ctb hemoparasitos farber

7/23/2019 CTB Hemoparasitos Farber

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Desarrollo de Herramientas

Moleculares para el estudio de

enfermedades transmitidas porgarrapatas

Marisa Farber, PhDInst. Biotecnologia

INTA (National Institute for Agricultural Technology)

Buenos Aires, Argentina


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Babesiosis: Babes ia bov i s, Babes ia b igem inaAnaplasmosis: Anaplasma marg ina le.

En Argentina:

Las prdidas econmicas directas por reduccin de peso o mortalidad, y loscostos para el tratamiento y la prevencin de estas enfermedades, mediantevacunas vivas en la Argentina, se han estimado en US$ 38.9 millones al ao.

Tristeza bovina (Bovine Tick-Borne Diseases)

65W

33S

30S

Boophi lus microplus

Babesia enzootic area A. marginale enzootic area

Ticks & TBD free area


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Babesiosis: Babes ia bov is ,

Babes ia b igemina

Anaplasmosis: Anaplasma marg inale


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Ciclo de vida


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RELEVANCIA SOCIAL, ECONOMICA Y

PRODUCTIVA DEL PROBLEMA Demanda de alimentos en el mundo

Devaluacin del peso en el 2001, la suba del tipo de cambio real,

crecimiento de la economa Suba de precios internacionales

Ao Produccin (*) Exportacin (**) Expo/Prod. (%)

2000 2.489 342 12,6%

2001 2.526 152 6,1%2002 2.664 351 13,9%

2003 3.024 392 14,7%

2004 3.132 631 20,9%

2005 3.132 771 24,6%

2006 3.030 565 18,6%

(*) miles de toneladas res (**) miles de toneladas res con hueso

Fuente: SAGyPA

PRODUCCION DE CARNE VACUNA 2000-2006


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Distribucin de la produccin ganadera en

Argentina

Stock de 49.000.000 bovinos

Pampa hmeda concentra el 60%

NEA posee el 24% del stock

NOA tiene el 8,4%


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LABORATORIO DE HEMOPARASITOS

Un poco de historia

Comenz por el Diagnstico

Continu con Vacunas Se extendi a la Epidemiologa


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Aprovechamiento de la informacin

genmica para el desarrollo de

herramientas aplicadas al Estudio de la

Babesiosis y Anaplasmosis Bovinas


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GENOMAS

EPIDEMIOLOGIA DIAGNOSTICO

GENOMICA FUNCIONAL: ANTIGENOS VACUNAS


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En qu trabajamos?

Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas

Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico

Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos

Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia

en Anaplasma

- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos

Sistemas de expresin heterloga


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En qu trabajamos?





en Anaplasma




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La tcnica de Reverse Line Hybridization (RLB) puede serutilizada para la deteccin simultnea de diversas especies cepas de parsitos en muestras de aislamientos.

La introduccin de la sonda general (catch all) permite ladeteccin de parsitos an no descriptos.

Se ha desarrollado este mtodo para parsitostransmitidos por garrapata tales como Theileria ssp.,Babesia ssp., Ehrlichia ssp. y Anaplasma ssp.

Permite la caracterizacin de numerosas muestras en unmismo ensayo partiendo de un producto de PCR.


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RLB

Primers:

Anaplasma ssp.HER-F: AGAGTTGGATCMTGGYTCAG

EHR-R: AGAAGAAGTCCCGGCAAACT

Babesia ssp .

RLB-F2: GACACAGGGAGGTAGTGACAA

RLB-R2: B-CTAAGAATTTCACCTGTGACAGT

Sondas:

A. centrale especfica:

TCGAACGGACCATACGC

A. marginaleespecifica:

GACCGTATACGCAGCTTG

Anaplasma ssp. catch all:

GGGGGAAAGATTTATCGCTA

B. bovis especfica:CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG

B. b igeminaespecfica:

CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG

Babes ia ssp. cat ch al l.

CTGTCAGAGGTGAAATTCT


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Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.


