyrmv-3-glc

(A)

(B)

(C)



like pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (B); different hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (C). Abbreviation: pyrmv-3-glc, pyranomalvidin 3-glucoside.

UV-vis spectra of vitisin-like pyranoanthocyanins were characterized in their

visible region by a maximum absorbance broad band in the red-absorption region

(475-536 nm) that was not symmetrical showing a shoulder on the left part of the

band (455-515 nm), together with secondary bands near the yellow-absorption region

(353-388 nm) and the UV-region (262-283 and 292-305 nm). The wavelength of the

maximum absorbance in the red-absorption region of vitisin-like pyranoanthocyanins

was very affected by the substituent linked to C-10



Table IV. 3. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of vitisin-like

pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H,

from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-

methyl, from acetoacetic acid).

pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.

In fact, this band showed maximum absorbance at 480 nm for the malvidin-based

derivative having the most electron-donor substituent (methyl group) whereas

bathochromic shifts up to 54 nm were observed for the corresponding derivatives

having substituent with decreasing electron-donor (and parallel increasing electron-

acceptor) capabilities, following the sequence of 10-methyl (absorption maximum in

the range 475-484 nm), 10-hydrogen (absorption maximum in the range 485-498

nm), 10-carboxy (absorption maximum in the range 504-516 nm), and 10-acetyl

(broad absorption maximum in the range 528-536 nm) groups.

Less important was the change induced by the B-ring substitution pattern on the

maximum absorbance wavelength in the visible region. The vitisin-like

pyranoanthocyanins with tri-substituted B-ring (pyranodelphinidin-, pyranopetunidin-,

and pyranomalvidin-types) showed visible maxima which were bathochromically

shifted up to 12 nm (3-12 nm according to the C-10 substituent) with regard to those

of the pyranoanthocyanins with di-substituted B-ring (pyranocyanidin- and

pyranopeonidin-types), similar to the effects reported for the anthocyanins from which

they derived (18). In addition, the acylation of the 3-glucosidic moiety only induced

expected changes in the UV-vis spectra of an individual vitisin-like pyranoanthocyanin

series when the acylating residues were 6”-p-coumaroyl and 6”-caffeoyl, thus

appearing extra shoulders at around 312-314 and 322-340 nm, respectively, as it has

been similarly reported for acylated anthocyanins (18).

In contrast, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins showed a sharper band in the red-

absorption region (500-520 nm) together with two shoulders in the orange-brown

absorption regions of 475-486 and 415-420 nm (Figure 3C) and also other UV-region

absorption maxima or shoulders (250-263 nm; 275-280 nm; 295-301 nm).

Table IV. 4. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).



*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-



glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detecte

In addition, the substitution pattern of the hydroxyphenyl moiety (E-ring) affected

the wavelength of maximum absorbance in the red-absorption region, and successive

bathochromic shifts of 6-7 nm were observed following the sequence of mono-

substituted (10-p-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, 500-506 nm), di-substituted

(10-catechyl-pyranoanthocyanins, 506-512 nm; 10-guaiacyl-pyranoanthocyanins,

506-513 nm), and tri-substituted (10-syringyl-pyranoanthocyanins, 514-520 nm). The

shoulder at 415-420 nm was more pronounced in the case of 10-p-hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins. Less than described for vitisin-like pyranoanthocyanins, the B-

ring substitution pattern of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins also affected the red-

absorption region maximum: a bathochromic shift of only 3-5 nm for tri-substituted

structures (pyranodelphinidin-, pyranonopetunidin-, and pyranomalvidin-types) with

regard to di-substituted ones (pyranocyanidin- and pyranopeonidin-types). Finally, the

acylation of the glucose residue only introduced change in the UV-absorption region in

the expected cases of p-coumaroyl and caffeoyl acylating groups, similarly to that seen

for vitisin-like pyranoanthocyanins.

ESI-MS/MS Spectra of Pyranoanthocyanins

The soft positive ionization conditions provided by the electrospary ionization (ESI)

chamber together with the use of an acidic elution solvent, allowed the formation of

molecular ions for all kinds of pyranoanthocyanins in their flavylium-like form. Further

fragmentation in the ion trap (MS/MS) led to the loss of the entire glucosidic moiety,

whatever it was acylated or not (no intermediate loss of the acyl residue of the

glucosidic moiety is observed). This behaviour is typical for anthocyanins

(anthocyanidin 3-glucosides) and it has been also reported for the pyranoanthocyanins

formed from them (15).

Table IV.5. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H,



from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).


10- H 10-carboxy 10-acetyl 10-methyl

pyrdp-3-glc

pyrdp-3-acglc

pyrdp-3-cfglc

pyrdp-3-cmglc

pyrcy-3-glc

pyrcy-3-acglc

pyrcy-3-cfglc

pyrcy-3-cmglc

pyrpt-3-glc

pyrpt-3-acglc

pyrpt-3-cfglc

pyrpt-3-cmglc

pyrpn-3-glc

pyrpn-3-acglc

pyrpn-3-cfglc

pyrpn-3-cmglc

pyrmv-3-glc

pyrmv-3-acglc

pyrmv-3-cfglc

pyrmv-3-cmglc

489; 327

531; 327

nd

635; 327

473; 311

nd

nd

619

503; 341

545; 341

nd

649; 341

487; 325

529; 325

649

633; 325

517; 355

559; 355

679; 355

663; 355

533; 371

575; 371

695; 371

679; 371

517; 355

559; 355

679; 355

663; 355

547; 385

589; 385

709; 385

693; 385

531; 369

573; 369

693; 369

677; 369

561; 399

603; 399

723; 399

707; 399

531; 369

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

545; 383

587; 383

nd

691; 383

529; 367

571; 367

nd

675; 367

559; 397

601; 397

nd

705; 397

503; 341

545; 341

nd

nd

487; 325

529; 325

nd

633; 325

517; 355

559; 355

nd

663; 355

501; 339

543; 339

663; 339

647; 339

531; 369

573; 369

693; 369

677; 369

*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn,

pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside;

cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.

Table IV. 6. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series formed in model wine (10-p-hydroxyphenyl, from p-



coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).

MS/MS 10-p-hydroxyphenyl 10-catechyl 10-guaiacyl 10-syringyl

pyrdp-3-glc

pyrdp-3-cfglc

pyrdp-3-acglc

pyrdp-3-cmglc

pyrcy-3-glc

pyrcy-3-cfglc

pyrcy-3-acglc

pyrcy-3-cmglc

pyrpt-3-glc

pyrpt-3-cfglc

pyrpt-3-acglc

pyrpt-3-cmglc

pyrpn-3-glc

pyrpn-3-cfglc

pyrpn-3-acglc

pyrpn-3-cmglc

pyrmv-3-glc

pyrmv-3-cfglc

pyrmv-3-acglc

pyrmv-3-cmglc

581

743

nd

727

565; 403

nd

nd

711

595; 433

757; 433

637; 433

741; 433

579; 417

741; 417

621; 417

725; 417

609; 447

771; 447

651; 447

755; 447

597; 435

nd

639; 435

743; 435

581; 419

743

623; 419

727; 419

611; 449

773

653; 449

757; 449

595; 433

757; 433

637; 433

741; 433

625; 463

787; 463

667; 463

771; 463

611; 449

773

653; 449

757; 449

595; 433

757

637; 433

741; 433

625; 463

787; 463

667; 463

771; 463

609; 447

771; 447

651; 447

755; 447

639; 477

801; 477

681; 477

785; 477

641; 479

nd

683; 479

787; 479

625

nd

667; 463

771; 463

655; 493

817; 493

697; 493

801; 493

639; 477

801; 477

681; 477

785; 477

669; 507

831; 507

711; 507

815; 507

Tables 5 and 6 summarized the molecular (MS conditions) and product ions detected

when possible (enough signal intensity for the molecular ion to be isolated in the ion



trap and fragmented under MS/MS conditions), for the studied pyranoanthocyanin

series. These data were in agreement with the expected m/z values for each

pyranoanthocyanin series and were used, in combination with UV-vis data, for

identification. By means of extracted ion chromatograms (EIC) at m/z values of the

expected pyranoanthocyanidin aglycones it was possible to identify each of the

pyranoanthocyanidin-based series for every combination of C-10 substituent and B-

ring substitution pattern.

MS detectors have high sensitivity and they allow the analysis of single compounds

in complex mixtures without previous isolation (extracted ion chromatograms).

However, our results showed the necessity of using MS/MS experiments because some

pairs of different pyranoanthocyanin structures were isomeric (the 3-(6”-p-

coumaroyl)- and the 3-(6”-caffeoyl)-glucosides of the pairs

pyranodelphinidin/pyranocyanidin and pyranopetunidin/pyranomalvidin of all the

pyranoanthocyanins studied; the 3-glucosides of 10-acetyl-pyranoanthocyanins and

the 3-(6”-acetyl)-glucosides of their respective pyranoanthocyanins) and had the same

m/z value for their molecular ions but different m/z values for their product ions.

Therefore, the use of single-quadrupole MS detectors cannot distinguish between such

pairs of compounds, especially in the case of vitisin-like pyranoanthocyanins because

their retention times were also quite close (Table 1). On the other hand, even working

under MS/MS conditions, MS detectors were not enough for unequivocal identification

of each of the very wide sort of pyranoanthocyanin structures. As can be seen in

Tables 5 and 6, many pyranoanthocyanin series (including all the non-acylated and

acylated 3-glucosides) showed the same molecular and product ions (for instance,

pyranopeonidins and 10-methyl-pyranocyanidins show the common aglycone m/z

value, 325; and 10-p-hydroxyphenyl-pyranodelphinidins and 10-catechyl-

pyranocyanidins show the common aglycone m/z value, 419). In all the

aforementioned cases, the UV-vis information afforded by DAD-detector and the

retention times obtained by the separated experiments developed with each individual

pyranoanthocyanin precursors were necessary to differentiate among the above

remarked coincidences. The use of ion trap instruments able to perform MSn

experiments with n ≥ 3 could help to the unambiguous identification of the

aforementioned pairs of compounds of identical molecular weight, really having an

add-on value for other researchers.



Tentative Identification of New Pyranoanthocyanin Structures.

In this work, a new kind of pyranoanthocyanin structure has been found. As far

as we know, the 10-acetyl-pyranoanthocyanins derived from diacetyl (butanedione)

has not been previously reported. We tried this compound because it was expected to

be present in red wines as a lactic acid bacteria metabolite and it presented the

chemical requisites for reacting with anthocyanins to form pyranoanthocyanins (a

polarizable double bound in its enolic form). We found that diacetyl reacted in a model

wine giving rise to the expected 10-acetyl-pyranoanthocyanins. However, the yield of

the reaction was poor and we were only able to detect by ESI-MS/MS a few of the

expected components of the complete series (Table 6). It is remarkable that the UV-

vis spectra of this new kind of pyranoanthocyanins showed a visible maximum at

around 528-536 nm (Figure 3B and Table 3), a value quite similar to that of the

anthocyanins from which was formed. Therefore, these new pigments can be described

as red-purple pigments and not as orange pigments as usually other

pyranoanthocyanins are. Despite of the low capability of diacetyl to react with

anthocyanins and the little amounts expected for this metabolite in wines, it is

noteworthy that we found MS evidence of the occurrence of 10-acetyl-pyranomalvidins

in real samples of red wines that developed malolactic fermentation, thus suggesting

their formation in red wine is possible.



Figure IV.4. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of a 2-years old Tempranillo commercial red wine: DAD-chromatogram at 520 nm (A); extracted ion chromatogram (EIC) at m/z 355 (pyrmv) showing the peaks assigned to the 3-glc (20.2 min), the 3-acglc (22.3 min), and the 3-cmglc (27.3 min) derivatives (B); EIC at m/z 397 (10-acetyl-pyrmv) showing the peak assigned to its 3-glc (22.1 min) derivative (C); EIC at m/z 559 corresponding to the molecular ions of the isomers 10-acetyl-pyrmv-3-glc and pyrmv-3-acglc (D); MS/MS spectra of peaks corresponding to 10-acetyl-pyrmv-3-glc (E) and pyrmv-3-acglc (G), and their overlapping zone (F). Abbreviations: pyrmv, pyranoamalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-acglc, 3-(6”-acetyl)-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.

27.322.320.2

(A) DAD, 520 nm

20.2

22.3 27.3

(B) EIC 355 +All

22.1 (C) EIC 397 +All

22.3(D) EIC 559 +All MS

0

200

Intens.

mAU

0

1

x106

0

1

2

0.0

0.5

10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Time [min]

x104

x106

355.2

397.1 (E) +MS2(559.5), 22.1 min

0

2

4

x104

355.2

397.1 (F) +MS2(559.6), 22.2 min

0

2

4

x104

355.2

397.1

(G) +MS2(559.5), 22.3 min

0

1

2

200 400 600 800 1000 m/z

x105



The identification of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in wines was difficult because

their low concentrations. In addition, the expected major 10-acetyl-pyranomalvidin 3-

glucoside partially co-eluted with its isomer 10-pyranomalvidin 3-(6”-acetyl)-glucoside

under the chromatographic conditions we used (Figures 4C and 4D) and its occurrence

was confirmed by MS/MS experiments (Figures 4E-4G): the isolated molecular ions

(m/z = 559) were fragmented into two product ions, one corresponding to 10-acetyl-

pyranomalvidin aglycone (m/z = 397) and the other to pyranomalvidin aglycone (m/z

= 355), the ratio between these two product ions varying accordingly to the elution

time.

Finally, one apparently new pyranoanthocyanin structure was found in the

experiments using pyruvic acid. In this case, a second set of signals were found in the

corresponding extracted ion chromatograms at the expected m/z values of the

pyranocyanidin and pyranopeonidin aglycones (355 and 369, respectively). These new

signals showed the same molecular and product ions than their corresponding 10-

carboxy-pyranoanthocyanins, thus indicating they were isomers. In addition, the

retention times and UV-vis spectra of these new compounds were identical to that

described for 10-methyl-pyranoanthocyanins with petunidin- and malvidin-based

structures, respectively, which showed coincident m/z values for their molecular and

product ions (Table 5). Moreover, the series of the other 10-methyl-

pyranoanthocyanins (delphinidin-, cyanidin- and peonidin-based structures) were also

found in the reaction mixture with pyruvic acid when appropriate m/z common

aglycone values (341, 325, and 339, respectively) were selected to obtain extracted

ion chromatograms. We repeated the reaction of pyruvic acid with grape skin extracts

from other grape cultivars (Cabernet Sauvignon and Petit Verdot) with similar results

(data not shown). Bearing in mind the low amounts in which acetoacetic acid occurs in

wine and the poor yield of its reaction in the model wine reaction studied in this work,

it could be also suggested that the occurrence of 10-methyl-pyranoanthocyanins in

wine could be related in an important extent to the formation of 10-carboxy-

pyranoanthocyanins. In fact, the isolation and identification of 10-methyl-

pyranoanthocyanins were made for the first time from aged Port wines (13), a type of

red wine that is characterized by high contents of pyruvic acid and 10-carboxy-

pyranoanthocyanins due to its special winemaking technique. In recent years, the

reactivity of 10-carboxy-pyranoanthocyanins has been reported, leading to the

formation of new wine pigments: the so-called portisins (reaction products of 10-



carboxy-pyranoanthocyanins with vinyl-flavanols, vinylphenols, and hydroxycinnamic

acids with the loss of the 10-carboxy group) (3-6); a new family of pyranoanthocyanin

dimers with a turquoise color (7); or the new yellowish pigments (called oxovitisins)

produced by oxidative decarboxylation of 10-carboxy-pyranoanthocyanins (8,9).

Supporting Information

Supporting Information Available: Control model wine evolution over the reaction

time. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

LITERATURE CITED

1. Monagas, M.; Bartolomé, B. Anthocyanins and anthocyanin-derived compounds.

In Wine Chemistry and Biochemistry; Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C., Eds.;

Springer Science and Business Media: New York, NY, 2009; pp 439-462.

2. Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P. Pyranoanthocyanins: An overview on

structures, occurrence and pathways of formation. Trends Food Sci. Technol. 2007,

18, 526-534.

3. Mateus, N.; Silva, A. M. S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; de Freitas,

V. A new class of blue anthocyanin-derived pigments isolated from red wines. J. Agric.

Food Chem. 2003, 51, 1919-1923.

4. Mateus, N.; Oliveira, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A. P.

NMR structure characterization of a new vinylpyranoanthocyanin-catechin pigment.

Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3455-3457.

5. Mateus, N.; Oliveira, J.; Pissarra, J.; González-Paramás, A.M.; Rivas-Gonzalo, J;

Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A new vinylpyranoanthocyanin

pigment occurring in aged red wine. Food Chem. 2006, 97, 689–695.



6. Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. Reaction between

hydroxycinnamic acids and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins. J.

Agric. Food Chem. 2007, 55, 6349-6356.

7. Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva, A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de

Freitas, V. Pyranoanthocyanin Dimers: A New Family of Turquoise Blue Anthocyanin-

Derived Pigments Found in Port Wine. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5154–5159.

8. He, J.; Oliveira, J; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxovitisins: A New

Class of Neutral Pyranone-anthocyanin Derivatives in Red Wines. J. Agric. Food Chem.

2010, 58, 8814–8819.

9. He, J.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxidative formation and

structural characterisation of new a-pyranone (lactone) compounds of non-oxonium

nature originated from fruit anthocyanins. Food Chem. 2011, 127, 984-992.

10. Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P; Blanco-Vega, D.; Hermosín-

Gutiérrez, I. Survey on the content of vitisin A and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins

in Tempranillo wines. Food Chem. 2010, 119, 1426-1434.

11. Schwarz, M.; Jerz, G.; Winterhalter, P. Isolation and structure of pinotin A, a

new anthocyanin derivative from Pinotage wine. Vitis 2003, 42, 105-106.

12. Schwarz, M.; Wabnitz, T. C.; Winterhalter, P. Pathway Leading to the Formation

of Anthocyanin-Vinylphenol Adducts and Related Pigments in Red Wines. J. Agric. Food

Chem. 2003, 51, 3682-3687.

13. He, J.; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; De Freitas, V. Isolation

and Structural Characterization of New Anthocyanin-Derived Yellow Pigments in Aged

Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9598-9603.

14. Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C.

Separation of pyranoanthocyanins from red wine by column chromatography. Anal.

Chim. Acta 2004, 513, 305-318.

15. Alcalde-Eon, C.; Escribano-Bailón, M. T.; Santos-Buelga, C.; Rivas-Gonzalo, J. C.

Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing.

