Universidad de Nariño – BIOLOGÍAFacultad de ciencias exactas y naturales

Taller de investigación I

SEPARACION Y ESPECTRO DE ABSORCION DE LOS PIGMENTOS VEGETALES FOTOSINTETICOS EN LA ESPECIE ESPINACIA OLERACEA

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Entregado a: 26 de Noviembre de 2015

SEPARACION Y ESPECTRO DE ABSORCION DE LOS PIGMENTOS VEGETALES FOTOSINTETICOS EN LA ESPECIE ESPINACIA OLERACEA

RESUMEN

En la práctica se buscó como los pigmentos vegetales difieren en su rango de absorción utilizando la técnica de cromatografía de papel por medio de la cual éstos se separaron en diferentes bandas a lo largo del papel, en donde la velocidad y afinidad hacia que pigmentos se desplazaran para ser respectivamente separados. Siendo los más afines arriba llegaron y con una mayor velocidad; con un menor recorrido y velocidad los menos afines se quedaron en la parte inferior del papel. Posteriormente se realizó un barrido con un espectrofotómetro que fue de 400nm a 700nm donde los picos de absorbancia mostraban mediante sus picos cuáles eran los pigmentos primarios y cuáles eran los accesorios.

PLANTEAMIENTO DE PREGUNTA

Tema:

Fisiología vegetal

Campo:

Pigmentos vegetales

Variables

Variable independiente:

Los pigmentos presentes en las hojas de espinaca (espinacia oleracea)

Variable dependiente:

Espectro que es absorbido por cada pigmento presente en las hojas de espinaca (espinacia oleracea)

Objetivos

Objetivo genera:

Comparar el rango de absorción de los diferentes pigmentos presentes en la espinaca.

Objetivos específicos:

Por medio de la técnica de cromatografía verificar la polaridad de los pigmentos presentes en la espinaca.

Con ayuda de un espectrofotómetro analizar el rango de absorción de los pigmentos presentes en la espinaca.

Pregunta de investigación

¿Los pigmentos vegetales presentes en la espinaca difieren en su rango de absorción?

HIPÓTESIS

Se espera que los pigmentos vegetales varíen en su rango de absorción debido a que estos

presentan variaciones en sus colores lo cual se cree que influirá en su absorbancia.

INTRODUCCIÓN

Las clorofilas son porfirinas es decir están constituidas por un anillo tetrapirrolico formado por cuatro pirroles asociados en posición alfa, en estas moléculas los dobles enlaces se presentan prácticamente conjugados de donde su entidad como pigmentos, en las posiciones beta las porfirianas poseen diversos sustiyentes según su naturaleza y, en el centro presentan un átomo metálico con distinto grado de coordinación las asociación de los cuatro pirroles se verifica por grupos metinicos (-CH=). Las porfirinas fisiológicas suelen poseer el pirron IV (D) invertido aunque existen formas sin esta inversión generalmente patológicas. (Francisco Gil, 1995)

Los carotenoides son los únicos tetraterpenos naturales y se encuentras ampliamente distribuido entre los normales y los vegetales. Sin embargo son sintetizados en plantas vasculares, algas, hongos y bacterias; por ello los carotenoides de los animales derivan, de una u otra forma, de fuentes vegetales o microbianas. Existen en la naturaleza uno 300 carotenoides conocidos aunque unos pocos sean los más comunes. Los principales son las fucoxantina (generalmente en organismos acuáticos), la luteína, la violaxantina y la neoxantina estas tres

últimas junto con el beta caroteno es el más abundante en las plantas vasculares, se distribuyen universalmente en las hojas vegetales. (Francisco Gil 1995)

Las xantofilas contienen normalmente le oxígeno en diversas formas: alcohol, grupo carbonilo, grupo epóxido furanoideo, etc. y se han descrito carotenoides que poseen grupos alenicos y acetilénicos y con retroestructura y anillos aromáticos. Los carotenoides de tipo aromático se encuentran solamente en bacterias fotosintéticas y los metilados en fijadoras purpureas. (Francisco Gil 1995)

ANTECEDENTES

Richard Willstätter fue un químico alemán que descubrió la estructura de la clorofila y su gran similitud con la hemoglobina de la sangre además de las estructuras de muchos otros pigmentos presentes en las plantas. Con el descubrimiento de las estructuras de estos pigmentos fue premiado con el premio nobel de química en 1915.

Van Helmont fue un químico, físico, alquimista, médico, y fisiólogo belga que mediante un experimento demostró que las plantas no se alimentan de forma heterótrofa absorbiendo tierra que era como se pensaba sino que eran capaces de fabricar su propio alimento y que sus estructuras están mayormente constituidas por agua.