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Deteccin de polimorfismo en la sonda especfica

para B. bigem ina

Observations Name

Currenly used probe MEXICO C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G

BgM2P C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G CLONED Jul-04

C G T T T T T T C C C T C T T T T T G G

G G G C

T

C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G

C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G

C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G

C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G

BgS1A C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G CLONED Jul-04


C

BgS2P C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G CLONED Jul-04

BgS2P.clone1 C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G C LO NE D S ep -04

BgS2P.clone2 C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G C LO NE D S ep -04

BgS2P.clone3 C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G C LO NE D S ep -04


G T


G T


C T G

T

C G T T T T T T C C C T G T T T T T G G

T G G C

C

Secuencias para membrana

C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G




B. bigemina P

B. bigemina A

B. bigemina T

B. bigemina M

BgS1A

Possible options for BgM2P sequences

BgS2P

Pathogenic B. bigeminafrom Alen-Cue,

Corrientes, ArgentinaBgM1P

AttenuatedB. Bigemina

PathogenicB. bigemina

BgM2P PCR

Sequence

Reference sample

Details

PCR Nov-04

Nov-04

AttenuatedB. Bigemina from Alen-Cue,

Corrientes, ArgentinaBgM1A PCR Nov-05

Sep-II-04

PCR Sep-II-04

PCR

Pathogenic B. bigeminafrom Chavarria,

Corrientes, Argentina

PCR Nov-05

B. bigeminafrom Brasil PCR Nov-05


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Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.


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Deteccin de B. bigeminapor PCR:


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Inmunosensor ptico basado en MSP5 para el

diagnstico de A. marginale


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0

1

2

3

4

5

6

7

10-20

21-30

31-40

41-50

51-60

61-70

71-80

81-90

91-100

>101

F.A.U at 670 nm

Numberofsera

Anaplasma spp uninfected cattle

Anaplasma spp infected cattle

Distribucin de Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (F.A.U) de 12 sueros

negativos (barras negras) y 9 sueros de bovinos infectados con A. marginale.

PositivosNegativos

Positivos 25 6

IS

Negativos 1 1

Valor de corte: 40 F.A.USensibilidad 95%

Especificidad 83%

Concordancia entre las dos

pruebas: 88%

Comportamiento del inmunosensor en muestras de campo: concordancia con el

ELISAc como gold standard


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En qu trabajamos?





en Anaplasma




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Muestreo NEA y NOA

Diseo del muestreo: Establecer zonas de riesgo en funcin del nmerode generaciones de garrapatas que nos permite definir 3 regiones de baja,media y alta transmisibilidad respectivamente, las cuales se asocian

indirectamente las condiciones climticas, uso de garrapaticida, etc.

Hiptesis de trabajo: Definir marcadores moleculares que permitanasociar los indicadores de riesgo con la variabilidad gentica de los

aislamientos.


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Marcadores moleculares

Regiones repetidas en tandem en genes que codifican paraprotenas de superficie:A. marginale (MSP1a), B. bovis (Bv80, TRAP,P200, Antigen 3, Desmoyokin), B bigemina (P200, PLP)

MACF

Primer For

Primer Rev

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PCR amplification of the repeat region fromdifferent isolates of 1:BgS2P,2:BgS1A, 3:BgM1P, 4:BgM1A, 5 and 6:BgMx

(Jg29), 7:BgBr, 8:BgM2P, 9:negative control.

B. bigemina.


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Marcadores moleculares

VNTR (Variable number of tandem repeats) :A. marginale (AMTR 15 yAMTR11). En desarrollo para Babesia sp

MLST (Multilocus Sequence Typing): seleccin de los genes blanco(housekeeping genes), determinacin de la especificidad,secuenciacin de los fragmentos amplificados, bsqueda depolimorfismo de nucletidos simples (SNPs), determinacin de la tasade sustitucin para verificar que los genes seleccionados respondan amodelos de evolucin neutra.


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DataBase

The ACCESS data base (DB) includes information about4189 bovine samples from Northeast (1198) andNorthwest (2991) Argentina.

DB fields correspond to information describing sampling(date, responsible, place of work), the field (region,province, locality, department, field coordinates), thecattle (breed, age, tick control strategies), the sampleevaluation (ELISA, PCR, RLBH), molecularcharacterization: Polymorphic genes, VNTR, MLST.

Based on the information required, different queries weredesigned. These queries enable the DB user to easilyextract information about the 4189 samples.