A comprehensive study. Anal. Chim. Acta 2006, 563, 238-254.



16. Castillo-Muñoz, N.; Gómez-Alonso, S.; García-Romero, E.; Hermosín-Gutiérrez,

I. Flavonol profiles of Vitis vinifera red grapes and their single-cultivar wines. J. Agric.

Food Chem. 2007, 55, 992-1002.

17. Organisation Internationale de la Vigne et du Vin. Détermination par CLHP de

neuf anthocyanes principales dans le vin rouge et rosé. Resolution OENO 22/2003.

18. Wulf, L. W.; Nagel, C. W. High-pressure liquid chromatographic separation of

anthocyanins of Vitis vinifera. Am. J. Enol. Vitic. 1978, 29, 42-49.

19. Cejudo-Bastante, M. J.; Hermosín-Gutiérrez, I.; Pérez-Coello, M. S. Micro-

oxygenation and oak chip treatments of red wines: Effects on colour-related phenolics,

volatile composition and sensory characteristics. Part I: Petit Verdot wines. Food

Chem. 2011, 124, 727-737.

Funding Sources

This work was financially supported by the Instituto de la Viña y el Vino de Castilla-

La Mancha (Projects PREG-05-024 and PREG-10-002).



Suporting Information

Figure A. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of control model red

wine made f rom Syrah grape skin extract without addition of any reagent, af ter 1 day (A), 2 weeks

(B), and 7 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc,

and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caf feoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of

malvidin 3-glucoside; mv-3-glc-catechin is the direct adduct formed by reaction between mv-3-glc

and catechin; the rest of the peaks correspond to the other original grape skin anthocyanins.

(A)

(B)

(C)

min5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

dp

-3-g

lc

cy-3

-glc

pt-

3-g

lc

pn

-3-g

lc

mv-3

-glc

mv-3

-acg

lc

mv-3

-cm

glc

min5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

200

400

600

800

1000

min5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

200

400

600

800

mv-3

-cfg

lc

dp

-3-g

lc

cy-3

-glc

pt-

3-g

lc

pn

-3-g

lc

mv-3

-glc

mv-3

-acg

lc

mv-3

-cm

glc

mv-3

-cfg

lc

dp

-3-g

lc

cy-3

-glc pt-

3-g

lc

pn

-3-g

lc

mv-3

-glc

mv-3

-acg

lc

mv-3

-cm

glc

mv-3

-cfg

lc

mv-3

-glc

-cate

chin

mv-3

-glc

-cate

chin

CAPÍTULO V

Resultados y Discusión. Capítulo V.


CAPÍTULO V. Synthesis, Isolation, Structure Elucidation,

and Color Properties of 10-Acetyl-Pyranoanthocyanin.

JUSTIFICACIÓN

Al hacer el estudio pormenorizado de los piranoantocianos tipo vitisina e

hidroxifenilpiranoantocianos, se había probado con un nuevo “candidato”, el diacetilo,

que se formaba como subproducto de las bacterias lácticas que producían la

fermentación malo-láctica, y que era una pequeña molécula con un doble enlace

polarizado, lo que hacía pensar que pudiera reaccionar con los antocianos para dar un

nuevo pigmento del tipo piranoantociano. En el laboratorio se comprobó que se

formaba un nuevo pigmento no estudiado hasta el momento el 10-

acetilpiranoantociano, con una estructura muy parecida a los piranoantocianos del tipo

vitisina. Este pigmento era similar a otros piranoantocianos del tipo de las vitisinas y

se logró encontrar en muestras de vinos comerciales de cierta edad.

Como el rendimiento de la reacción era muy bajo no se pudo caracterizar

adecuadamente a los nuevos compuestos y se propuso como tema de este capítulo

aislar y purificar el pigmento para conseguir una concentración adecuada de producto,

que nos pudiera facilitar el someterlo a análisis con métodos espectroscópicos

(UV−vis, MS/MS, y NMR). Y así poder explicar sus características y comportamiento.

La estructura del 10-acetil-piranomalvidin-3-β-O-glucosa y del 10-acetil-

piranopeonidin-3-β-O-glucosa se confirmó con estos métodos espectroscópicos. Y se

comprobó que a diferencia de otros pigmentos de tipo vitisina estos nuevos

piranoantocianos tienen colores muy diferentes a los observados anteriormente.

Muestran una tendencia importante a dar compuestos hemiacetales, incoloros al pH

del vino. Reaccionan fácilmente en condiciones ácidas pH 2.0 con el bisulfito pero no

se produce la decoloración esperada, sino que se incrementa su intensidad y además

se desplaza hipsocromicamente hacía el naranja (absorbancias máximas en 487-491

nm).



MÉTODO DE ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS CROMÁTICAS

Sistema CIE

Se trata del sistema estándar de medida del color con el cual se deben comparar

el resto de los sistemas. Fue propuesto por la CIE en 1931, basándose en la teoría de

la percepción tricromática. El sistema CIE especifica el color definido por tres

parámetros (X; Y; Z) llamados parámetros triestímulo, que representan la cantidad de

los tres colores primarios: rojo, verde y azul. Para calcularlos, la CIE recomienda

registrar el espectro entre 380 y 700 nm a intervalos de 1, 5 ó 10 nm y aplicar las

siguientes ecuaciones:

X = k∑гג LגyגΔג

Y = k∑гג LגyגΔג

Z = k∑гג LגyגΔג

En el caso de que el color se deba a la transmisión de luz por un objeto, como en el

vino (гג) es una transmitancia espectral de la muestra para cada longitud de onda, (L (ג

la emisión espectral de la muestra para esa misma ג, (x ג , y ג , z ג ) son funciones

matemáticas de color relacionadas con el observador estándar elegido, y (Δג) el

intervalo de medida. Para los vinos, la CIE propuso un método aproximado más simple

que permitía calcular los parámetros triestímulo (T ג = transmitancia a una ג

determinada):

X= 0.42 T625 + 0.35 T550 + 0.21 T445

Y= 0.20 T625 + 0.63 T550 + 0.17 T495

Z= 0.24 T495 + 0.94 T445

Una vez obtenidos estos parámetros se calcula la proporción de cada uno de

ellos:

X = X / (X+Y+Z)

Y = Y / (X+Y+Z)

Z = Z / (X+Y+Z)

Los valores resultantes (x, y, z) se denominan coordenadas tricromáticas. El

diagrama cartesiano donde se representa (x) e (y) se denomina diagrama de



cromaticidad donde cada punto (x, y) proporciona la cromaticidad de la muestra,

definida por la longitud de onda dominante (correspondiente a la percepción sensorial

del matiz) y por la pureza (correspondiente a la percepción de saturación). La tercera

dimensión la proporciona (z) que corresponde al porcentaje de luminosidad.

Figura V.1. Diagrama de cromaticidad CIE.

El Sistema CIELAB

En el año 1971 la CIE desarrolló un nuevo espacio cromático a partir de

transformaciones no lineales de los valores triestímulo del sistema CIE de 1931. En



este nuevo sistema el espacio se define mediante coordenadas rectangulares (L*, a*,

b*) junto con otro espacio de coordenadas cilíndricas (L*, C*, h*). Las relaciones

entre las coordenadas CIELAD y las CIE son:

Figura V. 2. Coordenadas rectangulares del sistema CIELAB.



Los parámetros (x, y, z) son los valores triestímulo de la muestra y los valores

(x0, y0, z0) lo son del iluminante. El eje L*, representa la luminosidad. El eje a*, una

medida del componente rojo (valores positivos) y verde (valores negativos). El eje b*,

mide el componente amarillo (positivo) y azul (negativo). A partir de los valores de a*

y b* se calculan los valores psicométricos C* (cromaticidad) y h* (ángulo de tono),

relacionado con el término tonalidad o matiz de color:

C* = (a*2 + b*2)½ y h* = arctg (b*/a*)

En este sistema las diferencias de color global entre dos muestras (ΔE) se

calculan con la expresión:

ΔE = [(ΔL*)2 + (Δa*)2 + (Δb*)2]

MÉTODO DE PURIFICACION Y CONCENTRACION POR FCPC

Cromatografía de reparto centrífuga es una técnica de cromatografía líquida-

líquida. El Cromatógrafo de Particionamiento centrífugo hace por lo tanto funciones

basadas en los principios de la cromatografía de partición líquido/líquido: dos fases

líquidas inmiscibles se mezclan juntas para formar un sistema de dos fases, y luego se

separan varias veces. Los solutos individuales están aislados sobre la base de los

diferentes coeficientes de reparto de cada compuesto, en este sistema de dos fases.

Una de las fases líquidas del sistema de dos fases se utiliza como una fase

líquida estacionaria: se alimenta a la columna (el rotor) mientras que la última está

girando a velocidad de rotación moderada. La fase estacionaria se mantiene dentro del

rotor por la fuerza centrífuga generada.

La segunda fase del sistema de dos fases, se utiliza como la fase móvil y

contiene los solutos que se extrajeron. Se alimenta a presión en el rotor y se bombea

a través de la fase estacionaria.

Es en ese momento cuando se produce el intercambio de moléculas entre las dos

fases La separación de los solutos se logra como una función del coeficiente de

partición específica (Kd) de cada soluto entre las fases móvil y estacionaria. La fase

móvil se decanta a continuación, en cada salida de la célula entrando así en la

siguiente celda.



Las fracciones eluídas de las fases móvil y estacionaria se recogen durante un

período de varios minutos a varias horas. Estas fracciones, o eluidos, contendrán los

solutos purificados individuales.

Figura V. 3. Funcionamiento del cromatógrafo FCPC.

El rotor del Cromatógrafo de FCPC se compone de varios discos celulares

individuales, cuyo número varía en función del proceso.

La cromatografía de reparto centrífuga es una técnica de cromatografía

preparativa. Es una alternativa a las técnicas de purificación clásicas tales como la

HPLC preparativa (cromatografía líquida de alto rendimiento) o cromatografía Flash.

La cromatografía de reparto centrífuga se puede utilizar para:

La purificación final (pureza> 99,5%) de las moléculas de derivados de

extractos naturales, sintéticos o mezclas de matrices biológicas.

Fraccionamiento o pre-fraccionamiento de extractos crudos altamente

complejos.

Extracción líquido-líquido utilizando los prototipos de extractores

centrífugos de particiones de nuevo desarrollo (CPE).



KEYWORDS: red wine, color, pyranoanthocyanins, diacetyl, LC-MS, UV−vis, NMR



INTRODUCTION

Red wine color chemistry has been attracted for decades the attention of many

researchers.1 In addition to the early proposed formation of polymeric pigments by

reaction between anthocyanins and tannins, a new class of non-polymeric pigments

have gained position in this field, namely the so called pyranoanthocyanins. The

general pathway of pyranoanthocyanin formation involves an anthocyanin and a

compound having a polarisable double bound (pyranoanthocyanin precursor) that react

to give rise to a new pyrano ring fused to the anthocyanin molecule.2 Many

pyranoanthocyanin precursors have been identified, including those derived from some

yeast metabolites produced during alcoholic fermentation (e.g., pyruvic acid or

acetaldehyde) and also other compounds generated from grape phenolics over wine

aging (e.g., free hydroxycinnamic acids or 8-vinyl-flavanols). Pyranoanthocyanins have

been also found in other natural sources or their processed products.2 In recent years,

some pyranoanthocyanins with the simplest structures (A-type vitisins or 10-carboxy-

pyranoanthocyanins, and 10-methyl-pyranoanthocyanins) have been identified as the

starting point for the formation of more complex pyranoanthocyanins,3-8 or their

transformation into other kinds of non-red pigments.9,10

The contribution of pyranoanthocyanins to total red wine color has been largely

suggested on the basis of their color stability in comparison to grape anthocyanins

from which they derived. Several studies on aqueous solution equilibria in which

pyranoanthocyanins are involved have demonstrated they are more resistant than

anthocyanins from which they derive with regard to both the hydration of the red

colored flavylium cation (leading to the formation of colorless hemiacetal form) and

bleaching by bisulfite.5,11-17 The aforementioned studies supported that almost all the

pyranoanthocyanins molecules present in wines really contribute to red wine color, as

they predominantly occur at wine pH conditions as red-orange colored flavylium

cations without significant variations due to changes in pH or bisulfite addition.

In a previous study dealing with the formation of diverse pyranoanthocyanins in

a model wine, we suggested the formation of a new member of this pigment family

obtained from diacetyl, a secondary product of lactic acid bacteria metabolism, which

was tentatively assigned as 10-acetyl-pyranoanthocyanins.18 In addition, we also

found evidence of the occurrence of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in real red wine



samples. In order to ascertain the role in red wine color of this new kind of pigment

derived from grape anthocyanins and fermentation metabolites, the aim of our work

was the synthesis and isolation of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in order to confirm

the suggested structure and also to study their chromatic characteristics under

variable pH conditions and resistance to bleaching by bisulfite.


Chemicals

All solvents were of HPLC quality and water was of MilliQ® quality. Malvidin 3-

glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard for

quantification of anthocyanins in red grape skin extracts. Diacetyl (2,3-butanedione; ≥

99.0%, Fluka) was the reagent used for the formation of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins from grape skin anthocyanins.

Red Grape Skin Extracts

Red grapes of V. vinifera Garnacha Tintorera variety were chosen because of its

unique anthocyanin profile: similar high proportions of peonidin- and malvidin-based

anthocyanins, mainly occurring as non-acylated derivatives. Batches of 100 g of

healthy red grapes were collected at technological maturity and finger pressed to

remove the pulp and the seeds. The remaining skins were washed in water (3 x 25

mL) and softly dried twice by patting them between sheets of filter paper. The dried

skins were extracted with 100 mL of a mixture 50:48.5:1.5 (v/v) of

CH3OH/H2O/HCOOH,19 using a homogenizer (Heidolph DIAX 900) for 2 min and then

centrifuging at 2500g at 5 ºC for 15 min. The supernatant of this crude grape skin

extract was stored at -20 ºC until using.

Purification of Red Grape Skin Extracts

Anthocyanins present in red grape skin extracts were isolated, in order to

prevent interferences during the formation reaction of 10-acetyl-pyranoanthocyanins.

The separation procedure was adapted from the SPE method developed for isolation of

grape skin flavonols,19 but this time the interest was focussed in the recovery of the

retained anthocyanins by cation exchanging. The crude grape skin extract (3 mL) was

firstly dried in a rotary evaporator (35 ºC), then re-dissolved in 0.1 N HCl (3 mL) and



passed through the MCX cartridges (Waters) previously conditioned with 5 mL of

methanol and 5 mL of water. After washing with 5 mL of 0.1 N HCl and 5 mL of water,

the non-anthocyanin phenolic compounds were eluted with 3 x 5 mL of methanol.

Fixed anthocyanins were removed using 3 x 5 mL of 2% (w/v) ammonia in methanol-

water (80:20 v/v), and the cationic exchanger material was regenerated with 3 x 5 mL

of 2% (w/v) hydrochloric acid in methanol-water (80:20 v/v). The anthocyanin eluate

(deep blue color solution) was immediately acidified by adding HCl 4N until intense red

color was regenerated. After drying in rotary evaporator (35 ºC), anthocyanins were

solved in acetone (5 mL) and excess of ammonium chloride was eliminated by

filtration. A further purification by SPE on C18 cartridges (Sep Pack, Merck) was

necessary to completely removing of salts: after removing of acetone in a rotary

evaporator (35 ºC), the residue was re-dissolved in 0.1N HCl and applied to a the SPE

cartridge, previously conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of water; the

purified anthocyanins were recovered with 2% HCl in methanol and stored at -20 ºC

until use.

Reaction of Formation of 10-Acetyl-Pyranoanthocyanins

Reaction conditions described for the synthesis of 10-carboxy-pyranomalvidin-3-

glucoside12 were adapted for improving reaction yield. The adequate volume of purified

grape skin extract that contained 100 mg of total anthocyanins (as malvidin-3-

glucoside equivalents) was dried in rotary evaporator (35 ºC). The solid residue was

dissolved in water (50 mL) in an amber glass bottle (60 mL) and pH was adjusted to

2.5 with HCl 1N. Further addition of diacetyl (9.85 mL) was made to obtain a molar

ratio diacetyl:anthocyanin of 500:1 with regard to the total anthocyanin concentration

(2000 mg/L of mv-3-glc equivalents). After closing of the bottle, the reaction mixture

was gently blended and allowed to react in an oven at 35 ºC. The reaction was

stopped after maximum chromatographic yield was reached (usually 17-18 h) by

cooling and removing the excess of diacetyl. Thus, the reaction mixture was applied to

a chromatographic glass column (2.5 x 30 cm) filled with Amberlite XAD-7 (2 h

methanolic suspension, followed by filling of the column and rinsing with 2 x 125 mL

water). First wash with methanol-water (25:75 v/v) removed excess diacetyl (yellow

eluate) and non-reacted anthocyanins (orange eluate). Further elution with methanol-

water (40:60 v/v) yielded a fraction containing the expected reaction products (red-

purple eluate) that were submitted to countercurrent chromatography in the next step.



Fractionation of Main Reaction Products by Fast Centrifugal Partition

Chromatography (FCPC)

Countercurrent chromatography was carried out using a Fast Centrifugal

Partition Chromatography system model FCPC-200 (Kromatron, France) with a total

rotor volume of 198 mL and 840 partition cells. The FCPC system was connected to a

semi-preparative ternary pump model BETA-50 (ECOM, Czech Republic), a UV-Vis

detector model Flash 06S DAD 600 (ECOM, Czech Republic) and a fraction collector

model CHF122SC (Advantec, USA). Samples were manually injected from a 10 mL

loop through a 3725i Rheodyne valve (USA).

Separation was carried out using a gradient of a ternary biphasic solvent system

composed by ethyl acetate, 1-butanol and water and operating the FCPC system in

ascending mode, at a flow rate of 5 mL/min and a rotor speed of 1750 rpm, as

modified from Renault et al.20 Phases composition was as follows: stationary phase,

ethyl acetate-1-butanol-water (4:5:91 v/v); mobile phase A, ethyl acetate-1-butanol-

water (77:15:8 v/v); mobile phase B, ethyl acetate-1-butanol-water (40:46:14 v/v).

Each phase was acidified with 0.1% trifluoroacetic acid. Sample was injected dissolved

in 10 mL of a mixture of stationary phase and mobile phase A (50:50 v/v). The linear

gradient was as follows: zero min, 100% mobile phase A; 90 min, 100% mobile phase

B; 115 min, 100% mobile phase B. Fractions of 10 mL were collected every 2 min

from minute 12. Detection was performed at 280 and 520 nm.

