evaluaciÓn de los medios de cultivo para verificar su

ESTUDIAR PARA PREVERY PREVER PARA ACTUAR

Instituto Tecnológico de Colima

Dirección General de Educación Superior Tecnológica

Institutos TecnológicosSEP

R

P R E M I OINTRAGOB

2006

a la

06

RSGC - 617INICIO: 2012.09.28

TERMINO: 2015.09.28

ISO 9001:2008

PROCESO EDUCATIVO

S G C

S N E S T

IMNC-RSGC-617

IMNC-RSGC-617IMNC-RSGC-617

CERTIFICADO BAJO LANORMA ISO 9001:2008

CERTIFICADO BAJO LANORMA ISO 9001:2008Villa de Álvarez, Col., Noviembre de 2013

"EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA VERIFICAR SU REPRODUCTIBILIDAD

Y SELECTIVIDAD"

OPCIÓN X MEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOQUÍMICO

PRESENTA JANETTE ESMERALDA CAMPOS RADILLO

ASESOR DR. ARGELIA JUÁREZ ALCARAZ

I

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1

2. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 3

3. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS ..................................................................... 3

3.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 3

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 3

4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA .......................................................................................... 4

4.1 MISIÓN ............................................................................................................................... 4

4.2 VISIÓN ............................................................................................................................... 4

4.3 POLÍTICA DE LA CALIDAD ............................................................................................ 5

4.4 SERVICIOS ....................................................................................................................... 5

5. PROBLEMÁTICA A RESOLVER ........................................................................................... 6

6. ALCANCES Y LIMITACIONES .............................................................................................. 6

7. FUNDAMENTO TEÓRICO ..................................................................................................... 7

8. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS ............ 19

8.1 CONSERVACIÓN DE CEPAS A MEDIANO PLAZO EN ACEITE MINERAL....... 21

8.2 CRITERIOS DE CALIDAD EN LA EVALUACIÓN FÍSICA Y BIOLÓGICA DE

MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS ................................................................................. 25

8.3 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS .............................. 28

8.4 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS ........ 32

8.5 PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS, DIFERENCIALES E INDICADORES. .......................................................................................................................... 36

8.6 PRUEBA DE TOXICIDAD DEL DILUYENTE ............................................................. 41

8.7 PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES PARA CUENTA EN PLACA ................................................................................................................. 44

9. RESULTADOS ........................................................................................................................ 46

10. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES ...................................................................... 50

11. ANEXO 1 ............................................................................................................................. 52

12. ANEXO 2 ............................................................................................................................. 78

13. GLOSARIO .......................................................................................................................... 82

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 84

1

1. INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que fueron

ideadas para favorecer el crecimiento, la reproducción o identificación de

microorganismos.

Los requisitos nutricionales de las bacterias reflejan su capacidad

biosintética, y la célula puede obtener sus nutrientes para desarrollarse

tomándolos directamente del medio o sintetizándolos a partir de otros materiales.

Las necesidades nutricionales de los microorganismos pueden ser:

elementales, energéticas o específicas.

Las elementales consisten en aquellas sustancias que necesitan para su

composición celular, como los ácidos nucleicos, glúcidos y lípidos; estas

necesidades son comunes para todas las bacterias, pero existen diferencias en la

forma de utilizar tales sustancias para simulación, dependiendo de la capacidad de

degradación y de síntesis de cada especie.

Los elementos necesarios son carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, azufre y

fósforo; en menor cantidad potasio, magnesio y fierro, además de otros

oligoelementos como manganeso, zinc, cobre, cobalto y molibdeno. Las fuentes

de carbono pueden ser el CO2 atmosférico, compuestos simples como el citrato o

sustancias más complejas como azúcares y aminoácidos. El nitrógeno pueden

obtenerlo algunas bacterias del aire, pero la mayoría lo requieren en forma de

nitratos, sales de amonio o compuestos orgánicos de nitrógeno. El azufre lo

obtienen de compuestos orgánicos como la cisteína o inorgánicos como sulfuros o

tiosulfatos. Las necesidades energéticas de las bacterias las satisfacen las

reacciones de óxido-reducción, como la oxidación o fermentación de azúcares o

ácidos orgánicos.

Las sustancias específicas son compuestos como aminoácidos, vitaminas,

bases púricas, carbohidratos, etc. que deben ser proporcionados, debido a que no

se encuentran en operación sus vías sintéticas. Además de los nutrientes, los

2

medios de cultivo deben reunir condiciones físico-químicas específicas de

actividad de agua, pH y potencial de óxido reducción. El contenido de agua es un

factor muy importante para el desarrollo bacteriano, ya que esta sustancia

interviene en muchas de las reacciones químicas dentro de la célula y es

indispensable para disolver los compuestos que atraviesan la pared celular.

Es muy importante el ajuste del pH del medio para un buen desarrollo

bacteriano. La mayoría de las bacterias crece a un pH cercano a la neutralidad; sin

embargo, hay microorganismos que requieren pH ácido o alcalino.

Durante la esterilización, el oxígeno disuelto se libera, bajando el potencial

de óxido-reducción; al enfriarse el medio, el oxígeno se re-disuelve. Por esta

causa, se calientan los medios para sembrar bacterias anaerobias. Posteriormente

se deberá aislar el medio del oxígeno atmosférico mediante capas de vaselina,

aceite o agar, o inactivarlo agregando sustancias productoras como tioglicolato o

cisteína [1].

3

2. JUSTIFICACIÓN

El presente proyecto se elaboró con la finalidad de mejorar el control en los distintos

factores que pudiesen repercutir o afectar de manera directa o indirectamente a los medios de

cultivo que son utilizados para llevar a cabo las determinaciones y análisis realizados en el

Laboratorio Estatal, además de garantizar una mejor calidad y veracidad de los resultados

obtenidos, por medio del control de calidad de los medios de cultivo.

3. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar cada uno de los procedimientos específicos establecidos en el

área de control de calidad de medios, para verificar la reproducibilidad y

selectividad de los medios de cultivos utilizados en el Laboratorio Estatal de Salud

Pública

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Confirmar que los medios de cultivo adquiridos en forma deshidratada

comercialmente y utilizados en el área de preparación de medios cumplan

con la función requerida de Productividad y Selectividad.

Establecer los lineamientos para garantizar que las cepas microbianas

obtenidas de las áreas microbiológicas del Laboratorio Estatal cumplan con

las características de viabilidad, pureza y estabilidad.

4

4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA

Este proyecto se llevó a cabo en el Laboratorio Estatal de Salud Pública

del Estado de Colima (LESP), dentro del departamento de Control Ambiental, en

el Área de Control de Calidad de Medios de Cultivo.

El Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Colima (LESP), es

una organización dependiente de la Secretaría de Salud, que enfoca su servicio

principalmente a la vigilancia Epidemiológica y Salud ambiental, adoptando para

esto, una cultura de calidad como forma de trabajo en beneficio de la población

colimense.

La Secretaría de Salud es la dependencia del ejecutivo federal que tiene

fundamentalmente como objetivo proteger la salud de la población. En el

departamento de Control Ambiental su objetivo es brindar apoyo a las actividades

de vigilancia sanitaria con métodos de laboratorio.

4.1 MISIÓN

Somos el Laboratorio de Referencia del Estado de Colima que realiza

análisis especializados, oportunos y confiables a los usuarios del Sector Salud y a

la población del Estado de Colima, en las áreas de epidemiología y de protección

contra riesgos sanitarios.

4.2 VISIÓN

Ser un Laboratorio Acreditado del Sistema Nacional de Salud, que aplique

tecnología de vanguardia y un marco analítico que dé satisfacción a las

necesidades de la población, contribuyendo a mejorar la salud de nuestra

comunidad.

5

4.3 POLÍTICA DE LA CALIDAD

Quienes trabajamos en el Laboratorio de Salud Pública de Colima estamos

comprometidos en lograr la satisfacción de nuestros usuarios aplicando las

buenas prácticas de laboratorio, nos capacitamos para garantizar nuestra

competencia técnica y aplicamos la mejora continua de nuestros Sistemas de

Gestión de Calidad.

4.4 SERVICIOS

Analizar las muestras recibidas del programa de control sanitario enviadas

por la dirección de regulación sanitaria y las jurisdicciones sanitarias I, II, y

III.

Asesorar al personal de regulación sanitaria y de las jurisdicciones cuando

lo soliciten.

Colaborar con el departamento de vigilancia epidemiológica en caso de

brotes de enfermedades vehiculizadas por alimentos.

Apoyar a las instituciones del sector salud para el análisis de aguas,

alimentos y superficies vivas e inertes en centros de desarrollo infantil.

Capacitar y/o asesorar al personal de la red de laboratorios para que

realice el monitoreo ambiental de las salas quirúrgicas y toco quirúrgicas de

los hospitales de la Secretaría de la Salud.