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RLBH detection

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%Bbo

tot

%Bbi

tot

%Am

tot

%Eo

tot

%Bbo

%Bbi

%CA+

Bbo-Bb

i-

%Am

%Eo

%Neg

%Bbo

Bbi

%Bbo

Am

%Bbo

Eo

%Bbi

Am

%BbiEo

%AmEo

%Bbo

Bbi

Am

%Bbo

BbiEo

%Bb

iAmEo

%Bbo

AmEo

%Bbo

Bbi

AmEo

NEA

NOA

Total

La proporcin de animales co-infectados conA. marginale y Babesia sp result

significativamente alta (P


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En qu trabajamos?





en Anaplasma




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Seleccin de antgenos candidatos

PCR sustractiva

Library phoA Bibliografa

Bioinformtica

Antigeno Identificacin Caractersticas

TolC Library PhoAC OMP conservada.

Sistema secrecin TipoI.OMP85 Library PhoAC OMP conservada.

Antgeno protectivo

OMP 4 Library PhoAC Familia de antgenos superficie

PhoAc Library PhoAC OMP Cluster conservadopatgenos y simbiontes

intracelulares.

L22 PCR sustractiva

Adh Dominiostransmembrana

Probable adhesina

AM 742 Dominiostransmembrana

Hypotetical protena -

Caracterizacin bioinformtica

Verificar la transcripcin

Expresin de protenas recombinantes

Ensayos de linfoproliferacin

Perfil de estimulacin de citoquinas

Western blot

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin


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Los genes que codifican protenas

exportadas pueden identificarse mediantefusiones traduccionales al gen de la fosfatasaalcalina (phoA) de Escherichia col i.

La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta

cuando la enzima se encuentra fuera del mbito

citoplasmtico.

El gen reportero phoA utilizado no poseesu promotor ni la regin que codificael pptido seal amino terminal.

La actividad PhoA se detecta fcilmenteutilizando BCIP como sustrato.


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Actividad de PhoA de acuerdo con la localizacin subcelular

Membrana externa

CITOPLASMA

MEDIO EXTERNO

PERIPLASMA

Membrana interna

NH2

NH2

NH2

NH2NH2

NH2

NH2

NH2

PhoA enzimticamente inactiva

PhoA enzimticamente activa

Segmento hidrofbico

de transmembrana


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Bsqueda de protenas exportables

Clonado y expresin de fusiones a

PhoA en Escherichia coliCC118


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Western blot



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PredictedORF

Signalpeptide

TMDomains Conserved

domainBlast2GO Uniprot

Ortologos

ID Name Annotation Nucleotide Signal P TM Pred

Conservedcluster withinintracellular

pathogens andendosymbionts

AM1108

PhoACHypothetical

protein2076 +

1Pentapeptide

repeat

Pentapeptiderepeat

Pentapeptiderepeat domain

protein2

AM127

L22Hypothetical

protein3000 +

1B-Lectin

-Acetamidaseformamidasefamily protein2

AM

216

AdhHypothetical

protein

2529 +

- Conservedcluster within

Anaplasmasand Ehrlichias1

PhoAC Orf L22 Adh


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Western blot


Confirm la expresin de los

genes candidatos


35/58








Western blot


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N IDInfectados/ no

infectadosMsp5-PCR

ControlNo

infectado- -

282 Infectado Aguda +

285 Infectado Crnico +

99 Infectado Crnico +







Western blot

Ensayos con animales naturalmenteinfectados (Mercedes, Corrientes)

Confirm la infeccin por pcrdiagnostica del gen msp5Respuesta positiva fuerte para PhoAC ORF yAdh Cterm ymas dbil para los antgenos L22 N term y Adh Nterm


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msp5 PhoAC Adh- Adh+

L22 Cterm PhoACPhoAc 5

Western blot









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RT qPCR Citokine expression profile

AM1108 PhoAC ORF

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

IL2 IL10 IL12p35 TNF INFFactorofUP-regulatation

AM216 Adh-

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

IL2 IL10 IL12p35 TNF INF

Results were presented as ratios calculated with the Relative expression software tool (REST@)

application described by Plaffl et al. The value of PCR efficiency for all transcripts was 2, as

calculated following the formula: E = 10[-1/slope].