Composition of the fractions was determined using HPLC-DAD-ESI-MS/MS and

those containing the compounds of interest were stored at -20 ºC until further

purification. Two main fractions were collected containing the main produced 10-

acetyl-pyranoanthocyanins derived from the main anthocyanins present in grape skin

extracts, namely the 3-glucosides of malvidin and peonidin.

Semi-Preparative HPLC Purification of Main Produced 10-Acetyl-

Pyranoanthocyanins

FCPC fractions enriched in 10-acetyl-pyranoanthocyanins were purified using a

semi-preparative HPLC system composed by two HPLC pumps model 510, a gradient

controller model 600, a manual injector model U6K and an UV-Vis detector model

PDA-996 all from Waters (USA) and controlled by the Millenium v. 3.2 software

(Waters, USA). Volume injection was 250 µL and separation was carried out in a



Kromasil C18 column (250 x 10 mm i.d., 5 µm; Análisis Vínicos, Spain), flow 2

mL/min, using a biphasic solvent gradient: phase A, water-acetonitrile-formic acid

(87:3:10 v/v); phase B, water-acetonitrile-formic acid (40:50:10 v/v). The gradient

was as follows: zero min, 75% A; 8 min, 65% A; 18 min, 65% A; 21 min, 0% A; 23

min, 0% A; 25 min, 75% A. Detection was performed at 520 nm and fractions were

manually collected. Fractions containing the purified 10-acetyl-piranoanthocyanins

were dried under vacuum, re-dissolved in 0.1 N HCl methanol and dried again under

vacuum to obtain the compounds as chloride salts, which were stored at -20 ºC until

further use.

Analytical HPLC-DAD-ESI-MS/MS

HPLC separation, identification, and quantification of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins were performed on an Agilent 1100 Series system (Agilent,

Germany), equipped with DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL (G2445C VL)

electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS) system, and coupled to an

Agilent Chem Station (version B.01.03) data-processing station. The mass spectra

data were processed with the Agilent LC/MS Trap software (version 5.3). The reaction

mixture samples and semi-preparative HPLC fractions were directly injected after

proper dilution if necessary (HCl 0.1N) whereas the FCPC were previously dried in

rotary evaporator (35 ºC) and re-dissolved in HCl 0.1 N. After filtration (0.20

polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) the

-phase column Zorbax Eclipse XDB-C18

(2.1 x 150 mm; 3.5

protected with a guard column of XDB-

Germany). The chromatographic conditions were adapted from the OIV method for

analysis of anthocyanins in red wines21 and the detection wavelength was 520 nm. The

solvents were water/acetonitrile/formic acid (87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10,

v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.19 mL/min. The linear gradient for solvent B

was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min, 50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min,

6%. For identification, ESI-MS/MS operating parameters were optimized by direct

infusion of solutions of both a standard of malvidin 3-glucoside and

chromatographically pure isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside.



pH Assay

For the pH assay, solutions of each pigment (2 mM) were prepared in 12% (v/v)

aqueous ethanol and added to buffer solutions with different pH values in a range

between 1.0 and 13.0. The solvents used for preparation of the buffer solutions were

0.2 M KCl, 0.1 M HCl, 0.2 M HCl, 0.1 M KHC8O4H4, 0.1 M NaOH, 0.2 M NaOH, 0.1 M

KH2PO4, 0.1 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, 0.025 M Borax, and 0.05 M

Na2HPO4 according to Robinson and Stokes.22 The final concentration of each pigment

was 0.08 mM. All of the pigments solutions were left to equilibrate for 2 h, and then

spectroscopic absorbance curves were recorded for all of the solutions from 360 to 830

nm with a 1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz cell in a

Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Japan).

SO2 Bleaching Assay

The bleaching by SO2 was studied using the pigments solutions at pH 2.0.12 To

these solutions were added different aliquots of an aqueous solution of sodium bisulfite

to achieve SO2 concentrations in the range between 0 and 200 ppm. Spectroscopic

absorbance curves were recorded for all of these solutions from 360 to 830 nm with a

1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz cell in a Shimadzu UV-1800

spectrophotometer (Japan).

Molar Extinction Coefficients and CIELAB Color Measurements

Molar extinction coefficients of the isolated 10-acetyl-piranoanthocyanins

according to the Beer-Lambert law were determined using solutions of the pigments in

the concentration range 0.01-0.16 mM at pH 1.0 and pH 3.6 buffers prepared

according to Robinson and Stokes.22 Spectroscopic absorbance curves were recorded

from 360 to 830 nm with a 1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz

cell in a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Japan). Molar extinction coefficients of

each pigment were calculated at two different wavelengths, namely, 520 nm and the

wavelength corresponding to the maximum absorbance of each pigment.

Spectroscopic curves of the 0.08 mM solutions of the pigments at pH 3.6 were used to

determine the color coordinates in the CIELAB color space using CIE D65/10º

illuminant/observer conditions.23 All of the color calculations were performed using a

computer program developed by our group.



Structure Elucidation by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

The assignment of the proton (1H) and carbon (13C) peaks was done by 1H-NMR,

1H-1H-COSY, 1H-1H-NOESY, 1H-13C-HMQC and 1H-13C-HMBC experiments in CD3OD and

DMSO-d6 containing different proportions of CF3COOD (from 2% to 30%). The NMR

experiments were carried out using a Varian Inova NMR spectrometer operating at

499.772 MHz for 1H and at 125.678 MHz for 13C. The spectrometer was equipped with

a gradient amplifier and a four-nucleus 5 mm 1H{15N-31P}PFG high-field indirect

detection probe. All 1D and 2D experiments (COSY, NOESY, HMQC, and HMBC) were

performed at 298K using standard pulse sequences from the Varian library.


Synthesis and Isolation of the 10-Acetyl-Pyranoanthocyanins

Derivatives Formed from the 3-Glucosides of Peonidin and Malvidin

Starting from the most common reaction conditions found in literature about the

synthesis of pyranoanthocyanins from their anthocyanin precursors,12 we assayed

different conditions in order to increase yield reaction and minimize anthocyanin

thermal degradation and also product degradation following extended reaction time.

We finally found that use of high anthocyanin concentration (2000 mg/L) with a great

excess of diacetyl (molar ratio 500:1 with regard to anthocyanins) during a relatively

short reaction time (18 h) led to the best results in aqueous solution at pH 2.5 and 35

ºC.

The used red grape skin extract contained two main non-acylated anthocyanins

in similar proportions, namely, the 3-glucosides of peonidin and malvidin (pn-3-glc and

mv-3-glc, respectively), together with little amounts of their respective 6”-p-

coumaroylated derivatives.



Figure V.4. Reaction mixture after 18 h showing the formation of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins and the remaining anthocyanin precursors. Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.

When the reaction was stopped, less than 10-19% of initial individual

anthocyanins still remained, and the expected 10-acetyl-pyranoanthocyanins were

observed but their yields were far from quantitative: on the basis of calibration curves

obtained for pn-3-glc and mv-3-glc and their isolated reaction products (the purity of

isolated compounds was checked by HPLC peaks detected at both 520 and 280 nm),

the calculated reaction yields for 10-acetyl-pyranopeonidin-3-glucoside (10-acet-pypn-

3-glc) and 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside (10-acet-pymv-3-glc) were 32% and

35%, respectively; in contrast, the estimated yields for their p-coumaroylated

derivatives, 10-acet-pypn-3-cmglc and 10-acet-pymv-3-cmglc, were higher (50% and

63%, respectively), thus suggesting the presence of p-coumaroyl residue could

facilitate the reaction or even stabilize the new pigments formed.

Likely explanations for the aforementioned low reaction yields comprised the well

known thermal degradation of anthocyanins and also the involvement of formed 10-

acetyl-pyranoanthocyanins in further reactions similar to those reported for other

vitisin-like pyranoanthocyanins.3-10

min0 5 10 15 20 25 30

0

25

50

75

100

125

150

175

mAU

pn

-3-g

lc

mv-3

-glc

pn

-3-c

mglc

mv-3

-cm

glc

10-a

cet-

pyp

n-3

-glc

10-a

cet-

pym

v-3

-glc

10-a

cet-

pyp

n-3

-cm

glc

10-a

cet-

pym

v-3

-cm

glc

200



The fractionation of the reaction mixture by countercurrent chromatography

(Fast Centrifugal Partition Chromatography, FCPC) allowed the separation of almost

pure 10-acet-pymv-3-glc that further was highly purified by semi-preparative HPLC.

However, in the case of 10-acet-pypn-3-glc, FCPC did not allow a proper fractionation,

but semi-preparative HPLC overcame this trouble and also highly pure compound was

obtained. Unfortunately, we had no success in obtaining any fraction enough enriched

in the p-coumaroylated derivatives of 10-acetyl-pyranoanthocyanins

Structure Elucidation of 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-Glucoside and 10-

Acetyl-Pyranomalvidin-3-Glucoside

The on-line UV-vis spectra registered for the new 10-acetyl-pyranoanthocyanins

showed remarkable differences with regards to other previously described structure-

related pyranoanthocyanins bearing a non-phenolic substituent at position C-10 (the

so-called vitisin-type pyranoanthocyanins). For instance, 10-carboxy-

pyranoanthocyanins (also known as A-type vitisins) show well defined visible

absorbance maxima around 505-509 and 511-514 nm for compounds derived from pn-

3-glc and mv-3-glc, respectively, and the analogue 10-methyl-pyranoanthocyanins

have visible absorbance maxima at even lower wavelengths values, around 475-480

and 480-482 nm.18 For most described pyranoanthocyanins, the visible absorbance

maxima are hypsochromically shifted with regard to their anthocyanin precursors and

their color is described as red-orange. However, the synthesized 10-acetyl-

pyranoanthocyanins showed a broad absorbance band with not-well defined

absorbance maxima at similar wavelength values with regards to their anthocyanin

precursors.



Figure V.5. HPLC on-line DAD UV-vis spectra of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins (C, D, G, H) and their respective anthocyanin precursors (A, B, E, F). Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-

(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.

For non-acylated 10-acetyl-pyranoanthocyanins, a broad absorbance band was

observed at 505-522 nm for 10-acet-pypn-3-glc (Figure 2A) and 515-532 nm for 10-

acet-pymv-3-glc (Figure 2B) being the visible absorbance maxima located at the same

wavelength values than their respective anthocyanin precursors. Similar results were

found for p-coumaroylated 10-acetyl-pyranoanthocyanins, with respective broad

visible absorbance bands in the ranges 510-530 nm (Figure 2C) and 520-542 nm

(Figure 2D) and maxima even slightly bathochromically shifted with regard to their

respective anthocyanin precursors. In addition, these p-coumaroylated derivatives

278

522

314

284532

312283

529

315

280

536

315

272

352

527

250

302

270

335380

nm250 300 350 400 450 500 550

Norm.

280

517

250

300 335360

10-acet-pypn-

3-glc

pn-3-glc

nm250 300 350 400 450 500 550

0

200

400

600

800

10-acet-pypn-3-cmglc

pn-3-cmglc

nm250 300 350 400 450 500 550

10-acet-pymv-

3-glc

mv-3-glc

528

nm250 300 350 400 450 500 550

10-acet-pymv-

3-cmglc

mv-3-cmglc

Norm.

Norm.Norm.

0

200

400

600

800

0

200

400

600

800

0

200

400

600

800

A) B)

C) D)



showed the expected absorbance band at 315 nm attributable to the p-coumaroyl

residue that was the most intense band.

Figure V. S1. MS and MS/MS (MS2) spectra of non-acylated (A and B) and

p-coumaroylated (C and D) 10-acetyl-pyranoanthocyanins. Abbreviations: pyrpn, pyranopeonidin; pyrmv; pyranomalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.

529.2+MS, 10-acet-pyrpn-3-glc

367.2+MS2 (529.5)

559.2+MS, 10-acet-pyrmv-3-glc

397.3+MS2 (559.5)

675.3+MS, 10-acet-pyrpn-3-cmglc

367.2+MS2 (675.6)

705.3+MS, 10-acet-pyrmv-3-cmglc

397.2+MS2 (705.7)

0

1

x107

Intens.

0

2

4

x106

0

2

4x107

0.5

1.0

x107

0

0.5

x107

0

2

4

x106

0

0.5

1.0

x107

0

0.5

1.0

x107

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

A)

B)

C)

D)

-162 (glc-H2O)

-308 (cmglc-H2O)

-162 (glc-H2O)

-308 (cmglc-H2O)



Mass spectrometry data were in agreement with the suggested structures of 10-

acetyl-pyranoanthocyanins. The MS spectra in positive ionization mode showed the

expected m/z signals attributable to the molecular ions of the flavylium cation form in

which these compounds predominantly might exist in the acidic medium used for their

elution.

Moreover, the MS/MS spectra (positive ionization mode) showed the expected

fragmentation pattern common to pyranoanthocyanins and anthocyanins, namely, the

breaking of the glucosidic bond at C-3 with a neutral loss of glucose (fragment loss of

162 amu) for non-acylated glucosides and a neutral loss of the entire 6”-p-coumaroyl-

glucose residue (fragment loss of 308 amu), without intermediate fragmentation of the

ester bond, in the case of p-coumaroylated glucosides.18 In both cases, the resulting

MS/MS fragment ions appeared at the expected m/z values of the aglycons 10-acetyl-

pyranopeonidin (m/z of 367) and 10-acetyl-pyranomalvidin (m/z of 397).

Definitive evidence supporting the expected structures of 10-acetyl-

pyanoanthocyanins was provided by the NMR spectra obtained for the two non-

acylated main reaction products that could be isolated in enough amount, 10-acet-

pypn-3-glc. (Table 1) and 10-acet-pymv-3-glc (table2).



Table V.1. NMR Spectroscopic Data Registered in CD3OD-CF3COOD (70:30,

v/v) for 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).



Table V. 2. NMR Spectroscopic Data Registered in (A) DMSO-d6-CF3COOD (80:20) and (B) CD3OD-CF3COOD (70:30) for 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).

The NMR spectra were registered in acidic medium to promote the almost quantitative

predominance of the flavylium cation form. The obtained NMR data were in



concordance with reported data for structurally related compounds, as the 10-carboxy-

pyranoanthocyanins.12,24

The evidence of formation of the new pyrano D-ring was supported by the

absence of any signal attributable to H-4 which was present in the anthocyanin

precursors. In addition, a new signal appeared at 7.90-7.97 ppm having an integral

value corresponding to 1 proton and which was not coupled with any other proton; this

new signal was assigned to H-9 of the new D-ring. The recording of the 1H-NMR

spectrum of 10-acet-pymv-3-glc in CF3COOD-DMSO-d6 (20:80) after 15 h of storage at

25 ºC gave additional supporting evidence to the suggested structure of

pyranoanthocyanin

Figure V. S2. 1H-NMR signals corresponding to the aromatic protons in rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acet-pyrmv-3-glc registered in DMSO-d6 with 20% CF3COOD: A) fresh solution; B) solution stored at

7.68.0 7.2

A)

B)

H-9

H-2’H-6’

H-8

H-6

H-9

H-2’H-6’

H-8 H-6

*

* *



25ºC during 15 hours (asterisks indicates signals of free aglycon released by acid hydrolysis of glucosidic bond during storage).

A decrease in the intensity of the signal attributable to H-9 of the new formed

D-ring was observed after this time. Hydrogen-deuterium (H-D) exchange in CD3OD

has been reported for anthocyanin positions H-6 and H-8, whereas for A-type vitisins

(10-carboxy-pyranoanthocyanins) the latter positions do not exchange but the position

H-9 does,25 with a half-life for the H-D exchange of 25 hours in the latter case. For 10-

acet-pymv-3-glc the signal intensity for H-9 decreased by 71% of its initial value after

15 h, thus suggesting that H-D exchange in this type of pyranoanthocyanins is faster

than those described for A-type vitisins. Moreover, the signal at 2.64-2.65 ppm was

not coupled with any other signal and integrated for 3 protons, thus being compatible

to the expected acetyl group at C-10 position of the new D-ring. The integral value of

signals attributable to methoxy groups, together with chemical shifts and signal

multiplicity (proton-proton coupling constants) assigned to protons of B-ring allowed

the confirmation of the corresponding peonidin- and malvidin substitution patterns.

Finally, the chemical shifts and, especially, the proton-proton coupling constants

values attributable to the glucosidic moiety were compatible, in both cases, with a

glucose linked in β anomeric configuration to the pyranoantocyanidin residue. The

linkage position of glucose to pyranoanthocyanidin was confirmed by the detection of

the corresponding long-distance 1H-13C correlation (HMBC experiment) between the

anomeric proton (H-1”) and the carbon at position 3 in C-ring. In summary, the two

main reaction products formed from the reaction of pn-3-glc and mv-3-glc with

diacetyl were 10- acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -glucoside (Figure 3A) and 10-acetyl-

pyranomalvidin-3-O- β -glucoside (Figure 3B), respectively.



Figure V. 6. Chemical structures of synthesized and isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-O- β -glucoside (A) and 10-acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -

glucoside (B) in their flavylium cation forms.

NMR Study of the Different Equilibrium Forms of 10-Acetyl-

Pyranoanthocyanins in Solution

It is well established that both anthocyanins and pyranoanthocyanins are

involved in several equilibria in solution. In fact, the use of NMR spectroscopy for

structure elucidation of pyranoanthocyanins works easier if only one of all possible

forms are present in solution at the moment of spectroscopic analysis. As usual in the

NMR analysis of these compounds, a strong acidic medium (trifluoroacetic acid in

proportions 2-10%), mainly in non-aqueous solvents (DMSO-d6 or CD3OD) allows that

only the flavylium cation form was occurring and, subsequently, most of reported NMR

data for anthocyanins and pyranoanthocyanins are those of their flavylium cation

forms.

However, the recording of NMR spectra of the isolated 10-acetyl-

pyranoanthocyanins using up to 10% CF3COOD in both CD3OD and DMSO-d6 always

resulted in a mixture of the expected signals attributable to the flavylium cation form

together with two set of signals occurring in similar proportions (Figure 4A) which were

tentatively assigned to neutral hemiacetal forms.

A) B)



Figure V.7.. 1H-NMR signals corresponding to the anomeric (H-1”) and aromatic protons in

rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins registered in different solvents: A) 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD with 2%

CF3COOD (asterisks indicate signals assigned to hemiacetal forms); B) 10-acet-pymv-3-glc in

DMSO-d6 with 20% CF3COOD; C) anomeric proton (H-1”) section of 10-acet-pypn-3-glc spectra in

CD3OD with variable proportions (5-30%) of CF3COOD. Abbreviations: f, flavylium cation form;

hm, hemiacetal form.