Realizar análisis microbiológico e investigación de Vibrio cholerae en aguas

negras y blancas, recolectadas por la comisión de agua potable y

alcantarillado de manzanillo (CAPDAM), así como las jurisdicciones

sanitarias, I, II, III y hospitales privados y del sector salud.

Ofrecer análisis microbiológicos y fisicoquímicos de alimentos, sal, vísceras

de res, aguas de red, de pozo, de tanque, de fuentes naturales, aguas

purificadas y/o bebidas no alcohólicas, hielo en barra y/o purificado a

clientes particulares que requieran el servicio.

Capacitar y adiestrar a prestadores de servicio social y prácticas

profesionales.

6

Realizar los estudios microbiológicos en apoyo al programa de vigilancia

de diarreas y agua limpia.

5. PROBLEMÁTICA A RESOLVER

Hoy, más que nunca, el laboratorio necesita soluciones rápidas, fiables y de

gran calidad. El control de la calidad en la preparación y evaluación de los medios

de cultivo es considerado como una esencial y buena práctica de laboratorio,

necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica

microbiológica. En el Laboratorio Estatal de Salud Pública no se cuentan

implementados los procedimientos para la evolución de medios de cultivo.

Este es un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, a

través del productor hasta el producto final utilizado en las áreas posteriores.

Por esta razón, se le confiere una gran importancia y está considerado

como uno de los puntos críticos de control en el análisis microbiológico, del cual

depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios de ensayo.

6. ALCANCES Y LIMITACIONES

El presente trabajo tendrá como propósito evaluar los medios de

cultivo sólidos, semisólidos y líquidos elaborados en el área de preparación de

medios. Se aplicaran cada uno de los procedimientos establecidos por el área de

control de calidad, se realizara el respectivo reporte y se establecerán los formatos

correspondientes de cada técnica donde se aprobara o rechazara el medio

evaluado. Se adquirirá la habilidad para el manejo del equipo requerido para la

ejecución de la técnica mencionada en el Laboratorio Estatal.

7

7. FUNDAMENTO TEÓRICO

Medios de cultivo:

Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproducción y

la identificación de los microorganismos.

Contienen sustancias nutritivas

pH adecuado

Deben estar estériles.

2. Incubación:

Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.

La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico, anaerobio)

Tiempo.

Temperatura.

Clasificación de medios de cultivo

1. De acuerdo al Manual de recomendaciones generales para la

preparación de medios de cultivo (1989), los medios de cultivo pueden

clasificarse siguiendo diferentes criterios convencionales; según su

consistencia, pueden ser sólidos, líquidos o semisólidos.

En base a su uso pueden clasificarse en:

- Medios de pre-enriquecimiento.

- Medios de enriquecimiento.

- Medios selectivos.

- Medios diferenciales.

- Medios indicadores.

- Medios nutritivos (simples o enriquecidos).

- Medios para conservación de cepas.

Medios de pre-enriquecimiento. Tienen la función de reanimar e iniciar la

proliferación de microorganismos potencialmente afectados en su viabilidad,

8

permitiendo su recuperación a partir de productos que han sido sometidos a

tratamientos como la desecación, congelación, procesos caloríficos, etc., que

pueden dañar alguna o algunas de las estructuras celulares. Estos medios no

tienen agentes bacteriostáticos y se utilizan en productos con baja carga

microbiana.

Medios de enriquecimiento. Son medios que favorecen el desarrollo de un

grupo particular de microorganismos, para facilitar su aislamiento posterior. En

este caso, se utilizan agentes bacteriostáticos que afectan lo menos posible al

germen seleccionado, pero inhiben lo suficiente el desarrollo de los

microorganismos acompañantes no deseables.

Medios selectivos. Son medios que favorecen el crecimiento de ciertos

microorganismos inhibiendo a otros no deseados. Estos medios pueden tener

varios grados de selectividad y ésta suele ser inversamente proporcional a su

sensibilidad.

Medios diferenciales. Son medios sólidos que permiten obtener colonias

de aspecto característico, para poder distinguirlas de colonias de microorganismos

no deseados que también pueden desarrollarse en el mismo medio.

Medios indicadores. Estos medios están constituidos por una base

adicionada de una o varias sustancias que permitan poner en manifiesto una o

más características fisiológicas del germen.

Medios nutritivos (simples o enriquecidos). Son medios que permiten el

desarrollo o conservación de microorganismos. Para el aislamiento de

microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales, pueden

emplearse medios simples adicionados de nutrientes ricos en proteínas, hidratos

de carbono, etc. A estas variantes se les conoce como medios enriquecidos.

Medios para conservación de cepas. Estos medios son muy variables,

pues su composición dependerá de los microorganismos que se van a conservar.

Es recomendable que los medios no contengan en lo posible sustancias que al ser

metabolizadas pueden afectar la viabilidad de los microorganismos, o en su

defecto estos medios deben de contener sistemas reguladores.

9

Almacenamiento y conservación de los medios preparados

La estabilidad de los medios de cultivo ya preparados es limitada; algunas

fórmulas que contienen sustancias inestables tales como antibióticos deben

emplearse inmediatamente después de su preparación. En los casos en que el

medio conste de una base o sustancias agregadas posteriormente (como Baird-

Parker, agar sangre) es preferible preparar la base que puede almacenarse y el

día de su uso agregar el complemento inestable.

La mayoría de los medios deben de conservarse en refrigeración entre 4 y

10°C durante un tiempo limitado, debido a su deshidratación. Otros medios, como

los que contienen tioglicolato o fosfatos se conservan mejor a temperatura

ambiente. Es recomendable conservar los medios de cultivo en placa en bolsas de

plástico para evitar su deshidratación. Debe permitirse que los medios

conservados en refrigeración adquieran a temperatura ambiente antes de su

empleo.

Garantía de la calidad

La exactitud de un informe depende, de manera importante, de la calidad de

los medios y reactivos que se emplean en el análisis y del cuidado que se tuvo en

su preparación y empleo.

El uso extenso de preparaciones deshidratadas de medios de cultivo, ha

facilitado enormemente el trabajo de los laboratorios de microbiología,

asegurándose entre otras cosas una mayor uniformidad en los constituyentes de

las fórmulas. Aunque es responsabilidad del fabricante asegurar la calidad de sus

preparaciones deshidratadas, es un hecho que un medio fabricado con el mayor

cuidado y sometido a los controles de calidad más estrictos, pierde su valor si el

usuario no lee y sigue cuidadosamente las instrucciones de preparación, o si para

ésta emplea agua de mala calidad o material sucio; por estos motivos, es

ineludible que, para asegurar la calidad del medio preparado, el usuario efectúe un

mínimo de pruebas de control que incluyan tanto determinaciones físicas como

biológicas.

10

Aspecto

El primer punto a considerar en la evaluación de calidad de un medio de

cultivo preparado es su aspecto: Ciertas características pueden ser indicativas de

algunos errores técnicos, de la calidad inadecuada de algún ingrediente o de la

preparación incorrecta de los recipientes que lo contengan.

Para el caso de caldos, en éstos no debe presentarse turbidez ni

precipitación; su existencia puede indicar una mala calidad del agua empleada en

su preparación, desde el punto de vista de su contenido de iones, el uso de

recipientes sucios, el sobrecalentamiento durante su preparación o un ajuste de

pH incorrecto.

Si el color de un medio es distinto al habitual puede ser indicio de un ajuste

de pH incorrecto, particularmente en el caso de medios que contengan

indicadores, o bien de un sobrecalentamiento durante la preparación, que pudo

ocasionar la caramelización de azúcares o la destrucción o deterioro de

colorantes; además, el envasar el medio en recipientes sucios puede ser el origen

del cambio de color.

Por lo que respecta al punto de solidificación y a la estabilidad del gel, éstos

pueden verse afectados por varios factores. Se espera que los medios que

contienen agar permanezcan con una consistencia firme entre los 33 y los 39°C.

un punto de solidificación muy alto puede indicar que se ha pesado demasiado

medio de cultivo, que la calidad del agar es inadecuada o que se agregó mayor

cantidad de agar que la requerida por la formula. Por el contrario, una estabilidad

del gel muy baja, esto es, cuando el medio no solidifica satisfactoriamente, puede

obedecer entre otras causas, a que se empleó menos medio del requerido, a que

el medio no se disolvió completamente, a que sufrió un sobrecalentamiento

durante su preparación, en particular a pHs extremos, o a que el agar es de

calidad pobre.

