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1. TEMA: EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES2. OBJETIVOS:

2.1. GENERAL: Realizar La Extracción Y Análisis De Pigmentos Alimentarios Vegetales.2.2. ESPECÍFICO:

Extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta vulgaris var. Cicla)

mediante cromatografía circular y cromatografía ascendente en tira de

papel.

Determinar antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca).

Conocer el efecto de la cocción sobre los pigmentos vegetales de la

zanahoria (Daucus carota).

Realizar la extracción y análisis de betaninas presentes en la remolacha

(Beta vulgaris).

Extraer y analizar carotenoides a partir del achiote (Bixa orellana).

3. MARCO TEÓRICO:

PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES

Son sustancias naturales que brindan los colores que poseen los alimentos. Es un material que viene incorporado en la textura misma, que refleja la luz de diferentes formas, generando a nuestra vista, distintos colores y tonalidades. Los pigmentos además de existir en forma natural, pueden también sintetizarse y obtenerse químicamente, para ser aplicados en la industria tanto en alimentación, como en pinturas, barnices, cosméticos, ropa, etc.

En la alimentación natural, orgánica y macrobiótica, puede verse extracción de pigmentos de forma artesanal, con fines medicinales o simplemente como colorante natural para alimentación y bebidas. Existen estudios que exponen las posibilidades terapéuticas de estos componentes vegetales, que en su mayoría aportan una cantidad de antioxidante al organismo.

CLOROFILA

El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz.

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También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. Las clorofilas se encuentran en las membranas de los tilacoides, que en las cianobacterias son invaginaciones de la membrana plasmática, y en los plastos de las células eucarióticas que son vesículas distribuidas por su interior. Las clorofilas aparecen insertas en la membrana, a las que se anclan por la cadena lateral constituida por un resto de fitol, asociadas a proteínas y otros pigmentos, con los que forman los fotosistemas.

ANTOCIANINAS

Son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las células vegetales y que otorgan el color rojo, púrpura o azul a las hojas, flores y frutos. Desde el punto de vista químico, las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y son glicósidos de las antocianidinas, es decir, están constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. Sus funciones en las plantas son múltiples, desde la de protección de la

radiación ultravioleta hasta la de atracción de insectos polinizadores.

BETANINAS

La Betanina, rojo remolacha es una sustancia que consiste en el extracto acuoso de la raíz de la remolacha roja Beta vulgaris. Se extrae generalmente tras la cocción en agua, y presenta un color rosado.

Utilización:

Estos compuestos extraídos de la remolacha son utilizados generalmente en la industria de la alimentación como colorante para ciertos postres, como las gelatinas o el yogur de frutas rojas.

CAROTENOIDES

Pueden obtenerse una variedad de colores del amarillo al rojo, pasando por el naranja. En esta clasificación, se encuentra el rojo del tomate y el betacaroteno. Desde el punto de vista químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados por unidades de isopreno (ocho unidades, es decir, cuarenta átomos de carbono), y su biosíntesis se produce a partir de isopentenil pirofosfato. Esto produce sus rasgos estructurales más evidentes, la presencia de un muchos dobles enlaces conjugados y de un buen número de ramificaciones de grupos metilo, situados en posiciones constantes. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos básicos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de tamaño menor, formados por ruptura de los carotenoides típicos.

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CARACTERÍSTICAS DE EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS:

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo.

En el método de extracción simple, como se desarrolla más adelante se utilizará como extractante el alcohol etílico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos no misibles y con diferente peso específico.

En el segundo método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona y como separador el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los pigmentos, y se basa en la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la técnica.

4. FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA:

EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS

Entre los distintos métodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se encuentra el de la cromatografía en papel, que es una técnica que permite la separación de las sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad que tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente según su color.

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CLOROFILASExisten en cuatro formas diferentes, α, β, γ y δ, siendo las dos primeras las presentes en las plantas. Las clorofilas tienen típicamente dos picos de absorción en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm de longitud de onda), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media del espectro, la más nutrida y correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta es la razón por la que las clorofilas tienen color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen cloroplastos activos en sus células, así como a los paisajes que forman.Las plantas superiores tienen dos tipos de clorofila muy semejantes entre sí, denominadas a y b, siendo la primera la mayoritaria y la que se degrada más fácilmente.(6)

ANTOCIANINAS Y BETALAÍNAS

En antocianinas el color a un PH determinado es función de los sustituyentes. Al aumentar el número de hidróxidos en el anillo B se intensifica el color azul mientras que la presencia de grupos metoxilo genera el color rojo. Son muy reactivas, el ion flavilio es deficiente en electrones y reacciona rápidamente. Generalmente son reacciones de decoloración no deseadas.