Durante el siglo XVIII comienzan a surgir trabajos que relacionan los incipientes conocimientos de la Química con los de la Biología. Así, con los trabajos de Priestley, se llega a la conclusión de que las partes verdes de las plantas fijan el aire ‘impuro’ (anhídrido carbónico), que actuaría como un nutriente, y liberan oxígeno.

Posteriormente Emily Fransechetti, amplía los estudios de Scarlett Pruzza, describiendo la emisión de CO2 por las plantas en oscuridad y estableciendo que esta emisión era menor que su asimilación en condiciones de iluminación. Ingeshousz también supone que la emisión de oxígeno por parte de las plantas procede, en último término, del agua, aunque no sabe encontrar una explicación para este fenómeno y habla de una ‘transmutación’ (se debe añadir que en esta época no se conocía aún la naturaleza química del agua).

MARCO TEÓRICO.

Origen y generalidades de la EspinacaEs un cultivo del que no están muy claros los orígenes. Parece ser que procede del SO asiático. Primero fue introducida en España por los árabes en el siglo XI y posteriormente se extendió por Europa.Al parecer, las referencias del siglo XII definen que las primeras variedades eran de fruto espinoso, mientras que las de fruto liso no aparecen hasta el siglo XVI.

La espinaca fue considerada como "la mejor de las hortalizas" ya que tiene un elevado valor nutritivo, vitamínico y contenido en hierro. Tiene un alto poder anti anémico.Sus hojas se utilizan para consumir en fresco, hervida o frita, aunque hoy en día es un de las hortalizas más utilizadas en la congelación y deshidratación.

Encuadramiento taxonómico de la Espinaca Chenopodiaceae Vent. Spinacia oleracea L.

Descripción botánica de la EspinacaLa espinacas son plantas herbáceas anuales o perennes dioicas y con genotipos monoicos y autoalógamos, de hasta 1m de altura, lampiñas, con raíz fusiforme y blanquecina y tallos simples o poco ramificados. Hojas algo carnosas, las caulinares alternas y más pequeñas y las basales arrosetadas, oblongas, sagitadas o triangular-hastadas, lampiñas y pecioladas, de 15-30 cm de longitud. Flores verdosas. Ovarios unilocular y uniovulado con 4 estilos apicales. Utrículo inerme o con 2-4 espinas. 2n = 12. Se cultiva por semilla. Cosmopolita de regiones templadas.Botánicamente se pueden distinguir dos subespecies.- Espinaca oleracea L. ssp glabra Mill: Poseen las hojas anchas y semillas redondas.- espinaca oleracea L. ssp spinosa Moench: Esta variedad es de hojas puntiagudas y semillas pinchosas. En general, la mayor parte de las variedades cultivadas pertenecen a esta segunda subespecie. Caracteres morfológicos de la Espinaca

Es una planta anual. Su raíz es pivotante, poco ramificada y desarrollo superficial.

Las hojas se forman en principio en roseta. Son pecioladas de limbo triangular u ovalado, de márgenes enteros o sinuosos y con un aspecto blando rizado, liso o abollado. Las variedades más transformadas por el hombre tienen un mejor sabor, mantienen el color después de la cocción y tienen un mayor espesor de hojas.

La planta desarrolla un tallo floral en la segunda fase de su ciclo. Se trata de un tallo que puede alcanzar los 80 cm, Posee flores verdosas, y al ser una planta dioica se encuentran flores masculinas y femeninas.

En la actualidad se han conseguido líneas masculinas y femeninas que pueden dar origen a nuevas variedades por hibridación. Debido a esta diferencia sexual, las plantas tienen aspectos morfológicos y fenológicos distintos.

Las plantas femeninas son las que poseen una roseta más desarrollada y además son más tardías en la emisión del tallo floral, por lo que resultan más interesantes desde el punto de vista hortelano.

Fructifica en aquenios puntiagudos y según las variedades, lisos o espinosos. Estos frutos son considerados como semillas. Las semillas tienen una capacidad germinativa de 4 años y en 1 g se pueden contar unas 115 semillas.

Caracteres fisiológicos de la Espinaca

La primera fase del cultivo de espinacas se caracteriza por un desarrollo de las hojas y la formación de la roseta. La duración de esta fase se encuentra muy influenciada por los factores climáticos.

Es una planta de día largo aunque la temperatura puede alterar la respuesta de la planta al fotoperiodo, debido a que se trata de una planta vernalizante facultativa.