11

Esterilidad

El control de la esterilidad de un lote de medio de cultivo, puede llevarse a

cabo difiriendo su uso por 24 horas desde su preparación, y observando la

ausencia de crecimiento. No obstante, ya que esta prueba solo es indicativa de

contaminación masiva y principalmente de origen bacteriano, se recomienda

también incubar 4% de los tubos o cajas preparadas durante un tiempo

prolongado (entre 5 y 7 días) y a temperatura que favorezca el desarrollo de

bacterias como de hongos (37 y 25 °C, respectivamente). Como esta prueba daría

resultados extemporáneos al trabajo adecuado, es de primordial contar con

sistema adecuado de validación de los procesos de esterilización, que incluya el

uso de indicadores no solo químicos sino también biológicos. Conviene recordar

que la cinta testigo no indica el tiempo de exposición de los materiales a cierta

temperatura, y su vire ocurre a temperatura inferior a la de esterilización. La

presencia de contaminación de un lote de medio preparado, puede indicar no solo

esterilización deficiente, si no también contaminación post-esterilización, como

durante el envasado, o bien el empleo de aditivos contaminados que se agreguen

a las bases [1].

12

Control de la reactividad de algunos medios de cultivo en placa

Tabla 1. Control de la reactividad de cada microorganismo al medio de cultivo [1].

Medio de cultivo

Incubación Microorganismos

testigo

Resultados esperados Características del cultivo Morfología de las colonias

Tiempo Temperatur

a

Agar Baird-Parker

24-48 h 35°C Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Colonias negras, lustrosas, convexas, de 1 a 5 mm de diámetro, rodeadas por un halo claro o transparente. Colonias negras, lustrosas, de forma irregular. Al cabo de 24 h, presencia de zonas opacas alrededor de las colonias.

Agar bilis y rojo violeta

24 h 35°C Escherichia coli Proteus vulgaris Streptococcus faecalis

Colonias rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo. Colonias incoloras. Colonias pequeñas, de color rosado.

Agar sulfito de bismuto

48 h 35°C Salmonella typhimurium Escherichia coli

Colonias negras, rodeadas por un halo negro o grisáceo, con brillo metálico. Desarrollo ocasional. Colonias pequeñas, verdosas o incoloras.

Agar Mac Conkey

18-24 h 35°C Escherichia coli Proteus mirabilis Enterococos

Colonias grandes, rosadas o rojas con precipitado opaco. Colonias incoloras y transparentes. Inhibición del crecimiento. Colonias escasas, puntiformes y opacas.

Agar SS 18-24 h 35°C Salmonella typhimurium Shigella flexneri Escherichia coli

Colonias incoloras, transparentes con centro negro. Colonias transparentes, incoloras. Colonias pequeñas de color rosado o rojo; poco crecimiento o completa inhibición.

13

Agar TCBS 18-24 h 35°C Vibrio parahaemolyticus Vibrio alginolyticus Streptococcus faecalis

Colonias pequeñas con el centro verde azulado. Colonias grandes, amarillas. Inhibición del crecimiento.

Agar verde brillante

18-24 h 35°C Salmonella typhimurium Escherichia coli Staphylococcus aureus

Colonias transparentes, de color rosa palido. Colonias de color vcerde-amarillento opacas, con halo amarilliento. Inhibición del crecimiento.

Agar XLD 24-18 h 35°C Escherichia coli Salmonella typhimurium

Colonias amarillas. Colonias rojas, transparentes con centro negro.

IDENTIFICACIÓN DE CEPAS

Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o

genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones

de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número

depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la

identificación.

Pruebas bioquímicas

Son pruebas clínicas realizadas al grupo de las enterobacterias.

Se puede resumir en los siguientes puntos:

- Sustrato (contenido en medio de cultivo)

- Enzima o vía metabólica (secretada en el interior del microorganismo)

- Producto

- Revelados y/o indicador

14

Prueba de citrato

Principio: determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como

única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento con alcalinidad

resultante [8].

Medio de Citrato de Simmons

Sustrato: Citrato de sodio.

Vía: Varias dependientes del pH del medio.

Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2,

lactato/Acetoína y CO2 en condiciones ácidas.

Indicador: Azul de bromotimol.

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono

también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La

extracción de nitrógeno de las sales de amonio produce amoniaco y se alcaliniza

el medio virando el indicador al alcalino [8]. Véase Fig. 1 (Anexo 2).

Prueba TSI (Agar con Hierro de Kliger/azúcar triple y hierro.)

Principio: determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato

de carbono específico incorporado en un medio de desarrollo basal, con

producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la posible producción

de ácido sulfhídrico (H2S) [8].

Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que

alcalinizan todo el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa,

inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja

concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la

superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan

la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la

acidificación completa del medio. Véase Fig. 2 (Anexo 2).

15

Prueba de SIM

Principio: En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas

liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso

por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas

incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un

precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico [8].

Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol,

metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen

DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico

color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del

medio

El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se

observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona

de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la

zona inoculada [8]. Véase Fig. 3 (Anexo 2).

Prueba de Ureasa

Principio: determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en

dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante

alcalinidad.

La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco

que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de

fenol una prueba positiva es color bugambilia [8]. Véase Fig. 4 (Anexo 2).

Prueba descarboxilasa (Lya)

Principio: determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de

descarboxilar un aminoácido para formar una amina con la resultante alcalinidad.

Los aminoácidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que

incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta.

Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias [8]. Véase

Fig. 5 (Anexo 2).

16

Prueba de la Coagulasa

Principio: probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la

acción de la enzima coagulasa.

La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el

mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la

coagulación presentes en el plasma y formar un coagulo visible [8].

Prueba Oxidasa

Principio: determinar la presencia de enzimas oxidasas.

Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta

reacción se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del

citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un

aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de

electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo incoloro en

pocos segundos formándose un producto colorido [8].

Prueba de Voges Proskauer

Caldo RM/VP

Sustrato: Glucosa.

Vías: Fermentación ácida o neutra.

Producto: Acido orgánicos o acetoína.

Reveladores: Solución de Rojo de Metilo,

Alfa Naftol y KOH 40%.

Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos orgánicos que

provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de

amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos

microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido

láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del acetato

pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 en cantidades iguales [8].

17

Reacciones bioquímicas en enterobacterias

Tabla. 2 Reacciones bioquímicas de los microorganismos [7].

Esch

erich

ia c

oli

Sh

igella

so

nn

ei

Otr

as S

hig

ella

Sa

lmo

ne

lla

TIP

ICA

C.

fre

un

dii

E.

aero

ge

nes

P.

vu

lgaris

P. m

ira

bili

s

Indol + V - +

Rojo de metilo + + + + + + +

Voges-Proskauer + V

Uso de citrato (Simmons)

V + + V (V)

H2S (TSI) + + + +

Urea - V(W)

+ V

Cianuro de potasio + + + +

Movilidad V + + + + +

Gelatina (22°C) V + +

Descarbox. lisina V - - + - + - -

Arginina dehidrolasa V - V - (V) V(W)

- -

Descarbox. ornitina V + - + V + - +

Desaminac. Fenilalanina

- + +

Malonato V V

Gas de glucosa + B + + + V +

Lactosa + d (V) +

Sacarosa V d V + + V

D-Manitol + + V - + + - -

Dulcitol V V - V -

Salicina V V + V V

Adonitol +

I(meso)-inositol +

D-sorbitol V V - + + +

L-arabinosa + + V V + + -

Rafinosa V d V - V + -

L-ramnosa V (+) V - + + - -

+ = 90% muchos son positivos con 48 h.

V = son el 10% positivos en 48 h.

(+) = del 10% al 89.9% son positivos en 48 h.

18

(V) = el 90% son positivas entre 3 y 7 días.

W = el 50% son positivas en 48 h y el 90% son positivas de 3 a 7 días.

d = débilmente positiva.

b = muchas cepas de S. sonnei dan reacciones relativamente positivas de lactosa

(88%) y sacarosa (85%).

C = algunos serotipos de S. flexnerii producen gas de glucosa.

19

8. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES

REALIZADAS

EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

El tipo de evaluación que debe practicarse a un medio de cultivo, depende

íntimamente de su propósito. El objetivo que cada evaluación consiste en verificar

los siguientes parámetros:

a) El desarrollo de pequeños inóculos en los medios nutritivos.

b) La aparición de las reacciones deseadas en los medios para las

pruebas bioquímicas.

c) El crecimiento de organismos típicos en los medios diferenciales.

d) El crecimiento de los organismos deseados y la inhibición de los

microorganismos indeseables en los medios selectivos o de enriquecimiento.

e) La mayor recuperación de microorganismo en los medios de pre-

enriquecimiento.

f) La formación y el aspecto de las colonias en los medios sólidos.

Dada la complejidad de algunas de estas pruebas para valorar estos

parámetros, no es práctico efectuarlas con la misma periodicidad.

Las pruebas deben realizarse toda vez que el aspecto o pH del medio no

correspondan a lo esperado. En caso contrario, se sugiere probar:

Los medios nutritivos cada vez que se cambie de lote de medio

deshidratado, comparándolo con el que está en uso, para asegurar que no

es inferior en capacidad de sostener el crecimiento de microorganismos.

Los medios selectivos de uso esporádico, cada vez que se prepare un lote,

utilizando las cepas correspondientes.