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Regulation factor of cytokine profile

IL2 IL10 IL12p35 TNF IFN Enhanced expression

PhoAC 1,18 1,39 1,49 2,71 1,98 TNF, IFN

Adh- (C-term) 1,41 2,27 1,46 1,63 2,52IL2,IL10, IL12, TNF,

IFN


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Western blot


Identificacin y caracterizacin de nuevos

antgenos candidatos capaces de estimularuna respuesta inmunolgica especfica

Blancos potenciales para ser

estudiados en nuevas

formulaciones vacunales.


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Twin arginine translocation pathway: TAT system

Sistema de traslocacin de protenas plegadas a travs de lamembrana interna de bacterias Gram-negativas.


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Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y Cy su organizacin

en el genoma en las alphaproteobacterias.

Twin arginine translocation pathway: TAT system

Estudio la transcripcin de los genes y la regulacin.

Funcionalidad de tatABCen sistema heterologo de mutantes de Escherichia

coli.


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Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y Cy

su organizacin en el genoma


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Anaplasma marginale Brucella abortus

tatAB tatBC tatC-Ser

A

B

Dispersa Operon


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Funcionalidad de tatABCen sistema heterologo de Escherichia coli

Viabilidad en SDS 2%

pUNIp

3404 bp

AmaTatA,B,C

Promotor Tat Ecoli

Anaplasma marginale

Brucella abortus

Escherichia coli (Controles)

TatA,B y C

E coliTatC-

E coliTatB-

E coliTatA-

A marginale B abortus

Tat A Funcional ?

TatB No funcional Funcional

TatC No funcional Funcional


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En qu trabajamos?





en Anaplasma




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Anlisis de la regin que contiene el dominio MACPF

Estudio in si l ico (colaboracin Natalia Rego y Hugo Naya de la Divisin deBioinformtica del Instituto Pasteur de Montevideo)

Prediccin de estructura de los genes con dos gene finders basados en HMM:

Fgenesh entrenado con P. falciparum y Glimmer HMM entrenado con el

cromosoma II y III de B. bovis.

La anotacin pblica de cromosomas de B. bovis y Theileria sp. permiti el estudio de la

ortologa y sintenia entre estos cromosomas y los contigs de B. bigemina

Hasta el momento hemos identificado 6 genes con dominio MACPF y estamos

trabajando en la anotacin y la verificacin de los resultados con estudios in vitro

BbiPLP1

CDS de 1 Exn:BbiPLP1 3721 pb; BbiPLP2 3240pb

Seal TATA

Pptido seal

Regin polimrfica (PLR: perforin likerepeat)

Dominio MACPF (Smart)BbiPLP1: 623pb y BbiPLP2: 655pb

Sitio Poly A

BbiPLP2


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Verificacin de la expresin de la BbiPLP1

RT- PCR. A: cDNA Merozotos BbiMx, B: cDNA Merozotos BbiS3 y

C: cDNA Fases sexuales BbiMx

A B C

RT + RT- ADNg ADNg RT+ RT- RT+ RT- ADNg


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En qu trabajamos?





en Anaplasma




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Identificacin de potenciales nuevos antgenos de B .

b igeminaa partir de un anlisis protemico

Optimizacin de la purificacin de protenas totales de merozotos del aislamiento argentino BbiS2P

-Infeccin experimental con BbiS2P de terneros esplenectomizados

- Purificacin de merozotos (estado intraeritroctico) con gradiente de Percoll

- Preparacin del extracto de protenas solubles totales

- Optimizacin del Isoelectroenfoque

- Optimizacin del SDS- PAGE

- Optimizacin del mtodo de deteccin de las protenas (Coomassie coloidal)

-Transferencia de los perfiles proticos a membranas PVDF- Inmunoscreening con sueros bovinos

Gel en 2D teido. IEF: tiras de 7 cm, rango de pH 4-7 y SDS-

PAGE 10%. A: protenas de merozotos de BbiS2P. B: protena de

eritrocitos no infectados

A B

+ - + -


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Descubrimiento de biomarcadores peptdicos para

diagnstico: aplicacin para el diagnostico de la

babesiosis bovina-Se utilliz una pipeline bioinformatica (desarrollada por Santiago Carmona y Fernan

Agero- IIB UNSAM) diseada para identificar antigenos peptidicos a partir del genomaanotado de parasitos patgenos.