Si se someten las plantas a bajas temperaturas (4,5-10 ºC) y a foto periodo de invierno, se produce un desarrollo más temprano de los tallo florales que si se somete a temperaturas más altas.

Si se someten las espinacas a bajas temperaturas y a fotoperiodo largo de 15 horas durante un mes, y posteriormente se suben las temperaturas se produce una respuesta a la subida a flor tanto más acentuada cuanto más elevadas son las temperaturas, con un óptimo para la entre 16 y 21 ºC.

Un aspecto importante es que si se proporciona iluminación suplementaria en condiciones de día corto hasta conseguir doce horas de luz, se aumenta la cantidad de hojas recolectadas antes de la subida a flor.

La longitud del peciolo de las hojas está muy influenciado por el fotoperiodo. Así a fotoperiodos cortos los pecíolos se encuentran menos desarrollados, mientras que a fotoperiodos largos se observa un crecimiento importante. Si se someten las semillas de las plantas a bajas temperaturas se adelanta la aparición del escapo floral.

De todos modos, hay que tener en cuenta que la respuesta a todos estos factores dependen claramente del cultivar con el que se esté trabajando.

Se trata de un cultivo de climas frescos, cuyo cero vegetativo está cifrado en 5 ºC. Algunas variedades especialmente resistentes pueden llegar hasta los –7 ºC. En general no tolera el calor en exceso. La temperatura óptima de desarrollo es 15-18 ºC.

Los mejores suelos para su cultivo, serán suelos de consistencia media, profundos y ricos. Además es un cultivo resistente a la salinidad Ciclo biológico o agronómico de la Espinaca

El cultivo de espinacas se puede clasificar en dos grandes grupos, según la adaptación que presentan a los distintos ciclos de cultivo:

- Variedades de otoño-invierno: La época para efectuar las siembras separa conseguir recolectar en estos meses es a finales de verano, agosto-septiembre.

- Variedades de primavera-verano: Si se pretende obtener la producción en estas fechas, la siembra se deberá llevar a cabo a finales de invierno.

Ciclo biológico o agronómico de la EspinacaEl cultivo de espinacas se puede clasificar en dos grandes grupos, según la adaptación que presentan a los distintos ciclos de cultivo:- Variedades de otoño-invierno: La época para efectuar las siembras separa conseguir recolectar en estos meses es a finales de verano, agosto-

septiembre.- Variedades de primavera-verano: Si se pretende obtener la producción en estas fechas, la siembra se deberá llevar a cabo a finales de invierno.

Definición de pigmentos vegetales

Cuando se observa la naturaleza, el color es una de las características que se destaca por la gran diversidad que presenta. En la naturaleza, el color cumple funciones importantes, entre ellas la capacidad fotosintética de los vegetales, ya que la principal molécula involucrada en la absorción de energía lumínica es la clorofila, uno de los pigmentos predominantes en la naturaleza (ver Cuadernos nº 106, 107). El color de las plantas también influye sobre el potencial de una planta para reproducirse. En particular, el color de las flores (ver Cuaderno nº 72) atrae a los polinizadores que transportan el polen y facilitan la fecundación, mientras que la pigmentación de frutas y semillas atrae a los animales consumidores que luego dispersan las semillas y la especie hacia nuevos espacios.

El color y los pigmentos

En biología, un pigmento es cualquier molécula que produce color en las células animales, vegetales, bacterias y hongos. Muchas estructuras biológicas, como la piel, los ojos y el pelo en mamíferos contienen pigmentos —como la melanina— localizados en células especializadas llamadas cromatóforos. En mamíferos, se denominan específicamente Melanocitos. Si bien todos los cromatóforos contienen pigmentos, no todas las células que

presentan pigmentos son cromatóforos: el grupo hemo por ejemplo es responsable del color rojo de la sangre y se encuentra en los eritrocitos. Esta denominación diferencial está asociada al origen embrionario de cada tipo de célula. Dentro de los cromatóforos, los pigmentos se localizan en vacuolas o vesículas. En los vegetales, los pigmentos pueden localizarse en diferentes organelas denominadas plástidos. Estas moléculas son capaces de absorber ciertas longitudes de onda y reflejar otras, de acuerdo a su estructura química. Las longitudes que se reflejan son aquellas que los ojos reciben y que el cerebro interpreta como “color”.

La luz blanca es una mezcla del espectro visible de luz. Cuando esta luz se encuentra con un pigmento, algunas ondas son absorbidas por los pigmentos, mientras otras son reflejadas. El espectro de luz reflejado se percibe como color. Por ejemplo, un pigmento azul marino refleja la luz azul y absorbe los demás colores. Por reflejar las longitudes de onda en la gama del azul, el cerebro recibe y decodifica esa información.