En los medios de alta selectividad se deben incluir testigos tanto positivos

como negativos, en todas las pruebas.

20

Entre los defectos que un medio puede presentar desde el punto de vista de

su efectividad biológica, cabe destacar la presencia de alteración y la cantidad de

crecimiento, la de crecimiento difuso y la de crecimiento atípico.

Un medio puede presentar escaso crecimiento, debido a la existencia de

sustancia inhibidoras en el recipiente donde se envasó o preparó, en el agua

donde se rehidrató o en la misma muestra que se sembró. Otras causas de este

defecto son un pH incorrecto, algunos aditivos inhibidores agregados en

cantidades incorrectas, el sobrecalentamiento y presencia de organismos

dañados, bien en la muestra o debido a un procedimiento incorrecto, como el

empleo de medio caliente durante una cuenta de vaciado en placa.

Un crecimiento excesivo en un medio de cultivo puede ser causado por la

destrucción de los inhibidores selectivos por sobrecalentamiento o por el uso de

aditivos inhibidores en cantidades incorrectas.

La participación de crecimiento difuso puede ser motivada por la

destrucción de inhibidores del fenómeno por sobrecalentamiento, por el uso de

placas con la superficie muy húmeda o por el empleo de un inóculo excesivo.

Finalmente, la aparición de crecimiento atípico puede obedecer a una mala

formulación del medio, a la adición de sustancias complementarias en cantidades

incorrectas o de selección de mutantes [1].

21

8.1 CONSERVACIÓN DE CEPAS A MEDIANO PLAZO EN ACEITE

MINERAL

El uso de los microorganismos ha sido clave en el enfrentamiento y solución

de los graves problemas de la humanidad en los diferentes sectores. Estos

necesitan ser viables al menos durante el estudio y los experimentos, para lo cual

deberán ser mantenidos y conservados en una colección de cultivos microbianos

garantizando su disponibilidad.

1. CULTIVO INICIAL

1.1 A partir del cultivo primario tomar una asada y depositarlo en 10 ml de

Caldo Soya Tripticaseina o BHI (Infusión Cerebro Corazón).

1.2 Incubar a 35 ± 2°C por 24 horas.

2. CULTIVO DE RESERVA O MADRE

2.2 Inocular por estría cruzada en placa de Agar nutritivo.

2.3 Incubar a 35 ± 2°C por 24 horas.

2.4 Realizar descripción morfológica de las colonias desarrolladas.

2.5 Tomar una colonia y realizar siembra masiva.

2.6 Incubar a 35°C por 24 horas.

2.7 Tomar inóculo y realizar siembra por estría en 4 tubos previamente

etiquetados y que contienen agar nutritivo con bisel corto (cultivo

intermedio), incubarlos a 35°C por 24 hrs.

2.8 También realizar a partir de esta placa frotis para Gram y para pruebas

bioquímicas convencionales.

NOTA: Si las pruebas bioquímicas se realizan con el sistema API

(Sistemas de identificación multipruebas) anexar el formato respectivo.

22

2.9 Realizar otras pruebas complementarias como: Confirmación de

serotipo, movilidad, oxidasa, coagulasa, termonucleasa y hemólisis de

sangre en caso de que aplique.

Los resultados se registrarán en el formato control de calidad de cepas

microbianas APM- F- 019.

2.10 Sellar con cinta parafilm las placas de AN y almacenar en

refrigeración.

3. CULTIVO INTERMEDIO

3.1 Realizar etiquetas con la siguiente información: Nombre de la cepa,

clave interna, fecha de pase, CI (cepa o cultivo intermedio) y No. de

tubo.

3.2 Verificar la presencia de desarrollo en los 4 tubos de AN.

3.3 Adicionar aceite mineral estéril 1cm arriba del pico del agar inclinado.

3.4 Sellar con cinta parafilm y almacenar a temperatura ambiente (23 a

27°C) o en refrigeración (4 a 8°C).

Cada mes realizar evaluación para verificar su pureza, viabilidad y

estabilidad aplicando los puntos 1 y 2 de este procedimiento.

4. CULTIVO DE TRABAJO

4.1 Realizar etiquetas con la siguiente información: Nombre de la cepa,

clave interna, fecha de pase, CT (cepa o cultivo de trabajo) y No. de

tubo.

4.2 Etiquetar 4 tubos de 13 x 100 que contienen agar nutritivo (AN) con bisel

largo.

23

4.3 El día del control de cepas, sacar un tubo del refrigerador (Cultivo

intermedio) atemperar y sembrar en placa de AN para obtener colonias

aisladas.

4.4 Picar una colonia desarrollada en la placa de Agar Nutritivo y sembrar

por estría en bisel largo los tubos (Cepa de trabajo) Incubar a 35 ± 2°C

por 24 horas.

4.5 Observar desarrollo, sellar con cinta parafilm, guardar en gaveta a

temperatura ambiente hasta su uso.

Inactivar los cultivos y materiales de contacto provenientes de las cepas

adicionando cloro al 0.5% y dejar actuar por un lapso de 30 min.

En la Fig.1 se detalla la forma en que se realiza el procedimiento

mencionado [4].

24

Fig. 1 Proceso para la conservación de cepas.

25

8.2 CRITERIOS DE CALIDAD EN LA EVALUACIÓN FÍSICA Y

BIOLÓGICA DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

Solicitar al Área de Preparación de Medios (APM) los pedidos de medios

preparados en frasco, tubo y placa solicitados comúnmente por el Área de Control

Ambiental.

1. EVALUACIÓN FÍSICA DE MEDIO EN CALDO

Se debe de verificar en forma visual la apariencia y color, en los caldos no

debe haber turbiedad o material precipitado, existen excepciones como el caldo

tetrationato cuya apariencia física particular y diferente se especifica en la parte de

fórmulas de cada medio de cultivo. Se deberán de verificar los volúmenes de los

caldos con una probeta.

1.1 Inspeccionar y verificar los medios entregados por el APM observando:

Criterios de evaluación física y biológica en caldos y diluyentes:

Envases etiquetados con la siguiente información: Nombre o

abreviatura del medio de cultivo, volumen, fecha de preparación, No. de

lote, personal que los preparó,

Envases en buenas condiciones.

Ausencia de turbidez y precipitación.

Envases con tapa de rosca bien cerrada.

Ausencia de materia extraña.

Incoloro (donde aplique, diluyentes)

Presencia de campanas Durham (donde aplique, caldos)

pH finales dentro de los límites establecidos por el fabricante.

Volúmenes dentro del rango requerido (donde aplique, diluyentes)

Color característico del medio (donde aplique, caldos)

26

Prueba de esterilidad del medio entregado (donde aplique, caldos)

2. EVALUACIÓN FÍSICA EN PLACAS

Los agares deben de tener una consistencia firme y de color característico.

2.1 Inspeccionar físicamente y verificar con la prueba de esterilidad del

medio entregado por el APM observando:

Criterios de evaluación física y biológica en placas:

Envases etiquetados con la siguiente información: Nombre o abreviatura del

medio de cultivo, Fecha de preparación, No. de lote, personal que los

preparó.

Coloración característica del medio.

Solidificación y estabilidad del gel adecuada.

Ausencia de rajaduras en su superficie.

Ausencia de humedad en la tapa y superficie.

Ausencia de coágulo por enfriamiento del medio.

pH finales dentro de los límites establecidos por el fabricante.

Ausencia de burbujas en el medio.

Ausencia de colonias contaminantes.

Placas rotuladas en placa.

Envasadas en bolsas de plástico e identificadas con etiquetas.

Se registran todos los medios de cultivo recibidos en el formato FO-08-16-

1508 y registran si el producto es o no conforme, así mismo se deberán registrar

las causas de rechazo. A continuación en la Fig. 2 se resume el procedimiento

mencionado [3].

27

NO CUMPLE

SI

INICIO

SOLICITUD DE MEDIOS DE CULTIVOS

AL APM

RECEPCION DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO

APLICACIÓN DE LOS

CRITERIOS DE

ACEPTACIÓN Y

RECHAZO

REGISTRAR EN

FORMATO FO-08-16-

1508

DEVOLVER PRODUCTO

AL APM

GUARDAR PRODUCTOS EN

LUGAR CORRESPONDIENTES.

FIN

Fig. 2 Evaluación física de los medios de cultivo.

SI CUMPLE

28

8.3 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS

1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS EN PLACA

1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado la cepa deseada y la

interferente.

1.2 Incubar a 35 ± 2°C/ 18 - 24 horas.

2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO

2.2 Tomar una colonia aislada de la cepa deseada e interferente e inocular

por separado a tubos que contienen 10 ml de BHI (Caldo Infusión

Cerebro Corazón), previamente rotulados con el nombre o clave

correspondiente.

2.3 Incubar a 35 ± 2°C/ 18 horas.

3. DÍA DEL CONTROL

Preparación del material de trabajo

3.1 Preparar en una gradilla dos hileras de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y

rotular cada hilera de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,

10-7, 10-8, 10-9, 10-10.