-La pipeline define una funcin lineal que permite hacer un ranking de pptidos solapadosde 12 residuos aminoacidicos a partir de los fragmentos virtuales provenientes del

proteoma in silicodel parasito (Babesia bovis)

-Se consideraron los siguientes atributos para obtener la puntuacin de los peptidos:

Atributos Positivos

-regiones estructuradas vs. no estructuradas

-repeticiones

-sitios de glicosilacin

-localizacin subcelular-Medida del sesgo en el uso de codones (CAI)

Atributos Negativos

-Secuenciaas conservadas en el proteoma bovino

-Secuencias conservadas en el proteoma deTheileria


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Diseo del microarray de peptidos

Luego de inspeccionar manualmente los peptidos con mayor puntaje se seleccionaron 83peptidos, entre lo que se incluyen peptidos de reactividad conocida y los nuevos candidatos.

Se imprimieron los vidrios con los 85 peptidos y otros peptidos utilizados como control (JPTPeptide Technologies, Alemania)

Durante los proximos periodos se interrogar el array con grupos de sueros de bovinosinfectados y sueros control.


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En qu trabajamos?





en Anaplasma

- Familia de Perforinas en Babesia sp.

Bsqueda de nuevos antgenos



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Vectores virales: Capaces de estimular las diferentes vasdel sistema inmune generando proteccin efectiva.

Poxvi rusrecombinantes: renen estas caractersticas.

Genticamente atenuados.

Llevar secuencias de inters en posiciones que no sean esenciales para la

replicacin viral.

Fcil produccin (bajo costo) y administracin.

Estables, inocuos.

En Poxvirus, el ADN forneo se inserta por recombinacin homloga in vivo y

la expresin se consigue insertando el gen de inters bajo regulacin de

secuencias promotoras tempranas de poxvirus.


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pE: promotor temprano de poxvirus

X: gen de inters.

t: terminador de transcripcin y traduccin

poxvirus recombinante

poxvirus

pE- X - t

Sitio blanco de insercin

pE- X - t

recombinacin

homloga in vivo

Vector de transferencia

Teniendo en cuenta que:

La eficiencia de transfeccin es baja en cultivos primarios.

La frecuencia de ocurrencia de doble recombinacin (intercambio allico) no se puede cuantificar.

El virus salvaje replica normalmente.

Screening por actividad de una enzima marcadora

Actividad de la enzima B-glucuronidasa codificada por el

gen bacteriano uidA. Screening con X-Gluc (sustrato de la

enzima GUS)


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Poxvirus

pH6- GUS- t pE/L-XX - t

Gen no esencial

Poxvirus recombinante pH6-GUS- t pE/L -XX - t

recombinacin homloga in vivo

Vector de transferencia

1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.

2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.

3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.

4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.

5- Obtencin de un stockpuro.6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantesseleccionadas.

Obj i


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Objetivo

Disear, construir y caracterizar un MVA recombinante (MVAr) que exprese un

multiantgeno consistente en epitopes de tipo B y T de tres protenas

inmunognicas de B. bovis.

Rap-1 Msa-2c Hsp20

Epitopes T S ND S

Espitopes B S S S

Produccin INF - S ND S

Estado donde esta presente Merozoto Esporozoto Espor/Mero

Conservacin entre cepas S S S

Localizacin subcelular Roptrias Mem. Plsm. Citosol y MP

Construccin delMultiantgeno

Secuenciacin para verificar correcta orientacin.

Extraccin de ADNg o ARN de merozotos y amplificacin de los genesen cuestin conprimers especficos.

Clonado en vector de tipo T por separado e ingeniera gentica para

subclonar y fusionar los genes.

ND: No determinado

1 Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia


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1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.

2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.

3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.

4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.

5- Obtencin de un stock puro.

6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantesseleccionados.

1) Anlisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados o no para

determinar:

M 21 22 23 24 WT M 21 22 23 24WT C

B) Pureza de stocks recombinantes

(homogneos)M 22 23 24WT C

A) Presencia del gen de inters, pero stocks no

puros (no homogneo)

1.81.8

0.54 0.54

ctb hemoparasitos farber

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