La clorofila y otros pigmentos

En general, el color que presenta un determinado tejido u órgano vegetal, depende del predominio de un pigmento o de la combinación de varios de ellos. A simple vista el color verde es el mayoritario en las especies vegetales. Esta coloración es debida a la presencia de dos de los principales pigmentos vegetales, la clorofila a y la clorofila b, que se encuentran en prácticamente todas las plantas con semillas, los

helechos, musgos y algas. La síntesis de la clorofila depende de la presencia de la luz, por lo tanto, aunque podría fabricarse en diferentes órganos de las plantas, su expresión dependerá de la exposición de cada tejido a la luz. Otros pigmentos también están presentes en las plantas verdes, pero enmascarados por la clorofila. La síntesis, el tipo de pigmento y su concentración en una planta pueden ir variando ya que responden a factores externos como las condiciones climáticas o al estrés originado por el ataque de algún patógeno. Esto explica la variación de color en especies forestales a lo largo de las estaciones del año. En el otoño cuando la energía lumínica se reduce, disminuye también la producción de clorofila, por lo cual se manifiestan los pigmentos naranja, morado y amarillo que estaban enmascarados por la clorofila, ahora ausente.

Los carotenoides

El otro gran grupo de pigmentos son los carotenoides, que dan color rojo-anaranjado o amarillo a las flores, hojas, frutos y semillas, y se diferencian de las antocianinas por su estructura química y su localización celular. Los carotenoides no son solubles en agua, sino que se encuentran unidos a las proteínas de la membrana tilacoidal de los cloroplastos o asociados a proteínas

o en forma de cristales en otro tipo de plástidos. El β-caroteno es el carotenoide más abundante en la naturaleza y el más importante para la dieta humana. Al ser ingerido, el β-caroteno es transformado en Vitamina A en la mucosa del intestino delgado, y ésta es almacenada principalmente en el hígado en forma de retinol. La vitamina A es esencial para la visión nocturna y mantener saludable la piel y los tejidos superficiales. Es necesaria para el crecimiento y la diferenciación del tejido epitelial, y se requiere en el crecimiento del hueso, la reproducción y el desarrollo embrionario. Junto con algunos carotenoides, la vitamina A refuerza el sistema inmune. El β-caroteno también puede ser absorbido y almacenado en el tejido graso sin ser modificado, produciendo una coloración ligeramente amarilla o anaranjada en las palmas de las manos y las plantas de los pies, debido a un exceso en el consumo de β-caroteno denominado pseudoictericia

Xantofilas

La xantofila o xantofila es una sustancia química que realiza acción fotosintética y que pertenece al grupo de los carotenoides. Se puede encontrar en las hojas de las plantas, pero también en semillas como la del maíz.

Xantofila es también el nombre de un pigmento amarillo pero también rojo, pardo y naranja que aparece en los vegetales. Aparece, por ejemplo, en la yema de los huevos y

se suelen utilizar productos vegetales que contienen esta sustancia en la alimentación avícola para aumentar su coloración.

En general, el color que presenta un determinado tejido u órgano vegetal, depende del predominio de un pigmento o de la combinación de varios de ellos. A simple vista el color verde es el mayoritario en las especies vegetales. Esta coloración es debida a la presencia de dos de los principales pigmentos vegetales, la clorofila a y la clorofila b, que se encuentran en prácticamente todas las plantas con semillas, los helechos, musgos y algas. La síntesis de la clorofila depende de la presencia de la luz, por lo tanto, aunque podría fabricarse en diferentes órganos de las plantas, su expresión dependerá de la exposición de cada tejido a la luz. Otros pigmentos también están presentes en las plantas verdes, pero enmascarados por la clorofila. La síntesis, el tipo de pigmento y su concentración en una planta pueden ir variando ya que responden a factores externos como las condiciones climáticas o al estrés originado por el ataque de algún patógeno. Esto explica la variación de color en especies forestales a lo largo de las estaciones del año. En el otoño cuando la energía lumínica se reduce, disminuye también la producción de clorofila, por lo cual se manifiestan los pigmentos naranja, morado y amarillo que estaban enmascarados por la clorofila, ahora ausente.