3.2 En la misma gradilla acomodar a la par de cada hilera a partir del tubo

10-6, cinco tubos que contienen el caldo a evaluar y marcarlos como 10-

6, 10-7, 10-8,10-9, 10-10.

3.3 Rotular simultáneamente 10 placas Petri desechables estériles con 10-6

hasta 10-10.

Desarrollo experimental

3.4 Cumplidas las horas de incubación de la cepa deseada e interferente,

tomar 1 ml de la suspensión que contiene la cepa deseada y realizar las

diluciones decimales correspondientes a partir de las dilución 10-6

29

depositar 1 ml a placas estériles vacías y 1 ml a los tubos que contienen

el caldo a evaluar [5].

3.5 Repetir este procedimiento para la cepa interferente.

3.6 Realizar el vaciado en placa con agar cuenta estándar.

3.7 Dejar solidificar e incubar las placas a 35°C durante 24 horas. En forma

simultánea incubar los caldos a evaluar de acuerdo a las condiciones

requeridas.

4. DESARROLLO EN CALDO

4.1 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos evidenciar

con registro y visualmente las características típicas del crecimiento.

5. SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

5.1 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos sembrar la

dilución 10-6 hasta la dilución 10-10 en placas de Salmonella shigella

(SS), agar verde brillante (VB), Agar sulfito bismuto (SB).

6. CONTEO DE PLACAS

6.1 A las 24 horas contar las colonias desarrolladas en las placas de cuenta

estándar para conocer en que dilución se tienen una concentración de

100 a 150 UFC / ml [6].

7. CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Un medio de cultivo es considerado como aquel que tiene un

funcionamiento adecuado de selectividad y productividad cuando:

- Se observa suficiente inhibición del crecimiento del microorganismo que

debe ser inhibido (interferente) y suficiente crecimiento del microorganismo

deseado (control).

30

Expresar lectura e interpretación de los resultados en el formato FO-08-16-

1504 (Formato Promoción de crecimiento en caldo).

En la Fig. 3 se detalla la forma en que se realiza la promoción de

crecimiento en caldos [3].

31

Fig. 3 Promoción de crecimiento de microorganismos en caldos.

32

8.4 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS

SELECTIVOS

1. PREPARACIÓN DE LA CEPA

1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado las 3 cepas (la cepa

deseada y dos cepas interferentes):

Tabla 1. Cepas deseadas e interferentes para la promoción de

crecimiento en caldos selectivo.

PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS

Cepas

Salmonella typhimurium Deseada Interferente Interferente

Escherichia coli

Citrobacter freundii

1.2 Incubar a 35°C/ 18 - 24 horas.


2.1 Tomar una colonia aislada de cada una de las cepas e inocular por

separado en tubos que contienen 10 ml de BHI (Caldo Infusión Cerebro

Corazón), previamente rotulados con el nombre o clave correspondiente.

2.2 Incubar a 35 ± 2°C durante18 horas

3. DÍA DEL CONTROL

Preparación del material

3.1 Preparar en una gradilla una hilera de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y

rotular de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8,

10-9, 10-10.

3.2 En la misma gradilla acomodar a la par de la hilera a partir del tubo 10-6,

cinco tubos que contienen el caldo selectivo a evaluar el caldo

33

Tetrationato (CTT) y el caldo Rappaport Vassiliadis (CRp) y marcarlos

como 10-6, 10-7, 10-8,10-9, 10-10.


3.3 Sacar de la incubadora los tres tubos de BHI que contienen el cultivo o

suspensión de cada una de las cepas.

3.4 Transferir las 3 suspensiones de los tubos de BHI y colocarlos en un

matraz Erlenmeyer y agitar.

3.5 Tomar 1 ml de la suspensión y realizar las diluciones decimales

correspondientes, a partir de la dilución 10-6 depositar 1 ml a los tubos

que contienen el caldo selectivo a evaluar [5].

3.6 Incubar los caldos selectivos a evaluar a 35°C durante 24 horas.

4. SEMBRADO POR ESTRÍA EN MEDIOS SELECTIVOS


4.1 Rotular las placas con los medios selectivos Verde Brillante (VB), agar

Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD), agar Sulfito Bismuto (SB), agar

Salmonella shigella (SS) que corresponden a cada caldo selectivo

utilizado de acuerdo a la dilución (10-6 ,10-7, 10-8, 10-9 y 10-10).


4.2 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos que contienen

la mezcla de las 3 cepas tomar una asada e inocular en los medios

selectivos sembrando por estría cruzada en superficie.

4.3 Incubar a 35 ± 2°C, 24 a 48 horas.


Se evalúan los medios según su productividad y selectividad. En relación a

si productividad: El caldo selectivo debe permitir el desarrollo de un cultivo puro de

34

la cepa deseada con un inóculo bajo y un desarrollo pobre o nulo del cultivo de la

cepa interferente en mayor concentración.

En la Fig. 4 se detalla la forma en que se realiza la promoción de

crecimiento en caldos selectivos [3].

35

Fig. 4 Promoción de crecimiento de microorganismos en caldos

selectivos.

36

8.5 PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS,

DIFERENCIALES E INDICADORES.

1. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD

1.1 Usar tres cepas de microorganismos deseados y tres interferentes para

cada tipo de agar.

Tabla 2. Cepas deseadas e interferentes para la prueba ecométrica

PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS DIFERENCIALES E

INDICADORES

Cepas

Staphylococcus aureus Deseada

Staphylococcus aureus ATCC6538 Deseada

Staphylococcus epidermidis Deseada

Escherichia coli Interferente

Enterobacter aerogenes Interferente

Proteus mirabilis Interferente

.

1.2 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado cada una de las cepas e

incubar a 35°C durante 24 horas.


2.1 Inocular por separado una colonia aislada de cada una de las 6 cepas

de reserva a 6 tubos que contienen 10 ml de caldo infusión cerebro

corazón (BHI) previamente rotulados con el nombre o clave de las 3

cepas deseadas y de las 3 cepas interferentes.

2.2 Mezclar perfectamente los tubos e incubar 18 horas a 35°C±1°C.

37

3. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS

3.1 Seleccionar 6 cajas de petri que contienen el medio selectivo

a evaluar y 6 cajas de petri que contiene el medio de referencia.

3.2 Dividir cada una de las 12 cajas petri por la parte posterior de

la base marcándolas en 4 cuadrantes.

4. SIEMBRA

4.1 Tomar con un asa calibrada un 1microlitro de cada uno de los 6 tubos

de la suspensión bacteriana e inocular las 6 cajas de Petri que

contienen el medio a evaluar y otras 6 que contienen el medio de

referencia (se eligen 12 cajas de Petri: 3 que contengan el medio a

evaluar y 3 con el medio de referencia para inocular las cepas

deseadas. Se eligen 3 placas con el medio a evaluar de las cepas

interferentes y 3 con el medio de referencia para inocular las cepas

interferentes).

4.2 Trazar 5 estrías paralelas entre ellas sobre la superficie del medio en el

primer cuadrante.

4.3 Repetir las 5 estrías en cada uno de los demás cuadrantes de la placa

sin cargar el asa con cultivo y sin flamearla.

4.4 Trazar una última estriada central en el punto donde se unen los

cuadrantes.

En la Fig. 5 se detalla la forma en que se realiza la siembra.

Fig. 5 Siembra por estría para la técnica ecométrica en agares selectivos e

indicadores

38

4.5 Incubar las placas en posición invertida de acuerdo a las condiciones

en que se va a utilizar el medio de cultivo.


5.1 Determinar el valor de cada estría.

Efectuar la lectura de las cajas petri teniendo en cuenta que cada estría

tiene un valor de 0.2, este valor corresponde a crecimiento completo o parcial

(considerándose válida cualquier estría que tenga crecimiento en más del 25% de

la línea).

5.2 Determinar el valor en cada cuadrante de una placa.

El valor de 0.2 se multiplica por el número de estrías que se realizó en cada

cuadrante que son 5, por lo tanto cada cuadrante tiene un valor total de 1.

5.3 Determinar el valor de la estría central.

La estría central tiene un valor de 1 este valor corresponde a crecimiento completo

o parcial que se presente en ella.

5.4 Determinar el valor de la placa

La placa está dividida en 4 cuadrantes si cada cuadrante tiene valor de 1 entonces

4 x 1= 4 a este valor le sumamos el valor de la estría central que es de 1 y

tenemos que la placa tiene un valor máximo de 5.

Expresar en forma simultánea el desarrollo en el formato APM-F-017

valores de selectividad y reproductividad.

Los resultados obtenidos se expresan con un número de 6 cifras, en que las

primeras 3 representan la presencia de crecimiento en las estrías de las cepas

que deben crecer en el medio, y las otras 3 representan la presencia en las estrías

de las cepas que no deben crecer.