A) B)

7.58.0 7.58.0 4.64.84.64.8

H-1”H-1”

H-9

H-2’H-6’

H-8H-6

H-9

H-2’H-6’

H-8H-6

* * * **

*

* *

4.7 4.7

C)

*

H-1” f

H-1” hm-a

H-1”

hm-b5% CF3COOD

10% CF3COOD

20% CF3COOD

30% CF3COOD

ppm ppm

ppm

ppm

ppm

A) B)

7.58.0 7.58.0 4.64.84.64.8

H-1”H-1”

H-9

H-2’H-6’

H-8H-6

H-9

H-2’H-6’

H-8H-6

* * * **

*

* *

4.7 4.7

C)

*

H-1” f

H-1” hm-a

H-1”

hm-b5% CF3COOD

10% CF3COOD

20% CF3COOD

30% CF3COOD

ppm ppm

ppm

ppm

ppm



The mixture of different forms in equilibrium was quite evident with regard to

the signal attributable to the anomeric proton (H-1”) of the glucose residue, which

appeared as a set of three signals (three doublets with identical constant coupling):

the most intense was assigned to the flavylium cation form, whereas the other two of

similar intensity were assigned to the two possible epimeric isomers of the resulting

hemiacetal forms following hydration of flavylium cation form.26 One proof supporting

that we were dealing with a mixture of different forms in equilibrium was given by the

increase of the anomeric proton signal of flavylium cation form (H-1” f) and the

parallel decrease of both signals of epimeric hemiacetal forms (H-1” hm-a and hm-b)

when the percentage of CF3COOD was increased (Figure 4C). The set of signals

attributable to hemiacetal forms was still present as traces in the NMR spectrum

recorded in CF3COOD-CD3OD (30:70) but they totally disappeared using CF3COOD-

DMSO-d6 (20:80) (Figure 4B). Unfortunately, the use of CF3COOD-DMSO-d6 (20:80)

resulted in some extent of hydrolysis of the glucosidic bond after several hours (Figure

S2), as confirmed by chromatographic analysis, thus making unable the use of this

solvent for recording of low sensitive, time-consuming, 13C-NMR spectra.

Additional evidence supporting the existence of the aforementioned suggested

equilibrium was achieved by 2D NOESY NMR experiment performed with 10-acet-

pypn-3-glc in CF3COOD-CD3OD (5:95). Besides negative NOE cross-peaks, we

observed additional positive cross-peaks that are caused by chemical exchange

between the two hemiacetal forms and the same flavylium cation form of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins.26 Due to the similar values of chemical shifts attributable to the

anomeric proton signals for both flavylium and hemiacetal forms (Figure 4C), it was

not possible to clearly observe the expected cross-peaks because they were almost

indistinguishable from the correlation diagonal. Fortunately, clear positive cross-peaks

could be detected for the signals assigned to the different forms of 10-acetyl protons.



Table V. 3. Chemical Shifts of Nuclei (1H and 13C) Showing the Greatest

Differences with Regard to Compound 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O--Glucoside

was in the Flavylium Cation (f) or Epimeric Hemiacetal (hm-a and hm-b) Forms. Spectrum Registered in CD3OD-CF3COOD (98:2).

As also found for anthocyanins,26 the chemical exchange was not observed

between the two epimeric hemiacetal forms.

The sample of 10-acet-pymv-3-glc used for registration of NMR spectra in

CD3OD with increasing proportions of CF3COOD showed a new chromatographic peak,

eluting 5.92 min later, following several hours of storage after the recording of NMR

spectra



Figure V.8.. Chromatogram (detection at 520 nm) corresponding to the sample of 10-acet-pymv-3-glc just after recording the 1H-NMR in CD3OD with 30% of CF3COOD. It is also shown the on-line UV-vis spectra of 10-acet-pymv-3-glc (17.750 min) and newly formed compound (23.667 min), as well as the suggested

chemical structure of 10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc for the latter.

However, in this case, the characteristics of UV-vis spectrum (shape and value of

maximum absorbance wavelength) were closer to those described for A- and B-type

vitisins and 10-methyl-pymv-3-glc,18 showing a maximum at 498 nm. In addition, this

peak disappeared after drying of the sample and re-dissolution in HCl 0.1 N in

methanol. The MS spectra of this new compound showed a similar fragmentation

pattern than 10-acet-pymv-3-glc, but all signals were increased in 46 amu: molecular

ion at m/z 605 that originated a fragment ion at m/z 443 after loss of a neutral

glucose residue (162 amu). These results suggested that the new formed compound

was likely the product of the addition of two molecules of methanol to the carbonyl of

the 10-acetyl substituent of 10-acet-pymv-3-glc, that is, the new compound should be

10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc. This kind of derivative was also observed

when 10-acet-pypn-3-glc was kept in methanolic solution with 30% CF3COOH for 48

hours at room temperature. A minor new chromatographic peak appeared eluting 5.93

min later, showing a visible absorbance maximum at 491 nm, and having a molecular

ion at m/z 575 that further fragmented resulting in a product ion at m/z 413 (again

the same m/z values for molecular and fragment ions than 10-acet-pypn-3-glc, but

both increased in 46 amu). The formation of these dimethoxy derivatives suggested

the high reactivity of the carbonyl of the 10-acetyl substituent of 10-acetyl-

min0 5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

100

200

300

400

500

600 17.7

50

23.6

67

nm250 300 350 400 450 500 550

Norm.

0

100

200

300

400

500

600 23.667 min

17.750 min498 530



pyranoanthocyanins. This question will be discussed later with regard to the results of

stability of these pigments towards SO2 bleaching.

Looking back to the suggested occurrence of hemiacetal forms of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins detected in the 1H-NMR spectra of these compounds, it is

necessary to remark that two possible positions are available for hydration of the

flavylium cation form, namely, positions C-2 and C-10 .

Figure V. S3. Resonance forms of 10-acet-pyrmv-3-glc involving oxygen

atoms of rings C and D, and suggested formation of hemiacetals of this compound at positions C-2 and C-10.



Previous studies have demonstrated that the presence of new D-ring in

pyranoanthocyanins increases their stability towards nucleophilic attack of water

(resulting in the formation of hemiacetal forms) or bisulfite ion, both resulting in color

loss (bleaching), in comparison to their anthocyanin precursors.27-29 Moreover, several

studies had reported that pyranoanthocyanins were only involved in proton transfer

equilibria and the formation of hemiacetal forms had been not observed.14,15 However,

vitisin A has been suggested to form the hemiacetal forms at both C-2 and C-10

position;13 more recently, a study reported that 10-methyl-pyranomalvidin-3-glucoside

in weak acidic (pH 5) aqueous medium could give rise to a minor hemiacetal form

together with the flavylium cation and neutral quinoidal base forms, but the position of

nucleophilic addition was not specified.17

An in-depth analysis of NMR spectra of 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD-CF3COOD

(98:2) (the less acidic medium assayed, thus favoring the formation of hemiacetal

forms) provided enough evidence to suggest that the hemiacetal forms were formed

by nucleophilic attack of water to C-10, thus originating a mixture of two epimeric

isomers in similar proportions. The key was to determine whether, as a result of

hemiacetal formation, the chemical shift of the possibly involved carbon (C-2 or C-10)

was affected. NMR studies dealing with anthocyanins have determined that hemiacetal

formation is located in C-2, because an upfield shift (lower value of chemical shift) of

61 ppm was observed for this nucleus as compared to its anthocyanin precursor.26 The

long-distance 1H-13C correlation experiments allowed to determine the chemical shifts

of the nuclei involved in the possible location of hydration position for both the

flavylium cation and the two epimeric hemiacetal forms.



Figure V. S4. Long-distance 1H-13C correlations (HMBC experiment)

detected for the hemiacetalic form of 10-acet-pyrmv-3-glc involving nuclei susceptible to hemiacetal formation (C-2 and C-10).

(Table 3). Chemical shift values of carbon nuclei of B-ring (C-1´; C-3´and 5´; C-

4´) and C-2 assigned to hemiacetal forms differed little with regard to those

corresponding to flavylium cation form. However, the chemical shift of C-10 assigned

to hemiacetal forms was upfield shifted by 60.7 ppm with regard to the value for its

flavylium cation form. In addition, other nuclei showed lower upfield shifts (carbonyl

carbon of acetyl group) or even did not change their chemical shift values in their

hemiacetal forms as compared to their corresponding flavylium cation form. The

aforementioned results strongly evidenced that hydration position of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins is located at C-10.



Color Properties of 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-Glucoside and 10-

Acetyl-Pyranomalvidin-3-Glucoside

Anthocyanins are unstable compounds involved in several acidic-basic equilibria

in aqueous solution and also suffer nucleophilic attack to positions C-2 and C-4 of its

flavylium cation form.30 With regard to acidic-basic equilibria, the red-colored flavylium

cation form predominates in strong acidic medium. As pH increases, this cationic form

losses protons to form, successively, the blue-colored neutral and anionic quinoidal

bases. Pyranoanthocyanins are also involved in those aforementioned acidic-basic

equilibria.5,11-17 With regard to nucleophilic attack, position C-2 is the preferred for

water as nucleophilic agent whereas C-4 is the only available position for bisulfite

because the steric hindrance of position C-2.31 In both cases, the formed adduct

breaks the aromaticity of C-ring and the resulting compound is colorless (bleaching

effect). The ability of bisulfite bleaching is apparently lost by pyranoanthocyanins

because the position C-4 is involved in the formation of the new D-ring and is not

available for nucleophilic attack. Moreover, the nucleophilic attack of water to position

C-2 of pyranoanthocyanins is notably decreased. For those reasons,

pyranoanthocyanins are described as more stable pigments with regard to their

anthocyanin precursors and it is usual to evaluate how much more stable they are.

The visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins were modified when

registered in aqueous solution in a pH range 1-13 (Figure 6) as it has been also

reported for analogous compounds like vitisin A.13 At strong acidic media (pH < 4.0)

the absorbance maximum were in the range.



Figure V. 9. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of pH: A) 10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

360 410 460 510 560 610 660 710 760 810

Ab

sorb

ance

l (nm)

pH 1

pH 2

pH 3

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

pH 10

pH 11

pH 12

pH 13

A) 10-acet-pymv-3-glc

505

572

604

363

520

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

360 410 460 510 560 610 660 710 760 810

Abs

orba

nce

l (nm)

pH 1

pH 2

pH 3

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

pH 10

pH 11

pH 12

pH 13

B) 10-acet-pypn-3-glc

500

565

576

360

510

556



500-505 nm, with the highest value corresponding to pyranomalvidin derivative,

in agreement to previous findings related to the B-ring substitution pattern of vitisin-

type pyranoanthocyanins.18 At those very acidic pH values the flavylium cation form

must predominate but a broadening of the visible absorbance band, together with a

bathochromic shift and a parallel decrease in the absorbance maximum intensity, was

observed following pH increase.

At pH around 4.0 the visible spectra showed a broad absorbance band with

maximum around 510-520 nm. This behavior could be likely explained as the result of

two concurrent processes. On one hand, the formation of hemiacetal forms (colorless

form) that causes decrease in red color intensity as evidenced the NMR data. On the

other hand, the beginning of the deprotonation of the flavylium cation form to give rise

to the neutral quinoidal base (blue-colored form) which was increasing its proportion

as pH value increased up to reach a purple-blue color in weak basic media (around

8.0-9.0), with absorbance maximum at 604 nm for 10-acet-pymv-3-glc (Figure 6A)

and 576 nm for 10-acet-pypn-3-glc (Figure 6B).

At strong basic conditions (pH 10.0-12.0) the neutral quinoidal bases should be

subsequently deprotonated to form the anionic quinoidal base and this process was

accompanied by a hypsochromic shift of the visible absorbance maximum, at around

560 nm. Finally, at pH 13.0 the visible absorbance maximum changed to 360 nm and

the solution was light yellow.

The above mentioned results suggest that at usual red wine pH values (3.5-4.0)

the 10-acetyl-pyranoanthocyanins do not exist exclusively as flavylium cation forms,

being remarkable the contributions of hemiacetal and neutral quinoidal base forms. A

similar behavior has been reported for the analogous pyranoanthocyanin called vitisin

A (10-carboxy-pyranomalvidin-3-glucoside) that at wine pH (3.2-3.8) is in a complex

mixture of neutral and anionic, hydrated and non-hydrated states with the principal

species was the orange quinoidal base.13 Thus, the calculation of molar extinction

coefficients of 10-acetyl-pyranoanthocyanins suggested that these pigments show

similar color hue and intensity than their anthocyanin precursors in real wine

conditions (Table 4). 10-Acetyl-pyranoanthocyanins are red pigments with lower

coloration capacity than anthocyanins at strong acid media (pH 1.0), showing molar

extinction coefficient at 520 nm of 9700 for 10-acet-pymv-3-glc vs. 28100, the value

obtained for mv-3-glc which is also in agreement with literature data.11 However, at



red wine pH conditions (reference pH value of 3.6) both kinds of pigment showed quite

similar coloration capacity (molar extinction coefficients of 7800 and 10600,

respectively), but the decrease in coloration capacity suffered by mv-3-glc (from pH

1.0 to 3.6) was higher than that of 10-acet-pymv-3-glc (62% and 20%, respectively;

34% in the case of 10-acet-pypn-3-glc). This decrease is likely owing to the formation

of hemiacetal forms, but 10-acetyl-pyranoanthocyanins were more resistant to this

process than their anthocyanin precursors. Moreover, the CIELAB color parameters

calculated at pH 3.6 are a reflection of the aforementioned results.

Table V.4.. CIELAB Color Parameters Measured at pH 3.6 for 0.08 mM Pigment Solutions.

At equal molar concentrations, 10-acet-pymv-3-glc shows color characteristics

very close to those of mv-3-glc, the only difference being a slight lower contribution of

the red component (a*) of the former pigment with parallel lower chroma value (C*).

Finally, the B-ring substitution pattern affected the color characteristics of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins, as also found for anthocyanins and other vitisin-type

pyranoanthocyanins:18 on one hand, a bathochromic shift of 8 nm is observed in B-ring

tri-substituted compounds (10-acet-pymv-3-glc) with regard to di-substituted ones

(10-acet-pypn-3-glc), which is independent of the pH value; on the other hand, the

molar extinction coefficient were notably higher for tri-substituted compound (35%

more at pH 1.0; 65% more at pH 3.6). These differences also reflected on the CIELAB

color parameters shown by 10-acet-pypn-3-glc with regard to 10-acet-pymv-3-glc

measured at the same concentration and pH 3.6 (Table 5): its color was less intense



(higher value of L*) with lower contributions of both red (a*) and blue (b*) color

components.

Figure V. S5. Color shown by aqueous solutions at pH 3.6 and concentration of 0.08 mM of: A) 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside; B) 10-acetyl-

pyranopeonidin-3-glucoside.

The behavior of 10-acetyl-pyranoanthocyanins toward SO2 bleaching gave

unexpected results compared with previous studies dealing with other

pyranoanthocyanins .

Firstly, the samples did not bleach after SO2 addition and a hypsochromic shift of

the color hue was observed to red-orange nuances. Moreover, the color intensity

increased in parallel to concentrations of added SO2. The wavelength of absorbance

maximum after addition of SO2 (491 nm for 10-acet-pymv-3-glc and 487 nm for 10-

acet-pypn-3-glc) and the shape of spectra resembled those of vitisin-type

pyranoanthocyanins, especially those of 10-methyl-pyranoanthocyanins.18

A) B)



Figure V.10.. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of the concentration of added SO2 at pH 2.0: A)

10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

360 460 560 660 760

Abso

rban

cia

l (nm)

0 ppm SO2

50 ppm SO2

100 ppm SO2

150 ppm SO2

200 ppm SO2

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

360 410 460 510 560 610 660 710 760 810

Abso

rban

ce

l (nm)

0 ppm SO2

50 ppm SO2

100 ppm SO2

150 ppm SO2

200 ppm SO2

504

491

499

487

A) 10-acet-pymv-3-glc

B) 10-acet-pypn-3-glc



Figure V. 11. Reaction product of nucleophilic attack of SO2 to 10-acet-pymv-3-glc: A) suggested structure; B) mass spectra (MS, MS2, and MS3).

NMR data have supported that nucleophilic attack of water was in C-10 position

of 10-acetyl-pyranoanthocyanins, but in the case of bisulfite ion (the ionic species

formed by SO2 in acidic aqueous media) it is expected that steric hinderance of the

acetyl group would prevent the formation of an addition compound. Moreover, if

bisulfite attacks happened in C-10, a decrease in color intensity must be observed as

in the case of formation of hemiacetal form. Therefore, bisulfite has to attack another

electrophilic position of the molecule, as the carbonyl of the 10-acetyl substituent.

397.2

559.3

577.2 641.2

663.1

641.2

+MS

559.2 +MS2(641.7)

397.2 +MS3(641.0->559.0)

0

1

2

3

4

5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0

1

2

3

350 400 450 500 550 600 650 m/z

-162 (-glc-H2O)

-82 (-H2SO3)

397.2

x105

Intens.

x105

x104

A)

B)



The resulting adduct (Figure 8A) could eliminate the conjugation of acetyl group

with D-ring and the new substituent at C-10 could resemble, in terms of visible

absorption spectrum, the structural features of 10-methyl-pyranoanthocyanins. This

result is in the same way of the finding reported in the latter section dealing with the

formation of dimethoxy derivatives of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in acidic

methanolic solutions. Both results suggest a high reactivity of the 10-acetyl group of

this kind of pyranoanthocyanins.

The HPLC chromatograms of samples of 10-acetyl-pyranoanthocyanins treated

with SO2 did not show any additional peak attributable to the suggested adduct with

bisulfite. However, direct injection of reaction mixture in the MS detector allowed the

detection of the expected molecular ion for the suggested adduct (Figure 8B; similar

molecular ion at m/z 611 was observed for the reaction mixture of 10-acetyl-pypn-3-

glc). Moreover, the MS2 spectra showed a fragment ion assignable to 10- acet-pymv-

3-glc by loss of a molecule of H2SO3, and the MS3 spectra give rise to the subsequent

aglycon 10-acet-pymv by loss of the glucose unit. A similar behavior was observed for

the MS2 and MS3 spectra corresponding to the bisulfite adduct formed from 10-acet-

3pypn-3-glc. The aforementioned result suggest that bisulfite adduct is very labile and

it is likely the reason why it was not observed under chromatographic conditions used.