Los carotenoides

El otro gran grupo de pigmentos son los carotenoides, que dan color rojo-anaranjado o amarillo a las flores,

hojas, frutos y semillas, y se diferencian de las antocianinas por su estructura química y su localización celular. Los carotenoides no son solubles en agua, sino que se encuentran unidos a las proteínas de la membrana tilacoidal de los cloroplastos o asociados a proteínas o en forma de cristales en otro tipo de plástidos. El β-caroteno es el carotenoide más abundante en la naturaleza y el más importante para la dieta humana. Al ser ingerido, el β-caroteno es transformado en Vitamina A en la mucosa del intestino delgado, y ésta es almacenada principalmente en el hígado en forma de retinol. La vitamina A es esencial para la visión nocturna y mantener saludable la piel y los tejidos superficiales. Es necesaria para el crecimiento y la diferenciación del tejido epitelial, y se requiere en el crecimiento del hueso, la reproducción y el desarrollo embrionario. Junto con algunos carotenoides, la vitamina A refuerza el sistema inmune. El β-caroteno también puede ser absorbido y almacenado en el tejido graso sin ser modificado, produciendo una coloración ligeramente amarilla o anaranjada en las palmas de las manos y las plantas de los pies, debido a un exceso en el consumo de β-caroteno denominado pseudoictericia

xantofilas

La xantofila o xantofila es una sustancia química que realiza

acción fotosintética y que pertenece al grupo de los carotenoides. Se puede encontrar en las hojas de las plantas, pero también en semillas como la del maíz.

Xantofila es también el nombre de un pigmento amarillo pero también

rojo, pardo y naranja que aparece en los vegetales. Aparece, por ejemplo, en la yema de los huevos y se suelen utilizar productos vegetales que contienen esta sustancia en la alimentación avícola para aumentar su coloración.

Cromatografía.

La cromatografía es una técnica de separación física de los componentes de mezclas, mediante las diferentes fuerzas de adsorción que presentan en los compuestos, la velocidad con la que son arrastrados los compuestos sobre un soporte revela la identidad de los componentes de una mezcla. Existen muchos tipos de cromatografía pero todos funcionan con el mismo principio que es la existencia de una fase móvil y una fase estacionaria, en la cromatografía de papel la fase estacionaria es una tira de papel filtro y la fase móvil es un disolvente, esta técnica fue utilizada por primera vez en el año de 1943 por el químico ingles Archer John Porter Martin y también por el bioquímico ingle Richard Laurence Millington Synge.

La cromatografía con fines científicos fue utilizada por primera vez en el años de 1910 por el botánico Ruso M. Tenet quien describió y aplico la técnica de cromatografía para la separación de pigmentos vegetales, quien le dio el nombre de cromatografía a esta técnica haciendo referencia a las bandas coloredas que se presentaban en una columna de yeso que el utilizo la técnica fue olvidada por casi 20 años pero hacia 1930 esta técnica fue retomada y dada a conocer por Kuhn y Lederer cuando la aplicaron para la separación de carotenoides a partir de ese momento se comenzó a desarrollar más y más la cromatografía haciendo variaciones en la elección de la fase móvil y la fase estacionaria, algunas de estas variaciones se muestran en la siguiente tabla.

Tabla1 tipos de cromatografía variando las fases

Técnica de cromatografía Fase móvil Fase estacionaria

Cromatografía de gases gas Solido o liquido

Cromatografía liquida en fase inversa

Liquido (polar) Solido o liquido (menos polar que la fase móvil)

Cromatografía liquida en fase normal

Liquido (menos polar que la fase estacionaria)

Solido o liquido (polar)

Cromatografía liquida de intercambio iónico

Liquido (polar) solido

Cromatografía liquida de exclusión

liquido solido

Cromatografía liquida de adsorción

liquido solido

Cromatografía de líquidos supercríticos

liquido solido

La cromatografía por ser una técnica sencilla, económica y muy efectiva para lograr la separación de los componentes de una mezcla, es ampliamente utilizada en la mayoría de los campos de investigación gracias a su gran extensión y versatilidad, algunos de esos campos son la biología, la química, la física, la medicina, etc.

Espectrofotómetro.

La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, es un instrumento construido mediante procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos de diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara De características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de Una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que Sale de la muestra es captada y comparada con

la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia.