Así, un medio muy selectivo estaría representado por el número (5, 5,5, 0,

0,0), en el que las cepas que se esperaban que crecieran, se desarrollaron en las

5 estrías de las 3 cajas, y las que no deberían no lo hicieron en las 5 estrías de las

3 cajas.

39

Son aceptables para un medio selectivo las formulas (5,5,5,0,0,0), (5,5,4

0,0,1) y (5,4,4 1,1,0). Para los medios indicadores se deben probar con cepas que

produzcan las reacciones características y otras que no las den [3].

En la Fig. 6 se detalla la forma en que se realiza la prueba ecométrica.

40

Fig. 6 Prueba para evaluar el Método ecométrico.

41

8.6 PRUEBA DE TOXICIDAD DEL DILUYENTE


1.1 Sembrar en una placa de agar nutritivo la cepa de Escherichia coli

ATCC 25922 e incubar a 35°C durante 24 horas.

2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO.

2.2 Tomar una colonia aislada de la cepa e inocular en un tubo con 2 ml de

caldo nutritivo.

2.3 Incubar durante 18 horas a 35°C.

3. DÍA DE CONTROL


3.1 Preparar 3 frascos con diluyente 99 ml y rotularlos con 10-2, 10-4 y 10-6.

3.2 Rotular 5 cajas petri con la dilución 10-6 para el tiempo 0 (T0),

simultáneamente otras 5 cajas petri con la dilución 10-6 para el tiempo

45 (T45).


3.3 Transferir 0.1 ml del cultivo que se encuentra en el caldo nutritivo a un

matraz Erlenmeyer con 100 ml de caldo nutritivo. Incubar 4 horas a

35°C.

3.4 Transferir 1 ml del cultivo anterior al frasco de la dilución 10-2 que

contiene el diluyente 99 (peptona gelatina).

3.5 A partir de la dilución anterior (1:100), realizar diluciones decimales en el

diluyente a probar hasta la dilución 1:1,000,000.(10-6) para tener un

inóculo de 100 a 250 UFC/ml.

3.6 Inmediatamente transferir 2 ml de la última dilución (10-6) a 5 cajas de

petri estériles rotuladas con (T0) y agregar por vaciado en placa 15 ml de

42

Agar Rojo Violeta Bilis fundido a 45°C, dejar solidificar y agregar una

segunda capa (5 ml) de agar rojo violeta.

3.7 Dejar transcurrir 45 minutos, se agita el frasco y de la misma dilución se

transfiere 2 ml a 5 cajas de Petri rotuladas con T45.

3.8 Agregar por vaciado en placa 15 ml de agar rojo violeta bilis fundido a

45°C dejar solidificar y agregar una segunda capa (5 ml) de Agar Rojo

Violeta Bilis [5].

3.9 Incubar ambas series de cajas de petri invertidas a 35°C durante 24

horas.

4. CONTEO DE PLACAS

4.1 Contar las colonias desarrolladas en las dos series de cajas (T0’ y T45’) y

hacer un promedio de cada serie[6].

4.2 Calcular el porciento de cambio en la población entre el T0’ y T45’

mediante la siguiente formula:

FÓRMULA

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre 20% ± 5%

En la Fig. 7 se detalla la forma en que se realiza la prueba de toxicidad de

diluyente [3].

43

Fig. 7 Prueba para determinar la toxicidad del diluyente

44

8.7 PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES

PARA CUENTA EN PLACA


1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado las cepas:

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Bacillus subtillis

1.2 Incubar a 35°C/ 18 - 24 horas.


2.1 Tomar una colonia aislada de cada cepa y sembrar por separado en 3

tubos de BHI e incubar a 35°C 18hrs.

3. DÍA DE CONTROL


3.1 Preparar en una gradilla una hilera de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y

rotular cada hilera de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,

10-7, 10-8, 10-9, 10-10.

3.2 Rotular simultáneamente 10 placas petri estériles con 10-6, 10-7, 10-8,

10-9, 10-10.


3.3 Depositar el contenido total de cada una de las suspensiones

bacterianas del BHI en un matraz estéril de 100 ml y agitar suavemente.

3.4 A partir de la mezcla anterior, transferir 1 ml y hacer las diluciones

decimales 10-1, 10-2 hasta llegar a 10-10 [5].

3.5 Simultáneamente transferir 1 ml a partir de la dilución 10-6, 10-7, 10-8,

10-9, 10-10 por duplicado a cajas Petri estériles para realizar el vaciado

45

en placa, las primeras 5 placas con el medio a evaluar Agar Rojo Bilis

Violeta y las restantes con el medio de referencia Agar Cuenta Estándar

(15 ml de cada medio fundidos a 45°C) observar Fig 7.

3.6 Dejar solidificar e incubar a 3 5± 1°C por 24 horas.

4. CONTEO DE COLONIAS

4.1 Seleccionar las placas con una cuenta ≥ 100 UFC/ml. Anotar los

resultados [6].

5. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El Porcentaje de recuperación bacteriana o proporción de productividad del

agar de interés, se calcula con la siguiente ecuación:

PR= (Ns/No)(100)

Dónde:

PR: Proporción de Productividad

Ns: Es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar

(obtenido de uno o más placas)

No: Es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de

referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser ≥100 UFC [6].

En general para que el medio de cultivo no selectivo (utilizado en recuento

en placa) sea conforme en cuanto a productividad su PR debe ser mayor o igual a

un valor límite de 0,7 [2].

46

9. RESULTADOS

- Conservación de cepas.

Se realizó la purificación de cepas microbianas a mediano plazo en aceite

mineral, obteniendo satisfactoriamente el crecimiento de los microorganismos, por

el método anteriormente descrito, se realizó la identificación por medio de pruebas

bioquímicas, tinción de Gram, agares selectivos. Se hizo uso del equipo Sistema

MicroScan WalkAaway plus de la marca Siemens Healthcare Diagnostics, para

corroborar los resultados de las pruebas bioquímicas para identificación cepas. Se

realizó la elaboración y modificación del formato correspondiente (véase

conservación de cepas anexo 1).

Microorganismos identificados

Cepa Clave

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Stapylococcus aureus ATCC 25923

Vibrio cholerae 01 OPS-OMS

Salmonella grupo G 3277

Shigella sonnei 3283

Salmonella grupo B 3355

Salmonella sp urbana 3321

Salmonella newport 4344

Shigella boydi 2965

- Criterios de calidad en la evaluación física y biológica de

medios de cultivo preparados.

Se establecieron los criterios de evaluación para caldos, diluyentes y

placas. Se realizaron las modificaciones correspondientes dando como resultado

el FO-08-16-1508 (formato criterios de calidad en la evaluación física de medios

de cultivo). (Ver anexo 1 Criterios de calidad en la evaluación física de medios de

cultivo).

47

- Prueba de promoción de crecimientos en caldos.

Aplicando el procedimiento anteriormente mencionados se evaluación los

siguientes medios.

MEDIO A EVALUAR (marca)

CEPA DESEADA CEPA INTERFERENTE RESULTADO

Caldo lauril (s) Difco

Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado

Caldo lauril (s) Bioxon


Caldo Lauril [1.5] bioxon


Caldo Ec. Con Mug Difco

Escherichia coli Enterobacter aerogenes Rechazado

Caldo lauril Mug Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado

Caldo lactosado bilis verde brillante Bioxon

Escherichia coli


Aceptado

Los medios fueron aceptados ya que se demostró la inhibición de la cepa

interferente, resultando como rango de sensibilidad la dilución 10-7, el medio caldo

Ec. con Mug fue rechazado ya que no presento crecimiento en el rango de

sensibilidad. Los resultados fueron registrados en el formato FO-08-16-1504

(promoción de crecimiento en caldos), a este formato se realizaron modificaciones.

(Véase Anexo 1 Promoción de crecimiento en caldos).

- Promoción de crecimiento en caldos selectivos

Realizando el procedimiento anteriormente descrito, se evaluó con las

siguientes cepas:


Cepas

Salmonella typhimurium Deseada Interferente Interferente

Escherichia coli

Citrobacter freundii

48

Evaluando el caldo selectivo Tetrationato (CTT) y el caldo Rappaport Vassiliadis

(CRp).

Caldos Evaluados Medio selectivo de recuperación

CTT con Verde Brillante y CTT base VB, XLD, SB

CTT con verde brillante y CTT base VB, SS, SV

Se demostró que el caldo CTT c/VB tuvo una recuperación en la dilución 10-6 y

10-7 en los medios VB, XLD y SB, el verde brillante es inhibidor de la cepa

Citrobacter y E. coli. Los medios selectivos son aceptables para su

reproducibilidad. (Ver anexo 2 FIG 6 y FIG 7).

En el CTT base se obtuvo una mayor recuperación en los medios selectivos

VB, XLD, SB, SS. (Ver anexo 1. Prueba de promoción de crecimiento en caldos

selectivos).