In conclusion, this study describes the synthesis, isolation, structure elucidation

and color properties of a new type of vitisin-like pyranoanthocyanins derived from

analogous grape anthocyanins and diacetyl, the so-called 10-acetyl-

pyranoanthocyanins, which were previously detected in red wines. These pigments

exhibit unusual properties like forming colored adducts with bisulfite. Significant

proportions of these pigments seem to exist on their hemiacetal and quinoidal base

equilibrium forms at weakly acidic pH. At wine pH, the color exhibited by these new

pigments is described as red-purple, in contrast to the most common red-orange color

reported for other vitisin-like pyranoanthocyanins. It would be of interest further

investigation about the factors influencing the formation of 10-acetyl-

pyranoanthocyanins in red wine: extent of diacetyl production by microorganisms

involved in alcoholic and malolactic fermentations; competing reactions of anthocyanin

precursors; and their evolution after formation as suggested by both the low reaction

yields observed in their synthesis and the reported reactivity for other similar vitisin-

like pyranoanthocyanins.



REFERENCES

1. Monagas, M.; Bartolomé, B. Anthocyanins and anthocyanin-derived

compounds. In Wine Chemistry and Biochemistry; Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C.,

Eds.; Springer Science and Business Media: New York, NY, 2009; pp 439-462.

2. Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P. Pyranoanthocyanins: An overview

on structures, occurrence and pathways of formation. Trends Food Sci. Technol. 2007,

18, 526-534.

3. Mateus, N.; Silva, A. M. S.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-Buelga, C.; de

Freitas, V. A new class of blue anthocyanin-derived pigments isolated from red wines.

J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1919-1923.

4. Mateus, N.; Oliveira, J.; Pissarra, J.; González-Paramás, A.M.; Rivas-Gonzalo,

J; Santos-Buelga, C.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. A new vinylpyranoanthocyanin

pigment occurring in aged red wine. Food Chem. 2006, 97, 689–695.

5. Oliveira, J.; de Freitas, V.; Silva, A. M. S.; Mateus, N. Reaction between

hydroxycinnamic acids and anthocyanin-pyruvic acid adducts yielding new portisins. J.

Agric. Food Chem. 2007, 55, 6349-6356.

6. Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva, A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de

Freitas, V. Pyranoanthocyanin Dimers: A New Family of Turquoise Blue Anthocyanin-

Derived Pigments Found in Port Wine. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5154–5159.

7. Oliveira, J.; Mateus, N.; de Freitas, V. Synthesis of a new bluish pigment from

the reaction of a methylpyranoanthocyanin with sinapaldehyde. Tetrahedron Lett.

2011, 52, 1996-2000.

8. Oliveira, J.; Mateus, N.; Rodriguez-Borges, J. E.; Cabrita, E. J.; Silva, A. M.

S.; de Freitas, V. Synthesis of a new pyranoanthocyanin dimer linked through a

methyl-methine bridge. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 2957-2960.

9. He, J.; Oliveira, J; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxovitisins: A

New Class of Neutral Pyranone-anthocyanin Derivatives in Red Wines. J. Agric. Food

Chem. 2010, 58, 8814–8819.



10. He, J.; Silva, A. M. S.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oxidative formation and

structural characterisation of new -pyranone (lactone) compounds of non-oxonium

nature originated from fruit anthocyanins. Food Chem. 2011, 127, 984-992.

11. Håkansson, A. E.; Pardon, K.; Hayasaka, Y.; de Saa, M.; Herderich, M.

Structures and colour properties of new red wine pigments. Tetrahedron Lett. 2003,

44, 4887-4891.

12. Oliveira, J.; Fernandes, V.; Miranada, C.; Santos-Buelga, C.; Silva, A.; de

Freitas, V.; Mateus, N. Color properties of four cyanidin-pyruvic acid adducts. J. Agric.

Food Chem. 2006, 54, 6894-6903.

13. Asenstorfer, R. E.; Jones, G. P. Charge equilibria and pK values of 5-

carboxypyranomalvidin-3-glucoside (vitisin A) by electrophoresis and absorption

spectroscopy. Tetrahedron 2007, 63, 4788-4792.

14. Oliveira, J.; Mateus, N.; Silva, A. M. S.; de Freitas, V. Equilibrium Forms of

Vitisin B Pigments in an Aqueous System Studied by NMR and Visible Spectroscopy. J.

Phys. Chem. B 2009, 113, 11352-11358.

15. Cruz, L.; Petrov, V.; Teixeira, N.; Mateus, N.; Pina, F.; de Freitas, V.

Establishment of the Chemical Equilibria of Different Types of Pyranoanthocyanins in

Aqueous Solutions: Evidence for the Formation of Aggregation in Pyranomalvidin-3-O-

coumaroylglucoside-(+)-catechin. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 13232-13240.

16. He, J.; Carvalho, A, R. F.; Mateus, N.; de Freitas, V. Spectral Features and

Stability of Oligomeric Pyranoanthocyanin-flavanol Pigments Isolated from Red Wines.

J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 9249-9258.

17. Oliveira, J.; Petrov, V.; Parola, A. J.; Pina, F.; Azevedo, J.; Teixeira, N.;

Brás, N. F.; Fernandes, P. A.; Mateus, N.; Ramos, F. J.; de Freitas, V. Chemical

behavior of methylpyranomalvidin-3-O-glucoside in aqueous solution studied by NMR

and UV-vis spectroscopy. J. Phys. Chem. B 2011, 115, 1538-1545.

18. Blanco-Vega, D.; López-Bellido, F. J.; Alía-Robledo, J. M.; Hermosín-

Gutiérrez, I. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of Pyranoanthocyanins Pigments

Formed in Model Wine. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 9523-9531.



19. Castillo-Muñoz N., Fernández-González M., Gómez-Alonso S., García-Romero

E., Hermosín-Gutiérrez I. Red-Color Related Phenolic Composition of Garnacha

Tintorera (Vitis vinifera L.) Grapes and Red Wines. J. Agric. Food Chem. 2009, 57,

7883-7891.

20. Renault, J. H.; Thépenier, P.; Zèches-Hanrot, M.; Le Men-Olivier, L.; Durand,

A.; Foucault, A.; Margraff, R. Preparative separation of anthocyanins by gradient

elution centrifugal partition chromatography. J. Chromatogr. A 1997, 763, 345-352.

21. International Organization of Vine and Wine. HPLC-Determination of nine

major anthocyanins in red and rosé wines. Resolution OENO 22/2003.

22. Robinson, R. A.; Stokes, R. H. Electrolyte Solutions, the Measurement and

Interpretation of Conductance, Chemical Potential, and Diffusion in Solutions of Simple

Electrolytes, 2nd ed.; Butterworths: London, U.K., 1968.

23. Determination of chromatic characteristics according to CIELab. International

Organization of Vine and Wine, Paris. Resolution Oeno 1/2006.

24. Jordheim, M.; Fossen, T.; Andersen, O.M. Preparative isolation and NMR

characterization of carboxypyranoanthocyanins. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 3572-

3577.

25. Jordheim, M.; Fossen, T.; Songstadt, J. Andersen, Ø. Reactivity of

Anthocyanins and Pyranoanthocyanins. Studies on Aromatic Hydrogen–Deuterium

Exchange Reactions in Methanol. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8261-8268.

26. Jordheim, M.; Fossen, T.; Andersen, Ø. Characterization of Hemiacetal Forms

of Anthocyanidin 3-O- -Glycopyranosides. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9340-

9346.

27. Sarni-Manchado, P.; Fulcrand, H.; Souquet, J. M.; Cheynier, V.; Moutounet,

M. Stability and color of unreported wine anthocyanin-derived pigments. J. Food Sci.

1996, 61, 938–941.

28. Bakker, J.; Timberlake, C. F. Isolation, identification, and characterization of

new color-stable anthocyanins occurring in some red wines. J. Agric. Food Chem.

1997, 45, 35–43.



29. Fulcrand, H.; Benabdeljalil, C.; Rigaud, J.; Cheynier, V.; Moutounet, M. A

new class of wine pigments generated by reaction between pyruvic acid and grape

anthocyanins. Phytochem. 1998, 47, 1401–1407.

30. de Freitas, V.; Mateus, N. Chemical transformations of anthocyanins yielding

a variety of colours (Review). Environ. Chem. Lett. 2006, 4, 175-183.

31. Berké, B.; Chèze, C.; Vercauteren, J.; Deffieux, G. Bisulfite addition to

anthocyanins: revisited structures of colourless adducts. Tetrahedron Lett. 1998, 32,

5771-5774.

Funding

Authors Sergio Gómez-Alonso and M. Victoria Gómez thank the Fondo Social

Europeo and Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha for co-founding of their

contracts through the INCRECYT program.

DISCUSIÓN

GENERAL

Resultados y Discusión. Capítulo VI.


DISCUSIÓN GENERAL

No cabe duda de que el color de los vinos tintos y rosados es una característica

que influye de manera primordial en la calidad de estos vinos. El color suele ser la

primera característica sensorial que los consumidores perciben de un vino y puede

condicionar en gran medida la valoración global que se le otorgue. En el caso de

consumidores no expertos, el color puede meramente conducir a tomar decisiones en

el ámbito de las preferencias personales de cada individuo. En cambio, para un

consumidor experimentado el color del vino constituye una herramienta

complementaria que le ayuda a evaluar la calidad de un vino, pudiéndole ofrecer

información de interés sobre las variedades de uvas empleadas, el tipo de elaboración

utilizado o la edad del vino, ayudándole así a interpretar de forma más certera el resto

de sensaciones percibidas y, en suma, a modular la valoración global de los vinos de

una forma más justificada.

Los vinos rosados y tintos deben su color rojo, en sus diversas variantes de

intensidad y tonalidad, a la presencia de unos pigmentos de naturaleza fenólica. Los

pigmentos rojos de los vinos proceden en primera instancia de la materia prima, la

uva, y son denominados antocianos. Durante la elaboración de los vinos, los

antocianos de la uva son transferidos por maceración al mosto-vino en fermentación.

Los antocianos de la uva son sustancias poco estables, bastante reactivas, y desde los

primeros momentos de la vinificación comienza su transformación en pigmentos

derivados antociánicos. El estudio de las nuevas estructuras formadas y del

comportamiento de estos pigmentos en relación a su estabilidad y evolución es objeto

de estudio desde hace bastantes décadas.

Una de las primeras hipótesis formuladas en relación a la evolución y

estabilización del color del vino tinto durante el envejecimiento de éstos fue la

formación de pigmentos antociánicos poliméricos por reacción de los antocianos de las

uvas con los taninos también procedentes de éstas. Esta hipótesis ha sido comprobada

experimentalmente en sistemas modelo y en los propios vinos y explica algunos de las

propiedades del color del vino tinto, como la precipitación de materia colorante y la

resistencia a la decoloración por sulfuroso y a cambios de color por variaciones de pH.

No obstante, en los últimos 20 años se ha sumado a esta hipótesis otra que la



complementa, que considera la formación de pigmentos antociánicos de bajo peso

molecular, con formación de unas nuevas estructuras denominadas piranoantocianos

ya que se forma un nuevo anillo piránico fusionado a la estructura del antociano. A

pesar de la aparente unicidad estructural, en realidad existe una gran diversidad de

piranoantocianos debido a que existen muchas variantes estructurales respecto a la

porción molecular unida al nuevo anillo de pirano formado, incluso hay

piranoantocianos que pueden llegar a adquirir naturaleza casi polimérica, como puede

ser el caso de los 10-flavanol-piranoantocianos.

Son muchos los estudios que se han realizado para identificar las estructuras en

las que pueden encontrarse los piranoantocianos. En los primeros años dedicados al

estudio de este tipo de compuesto se ponía en duda la relevancia de este tipo de

pigmentos en el color del vino tinto, incluso en el caso de vinos tintos envejecidos que

ya habían perdido mucho color por precipitación de pigmentos poliméricos (derivados

de la reacción entre antocianos y taninos). El principal argumento esgrimido era la

baja concentración en que se encontraban los pocos casos entonces conocidos de

estos nuevos pigmentos, normalmente en el rango de unos pocos mg/L, siendo los

mayores valores las pocas decenas de mg/L de vitisina A que se podían encontrar en

vinos tintos de Oporto, cuyo especial procedimiento de elaboración (adición de alcohol

vínico a un mosto tinto a mitad de la fermentación alcohólica) favorecía la formación

de estos derivados. El tiempo ha demostrado que la gama de piranoantocianos es muy

amplia y que, recurriendo al famoso dicho de “muchos pocos hacen un mucho”,

aunque cada uno de ellos se encuentra realmente en cantidades pequeñas, del orden

de algunos mg/L, en conjunto pueden contribuir con cantidades relevantes al color del

vino tinto. No obstante, no se han realizado estudios sistemáticos sobre la composición

en piranoantocianos de vinos tintos, y menos aún estudiado es el contenido de estos

pigmentos en vinos rosados. Esta Tesis ha pretendido, entre sus objetivos, rellenar

este hueco de datos realizando un estudio lo más detallado posible de los

piranoantocianos existentes en un número amplio de muestras de vinos.

Los vinos rosados suelen elaborarse con una corta maceración de las partes de

la uva en un medio que apenas contiene alcohol, por lo que en poco tiempo

(normalmente no excede de las 24 horas) se consigue extraer una pequeña fracción

de los antocianos del hollejo (bastante solubles en medio acuoso de acidez media,

como es el mosto con incipiente fermentación) pero apenas se extraen taninos de los



hollejos y, aún menos, de las pepitas. Por esta razón los vinos rosados tienen un color

rojo menos intenso que los tintos y las sensaciones de astringencia (relacionada con la

presencia de taninos) son prácticamente inexistentes. No obstante, es muy conocida la

evolución del color del vino rosado, con un viraje hacia tonos anaranjados en un

tiempo de envejecimiento relativamente corto. Podría pensarse que en los vinos

rosados la formación de pigmentos poliméricos es poco probable, mientras que sí se

podrían formar pigmentos del tipo piranoantociano, sobre todo derivados de la

reacción de los antocianos con ácidos hidroxicinámicos, un argumento que gana peso

cuando se considera que los piranoantocianos muestran coloraciones más anaranjadas

que los antocianos de partida (coloraciones rojas o con tonalidades ligeramente

púrpuras).

En el Capítulo I se describe el estudio de las características cromáticas y de la

composición en antocianos y piranoantocianos de una muestra de 130 vinos rosados

de 1 y 2 años de edad, elaborados con diversas variedades de uva. Los resultados han

mostrado que en la mayoría de los vinos rosados analizados predominan la

componente roja del color (a*), determinando en gran medida los valores tanto de

cromaticidad (C*) como de ángulo de tono (h*). Los vinos rosados presentaban

coloraciones que, en la mayoría de los casos, podían describirse como rojas con ligeras

tonalidades púrpuras y apenas tonalidades amarillentas (es decir, con una escasa

contribución de la componente amarilla del color, b*).

Las características cromáticas de los vinos rosados pudieron relacionarse con el

hecho de que la mayor parte de los pigmentos presentes en los vinos rosados eran los

antocianos originales de las uvas, cualquiera que fuera la variedad de uva empleada,

estimándose que la proporción de estos antocianos constituía, en término medio, un

76 % del conjunto de antocianos presentes (contenido medio de unos 37 mg/L,

expresado como malvidina 3-glucósido), siendo el contenido en antocianos

decolorables por sulfuroso (asimilables como pigmentos poliméricos o, al menos, como

pigmentos distintos de los antocianos nativos de la uva) muy bajo, con un promedio

del 16 %. De hecho, el antociano nativo de la uva predominante en los vinos rosados

fue malvidina 3-glucósido, que es el antociano habitualmente mayoritario en uvas Vitis

vinifera, hasta el punto que no pudieron diferenciarse de forma satisfactoria los vinos

rosados elaborados con distintas variedades de uva en base a sus perfiles de

antocianos, algo que sí suele ser posible en vinos tintos con hasta 3-5 años de edad. Al



parecer, la predominancia de malvidina 3-glucósido en las uvas sugiere que puede ser

un factor determinante que hace prevalecer su transferencia al vino frente a los otros

antocianos debido al corto tiempo de maceración empleado en la elaboración de vinos

rosados (se podría hablar de una especie de “control cinético” de la transferencia de

antocianos durante la vinificación).

Entre los antocianos no decolorables por el sulfuroso se encuentran los

piranoantocianos. En los vinos rosados analizados se encontró que la vitisina A

(formada por reacción de los antocianos con el ácido pirúvico producido por la

levaduras durante la fermentación) fue el compuesto de este tipo predominante. En

cambio, la formación de hidroxifenil-piranoantocianos, por reacción de ácidos

hidroxicinámicos con antocianos, fue escasa. Si bien las levaduras podrían activar la

formación de piranoantocianos por transformación de algunos derivados

hidroxicinámicos de la uva en 4-vinilfenoles (la llamada vía enzimática de formación),

ésta vía sólo es posible en el caso de los derivados de los ácidos p-cumárico y ferúlico,

pero no con los derivados mayoritarios que son los del ácido cafeico. Hay una segunda

vía de formación de este tipo de piranoantocianos, que supone la liberación de ácidos

hidroxicinámicos por hidrólisis de sus precursores de la uva, y su posterior reacción

directa con los antocianos (la denominada vía química de formación), que es posible

para todos los derivados hidroxicinámicos; no obstante, los ácidos hidroxicinámicos

liberados parece que mostraron mayor tendencia a formar ésteres etílicos, quizá por la

baja concentración en los vinos rosados del otro reactivo necesario, los antocianos.

Por último, las relaciones anteriormente encontradas entre las características

cromáticas de los vinos rosados y su composición en pigmentos antociánicos fueron

corroboradas al comparar vinos de 1 y 2 años de edad. Los vinos rosados más

envejecidos mostraron coloraciones rojas menos intensas y con tonalidades más

anaranjadas, así como un menor contenido en antocianos totales, con una mayor

contribución de los antocianos no decolorables, relacionados estos últimos con

mayores concentraciones de hidroxifenil-piranoantocianos.