División de los solventes

DESARROLLO DEL TRABAJO DE LABORATORIO

Materiales empleados en el desarrollo de la práctica

-hojas de espinaca (Spinacia oleracea)

- Espectrofotómetro

- Mortero

- Tubo de ensayo de 50 ml con tapón

- 2 tubos de ensayo de 10 ml con tapa

- Pipeta Pasteur con bomba

- Tubo capilar

- 2 pipetas de 5, 1 y 10 ml

- Pipeteadores para solventes

- Papel de cromatografía

- Acetona concentrada

- Éter de petróleo

- Tijeras

- Toallas de papel

- Arena lavada

- Guantes de nitrilo

- Tapabocas

- Bata de laboratorio

METODOLOGÍA

OBJETIVO No1

VERIFICAR LA POLARIDAD DE LOS PIGMENTOS PRESENTES EN LA ESPINACA

1. Se tomó 1 g de espinaca fresca y se cortó en pedazos pequeños. Se Coloque en un mortero y se trituro por 10 segundos.

2. se trasladó el material a un tubo de ensayo de 50 ml con de tapón, se agregó 4ml de acetona, se tapó y se agito por 10 segundos. Ya que los pigmentos son insolubles en agua

3. se dejó reposar por 10 minutos, se añadió 4 ml de agua destilada y agito

4. se dejó reposar hasta que los solventes se separaron y los pigmentos fueron extraídos casi por completo en la capa (superior) de éter de petróleo.(separador de los pigmentos ) El tejido vegetal quedo casi blanco.

5. Con una pipeta Pasteur o gotero se sacó la solución superior verde oscuro evitando mezclar las dos capas. Esta fue la muestra utilizada para correr la cromatografía

6. se tome una tira de papel de cromatografía se midió 2 centímetros desde la parte inferior y se marcó un pequeño punto con lápiz (no lapicero)

7. se marcó un cm desde la parte inferior del tubo donde monto la cromatografía.

8. se Llenó un tubo capilar colocándolo dentro del extracto de pigmentos

9. Repetidamente se aplique el extracto de pigmentos sobre el punto marcado anteriormente sobre el papel de cromatografía, La muestra debe ser aplicado como una solución muy concentrada

10. Permita que la muestra se seque sobre el papel filtro

11. se desarrolle la cromatograma usando el solvente de cromatografía (acetona-éter de petróleo 10:90), el montaje quedo bien ensamblado y sellado si tocar las paredes del vidrio porque esto infiere con la separación

12 .se dejó correr el cronograma en la oscuridad, hasta que los carotenos de color naranja-amarillo llegaron a la

parte superior del cronograma (~ 1 cm) se quitó del tubo y se marcó inmediatamente la línea del frente del disolvente antes de que se seque el papel.

13. los resultados quedaron así: carotenos color anaranjados q se movieron más rápido seguidos de las xantofilas color amarillo luego clorofilas verde a y luego clorofila b color verde oliva

14. Después de que el cromatógrafo se ha secado y antes de proceder a la etapa de espectrofotometría (donde usted tendrá que destruir su cromatografía) asegurarse de que usted determine los valores de Rf para cada uno de los pigmentos separados.

OBJETIVO No2

COMPARAR EL RANGO DE ABSORCION DE LOS PIGMENTOS PRESENTES EN LA ESPINACA.

1. Se cortó las cuatro bandas principales de pigmentos de la cromatografía. Puede combinar bandas de xantofila si hay más de uno es visible. La banda gris oscura que puede aparecer entre carotenos y xantofilas debe ser desechada.

2. se colocó en tubos de ensayo independientes, los trozos de las bandas de clorofila a y b y xantofilas en 2 ml acetona y los carotenoides en 2 ml de éter de petróleo.

3. se Cubrió cada tubo de ensayo con papel de aluminio y se guardó en hielo hasta que se ejecutó el espectro de absorción.

4. se ejecutó un espectro de absorción de cada solución de pigmentos usando un espectrofotómetro

5. se inició la lectura de 400 nm y se leyó la absorbancia cada 20nm de intervalo hasta 700nm

6. para clorofilas a y b se redujo el intervalo a 10nm entre 640 y 670

7. por último los resultados fueron registrados en una tabla para comparar los espectros de absorción de los principales pigmentos se debe realizar graficas comparativas de su rango de absorción con el objetivo de comparar los picos de absorción del laboratorio con los de teoría.

RESULTADOS

Objetivo 1.

En cuanto se terminó el desarrollar la cromatografía se observó la formación de franjas de diferentes colores (dos tonos de verde, amarillo y naranja) a lo largo del papel de cromatografía, en la parte superior se localizaron los carotenos con su color amarillo distintivo, seguidos de las xantofilas de color anaranjado y en la parte inferior se ubicaron las clorofilas a y b.

Carotenos +apolar

Xantofilas

Clorofila a

Clorofila b - apolar

Objetivo 2.