- Prueba Ecométrica en agares selectivos, diferenciales e indicadores.

Se usaron las tres cepas deseadas y las tres interferentes dando resultados

aceptables demostrando que los medios selectivos agar salado manitol (ASM) y el

Agar eosina azul de metileno (EMB) (ver anexo 2 FIG. 8), son aceptados para

trabajar con ellos. (Ver anexo 1 Prueba ecométrica).

- Prueba de Toxicidad del diluyente.

Se realizó el procedimiento anteriormente descrito, evaluando lo siguiente:

DILUYENTE CEPA RESULTADO

Solución amortiguadora

de fosfatos

Escherichia coli ATCC

25922

Aceptado

Peptona de gelatina Escherichia coli ATCC

25922

Aceptado

Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre 20% ± 5% y se

demostró que los diluyentes analizados son viables para trabajar con ellos. (Ver

anexo 1. Toxicidad de diluyente).

49

- Porcentaje de recuperación bacteriana en agares para cuenta en placa.

Utilizando las cepas:

Escherichia coli


Staphylococcus epidermidis

Se evaluaron los medios Agar Billis Rojo Violeta (ABRV) y el medio agar cuenta

estándar (ACE), utilizando como cepa control: Escherichia coli, cepas

interferentes: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Ver anexo 2

FIG. 9. Se seleccionaron las placas con una cuenta ≥ 100 UFC/ml. (Ver anexo 1.

Porcentaje de recuperación bacteriana en agares para cuenta en placa).

50

10. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES

El trabajo realizado en esta investigación, cumplió los objetivos que se

plantearon al 100 %. La evaluación de medios de cultivo resultó ser el

procedimiento más importante del departamento de control ambiental, ya que el

desarrollo de los procedimientos en el área de Microbiología de alimentos

depende de la buena calidad de un medio. Sin un medio de cultivo viable se

tendría falsos positivos en cada una de las pruebas realizadas en estos. Control

de calidad es un área importante en todos los laboratorios, manteniendo

controladas las diferentes variables que pueden afectar a un medio se logra un

resultado confiable tanto para el mismo laboratorio como para el cliente.

Las condiciones de trabajo en el laboratorio, el equipamiento e instalaciones

no fueron las más adecuadas, sin embargo, se logró realizar cada uno de los

procedimientos descritos anteriormente.

Con la experiencia adquirida se recomienda lo siguiente:

a) Se implemente un plan de trabajo complementario en las áreas de

preparación de medios de cultivo, control de calidad de medios y

Microbiología de Alimento, desarrollando cronogramas de actividades de

cada área mencionando los medios de cultivo a utilizar, la cantidad de

medio y el tiempo en que se desarrollará dicha actividad, con el fin de

mejorar la comunicación, coordinar y facilitar cada una de las actividades

correspondientes de cada departamento.

b) Información adecuada y oportuna a través de talleres para que manejen

adecuadamente sus equipos e instalaciones.

c) Qué se tomen acciones inmediatas para el equipamiento del área de control

de calidad de medios.

d) Es indispensable que se logre una mejor comunicación entre todas sus

áreas y trabajadores.

51

e) Es relevante la importancia de continuar con este proyecto ya que como

área nueva dentro de este laboratorio, sin un buen control de calidad no se

aseguran resultados confiables.

La cooperación incondicional y apoyo de los Químicos Analistas, fue parte

de este logro. El trabajo concluido en tiempo y forma, fue de acuerdo a lo

planeado inicialmente y de acuerdo al cronograma de actividades.

Dentro de los logros realizados en el proyecto, se obtuvo experiencia en el

manejo e implementación de control de calidad en medios de cultivo. Además de

tomar las decisiones en el momento adecuado bajo presión. Por otro lado, quedó

claro que el trabajo en equipo, propicia que los resultados sean exitosos y

confiables.

52

11. ANEXO 1

CONSERVACIÓN DE CEPAS

54

CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: CALDOS

56

CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: DILUYENTES

NOMBRE DEL DILUYENTE Dil 9 Dil 99 Dil 9 Dil 99 Dil 99 FECHA DE EVALUACIÓN 19/06/12

5/100

19/06/12 21/06/12

5/100

22/06/12 29/06/12 CANTIDAD EVALUADA 5/100 3/6 5/100 2/6 2/4 FECHA DE PREPARACIÓN 14/06/12 14/06/12

2

21/06/12 21/06/15

2

29/06/12 LOTE DE PREPARACION 24-4 24-3 25-4 25-5 26-5 MARCA COMERCIAL BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON No DE LOTE 9313901 9313901 9313901 9313901 9313901 CUMPLE CON LOS CRITERIOS? SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO Volumen dentro del rango requerido

Ausencia de turbidez y precipitación

Incoloro. Envase con tapa bien cerrada. Ausencia de materia extraña. Envases en buenas condiciones Presencia de etiquetas pH dentro del limite establecido PUNTOS INCUMPLIDOS 0 0 0 0 0

% DE CUMPLIMIENTO 100% 100% 100% 100% 100%

RESULTADO

VERIFICACIÓN DE VOLUMEN

1.-9ml

2.-8.9ml

3.-9.1ml

4.-8.9

5.-9ml

1.-90ml

2.-89.9ml

3.-90.5ml

4.-89.7ml

5.-90ml

1.-9ml

2.-8.9ml

3.-9.1ml

4.-8.9

5.-9ml

1.-90ml

2.-90.3ml

3.-90.2ml

4.-89.8

5.-90.2ml

1.-90.3ml

2.-90.4ml

3.-91ml

4.-89.9

5.-90.1ml

57

CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: PLACAS

FECHA DE EVALUACIÓN 29/05/12 29/05/12 29/05/12 29/05/12 08/06/12 12/06/12 12/06/12 ABREVIACIÓN MEDIO EN PLACA ASM EMB AN AN(3%N

aCl)

AVB ASM EMB

CANTIDAD EVALUADA 8 9 18 13 17 15 18 FECHA DE PREPARACIÓN 28/05/12 28/05/12 27/05/12 17/05/12 31/05/12 07/06/12 07/06/12 LOTE PREPARACIÓN 22-1 22-1 20-4 21-4 23-1 23-4 23-4 MARCA COMERCIAL BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON MCD-LAB BIOXON BIOXON No LOTE 1355936 7082277 0124694 2067037 71911120

26

1355936 7082277

CUMPLE CON LOS CRITERIOS? SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO

Presenta coloración característico

Solidificación y estabilidad de gel adecuado

Ausencia de rajaduras en superficie Ausencia humedad tapa y superficie No Hemolisis y coágulos de sangre NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA

Ausencia de coágulo formado por enfriamiento del medio

Libre de materia extraña. pH dentro del límite establecido Ausencia de burbujas en el medio Ausencia de colonias contaminantes Placas rotuladas en tapa Envasadas en bolsas de plástico e identificadas con etiqueta.

PUNTOS INCUMPLIDOS 0 0 0 0 0 0 0

PORCENTAJE DE CUMPLIMIENTO 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

58

PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS

64


CEPA CONTROL CLAVE CEPAS INTERFERENTES CLAVE

Salmonella typhimurium ATTCC14028 Citrobacter freundii

Escherichia coli

ATCC8090

ATCC25922

FECHA DE EVALUACIÓN 06/06/12

MEDIOS A EVALUAR

CTT c/VB CTT (base)

Marca Comercial Bioxon LOTE 1013423 Marca Comercial Bioxon LOTE 1013423

FECHA preparación 01/06/12 LOTE preparación 22-05 FECHA preparación 01/06/12 LOTE preparación 22-5

pH referido N/R pH final 8.13 pH referido N/R pH final 8.11

No. DIL ACE (UFC)

RECUPERACIÓN

Medios selectivos ACE (UFC)

RECUPERACIÓN

Medios selectivos

VB XLD SB VB XLD SB

10-6 133 + + + 133 ++ ++ ++

10-7 12 + + + 12 ++ ++ ++

10-8 1 - - - 1 - - -

10-9 0 - - - 0 - - -

Placa control ACE 0 UFC

65

CEPA CONTROL CLAVE CEPAS INTERFERENTES CLAVE

Salmonella typhimurium ATTCC14028 Citrobacter freundii

Escherichia coli

ATCC8090

ATCC25922


MEDIOS A EVALUAR

CTT c/VB CTT s/VB (base)

Marca Comercial BIOXON LOTE 1013423 Marca Comercial BIOXON LOTE 1013423

FECHA preparación 22/06/12 LOTE preparación 25-05 FECHA preparación 22/06/12 LOTE preparación 25-05

pH referido N/R pH final 7.60 pH referido N/R pH final 7.57

No. DIL ACE (UFC)

RECUPERACIÓN

Medios selectivos ACE (UFC)