El paso siguiente fue estudiar la composición en pigmentos antociánicos de bajo

peso molecular (incluidos los antocianos nativos de la uva) de vinos tintos. En el

Capítulo II se recogen los resultados obtenidos para una amplia muestra de 286

vinos tintos comerciales. Uno de los principales problemas al abordar el estudio de una



gama tan amplia y nutrida de pigmentos del vino tinto es la capacidad de separación e

identificación de todos y cada uno de estos compuestos. Se ha propuesto con

anterioridad la separación de fracciones de pigmentos del vino mediante técnicas

cromatográficas semi-preparativas, que posteriormente permiten realizar un análisis

muy detallado de prácticamente casi todos los pigmentos antociánicos conocidos, e

incluso esta metodología ha permitido la detección de nuevas estructuras presentes de

forma muy minoritaria. Sin embargo, este procedimiento resulta poco práctico cuando

se pretende aplicarlo de forma rutinaria al análisis de un número importante de

muestras de vino. Por esta razón, la metodología analítica empleada en nuestro

estudio consistió en el análisis cromatográfico directo del vino, sin fraccionamiento

previo, y asistido por la detección combinada mediante espectroscopía UV-vis

(detector DAD) y espectrometría de masas multidimensional (ESI-MS/MS). Se

pudieron identificar un total de 90 pigmentos antociánicos correspondientes a tres

grandes tipos de pigmentos (antocianos, aductos tanino-antociano y

piranoantocianos), de los que pudieron cuantificarse hasta 68 de ellos, aunque no para

todas las muestras. El primer resultado destacable es que el contenido en pigmentos

antociánicos de bajo peso molecular fue muy variable y los valores promedios para el

conjunto de todos los vinos oscilaron, para cada tipo de pigmento, dentro de rangos

muy amplios de valores (con valores de desviación standard que fueron de magnitud

similar o mayor que los valores medios): antocianos nativos de la uva, rango de 0.3-

505.0 y valor medio de 93.3 ± 80.2 mg/L, como equivalentes de malvidina 3-glucósido

(mv-3-glc); aductos directos flavanol-antociano, 0.00-3.19 y 1.24 ± 0.59 mg/L, como

mv-3-glc; aductos flavanol-antociano con puente etilideno, 0.00-8.70 y 1.14 ± 1.20

mg/L, como mv-3-glc; vitisinas tipo A, 0.71-49.16 y 7.84 ± 6.25 mg/L, como vitisina

A; vitisinas tipo B, 0.00-16.44 y 1.31 ± 1.87 mg/L, como vitisina B; 10-DHP-

piranoantocianos, 0.00-21.24 y 1.54 ± 2.58 mg/L, como 10-(3’,4’-dihidroxifenil-

piranomalvidina-3-glucósido (10-DHP-pymv-3-glc); 10-HP-pranoantocianos, 0.00-6.82

y 0.71 ± 0.89 mg/L, como 10-(4´-hidroxifenil)-piranomalvidina-3-glucósido (10-HP-

pymv-3-glc); 10-MHP-piranoantocianos, 0.00-1.27 y 0.11 ± 0.24 mg/L, como 10-DHP-

pymv-3-glc; y 10-flavanol-piranoantocianos, 0.00-12.36 y 0.74 ± 1.45 mg/L, como

10-HP-pymv-3-glc.

Entre los posibles factores que pueden contribuir a la amplia diversidad de

resultados obtenidos podrían citarse la variedad de uva empleada, el estado de

maduración (fenólica) de la uva en el momento de la vendimia, la tecnología de



elaboración utilizada (a su vez con múltiples opciones, entre las que se podrían

destacar la duración y el método de maceración empleados), las condiciones de

crianza y/o envejecimiento y/o almacenamiento, así como la edad del vino. Al

comparar vinos jóvenes (1-2 años de edad) se siguieron obteniendo amplios rangos de

contenido en los distintos tipos de pigmentos antociánicos, con ligeras diferencias

según la variedad de uva utilizada pero que no llegaron a ser estadísticamente

significativas, con la única salvedad de los vinos elaborados con la variedad Garnacha

que mostraron las mayores cantidades de hidroxifenil-piranoantocianos, en

consonancia con las altas concentraciones en derivados hidroxicinámicos (precursores

de este tipo de pigmentos antociánicos) que son características de esta variedad de

uva y sus vinos. Otro de los factores que pudieron evaluarse fue la edad de los vinos,

encontrándose que el envejecimiento tendió a uniformizar las pequeñas diferencias en

cuanto a la proporción de los diversos tipos de pigmentos antociánicos que se podían

encontrar entre los diferentes vinos varietales; las únicas pequeñas diferencias que se

encontraron entre vinos varietales tuvieron que ver con las concentraciones de

vitisinas de tipo B, encontrándose los mayores valores en los vinos envejecidos de

Syrah, así como con los 10-HP-piranoantocianos, con mayores concentraciones en los

vinos envejecidos de Merlot. Finalmente, se dispuso de un número suficiente de

muestras de vinos de la variedad Tempranillo (o su sinónima Cencibel) para estudiar la

evolución de las proporciones de las distintas familias de pigmentos antociánicos en

función de la edad. El envejecimiento afectó muy drásticamente a las concentraciones

de antocianos nativos de la uva, que llegaron a desaparecer en vinos con varios años

de edad, pero también lo hicieron el resto de pigmentos antociánicos, aunque de

diferente forma según el tipo de estructura: los aductos flavanol-antociano con puente

etilideno fueron los más afectados y sus proporciones tendieron a contribuir en

proporción cada vez menor conforme aumentaba la edad del vino, mientras que los

pigmentos del tipo hidroxifenil-piranoantociano fueron ganando importancia al

aumentar la edad.

Las conclusiones obtenidas en el Capítulo II, en relación a la edad del vino,

pueden estar fuertemente condicionadas por el hecho de que los vinos estudiados

pertenecían a diferentes vendimias y bodegas, con las consiguientes diferencias

intrínsecas que esto conlleva en cuanto a la composición fenólica inicial de los vinos

que, a su vez, deben afectar a las condiciones de formación de pigmentos antociánicos

de bajo peso molecular: por ejemplo, la competencia con la formación de pigmentos



poliméricos y la propia competencia entre los distintos precursores de los diferentes

tipos de pigmentos considerados. Para intentar arrojar un poco de luz sobre este

asunto, en el Capítulo III se presentan los resultados obtenidos en el estudio

detallado del contenido en vinos Tempranillo del pigmento nativo de la uva más

abundante, malvidina 3-glucósido (mv-3-glc), y de tres de sus derivados del tipo

piranoantociano: vitisina A (10-carboxi-pymv-3-glc) y dos hidroxifenil-

piranoantocianos (10-DHP-pymv-3-glc, o pinotina A; 10-HP-pymv-3-glc). Puesto que

es poco probable tener la oportunidad de analizar los mismos vinos a lo largo de su

envejecimiento durante un periodo de tiempo considerable, la aproximación más

factible consistió en analizar vinos de una misma bodega (elaborados con uvas de los

mismos viñedos y con técnicas enológicas similares) correspondientes a diferentes

vendimias consecutivas (serie vertical de vinos). Así, pudo analizarse una serie vertical

de vinos de hasta 29 años de edad, y también se analizaron vinos comerciales de

diferentes bodegas con edades comprendidas entre 1 y 10 años. De nuevo, se

encontró una gran variabilidad en las concentraciones de los tres piranoantocianos

considerados: vitisina A, 0-10.76 mg/L; pinotina A, 0-4.26 mg/L; 10-HP-pymv-3-glc,

0.03-1.37. El contenido en el antociano nativo mv-3-glc en los vinos jóvenes (1 año)

de la serie vertical fue inicialmente de unos 55-57 mg/L y disminuyó con la edad,

sobre todo a partir del segundo año, hasta alcanzar valores habitualmente muy por

debajo de 15 mg/L en vinos de 2-5 años, y casi desaparecer en vinos más viejos (6

años o más). No obstante en algunos vinos con 4 y 5 años se observaron cantidades

de mv-3-glc relativamente altas (próximos a 15 mg/L) que se atribuyeron al efecto

vendimia, es decir, a que en esos años pudieron darse unas condiciones que

permitieron obtener vinos con mayor contenido en antocianos. En los vinos de esta

serie vertical, la vitisina A (formada durante la fermentación alcohólica) ya se encontró

en las cantidades más altas en los vinos más jóvenes (1 a 3 años) y su concentración

mostró tendencia a disminuir con la edad, si bien se encontraron repuntes en su

concentración (máximos temporales) en vinos con 4 y 8 años que rompieron esta

tendencia, en consonancia con resultados previos reportados por otros autores. El

hidroxifenil-piranoantociano derivado del ácido caféico (pinotina A) no pudo detectarse

en muchos de los vinos de 1 año y en algunos de los vinos de 2 años, mientras que el

derivado similar formado a partir del ácido p-cumárico (10-HP-pymv-3-glc) ya se

encontraba presente en todos los vinos de 1 año, reforzando estos resultados la

hipótesis de que este tipo de pigmentos antociánicos pueden formarse tanto por vía

enzimática (durante la fermentación alcohólica) como química (en todo momento,



especialmente durante el envejecimiento). Ambos hidroxifenil-piranoantocianos

aumentaron sus concentraciones en los primeros años de la serie vertical de vinos,

para después disminuir fuertemente en vinos de 3-4 años, volver a aumentar sus

concentraciones a lo largo de varios años, con algunas interrupciones puntuales, y

finalmente disminuir a valores residuales en vinos muy envejecidos (más de 15 años).

La formación de hidroxifenil-piranoantocianos por vía química, durante el

envejecimiento, debe depender, en principio, de los siguientes factores: por un lado,

de la concentración de ácidos hidroxicinámicos libres (que reaccionan directamente

con los antocianos), como resultado de la hidrólisis de sus precursores procedentes de

la uva (ácidos hidroxicinamoil-tartáricos); de la concentración de antocianos que aún

queden en el vino; y de la competencia con otros reactivos que pueden reaccionar

preferentemente con los antocianos, ya sea por estar en mayor concentración (caso de

los taninos) o por ser más reactivos (caso del ácido pirúvico). En este contexto, al

analizar el conjunto de muestras de vinos comerciales, se encontró una correlación

aceptable entre las concentraciones de pinotina A y de ácido caféico (R2 = 0.623; en el

caso de la serie vertical, R2 = 0.680), lo que constituye una prueba a favor de la vía

química de formación como la principal en el caso de la pinotina A. La correlación

similar entre las concentraciones de 10-HP-pymv-3-glc y ácido p-cumárico no fue tan

buena (R2 = 0.464), sugiriendo que, en este caso, el mecanismo de formación por vía

enzimática contribuyó de manera importante en las primeras fases de elaboración

(fermentación alcohólica). La correlación encontrada para la pinotina A no mejoró

cuando se consideró la concentración combinada de los dos reactivos (ácido cafeico y

mv-3-glc), sugiriendo que los antocianos participan en otras reacciones que compiten

directamente y, al parecer, de forma más eficaz, con la de formación de hidroxifenil-

piranoantocianos. En este sentido, llamó la atención que en algunas de las muestras

de vinos envejecidos (con 4 o más años de edad) se encontraran concentraciones que

eran simultánea e inusualmente elevadas tanto de hidroxifenil-piranoantocianos como

de mv-3-glc. Esto implicaría que en estos vinos se dieron circunstancias, a lo largo del

proceso de envejecimiento, en que coincidieron concentraciones elevadas de

antocianos y ácidos hidroxicinámicos libres, junto con una escasez relevante de

posibles reactivos competidores (v.g., taninos). Como se demostró con la serie vertical

de vinos, en vinos envejecidos la cantidad de antocianos nativos de la uva debe ser

muy baja y la presencia de competidores de los ácidos hidroxicinámicos es pequeña

porque ya reaccionaron con los antocianos. La única posibilidad que prácticamente



queda para explicar los resultados anteriormente comentados es que se hubiera

añadido algo de vino joven (rico en antocianos) a un vino envejecido (pobre en taninos

reactivos y rico en ácidos hidroxicinámicos libres). Esta posibilidad es bastante real,

porque está permitido “refrescar” vinos envejecidos con hasta un 15 % de vino joven,

con idea de mejorar algunas de sus propiedades organolépticas (color y aromas muy

evolucionados). Para probar esta hipótesis, se realizaron experimentos de “refresco”

en vinos modelo que se sometieron a un envejecimiento acelerado. Los resultados

obtenidos demostraron cómo, tras un periodo de latencia en el que, muy

probablemente, los antocianos añadidos con el vino joven reaccionaron con los taninos

del vino envejecido y los incorporados con el vino joven, se constató el esperable

aumento de las concentraciones de pinotina A y de 10-HP-pymv-3-glc, aunque

también estuvo acompañado de un ligero aumento de la concentración de vitisina A.

Entre los resultados anteriormente comentados interesa destacar el periodo de

latencia observado en la formación de hidroxifenil-piranoantocianos en presencia de

taninos, aunque haya disponibles concentraciones elevadas de ácidos hidroxicinámicos

libres. Estos resultados sugieren que la formación de pigmentos antociánicos de bajo

peso molecular está en competencia (termodinámica o/y cinética) con la formación de

pigmentos poliméricos (tanino-antociano). También cabe destacar que los

piranoantocianos de tipo vitisina A se forman rápidamente en las primeras fases de la

elaboración de vinos tintos, en las que también hay cantidades relevantes de taninos,

al menos procedentes del hollejo y más tarde también de las pepitas, por lo que estas

reacciones parecen estar más favorecidas que las de formación de pigmentos

poliméricos. Por tanto, parece interesante conocer más acerca de la cinética de

formación de los distintos tipos de pigmentos antociánicos de bajo peso molecular. A

este interés se le puede sumar la dificultad práctica a la hora de identificar, en los

cromatogramas de muestras reales de vino tinto, los distintos miembros de cada

familia de pigmentos antociánicos, en principio con una complejidad estructural similar

a la de los antocianos a partir de los cuáles se forman (tipo de antocianidina y de

acilación del resto de glucosa). Por todo este conjunto de razones, en el Capítulo IV

se aborda el estudio que se realizó para caracterizar cromatográfica (tiempos de

retención y orden de elución) y espectroscópicamente (espectros UV-vis y MS/MS) las

series completas de piranoantocianos formados a partir de los antocianos de las uvas

(5 antocianidinas; derivados no acilados, acetilados, cumaroilados, y algunos

cafeoilados) y dos grupos de precursores del nuevo anillo de pirano: metabolitos de las



fermentaciones alcohólica (ácido pirúvico, acetaldehído y ácido acetoacético) y

maloláctica (diacetilo) que dan lugar a piranoantocianos de tipo vitisina; y ácidos

hidroxicinámicos (ácidos p-cumárico, caféico, ferúlico y sinápico) que originan

hidroxifenil-piranoantocianos. El estudio se realizó simulando las condiciones de

formación en un vino modelo (extracto de hollejo de uva tinta en vino sintético)

sometido a envejecimiento acelerado.

El ácido pirúvico y el acetaldehído reaccionaron rápidamente con los antocianos,

conduciendo a altos rendimientos de 10-carboxi-piranoantocianos (vitisinas tipo A) en

el primer caso, mientras que el acetaldehído mostró mayor tendencia a favorecer la

formación de pigmentos poliméricos, siendo muy bajos los rendimientos en vitisinas de

tipo B. En contraste, el ácido acetoacético y el diacetilo reaccionaron lentamente y los

rendimientos de los pigmentos correspondientes, 10-metil- y 10-acetil-

piranoantocianos, fueron pobres tras un periodo de envejecimiento acelerado de varias

semanas. Los 10-metil-piranoantocianos también fueron detectados como productos

marginales en la reacción de formación de 10-carboxi-piranoantocianos (a partir de

ácido pirúvico). La reacción de los antocianos con los ácidos hidroxicinámicos fue

progresando paulatinamente, aparentemente sin que se formaran pigmentos

poliméricos. No obstante, la velocidad de la reacción y el rendimiento obtenido de

hidroxifenil-piranoantocianos dependió de la estructura del ácido hidroxicinámico,

observándose que ambos aumentaron al hacerlo el número de sustituyentes hidróxilo

o/y metoxilo (p-cumárico < cafeico < ferúlico < sinápico).

El comportamiento cromatográfico de los derivados piranoantocianos mostró

algunas peculiaridades que se pueden relacionar con su polaridad. En el caso de los del

tipo vitisina, cada derivado eluyó (en condiciones de HPLC en fase reversa, C18) más

tarde (es menos polar) que su antociano precursor en los casos de los derivados no

acilados; en cambio, los derivados acilados eluyeron antes (son más polares) que sus

respectivos antocianos precursores, con el mismo orden de elución mostrado por estos

últimos (no acilados < acetilados < cafeoilados < cumaroilados). Este comportamiento

condujo a que cada serie de piranoantocianos tipo vitisina eluyera dentro del intervalo

de tiempo comprendido entre sus respectivos antocianos precursores de los tipos no

acilado (el más polar de cada serie de antocianos) y cumaroilado (el menos polar de

cada serie de antocianos), contribuyendo a una gran complicación de los

cromatogramas, ya que los picos de las vitisinas aparecieron entre los de los



antocianos de los que se forman. En cambio, los hidroxifenil-piranoantocianos siempre

resultaron ser menos polares que sus antocianos precursores y todos eluyeron más

tarde que éstos, independientemente de si eran acilados o no acilados; aún más, cada

serie eluyó después de la de sus antocianos respectivos, y la única diferencia

encontrada fue que los derivados cafeoilados y los acetilados intercambiaron su orden

de elución (no acilados < cafeoilados < acetilados < cumaroilados) respecto al de los

antocianos.

En cuanto a las propiedades espectroscópicas de los piranoantocianos (pyant)

estudiados, el sustituyente en posición C-10 del nuevo anillo piránico afectó de manera

muy acusada al máximo de absorción en la zona visible en el caso de los derivados

tipo vitisina, apareciendo a valores de longitud de onda dentro de un rango muy

amplio (475-536 nm, es decir, desde color amarillo-naranja hasta rojo-púrpura), en el

siguiente orden: 10-metil-pyant < vitisinas tipo B < vitisinas tipo A < 10-acetil-pyant.

En cambio, todos los hidroxifenil-piranoantocianos mostraron coloraciones

anaranjadas, y sus máximos visibles se concentraron en una banda más estrecha de

valores de longitud de onda (500-520 nm). En todos los piranoantocianos se observó,

al igual que ocurre con sus antocianos precursores, una influencia del grado de

sustitución del anillo B, con valores más altos de longitud de onda del máximo visible

para los compuestos tri-sustituidos respecto de los di-sustituidos, de unos 3-12 nm en

el caso de los de tipo vitisina y de 6-7 nm en los hidroxfenil-piranoantocianos.