El color de las antocianinas es función del PH además de su estructura. Algunas de ellas a PH ácido son de color rojo, a PH básico de color azul y a PH neutro son incoloras.

Al contrario de lo que sucede en el caso de las antocianinas, el color de las betalaínas no depende del pH. Las betacianinas mantienen su color púrpura sin ningún cambio entre pH 4 y 7, y los cambios que se producen a pH tan extremos como 2 ó 9 son pequeños. La betanina, una betalaína, es el componente principal del colorante de la remolacha roja.

CAROTENOIDES

A los carotenoides que contienen átomos de oxígeno se les conoce más específicamente como xantofilas. Los restantes constituyen el grupo de los llamados carotenos.Su color, que varía desde amarillo pálido, pasando por anaranjado, hasta rojo oscuro, se encuentra directamente relacionado con su estructura: los enlaces dobles carbono-carbono interactúan entre sí en un proceso llamado conjugación. Mientras el número de enlaces dobles conjugados aumenta, la longitud de onda de la luz absorbida también lo hace, dando al compuesto una apariencia más rojiza. Por ejemplo, el fitoeno que posee únicamente tres enlaces dobles conjugados absorbe luz en el rango ultravioleta y apareciendo por tanto

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incoloro a la vista, el licopeno, compuesto que confiere su color rojo al tomate contiene 11 enlaces dobles conjugados. Existen también carotenoides de color verde (ζ-Caroteno), amarillo (β-caroteno), y anaranjado.Como ejemplo de estos compuestos en la naturaleza, podemos citar al carotenoide mejor conocido, el que da al grupo su nombre, el caroteno, encontrado en zanahorias y responsable de su color anaranjado brillante.

5.- REACCIONES:

a. ANTOCIANINAS

Medio Acido, Básico

Con glucosa

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Con agua

Al calor

Cuando se somete a altas temperaturas, en presencia de azucares no hay cambios.

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6.- MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES: Vasos de precipitación Tubos de ensayo Gradilla Balón de aforo de 100 mL Papel filtro Capilares Varilla de agitación Pipetas de 10 y 5 mL Mortero y pistilo Reverbero Vasos de 250 ml Vidrio reloj Embudo Trípode Espátula Remolacha Acelga Frutillas Achiote Zanahoria

7.-RESULTADOS:

EXTRACCION Y ANALISIS DE CLOROFILA Cromatografía circular:

Clorofila b color amarillo verdoso

Cromatografía ascendente en papel:

Clorofila b color amarillo verdoso

RECORRIDO MUESTRA (cm)

RfTABLA BIBLIOGRÁFICA

ABSORBANCIA 549 nm CON BARRIDO INTELIGENTE

CLOROFILA A 5,6 0,62

0,65 0,016

Recorrido del solvente 9,0cm

Rf =distancia recorrida por lamuestradistanciarecorridaporelsolvente

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Rf =5,69,0 =0, 62

Propiedades de la clorofila

MUESTRA COLORACIÓNMuestra Original Verde OscuroMuestra + ác. Oxálico 5% Verde pálidoMuestra + NaOH 0,1 N Amarillo verdoso

ANTOCIANINAS

Esta determinación se realizó con fresas, se hizo una solución y se colocó en 9 tubos para realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados:

RESULTADOTubo 1 medir pH 3,43

MUESTRAS COLORACIÓNMuestra original Rosado claroTubo 1 +HCl Rojo naranjaTubo 2 + ácido acético Naranja intensoTubo 2 + agua TomateTubo 3 + NaHCO3 Forma espuma toma un color rojoTubo 4 + NaOH 10% Al añadir el reactivo se forma dos fases la

superior transparente y la inferior amarrillaAl agitar toma un color pardo y luego de un tiempo se hace amarrillo

Tubo 2 + HCl diluido +NaOH 10% Toma un color tomate claroTubo 5 + 10 a 20 mg de ác. Ascórbico Primero no cambia de color

Al calentar se observa un color carne forma una emulsión.

Tubo 6 + bisulfito de K Tomate intensoTubo 7 + FeCl3 Tomate claroTubo 8 + sln. De gelatina Color carne tipo emulsiónTubo 9 + glucosa Rosado pálido se diluye la muestraAlícuota en el vidrio reloj No sufre ningún cambio de color

ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIÓN SOBRE LOS PIGMENTOS

Esta determinación se realizó con zanahoria y acelga

COLORACIÓN TEXTURAVaso 1: agua + zanahoria sin descortezar

Color del agua es ligeramente amarillo

Blanda

Vaso 2: agua + zanahoria sin descortezar + ácido

Agua casi cristalina Semi blando

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AcéticoVaso 3: agua + zanahoria sin descortezar + NaHCO3