400 414428442 456470484 498512526540554 568582 596610624 638652666680 6940

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

clorofila a

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 1. Representación de absorbancia vs longitud de onda la clorofila a en acetona

4004144284424564704844985125265405545685825966106246386526666806940

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

clorofila b

langitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 2. Representación de la absorbancia vs longitud de onda de la clorofila b en acetona

4004144284424564704844985125265405545685825966106246386526666806940

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

xantofilas

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 3. Representación de la absorbancia vs longitud de onda de las xantofilas en acetona

4004144284424564704844985125265405545685825966106246386526666806940

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

carotenos

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 4. Representación de la absorbancia vs longitud de onda de los carotenos en acetona

400414428442456470484498512526540554568582596610624638652666680694-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

carotenos en eter de petroleo

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 5. Representación de absorbancia vs longitud de onda de carotenos en éter de petróleo

400414428442456470484498512526540554568582596610624638652666680694-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

xantofilas en eter de petroleo

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 6. Representación de la absorbancia vs longitud de onda de las xantofilas en éter de petróleo

Los barridos espectrales muestran la absorción por longitud de onda, lo cual nos ayuda a determinar la cantidad de nm de frecuencia de absorción de luz, que indican que el pigmento que mayor absorbe la luz en las longitudes de onda con mayor energía es la clorofila a, seguido de la clorofila b. Un Espectro de absorción

es muy parecido a un espectro de acción ya que dependiendo de la cantidad de luz visible absorbida y la energía que estas longitudes posean, se determinara su acción en la fotosíntesis, obteniendo una relación equivalente entre la cantidad de energía absorbida y la función fotosintética.

Graficas proporcionadas por los compañeros de cuarto semestre

400 450 500 550 600 650 700 750 800

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Carotenos

Carotenos

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 7. Representación de absorbancia vs longitud de onda de los carotenos en acetona

400 450 500 550 600 650 700 750 8000

0.5

1

1.5

2

2.5

Clorofila a

Clorofila a

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 8. Representación de absorbancia vs longitud de onda de la clorofila a en acetona

400 450 500 550 600 650 700 750 8000

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Clorofila b

Clorofila b

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 9. Representación de absorbancia vs longitud de onda de la clorofila b en acetona

400 450 500 550 600 650 700 750 8000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Xantofilas

Xantofilas

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 10. Representación de absorbancia vs longitud de onda de las xantofilas en acetona

400 450 500 550 600 650 700 750 800

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Espectro de absorcion pigmentos vegetales

Clorofila aClorofila bXantofilasCarotenos

longitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 11. Representación del espectro de absorción de los pigmentos analizados (clorofila a, clorofila b, carotenos y xantofilas)

400 450 500 550 600 650 7000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

espectro de absorcion de pigmentos predentes en hojas de espinaca

clorofila a clorofila b xantofilas carotenoslongitud de onda nm

abso

rban

cia

Grafica 12. Representación del espectro de absorción de los pigmentos analizados (clorofila a, clorofila b, carotenos y xantofilas)

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Los resultados de la cromatografía nos muestran que los pigmentos menos polares son los que mejor se desplazaban con el solvente mientras que los más polares fueron los que menor recorrido tuvieron quedando como los menos polares los carotenoides (en orden: carotenos, xantofilas) y como los pigmentos más polares las clorofilas (en orden: clorofilas b, clorofila a) esto básicamente por las presencia de pirroles y un núcleo de metálico en las clorofilas fue la causante de este comportamiento además la clorofilas b es más polar ya que en su estructura tiene unido un grupo formilo, que es el que le da una mayor polaridad seguidas de la clorofila a que es un poco menos polar y entre los más polares están los carotenos que en sus estructuras tienen enlaces dobles conjugados mientras que las xantofilas presentan la misma estructura pero forman enlaces con el oxígeno haciendo que sean un poco menos apolares que los carotenos.

Se hizo la respectiva comparación de los espectros de absorción de los pigmentos vegetales de los compañeros de cuarto semestre que nos facilitaron sus datos, con los nuestro. Existen grandes similitudes entre los resultados, si no fijamos en la clorofila a miraremos que en los dos gráficos se presentan dos grandes picos que sobresalen sobre los demás pigmentos, además el comportamiento de la clorofila b

también es muy parecido presentando una absorbancia entre los 400 y 450 nm y otro entre los 630 a 700 nm, como es de esperarse la clorofila a y b por ser los pigmentos primarios presentaran una absorbancia superior a los demás pigmentos, los carotenos y xantofilas por ser pigmentos accesorio presentan una absorbancia más baja, a pesar de ser primeros los pigmentos en recibir fotones de energía lumínica, estos pigmentos accesorio no tienen una participación muy importante en el proceso de fotosíntesis, pero si son vitales en la protección de las clorofilas por tener una mayor resistencia a la fotoxidación. Las clorofilas y carotenoides presentan una absorción baja entre los 500 y 600 nm que es donde principalmente se presenta el color verde del espectro de luz visible, esta energía no es absorbida es por eso que la mayoría de las plantas se las ve de color verde. Cuando las clorofilas se descomponen comienzan a verse los carotenos y xantofilas que son de colores amarillos a naranja.