RECUPERACIÓN

Medios selectivos

VB SS SB VB SS SB

10-6 96 + ++ + 96 ++++ ++ ++++

10-7 5 + + + 5 ++++ ++ ++

10-8 1 + + + 1 ++ ++ ++

10-9 0 0 0 0 0 - - -

Placa control ACE 0 UFC

66

PRUEBA ECOMETRICA

68

TOXICIDAD DEL DILUYENTE

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01

NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN

Solución amortiguadora de fosfatos 22/02/2012

Marca

comercial

Preparado por

ingredientes Lote N/A Fecha preparación 20/02/2012

pH referido 7.0 ± 0.2 pH final 7 Lote preparación 8-1

Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5

UFC SUMATORIA PROMEDIO

TIEMPO0 150 105 115 114 169 653 130.6

TIEMPO45 155 136 166 110 204 771 154.2

Placa ABRVCONTROL= 0 UFC Lote preparación8-2

RESULTADO 15.30%

69

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01


Solución amortiguadora de fosfatos 07/03/2012

Marca

comercial

Preparado por

ingredientes Lote N/A Fecha preparación 29/02/2012

pH referido 7.0 ± 0.2 pH final 7 Lote preparación 9-2

Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5


TIEMPO0 110 147 147 150 118 806 134.4

TIEMPO45 148 165 185 166 117 781 156.2


RESULTADO 16.22%

70

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01


Peptona de gelatina 07/03/2012

Marca

comercial BIOXON Lote 9313901 Fecha preparación 05/03/2012

pH referido 6.5 ± 0.7 pH final 7.11 Lote preparación 10-1

Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5


TIEMPO0 104 72 78 65 124 88.6

TIEMPO45 115 98 87 86 125 102.2


RESULTADO 15.34%

71

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01



Marca



Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5


TIEMPO0 164 165 188 175 209 901 180.2

TIEMPO45 142 245 240 198 220 1053 210.6

Placa ABRVCONTROL= 0 UFC Lote preparación

RESULTADO 16.87%

72

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01



Marca



Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5


TIEMPO0 165 169 147 152 138 771 154.2

TIEMPO45 195 182 164 174 180 895 179


RESULTADO 16.08%

73

CEPA CONTROL

No. DE COLECCIÓN

CLAVE

Escherichia coli

ATCC25922

CCM-Esc-01



Marca



Minutos PLACA 1

UFC

PLACA 2

UFC

PLACA 3

UFC

PLACA 4

UFC

PLACA 5


TIEMPO0 144 165 118 139 127 693 138.6

TIEMPO45 168 184 135 143 169 799 159.8


RESULTADO 15.29%

74

PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES PARA CUENTA EN PLACA

CEPA CONTROL No DE COLECCIÓN CEPAS INTERFERENTES No DE COLECCIÓN

Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus


ATCC25923

ATCC12228


MEDIO A EVALUAR Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV)

FECHA Preparación LOTE Preparación

MARCA LOTE 23-5 pH Referido

No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) MEDIO DE REFERENCIA (UFC)

Agar Cuenta Estándar

Dilución 10-6 >250 >250

Dilución 10-7 35 41

Dilución 10-8 3 0

Dilución 10-9 0 0

Medio Control Placa Control 0 UFC Placa Control 0UFC

75




ATCC25923

ATCC16538


MEDIO A EVALUAR Agar Cuenta Estandar (ACE)

FECHA Preparación 24/05/2012 LOTE Preparación 21-4

MARCA BIOXON LOTE 1139270 pH Referido 7.0 ± 0.2

No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC)

Agar Cuenta Estándar (ACE)

MEDIO DE REFERENCIA (UFC)

Agar Soya tripticasa

Dilución 10-6 322 312


Dilución 10-8 2 2

Dilución 10-9 <1 <1


76




ATCC25923

ATCC12228



FECHA Preparación LOTE Preparación

MARCA LOTE pH Referido

No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) MEDIO DE REFERENCIA (UFC)

Agar Cuenta Estándar

Dilución 10-6 >250 >250

Dilución 10-7 198 277


Dilución 10-9 <1 0


77




ATCC25923

ATCC16538



FECHA Preparación 01/03/2012 LOTE Preparación 09-4

MARCA BIOXON LOTE 1199727 pH Referido 7.4 ± 0.2

No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC)

Agar Cuenta Estándar (ACE)

MEDIO DE REFERENCIA (UFC)

Agar Soya tripticasa


Dilución 10-7 3 6

Dilución 10-8 0 0

Dilución 10-9 0 0


78

12. ANEXO 2

FIG. 1 REACCIÓN POSITIVA DE CITRATO

FIG. 2 REACCIÓN TSI POSITIVA CON

GENERACION ACIDO SULHÍDRICO

FIG 3 REACCIÓN NEGATIVA DE MOVILIDAD

FIG 3. REACCIÓN POSITIVA INDOL

79

FIG 4. REACCIÓN POSITIVA UREASA

FIG. 5. REACCIÓN POSITIVA DE LYA

FIG 6. PLACA DE SULFITO DE BISMUTO CTT

80

FIG. 7 PLACA SS. CRECIMIENTO DE SALMONELLA

FIG 8. IZQ. PLACA DE ASM. DER. PLACA DE EMB. AMBAS PRESENTANDO ALTA

SELECTIVIDAD Y PRODUCTIVILIDAD,

81

FIG. 9. PLACAS DE ABRV

82

13. GLOSARIO

Aseguramiento de Calidad: Conjunto de actividades planeadas y sistemáticas,

que lleva a cabo una empresa, con el objeto de brindar la confianza apropiada, de

que un producto o servicio cumple con los requisitos de calidad especificados.

Caldos enriquecidos: Son medios líquidos que por su composición permiten el

crecimiento de microorganismos determinados y la inhibición de microorganismos

no deseados, permitiendo la recuperación de bajas cargas microbianas.

Caldos Selectivos: Son medios líquidos que por su composición suprimen el

crecimiento de microorganismos indeseables y permite el desarrollo de un

microorganismo en especial.

Cepa bacteriana: Es aquella que proviene de una célula aislada o de un grupo de

células que presentan las mismas características genéticas.

Cepario: Conjunto de cultivos o cepas de microorganismos viables, aislados y

conservados por diferentes métodos.

Control de Calidad: Conjunto de métodos y actividades de carácter operativo,

que se utilizan para satisfacer el cumplimiento de los requisitos de calidad

establecidos.

Conservación a mediano plazo: Método de cultivo sobre medio inclinado y

aceite mineral. Permite obtener cultivos intermedios, para uso y conservación.

Cultivo primario o de donación (cepa primaria): Subcultivo proveniente de un

material de referencia, utilizado únicamente para realizar el número de resiembras

óptimas, tales que no originen cambios fenotípicos y genotípicos del cultivo.

Cultivo intermedio (cepa intermedia): Subcultivo proveniente de un cultivo

primario, utilizado únicamente para realizar pruebas de pureza y viabilidad en cada

resiembra.

83

Cultivo de trabajo (cepa de trabajo): Subcultivo proveniente de un cultivo

intermedio, el cual es utilizado para control interno de la calidad en los ensayos del

laboratorio y el cual no se debe replicar.

Diluyente: Sustancia adecuada donde se han demostrado no tener actividad

antimicrobiana bajo las condiciones de prueba (usados en diluciones).

Esterilización: Es la eliminación completa de toda forma de vida microbiana.

Puede conseguirse a través de métodos químicos, físicos y gaseosos

Esterilización por calor húmedo: Es un proceso capaz de eliminar todas las

formas microbianas por desnaturalización y coagulación de sus proteínas

celulares, este proceso se realiza en autoclave mediante vapor saturado a

presión.

Inocuidad: Garantía de no hacer daño.

Material estéril: Es aquel material libre de microorganismos patógenos, no

patógenos y esporas, después de haberse sometido a un proceso de

esterilización.

Medios selectivos: Son medios sólidos que eliminan el crecimiento de

microorganismos indeseables y permiten el desarrollo de un microorganismo o

grupo de microorganismos.

Toxicidad: Es una medida usada para medir el grado tóxico o venenoso de

algunos elementos. La toxicidad puede referirse al efecto de esta sobre un

organismo completo, como un ser humano, una bacteria, etc.

Productividad: Recuperación o supervivencia de los microorganismos.

Selectividad: Inhibición o supresión de los microorganismos no deseados.

84

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Manual de recomendaciones generales para la preparación de medios de cultivo 1989.

2. Manual de organización. Laboratorio estatal de salud pública de Colima 2012 SSA.

3. Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC). 2008. Catálogo oficial de medios de cultivo. Laboratorio estatal de salud pública de Colima.

4. CCAYAC. Taller teórico practico control de calidad de medios, manejo y conservación de cepas2012.

5. NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

6. NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Mesófilos aerobios por vertido en placa.

7. INDRE. Manual de técnicas de laboratorio 1997.

8. Mac faddin, Jean F. (2000). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. (3era edición). Buenos aires, Argentina: Editorial medica Panamericana.

evaluaciÓn de los medios de cultivo para verificar su

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