Estas diferencias espectroscópicas en el UV-vis ayudaron a identificar y asignar

los distintos derivados piranoantocianos de cada serie, en base a las variantes

estructurales que se dan a tres niveles: tipo de sustituyente en posición C-10, grado

de sustitución del anillo B (di- o tri-sustituido), y acilación o no del resto de glucosa

unida en posición C-3. No obstante, a veces resultó difícil obtener buenos espectros

UV-vis, incluso para algunos derivados mayoritarios, ya que éstos se registran en línea

y pueden coeluir otras sustancias que impiden que los espectros sean íntegros de la

sustancia que se pretende analizar. Es por ello que se recurrió a la identificación en

base a los espectros MS (se obtienen las relaciones m/z de los iones moleculares) y

MS2 (se analizan las relaciones m/z de los iones producto obtenidos tras la

fragmentación de los iones moleculares precursores). Al igual que ocurre con los

antocianos, los piranoantocianos generaron con facilidad iones moleculares cargados

positivamente (podrían designarse cationes piranoflavilio, por analogía con los cationes

flavilio que forman los antocianos), y la única fragmentación observada en los



experimentos MS2 fue la pérdida del resto glucosídico completo (tanto si estaba acilado

como si no) unido en posición C-3. Este comportamiento permitió identificar con

facilidad cada serie de derivados que compartían el mismo sustituyente en posición C-

10 y el mismo tipo de sustitución en el anillo B, es decir, la misma aglicona. De esta

forma, pudieron distinguirse parejas de piranoantocianos isómeros que, teniendo el

mismo valor m/z para sus iones moleculares, generaron distintos iones producto tras

su fragmentación (por ejemplo, los derivados cumaroilados y los cafeoilados de las

parejas piranodelfinidina/piranocianidina de cada serie de piranoantocianos según el

sustituyente en C-10). A pesar de todo, la metodología de análisis MS2 fue incapaz de

distinguir algunas parejas de isómeros que, además de tener la misma relación m/z

para sus iones moleculares, también generaban iones producto con el mismo valor m/z

debido a que los diferencias estructurales que afectaban a distintas posiciones de las

agliconas se vieron compensadas. En estos últimos casos, el estudio separado de cada

serie de piranoantocianos permitió asignar cada compuesto de forma independiente,

pero en un análisis aplicado a una muestra real en la que coexistan varios tipos de

piranoantocianos, la identificación podría verse limitada por estas coincidencias

espectrales (MS y MS2); los tiempos de retención y los espectros UV-vis podrían

ayudar a resolver algunas dudas pero, en los casos en que no fuera posible esto,

habría que recurrir a técnicas de espectrometría de masas multidimensional (MSn,

siendo n ≥3) para analizar en mayor profundidad las estructuras de la parte aglicona

de los piranoantocianos.

Por último, se estudiaron por primera vez los piranoantocianos formados por

reacción de los antocianos con diacetilo, un producto del metabolismo secundario de

las levaduras (fermentación alcohólica) y de las bacterias lácticas (fermentación

maloláctica) que hasta ahora no se había considerado (se había hecho con los ácidos

pirúvico y acetoacético y con el acetaldehído). Estos nuevos 10-acetil-piranoantocianos

mostraron unas características espectrales en la zona visible bastante diferentes a las

habituales para otros piranoantocianos de tipo vitisina. Lo más llamativo fue la

presencia de una banda ancha de absorción de la zona visible, con unos máximos de

absorción a longitudes de onda de 528-536 nm, es decir, estas vitisinas eran de color

rojo-púrpura, como sus antocianos precursores, y no de color rojo-anaranjado como

son las otras vitisinas. Además de obtenerse en un vino modelo, pudo demostrarse la

presencia de los nuevos pigmentos 10-acetil-piranoantociano en muestras reales de

vino tinto.



Las peculiares propiedades mostradas por los 10-acetil-piranoantocianos fueron

estudiadas en mayor profundidad, tal como se recoge en el Capítulo V, el capítulo

final de esta Tesis. A partir de un extracto de antocianos de uvas de la variedad

Garnacha Tintorera se sintetizaron y aislaron, para su posterior estudio, algunos de los

pigmentos mayoritarios obtenidos por reacción con diacetilo. Se eligió la variedad

Garnacha Tintorera por poseer un perfil de antocianos dominado por los derivados no

acilados y por pertenecer sus antocianos mayoritarios a las dos posibles series que

pueden considerarse en relación al grado de sustitución del anillo B: antocianos di-

sustituidos, representados por la peonidina, y tri-sustituidos, representados por la

malvidina. La combinación de técnicas de separación cromatográfica de tipo

preparativo (cromatografía de partición centrífuga rápida; en sus siglas inglesas, FCPC,

Fast Centrigugal Partition Chromatography) y semi-preparativo (HPLC con columnas

C18 semi-preparativas), permitió el aislamiento, con gran pureza, de los compuestos

10-acetil-piranopeonidina-3-β-O-glucósido y 10-acetil-piranomalvidina-3-β-O-

glucósido, en cantidades suficientes para su caracterización estructural y el estudio de

sus propiedades espectroscópicas, aunque en el medio de reacción también pudieron

detectarse los correspondientes derivados cumaroilados de los dos anteriores

piranoantocianos.

La caracterización estructural se basó en los datos obtenidos por espectroscopía

UV-vis, espectrometría de masas (MS, MS2 y MS3) y espectroscopía de Resonancia

Magnética Nuclear (experimentos mono- y bi-dimensionales de 1H-RMN y 13C-RMN).

Los datos de RMN revelaron propiedades remarcables de los 10-acetil-

piranoantocianos, sobre todo si se comparan con las de los otros piranoantocianos del

tipo vitisina conocidos (vitisinas tipos A y B, y 10-metil-piranoantocianos). Tanto los

antocianos como los piranoantocianos pueden existir en disolución acuosa en diversas

formas en equilibrio que dependen del pH del medio, habiéndose descrito la

coexistencia de formas catiónicas (cationes flavilio o piranoflavilio, de color rojo),

hidratadas neutras (hemiacetales, incoloros), desprotonadas o aniónicas (bases

quinoidales, de color azul), y formas hemiacetálicas por apertura del anillo piránico

principal (calconas, de color amarillo). Por esta razón, los espectros de RMN de este

tipo de compuestos se suelen registrar en medio metanólico ácido para que sólo se

encuentra una única forma presente, la forma catiónica roja, que facilita la elucidación

estructural. No obstante, en el caso de los 10-acetil-piranoantocianos, aún en estas

condiciones pudo observarse la presencia de las correspondientes formas



hemiacetálicas incoloras (los dos posibles enantiómeros que se forman por ataque

nucleofílico del agua) y se pudo demostrar que el ataque ocurría sólo en la posición C-

10 del anillo piránico secundario, el nuevo formado, en lugar de en la otra posible

posición, la C-2, que es la que únicamente se ha reportado para el caso de la

hidratación de los antocianos. La formación del hemiacetal fue posible debido a las

pequeñas cantidades de agua presentes en los disolventes empleados, sobre todo en

el metanol deuterado; únicamente en el caso en que los espectros se registraron en

dimetilsulfóxido perdeuterado fuertemente acidificado (DMSO-d6 con 20 % de

CF3COOD)pudo observarse la sola presencia de la forma catiónica de piranoflavilio.

El estudio de la modificación de los espectros UV-vis de los 10-acetil-

piranoantocianos en medio acuoso, al variar el valor del pH, mostró que estos

pigmentos tienen una fuerte tendencia a formar el hemiacetal y la base quinoidal a

valores de pH del orden de los habituales para vinos tintos (entre 3 y 4). Este

comportamiento explicaría por qué su banda de máxima absorción visible es tan ancha

(coexistencia de formas piranoflavilio, rojas, y quinoidales, azules) y se sitúa en torno

a los 510-520 nm, pudiéndose describir el color mostrado como más bien rojo neto, en

lugar del rojo-anaranjado más habitual para los otros piranoantocianos de tipo vitisina.

Todavía más sorprendente resultó el comportamiento de los 10-acetil-piranoantocianos

frente a la adición de bisulfito. Aunque, en general, los piranoantocianos se describen

como pigmentos resistentes a la decoloración por bisulfito en medio acuoso ácido (la

adición de bisulfito es similar a la adición de agua, generando una estructura incolora

parecida al hemiacetal), éstos experimentan una ligera disminución de la intensidad

del máximo de absorbancia en el visible ante dosis altas de bisulfito, pero sus

espectros no cambian de aspecto. En cambio, la adición de bisulfito en cantidades

crecientes a disoluciones acuosas ácidas de los nuevos 10-acetil-piranoantocianos

condujo a una intensificación también creciente de la absorción en el visible, junto con

un desplazamiento hipsocrómico (menor longitud de onda, es decir, con un viraje del

color de rojo hacia anaranjado) que cambió la forma del espectro UV-vis, con un

aspecto similar al mostrado por otro tipo de vitisinas. Un estudio detallado de los

espectros de masas de los aductos formados entre el ion bisulfito y los 10-acetil-

piranoantocianos, que incluyo el registro de espectros MS3, permitió establecer que el

ion bisulfito no se unió a la posición C-10 como en el caso del agua, muy

probablemente por impedimento estérico, sino que lo hizo sobre el carbono carbonílico

del sustituyente acetilo unido a la posición C-10, lo que explicaría el comportamiento

observado en los espectros UV-vis al añadir bisulfito. El aducto con bisulfito resultó ser



muy lábil y no pudo detectarse cromatográficamente en las disoluciones de 10-acetil-

piranoantocianos tratadas con bisulfito. No obstante, al infundir estas disoluciones

directamente en el espectrómetro de masas, pudieron detectarse los correspondientes

iones moleculares (espectro MS), así como las pérdidas sucesivas del grupo bisulfito

en la primera fragmentación (espectro MS2) y del resto de glucosa en la segunda

fragmentación (espectro MS3). La reactividad del grupo 10-acetilo también se puso de

manifiesto en disoluciones metanólicas de estos pigmentos. Tras varias horas, esta vez

sí pudieron observarse picos cromatográficos adicionales cuyos espectros UV-vis y

MS/MS fueron compatibles con la adición de 2 grupos metoxilo al carbono carbonílico

del sustituyente 10-acetilo. Todas estas propiedades de los 10-acetil-piranoantocianos

los convierten en unos pigmentos del vino singulares y de gran interés en relación con

el color del vino tinto.

En resumen, con esta Tesis Doctoral se ha podido contribuir de forma

significativa al aumento del conocimiento científico relacionado con los pigmentos

antociánicos de bajo peso molecular de los vinos tintos. En primer lugar, se ha

determinado que los antocianos nativos de la uva, en particular el mayoritario y más

estable de ellos, malvidina 3-glucósido, es el principal pigmento que se encuentra en

los vinos rosados, independientemente de la variedad de uva con que se hayan

elaborado. Los pigmentos poliméricos apenas contribuyen al color del vino rosado y,

entre los pigmentos derivados de antocianos de bajo peso molecular, la vitisina A es la

más importante, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos sólo comienzan a

cobrar relevancia en vinos rosados algo envejecidos. En segundo lugar, un estudio

detallado de la composición en pigmentos de bajo peso molecular (incluyendo la

antocianos nativos de la uva), realizado con una extensa y amplia gama de vinos

tintos, ha puesto de manifiesto que los contenidos y proporciones en que se

encuentran los distintos tipos de pigmentos antociánicos son muy variables y resulta

difícil establecer relaciones con el origen varietal y la edad del vino. Algunas

características que se han encontrado son, por un lado, la tendencia de los vinos de la

variedad Garnacha a poseer altas concentraciones de hidroxifenil-piranoantocianos y,

por otro, que el envejecimiento tiende a uniformizar los vinos debido a una

disminución generalizada de las concentraciones de todos los tipos de pigmentos

antociánicos de bajo peso molecular, aunque de forma particular afecta más a los

aductos flavanol-antociano con puente etilideno (casi desaparecen) y a los hidroxifenil-

piranoantocianos (parecen desaparecer a un ritmo menor y aumentan su proporción



entre los pigmentos que van quedando). En tercer lugar, se ha podido establecer que

ciertas prácticas enológicas, como refrescar vinos tintos envejecidos con algo de vino

joven, pueden alterar la composición de pigmentos antociánicos de bajo peso

molecular y, de forma sustancial, reactivan en los vinos envejecidos la formación, a

través de la denominada vía química, de hidroxifenil-piranoantocianos que aumentan

significativamente sus concentraciones. En cuarto lugar, se estudió la cinética de

formación de uno de los tipos de pigmentos antociánicos de bajo peso molecular, los

piranoantocianos, tanto del tipo vitisina (formados a partir de metabolitos secundarios

de las fermentaciones alcohólica y maloláctica) como de los hidroxifenil-

piranoantocianos. Se comprobó cómo, entre las vitisinas, las de tipo A (formadas a

partir de ácido pirúvico) son las únicas que se forman rápidamente y con rendimientos

elevados, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos sólo comienzan a formarse

después de un periodo de latencia en el que se van consumiendo otros reactivos

competidores, como los taninos, tras lo cual se forman progresivamente y pueden

llegar a alcanzar rendimientos elevados. Todos estos piranoantocianos fueron,

además, caracterizados cromatográfica y espectroscópicamente (UV-vis, MS y MS2)

para facilitar su identificación y cuantificación en análisis de muestras reales de vinos.

En quinto y último lugar, se estudiaron las propiedades del nuevo tipo de pigmentos

aportados en esta Tesis, los 10-acetil-piranoantocianos derivados de la reacción del

diacetilo (metabolito secundario de levaduras y bacterias lácticas, nunca antes

considerado) con los antocianos. Estos nuevos piranoantocianos se han podido

detectar en muestras reales de vinos y presentan unas características espectrales y de

color muy singulares. Por un lado, muestran una gran tendencia a formar hemiacetales

incoloros y bases quinoidales azules, junto con las formas piranoflavilio rojas, en

condiciones habituales del vino tinto (medio acuoso y pH entre 3 y4), por lo que el

color que muestran no es el esperable rojo-anaranjado del resto de piranoantocianos

conocidos, sino rojo-púrpura similar al de los antocianos de los que se forman. Por otro

lado, los 10-acetil-piranoantocianos no sólo no se decoloran al añadir bisulfito (como lo

hacen los antocianos de forma total, pero el resto de piranoantocianos sólo de forma

parcial y tras añadir grandes dosis de bisulfito), sino que aumentan su intensidad de

color ocurriendo paralelamente un viraje hacia tonalidades anaranjadas, todo ello

debido a la reactividad del sustituyente acetilo que los caracterizan.

La relevancia de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral puede

justificarse por el hecho de que los resultados recogidos en los Capítulos III, IV y V



han sido publicados en revistas científicas de reconocido prestigio, que se encuentran

situadas en los primeros puestos de la clasificación JCR dentro del área de

conocimiento “Food Science and Technology”. Así mismo, los resultados del Capítulo II

se han recogido en un manuscrito que está en proceso de revisión para su posible

publicación en una de las revistas anteriormente citadas. La lista de publicaciones

generadas por esta Tesis es la siguiente:

- Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Blanco-Vega, D.;

Hermosín-Gutiérrez, I. Survey on the Content of Vitisin A and Hydroxyphenyl-

Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines. Food Chemistry, 2010, 119, 1426-

1434.

- Blanco-Vega, D.; López-Bellido, F.J.; Alía-Robledo, J.M.; Hermosín-

Gutiérrez, I. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of Pyranoanthocyanins

Pigments Formed in Model Wine. Journal of Agricultural and Food

Chemistry,2011, 59, 9523-9531.

- S. Gómez-Alonso; D. Blanco-Vega; M. V. Gómez; I. Hermosín-

Gutiérrez. Synthesis, Isolation, Structure Elucidation, and Color Properties of

10-Acetyl-Pyranoanthocyanins. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

2012, 60, 12210-12223.

- Blanco-Vega, D.; Gómez-Alonso, S.; Hermosín-Gutiérrez, I.

Identification, Content and Distribution of Anthocyanins and Low Molecular

Anthocyanin-Derived Pigments in Commercial Red Wines. Food Chemistry,

manuscritoen revision (FOODCHEM-D-13-04008).

ÍNDICE DE

TABLAS Y

FIGURAS

INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.


TABLAS Tabla I.1. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos

rosados monovarietales.

Tabla I.2. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo.

Tabla I.3. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel o de Tempranillo que han

resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de

Student.

Tabla I.4. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel y Tempranillo, clasificados por

vendimia (2006 o 2007) que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de Student.

Table II. 1.Chromatographic (peak number as in Figure 2; retention times) and mass spectral

(MS, molecular ion; MS/MS, fragment ions) data corresponding to the low molecular red pigments identified in commercial red wine samples.

Table II. 2. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric

anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the whole set of studied samples of commercial wines (n = 286). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo; TEMP/CBSV, blends of tempranillo and cabernet sauvignon. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).

Tabla II. 3. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric

anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofyoung commercial wines (1-2 years old; n = 199). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).

Table II. 4. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric

anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofaged commercial wines (2 or more years old; n = 84). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD)corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; MER, merlot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test;α= 0.05).

Table III.1. Mean values and standard deviations (MV±SD) for the content (mg/L) of pyranoanthocyanins and related compounds (their precursors, malvidin 3-glucoside, free and bound hydroxycinnamic acids) in commercial Tempranillo wines grouped by age.



Table III. 2. Composition (mg/L) in pigments and hydroxycinnamic acids of the aged and young wines used in the experiments of refreshment.

Table IV. 1. HPLC retention times (min) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).

Table IV. 2. HPLC retention times (nm) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series

formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).

Table IV. 3. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of vitisin-like pyranoanthocyanin

series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).

Table IV. 4. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).

Table IV.5. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of vitisin-like pyranoanthocyanin

series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).

Table IV. 6. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanin series formed in model wine (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).

Table V.1. NMR Spectroscopic Data Registered in CD3OD-CF3COOD (70:30, v/v) for 10-

Acetyl-Pyranopeonidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).

Table V. 2. NMR Spectroscopic Data Registered in (A) DMSO-d6-CF3COOD (80:20) and (B)

CD3OD-CF3COOD (70:30) for 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O-β-Glucoside: 1H Data

(Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).

Table V. 3. Chemical Shifts of Nuclei (1H and 13C) Showing the Greatest Differences with

Regard to Compound 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O--Glucoside was in the

Flavylium Cation (f) or Epimeric Hemiacetal (hm-a and hm-b) Forms. Spectrum Registered in CD3OD-CF3COOD (98:2).

Table V.4.. CIELAB Color Parameters Measured at pH 3.6 for 0.08 mM Pigment Solutions.