Según lo que el comportamiento se los carotenos y xantofilas en éter de petróleo, se puede decir que este no es un buen solvente para los pigmentos ya que se es comparado con las demás graficas miraremos que presenta una absorbancia mucho menor que sus homólogos en cetona, principalmente las xantofilas que presentan un completo desorden en la línea que representa su absorbancia y en cuanto a números vemos que no superan los 0.035 de

absorbancia mientras que las xantofilas en acetona llegaron casi a los 0.25 de absorbancia que es muy similar a valores de absorbancia de las gráficas que fueron proporcionadas por los compañeros de cuarto semestre.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

CLOROFILA A:

En esta grafica se observa el barrido espectral utilizando como disolvente acetona y se identifica que la clorofila A tubo mayor absorbancia ya que los picos de absorción fueron más altos al medir de 400 a 700 nm con respecto o los otros pigmentos. Se observó los picos donde hubo mayor absorción que fue aproximadamente desde 400nm hasta 433 donde la absorbancia fue de 0.6 y en 660 donde la absorbancia fue de 0.4.

CLOROFILA B:

En esta grafica se observó que el rango de absorción de luz utilizando acetona como disolvente fue menor con respecto a la clorofila A porque solo hubo un pico de mayor absorción de 400 hasta 460 nm con una absorbancia de 0.25 aproximadamente tomando el rango desde 400 a 700nm , pero mayor que los otros pigmentos ya que están por debajo de la absorbancia de o.25

XANTOFILAS disolvente acetona

En esta grafica se observó que el rango de absorción utilizando acetona como disolvente fue menor

que en la clorofila A y B porque el pico de absorción solo llego hasta 0.22 entre 400 hasta 466 nm aproximadamente tomando el rango rango de 400 a 700 nm pero mayor que los carotenos ya que estuvieron por debajo de la absorbancia de 0.22

CAROTENOS disolvente acetona

En esta grafica se observó que el rango de absorción de luz utilizando como disolvente acetona fue menor que en todos los otros pigmentos porque el pico de absorción que tubo llego hasta 0.18 entre 400 hasta 481nm aproximadamente, en un rango total de 400 a 700 mn

XANTOFILAS disolvente éter de petróleo

En esta grafica se observó que el rango de absorción de luz fue muy baja porque el pico de absorción llego a 0.14 entre un rango de 400 hasta 481nm aproximadamente esto debido a que el éter de petróleo es un mal disolvente y el pigmento no pudo observar bien el espectro de luz

CAROTENOS disolvente éter de petróleo

En esta grafica se observó que el rango de absorción de luz fue totalmente baja ya que el pico de absorción llego a 0.035 entre 400hats a484 nm aproximadamente esto debido al disolvente q se utilizó ya que no se pudo observar con claridad el rango de absorción y además fue muy baja

CONCLUSIONES

*Se identificó que la calofila a fue la que mayor tubo rango de absorción seguida de la clorofila b y por ultimo xantofilas y carotenos debido a su absorbancia y rango en nm

*la clorofila a y b absorbieron mayor rango de luz debido a que son más polares en disolventes orgánicos y los carotenoides son menos polares

*los pigmentos presentes en la espinaca difieren de su rango de absorción porque los pigmentos biológicos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz mientras que reflejan otras. La luz que es absorbida puede ser utilizada por la planta para alimentar las reacciones químicas, mientras que las longitudes de onda reflejadas de la luz determinan el color del pigmento que aparecerá a la vista

BIBLIOGRAFÍA

1. elementos de fisiología vegetal, Francisco Gil Martínez, 1995, ediciones mundi prensa, paginas 411, 429, 491.

2. fisiología y bioquímica vegetal, J. Azcon-Bieto, 1993, primera edición, interamericana Mc Graw- Hill paginas 91, 135.

3. Meléndez Martínez, A. Vicario, I, Heredia, F. (2007). Pigmentos carotenoides: consideraciones estructurales y fisicoquímicas, 57 (2), 109 – 115.

4. Karp, G. (2009). Biología celular y molecular: conceptos y experimentos. (206-227). México. Mc Graw Hill.

5. Elena Pérez, U. (2009). Fotosíntesis: Aspectos Básicos. Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3). 1 – 45.