Agua toma un color amarillo intenso

Muy blando

COLORACIÓN TEXTURAVaso 1: agua + acelga Agua toma color verde claro BlandaVaso 2: agua + acelga + ácido Acético

Agua toma un colore verde oliva

Semi blando

Vaso 3: agua + acelga + NaHCO3

Agua toma un color verde amarrilento

Muy blando

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE BETANINAS

Se realizó con la remolacha se hizo una solución

RESULTADOSTubo 1 medir pH 6,92Absorbancia = 400 a 540 nm 1,657

MUESTRA COLORACIONMuestra original VinoTubo 1 + HCl No cambiaTubo 2 + NaOH 10% Vino pardoTubo 3 + ácido cítrico RojoTubo 4 + NaHCO3 Vino oscuroMuestra en cápsula al ambiente Se observó que el pigmento de la remolacha

se oscureció. Sin presentar ningún otro cambio

Muestra en cápsula a la luz solar Se observó una separación de fases en el pigmento. Una más densa y otra más leve que quedaba como sobrenadante. Además se observó cierta decoloración.

Muestra en cápsula a la luz artificial No se degrado en su color si, se concentró pues el calor evaporo el agua y además hubo la presencia de un precipitado fucsia

Tubo 5 calentar Cambia el color a los 90 C

COMPORTAMIENTO DURANTE LA COCCIÓN

OBSERVACIONESVaso 1 agua + remolacha entera Agua toma un color rojo claroVaso 2 agua+ remolacha descortezada Agua toma un color moradoVaso 3 agua + remolacha descortezada y troceada

Agua toma un color vino intenso

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EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE CAROTENOIDES A PARTIR DE ACHIOTE

RESULTADOSAbsorbancia=471 ó 482 nm 1. 344Contenido de bixina 0,2 %8.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

EXTRACCION Y ANÁLISIS DE CLOROFILA Se obtuvo un extracto cetónico de acelga de color verde obscuro.

Cromatografía circular Por falta de reactivos se aplicó como solvente la misma acetona, y luego se utilizó éter

etílico, este solvente arrastró las marcas del extracto de los puntos de aplicación a una gran velocidad y se observó con claridad una mancha verde amarillenta lo que nos indica que podría tratarse de la clorofila b.Aunque según datos bibliográficos la acelga por ser una planta superior contiene los dos tipos de clorofila y en mayor cantidad la clorofila pero tal vez en la cromatografía no se identifica debido a que esta se degrada más fácilmente por lo que se observa la clorofila bCromatografía ascendente en tira de papel

El extracto de acelga mediante la Cromatografía ascendente en tira de papel no presentó diferencia con la cromatografía circular ya que de igual manera se observó una manchita verde amarilla y al comparar los Rf con los de la tabla de bibliografía nos dio como resultados la existencia de clorofila b.

Según estos resultados podemos decir que para la extracción de clorofila tanto la cromatografía ascendente en tiras de papel como la circular son eficientes y eficaces ya que se separó claramente y de forma definida la mancha correspondiente a clorofila.

Se midió la absorbancia a 549 nm con un barrido inteligente ya que 640-667 nm como indica en la práctica no se observó ningún resultado.

Propiedades de la clorofila

El extracto más ácido oxálico al 5% cambio de color verde obscuro a color verde pálido esto se debe a que en medio ácido y con calor, la clorofilas pueden pasar a feofitinas que sería la misma estructura pero se sustituye el átomo de magnesio presente en el centro de anillo tetrapirrólico por un átomo de hidrógeno lo cual explica el cambio de color.

El extracto acetónico más NaOH 0.1 N cambio de color verde intenso a color amarillo verdoso estos cambios notorios se debe a que la estructura química compleja de la clorofila es fácilmente alterable por pH.

No se pudo diferenciar mediante reacción la clorofila a y b ya que el reactivo utilizado (KOH 2% en metanol) no se encontró en la concentración requerida (KOH 30% en metanol).

ANTOCIANINAS

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Esta determinación se realizó con fresas, se hizo una solución y se colocó en 9 tubos para realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados:

Se pudo observar que los cambios de pH son factores muy importantes en determinación de antocianinas ya que éstas son más estables en un medio ácido que en un medio neutro o alcalino. Al añadirle ácidos como lo hicimos en la práctica la forma predominante es la del ión flavión, el cual explica el color rojo anaranjado, cuando se somete a ph básicos como NaHCO3 o NaOH el ión flavilio es susceptible al ataque nucleofílico por parte del agua dando carbinol a pH 4,5 y seguido de la forma chalcona lo cual explica el color que obtuvimos como resultado.

Además obtuvimos el pH de la solución de fresas el cual es ácido lo cual concuerda con lo estudiado ya que es más estable a pH ácido que básico o neutro.

ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIÓN SOBRE LOS PIGMENTOS

Esta determinación se realizó con zanahoria y acelga

Después de haber sometido la muestra de zanahoria y acelga en agua con ác. Acético o con bicarbonato de sodio se observa que existen cambios de color en las muestras debido a la susceptibilidad de las mismas a la temperatura de cocción y al pH que se los ha expuesto, ya que las antocianinas son sensibles al calor y pH por lo que se degradan, los carotenoides son relativamente resistentes al calor y pH pero pueden sufrir transformaciones parciales en su isomería geométrica lo cual provoca cambios y de igual manera los la clorofila se degrada cuando existe altas temperaturas como es la que se utiliza para la cocción de un alimento.

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE BETANINAS

Pudimos observar que existen cambios de coloración en los tubos debido a los diferentes reactivos utilizados ya que alteran la estabilidad de las betaninas, los colores cambian cuando existe un pH muy acido bajo de 3 aquí la intensidad de la coloración decrece, cuando existe un pH básico es color es mas intenso debido un efecto betacrómico, por lo que la remolacha se encuentra entre un pH de 3 a 7 en donde esta es inalterable.

De igual forma son inestables a altas temperaturas en donde las betaninas producen isobetatinas o betaninas descarboxiladas.

En los vasos que contenían el alimento únicamente con agua se demoró su cocción y la carne mantuvo su forma en cambio en los vasos con ácido acético varió ligeramente su forma.

Al comparar el efecto de la cocción entre los tres vasos se pudo notar que el vaso con bicarbonato de sodio sale en el menor tiempo y un exceso de éste hace que tanto la carne como la acelga se desmenuce y la textura sea muy blanda.

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10.- CONCLUSIONES:

Logramos realizar la extracción y análisis de pigmentos alimentarios vegetales. En la práctica se pudo extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta

vulgaris var. Cicla) mediante cromatografía circular y cromatografía ascendente en tira de papel, no con los reactivos adecuados pero pudimos realizar la extracción y análisis por cromatografía en papel filtro, reemplazando al papel Cromatográficos, obteniendo buenos resultados y pudiendo distinguir el tipo de clorofila que existe en la acelga, logrando distinguir clorofila b en el extracto de acelga tanto en cromatografía circular como en la ascendente por papel sin embargo por no falta de metanol para la preparación del reactivo no se pudo identificar mediante pruebas de coloración.

Determinamos las antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca). Pudiendo obtener resultados que se los pueden observar a la vista, y se pudo comprobar la sensibilidad que estos compuestos presentan, siendo altamente sensibles al a luz, a medios ácidos y alcalinos sean estos fuertes o débiles, en general en medio ácido son de color rojizo y en el alcalino son verde oliva y el color natural que es rojo.

Conocimos el efecto de la cocción sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria

(Daucus carota), donde conocimos el comportamiento de esta en los diferentes

reactivos en que realizamos las diferentes pruebas, conocer el efecto de la cocción

sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria y de la acelga donde al ser cocidas en

agua liberan sus pigmentos cambiando el color del agua en tanto que le dan textura

suave al alimento pues debe desnaturalizarse los componentes a la acción del calor, al

igual que sucede con el ácido acético al 10% y el NaHCO3 al 10%, con excepción en la

zanahoria no se liberan los pigmentos con ácido acético al 10%.

Obtuvimos las betaninas presentes en la remolacha (Beta vulgaris) mediante la

extracción y análisis en la práctica.

Determinamos y analizamos los carotenoides presentes en el achiote (Bixa orellana).

11.- BIBLIOGRAFÍA:

Pigmentos vegetales, clasificación, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentos-vegetales.php

Clorofila, betalinas, carotenos, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm

Pigmentos alimentarios vegetales, extracción, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://innovaindustria.blogspot.com/2009/10/pigmentos-naturales-en-alimentacion.html

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Clorofila, tipos de clorofila, cromatografía circular, papel ascendente, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://botikanaturista.blogspot.com/2007/01/la-clorofila.html

Fundamento de las clorofilas, carotenoides, pigmentos vegetales, consultado el 2012-11-12, disponible en: Pigmentos alimentarios: http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol14_2_00/ali07200.htm

Los alimentos vegetales y sus pigmentos, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://www.ikerlarre.e.telefonica.net/paginas/pigmentos.htm

Alimentos, consultado el 2012-11-12, disponible en: www.kalsec.com/es/products/annatto_pg_norbixin.cfm

Alimentos naturales, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://bus.sld.cu/revistas/bi/vol22-1-03/ibio07103.pdf

12. ANEXOS

Pruebas con la zanahoria Pruebas con la zanahoria

Pruebas con la remolacha Pruebas con la remolacha

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Determinacion de antocianinas Prueba con la remolacha

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