FIGURAS Figura I.1. Correlación entre los parámetros cromáticos “colorido” (C*) y “componente roja del

color” (a*) correspondientes a los vinos rosados analizados.

Figura I.2. Correlación entre los parámetros cromáticos “ángulo de tono” (h*) y “componente amarilla-azul del color” (b*) correspondientes a los vinos rosados analizados.

Figura I.3. Correlación entre los contenidos de distintas fracciones de antocianos

a) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Totales; b) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Decolorables por Sulfuroso. Se han marcado las muestras que no correlacionan bien.

Figura I.4. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. cafeoato de etilo; b) Ácido p-cumárico vs. cumarato de etilo.

Figura I.5. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. mv-3-glc-4-VC;b) Ácido p-cumárico vs. mv-3-glc-4-VP.

Figura I.6. Correlación entre: a) %ANDS y componente amarilla del color; b) Suma de ANDS y

ADS (8% en forma roja a pH 3.6) y componente roja del color. Figura I.7. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de

uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2. Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y se ha encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C, Cencibel; CS, Cabernet Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.

Figura I.8. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de

uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1

Figura I.9. Perfiles de antocianos monómeros (HPLC, detección a 520 n) característicos de los

vinos rosados analizados. Dp, delfinidina; Cy, cianidina; Pt, petunidina; Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; acglc, acetilglucósido; cmglc, cumaroilglucósido.

Figura I.10. Representación de las muestras de vinos rosados de las variedades

sinónimas Cencibel y Tempranillo, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2: a) Muestras marcadas por nombre de variedad (rojo, Cencibel; azul, Tempranillo)

b) Muestras marcadas por vendimia (verde 2006; amarillo, 2007.Figure III.1. Chemical structure of wine pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside: 1, vitisin-type pyranoanthocyanins (R1 = COOH, vitisin A; R1 = H, vitisin B); 2, hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins (R2 = R3 = H, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol or mv-3-glc-4-VP; R2 = H and R3 = OH, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol or pinotin A; R2 = H and R3 = OCH3, malvidin 3-glucoside-4-vinylguaiacol or mv-3-glc-4-VG).



Figure II. 1. Structures of anthocyanins and anthocyanin-derived low molecular red wine pigments found in analysed wine samples: A) grape native anthocyanins; B) vitisin-type anthocyanins (R3 = COOH, A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins; R3 = H, B-type vitisins or simply pyranoanthocyanins); C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (R3 = H, 10-(4’’’-hydroxyphenyl)-pyranoanthocyanins or 10-HP-pyranoanthocyanins; R3 = OH, 10-(3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or 10-DHP-pyranoanthocyanins; R3 = OCH3, 10-(3’’’-methoxy-4’’’-hydroxy)phenyl-pyranoanthocyanins or 10-MHP-

pyranoanthocyanins); D) (4 →8)-flavanol-anthocyanin adducts (direct adducts); E) 8,8-

ethylidene-flavanol-anthocyanin adducts (acetaldehyde-mediated or ethylidene-bridged adducts); F) flavanol-pyranoanthocyanins (R = H, from monomeric flavanols; R = 8-flavanyl, from B-type procyanidin dimers). For all structures: R1 and R2 = H, OH, OCH3; acyl = acetyl, p-coumaroyl, caffeoyl

Figure II 2. Chromatographic profiles of anthocyanins and anthocyanin-derived pigments (DAD, detection at 520 nm) of different red wines: A) young Syrah wine; B) three-years old Cabernet Sauvignon wine; C) three-years old Garnacha wine; D) three-years old Merlot wine. Peak numbering (Table 2): 1-17, anthocyanins; 18-25, A-type vitisins; 26-28, B-type vitisins; 29-35, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins; 36-37, direct flavanol-anthocyanin adducts; 38-44, ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts; 45-68, flavanol-pyranoanthocyanins.

Figure II . 3. Expanded chromatograms of the elution zone corresponding to 10-flavanol-pyranoanthocyanins of aged Merlot wine: A) DAD-chromatogram (detection at 520 nm); Extracted Ion Chromatograms (EIC) at the m/z values corresponding to: B) 10-(epi)catechin-pymv-3-glc; C) 10-(epi)catechin-pymv-3-acglc; D) 10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc; E) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc; F) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc. Abbreviations: (epi)catechin, both (–)-epicatechin or (+)-catechin; pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-glucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.

Figure II. 4. MS/MS fragmentation patterns of: A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc; D) 10-flavanol-dimer-pymv-3-glc; E) 10-flavanol-dimer-pymv-3-acglc. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.

Figure II: 5. On-line DAD spectra of : A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc. Visible maximum absorbance is indicated for each compound. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside

FigureII. 6. Low molecular weight pigment content of 1 and 2 years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins and anthocyanin-

derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; GAR, Garnacha; MER, Merlot; PV, Petit Verdot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; pyant, pyranoanthocyanins.

Figure II. 7. Low molecular weight pigment content of 3 or more years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins and

anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-

derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; MER, Merlot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; TEMP/CBSV, blends of Tempranillo and Cabernet Sauvignon; pyant, pyranoanthocyanin

Figure II. 8. Low molecular weight pigment content of Tempranillo wines according to their age: A) concentrations (μmol/L) of total pigments and molar percentage of



anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: pyant, pyranoanthocyanin

Figure III.2. Changes in anthocyanins and pyranoanthocyanins of Tempranillo wines

during aging: a), 2 years old wine; b), 4 years old wine; c), 7 years old wine. Peak assignation: mv, malvidin; glc, glucoside; ac, acetyl; cm, p-coumaroyl; VP, vinylphenol; VG, vinylguaiacol.

FigureIII.3. Tempranillo wine vertical series. Variation with wine age of the

concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

Figure III.4. Correlation of free hydroxycinnamic acid concentration (mg/L) to the

corresponding concentration (mg/L) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines: a) caffeic acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-glc-4-VC, or pinotin A); b) p-coumaric acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

Figure III.5. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Tempranillo wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

Figure III.6. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young

Petit Verdot wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).

Figure IV.1. General structures of vitisin-like pyranoanthocyanins (A) and hydroxyphenyl-

pyranoanthocyanins (B). Structure features: labeling of aromatic rings; substituent at C-10 (R4 in D-ring for vitisin-like pyranoanthocyanins; R4 and R5 in E-ring for hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins); B-ring substituent (R1 and R2); and type of acylation of the glucosidic moiety.

Figure IV.2. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of pyruvic

acid in a model red wine made from Syrah grape skin extract, after 1 day (A), 1 week (B), and 9 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc, and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caffeoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of malvidin 3-glucoside; peaks 1-4 are the corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins derived from the reaction between

pyruvic acid and the aforementioned malvidin-type anthocyanins

FigureIV. 3. DAD on-line UV-vis spectra of: malvidin 3-glucoside (mv-3-glc) vs. its 10-carboxy- and 10-catechyl-pyranoanthocyanin derivatives (A); different vitisin-like pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (B); different hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (C). Abbreviation: pyrmv-3-glc, pyranomalvidin 3-glucoside.

FigureIV. 4. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of a 2-years old Tempranillo commercial red wine: DAD-chromatogram at 520 nm (A); extracted ion chromatogram (EIC) at m/z 355 (pyrmv) showing the peaks assigned to the 3-glc (20.2 min), the 3-acglc (22.3 min), and the 3-cmglc (27.3 min) derivatives (B); EIC at m/z 397 (10-acetyl-pyrmv) showing the peak assigned to its 3-glc (22.1 min) derivative (C); EIC at m/z 559 corresponding to the



molecular ions of the isomers 10-acetyl-pyrmv-3-glc and pyrmv-3-acglc (D); MS/MS spectra of peaks corresponding to 10-acetyl-pyrmv-3-glc (E) and pyrmv-3-acglc (G), and their overlapping zone (F). Abbreviations: pyrmv, pyranoamalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-acglc, 3-(6”-acetyl)-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.

Figura V.1. Diagrama de cromaticidad CIE.

Figura V. 2. Coordenadas rectangulares del sistema CIELAB.

Figura V. 3. Funcionamiento del cromatógrafo FCPC.

Figure V.4. Reaction mixture after 18 h showing the formation of 10-acetyl-pyranoanthocyanins and the remaining anthocyanin precursors. Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.

Figure V.5. HPLC on-line DAD UV-vis spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins (C, D, G,

H) and their respective anthocyanin precursors (A, B, E, F). Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside;

pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin. Figure V. S1. MS and MS/MS (MS2) spectra of non-acylated (A and B) and p-

coumaroylated (C and D) 10-acetyl-pyranoanthocyanins. Abbreviations: pyrpn, pyranopeonidin; pyrmv; pyranomalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.

Figure V. S2. 1H-NMR signals corresponding to the aromatic protons in rings A (H-6 and

H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acet-pyrmv-3-glc registered in DMSO-d6 with 20% CF3COOD: A) fresh solution; B) solution stored at 25ºC

during 15 hours (asterisks indicates signals of free aglycon released by acid hydrolysis of glucosidic bond during storage).

Figure V. 6. Chemical structures of synthesized and isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-

O- β -glucoside (A) and 10-acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -glucoside (B) in their

flavylium cation forms. Figure V.7.. 1H-NMR signals corresponding to the anomeric (H-1”) and aromatic protons

in rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins registered in different solvents: A) 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD with 2% CF3COOD (asterisks indicate signals assigned to hemiacetal forms); B) 10-acet-pymv-3-glc in DMSO-d6 with 20% CF3COOD; C) anomeric proton (H-1”) section of 10-acet-pypn-3-glc spectra in CD3OD with variable proportions (5-30%) of CF3COOD. Abbreviations: f, flavylium cation form; hm, hemiacetal form.

Figure V.8.. Chromatogram (detection at 520 nm) corresponding to the sample of 10-

acet-pymv-3-glc just after recording the 1H-NMR in CD3OD with 30% of CF3COOD. It is also shown the on-line UV-vis spectra of 10-acet-pymv-3-glc (17.750 min) and newly formed compound (23.667 min), as well as the suggested chemical structure

of 10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc for the latter. Figure V. S3. Resonance forms of 10-acet-pyrmv-3-glc involving oxygen atoms of rings C

and D, and suggested formation of hemiacetals of this compound at positions C-2 and C-10.



Figure V. S4. Long-distance 1H-13C correlations (HMBC experiment) detected for the hemiacetalic form of 10-acet-pyrmv-3-glc involving nuclei susceptible to hemiacetal formation (C-2 and C-10).

Figure V. 9. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function

of pH: A) 10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc. Figure V. S5. Color shown by aqueous solutions at pH 3.6 and concentration of 0.08 mM of: A)

10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside; B) 10-acetyl-pyranopeonidin-3-glucoside

Figure V.10.. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of the concentration of added SO2 at pH 2.0: A) 10-acet-pymv-3-glc; B)

10-acet-pypn-3-glc.

Figure V. 11. Reaction product of nucleophilic attack of SO2 to 10-acet-pymv-3-glc: A) suggested structure; B) mass spectra (MS, MS2, and MS3)

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES.


CONCLUSIONES

- La presente Tesis Doctoral supone una contribución al conocimiento de los

pigmentos antociánicos de bajo peso molecular del vino rosado y tinto

derivados de la transformación de los antocianos nativos de la uva, tanto por

el número de muestras analizadas como por el tipo de vinos analizados: 130

muestras de vinos rosados con 1-2 años; 286 muestras de vinos tintos de

diversas variedades con un rango de edad desde jóvenes hasta envejecidos

con 7 o más años; 106 vinos Tempranillo de 1 a 10 años de edad; y 48 vinos

de una serie vertical de vinos Tempranillo de 1 a 29 años de edad.

- De entre los pigmentos antociánicos de bajo peso molecular presentes en el

vino, se ha prestado una especial atención a los denominados

piranoantocianos, tanto los formados a partir de metabolitos secundarios de

las fermentaciones implicadas (denominados como “tipo vitisina”), como los

formados a partir de ácidos hidroxicinámicos provenientes de la materia prima

(denominados “hidroxifenil-piranoantocianos”). Se ha estudiado su formación

y evolución en los vinos y se ha contribuido con la identificación de nuevas

estructuras no descritas con anterioridad.

- Los vinos rosados, independientemente de su edad y variedad de elaboración,

contienen como pigmento mayoritario la malvidina 3-glucósido nativa de la

uva. Entre los pigmentos de tipo piranaontociano, la vitisina A (formada

durante la fermentación alcohólica a partir de ácido pirúvico) es mayoritaria, y

los hidroxifenil-piranoantocianos (derivados de ácidos hidroxicinámicos) sólo

empiezan a cobrar una importancia relativa en vinos de 2 años.

- Las características cromáticas mostradas por los vinos rosados, con una

predominancia de la componente roja del color y apenas contribuciones de la

componente amarilla, son consecuentes con la composición en pigmentos

antociánicos encontrada en estos vinos.

- El contenido en pigmentos antociánicos de bajo peso molecular fue muy

variable entre la amplia gama de vinos tintos comerciales analizados,

CONCLUSIONES.


encontrándose que los valores promedios para el conjunto de todos los vinos

oscilaron, para cada tipo de pigmento, dentro de rangos muy amplios de

valores, puesto que hay diferentes factores (variedad de uva empleada, edad

del vino) que oueden afectar al desarrollo de este tipo de pigmentos a partir

de los antocianos nativos de la uva.

- Al comparar sólo vinos jóvenes (1-2 años de edad) se siguieron obteniendo

amplios rangos de contenido en los distintos tipos de pigmentos antociánicos,

con ligeras diferencias (no significativas) según la variedad de uva utilizada,

con la única salvedad de los vinos elaborados con la variedad Garnacha que

mostraron las mayores cantidades de hidroxifenil-piranoantocianos, en

consonancia con las altas concentraciones en derivados hidroxicinámicos

(precursores de este tipo de pigmentos antociánicos) que son características

de esta variedad de uva y sus vinos.

- En cuanto al factor edad del vino tinto, el envejecimiento tendió a uniformizar

las pequeñas diferencias en cuanto a la proporción de los diversos tipos de

pigmentos antociánicos que se podían encontrar entre los diferentes vinos

varietales; las únicas diferencias significativas que se encontraron entre vinos

varietales tuvieron que ver con las concentraciones de vitisinas de tipo B,

encontrándose los mayores valores en los vinos envejecidos de Syrah, así

como con los 10-HP-piranoantocianos, con mayores concentraciones en los

vinos envejecidos de Merlot.

- En el caso de los vinos de la variedad Tempranillo (o su sinónima Cencibel), el

envejecimiento afectó muy drásticamente a las concentraciones de antocianos

nativos de la uva, que llegaron a desaparecer en vinos con varios años de

edad, pero también lo hicieron el resto de pigmentos antociánicos, aunque de

diferente forma según el tipo de estructura: los aductos flavanol-antociano con

puente etilideno fueron los más afectados y sus proporciones tendieron a

contribuir en proporción cada vez menor conforme aumentaba la edad del

vino, mientras que los pigmentos del tipo hidroxifenil-piranoantociano fueron

ganando importancia al aumentar la edad

CONCLUSIONES.


- Un estudio más detallado de los efectos del envejecimiento realizado con una

serie vertical de vinos Tempranillo reveló que en algunas muestras comerciales

de vinos envejecidos de esta variedad pueden encontrase cantidades

anormalmente altas de antocianos (superior a unos 15 mg/L como

equivalentes de malvidina 3-glucósido) y de hidroxifenil-piranoantocianos

(superior a 2-3 mg/L) de forma simultánea. Pudo demostrarse que estos casos

deben corresponder a vinos envejecidos que fueron refrescados con algo de

vino tinto joven, una práctica admitida si el vino joven no se añade en más de

un 15%.

- El efecto principal del refresco de vinos envejecidos fue la reactivación de la

vía química de síntesis de hidroxifenil-piranoantocianos, ya que el vino joven

aporta antocianos que pueden reaccionar con los ácidos hidroxicinámicos libres

presentes en los vinso envejecidos, sin la aparente competencia de los

taninos, que deben estar en menor proporción en los vinos envejecidos debido

a que ya reaccionaron a lo largo del envejecimiento de éstos.

- La formación de piranoantocianos del tipo vitisina e hidroxifenil-

piranoantocianos en vino modelo sometidos a envejecimiento acelerado,

permitió conocer las características cromatográficas y espectroscópicas

(espectros UV-vis y MS/MS) que permiten su identificación en las mezclas

complejas en las que aparecen en muestras reales de vinos, así como también

arrojó luz sobre la cinética de formación de estos compuestos.

- Entre las vitisinas, las de tipo A (a partir de ácido pirúvico) se forman muy

rápidamente y con altos rendimientos, compitiendo de forma muy efectiva con

los taninos. Las de tipo B (a partir de acetaldehido) se obtuvieron en

rendimientos muy bajos, ya que elacetaldehído parece que contribuyó en

mayor medida en la formación de pigmentos poliméricos tanino-antociano con

puente etilideno. Las vitisinas formadas a partir de ácido acetoacético y

diacetilo se formaron lentamente y con bajos rendimientos.

- Estas vitisinas mostraron características espectrales en el UV-vis que se

tradujeron en que su color rojo es de un tono más anaranjado que el de los

antocianos de partida, con la salvedad de las derivadas de diacetilo que

tuvieron una coloración rojo-púrpura.

CONCLUSIONES.


- Las vitisinas derivadas del diacetilo fueron estudiadas en mayor detalle, que

incluyó su síntesis, aislamiento y elucicidación estructural inequívoca. Estos

nuevos pigmentos de tipo piranoantociano mostraron propiedades poco

habituales en este tipo de pigmentos: gran tendencia a formar hemiacetales

incoloros a valores de pH muy ácido cuando debería predominar la forma de

catión flavilio roja; contribución destacable de la forma base quinoidal (azul) a

valores de pH habituales del vino tinto; no decoloración con sulfuroso y viraje

hacia tonalidades anaranjadas cada vez más intensas al incrementar la

concentración de sulfuroso añadido.

- En el caso de los hidroxifenil-piranoantocianos, pudo observarse una fase de

latencia en su formación, hasta que sus más directos competidores (los

taninos) se consumen y les permiten reaccionar con los antocianos. Los

espectros UV-vis no se afectaron mucho por el grado y tipo de sustitución del

ácido hidroxicinámico de partida, pero sí condicionó el rendimiento obtenido,

incrementándose en el orden p-cumárico < cafeico < ferúlico < sinápico, es

decir, al aumentar el número de hidroxilos o/y de metoxilos.

formación y evolución de pigmentos de tipo piranoantociano

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