concentraciÓn y detecciÓn de (oo)quistes de giardia …
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CONCENTRACIÓN Y DETECCIÓN DE (OO)QUISTES DE GIARDIA
SP. Y CRYPTOSPORIDIUM SPP. PROVENIENTES DE AGUA SUPERFICIAL
CAMILA PAOLA ZÁRATE OSPINA
ASESOR
MANUEL S. RODRÍGUEZ SUSA, Ph.D
CO – ASESOR
AIDA JULIANA MARTÍNEZ LEÓN, M.Sc
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CIVIL Y AMBIENTAL
TESIS DE PREGRADO EN INGENIERÍA AMBIENTAL
BOGOTÁ D. C.
2019
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Tabla de contenido
1. Introducción ......................................................................................................................... 4
2. Objetivos ............................................................................................................................... 5
2.1. Objetivo general ............................................................................................................. 5
2.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 5
3. Marco teórico ....................................................................................................................... 6
3.1. Normatividad en Colombia ............................................................................................. 6
3.2. Técnicas estandarizadas de concentración y detección de (oo)quistes .............................. 6
3.3. Técnicas alternativas de concentración de (oo)quistes ..................................................... 7
3.4. qPCR como técnica de detección y cuantificación de (oo)quistes .................................... 8
3.5. Comparación de las técnicas de concentración y detección de (oo)quistes ....................... 9
4. Materiales y métodos .......................................................................................................... 11
4.1. Toma de muestras ......................................................................................................... 11
4.2. Proceso de floculación y sedimentación ........................................................................ 14
4.3. Concentración de (oo)quistes ........................................................................................ 15
4.4. Extracción de ADN ...................................................................................................... 17
4.5. Detección y cuantificación de Giardia y Cryptosporidium mediante qPCR .................... 20
5. Resultados........................................................................................................................... 24
5.1. Visualización de quistes de Giardia por microscopía .................................................... 24
5.2. Concentración de material genético obtenido tras extracción de ADN ........................... 27
5.3. Resultados qPCR .......................................................................................................... 28
5.4. Cuantificación de quistes y ooquistes ............................................................................ 31
6. Discusión de resultados ...................................................................................................... 33
6.1. Proceso de concentración de (oo)quistes ....................................................................... 33
6.2. Extracción de ADN ...................................................................................................... 34
6.3. qPCR ............................................................................................................................ 35
7. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................................... 36
8. Referencias bibliográficas .................................................................................................. 37
9. Anexos................................................................................................................................. 40
9.1. Anexo 1: Especificaciones del producto AccuSpike ...................................................... 40
9.2. Anexo 2: Resultados de cada pozo correspondientes la qPCR de Giardia ...................... 41
9.3. Anexo 3: Resultados de cada pozo correspondientes la qPCR de Cryptosporidium ........ 42
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Índice de Tablas
Tabla 1. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 2: muestra del río Teusacá - 7 de Marzo ....... 27
Tabla 2. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 3: muestra del río Teusacá - 21 de Marzo ..... 27
Tabla 3. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 4: control positivo AccuSpike - 28 de Marzo 27
Tabla 4. Concentración de ácidos nucleicos del ensayo 2: muestra del río Teusacá – 10 de Mayo . 28
Índice de Figuras
Figura 1. Diseño del procedimiento experimental ......................................................................... 11
Figura 2. Ubicación geográfica del lugar de muestreo. Imagen tomada de Google Earth ............... 12
Figura 3. Lugar de la toma de muestra. Imagen tomada por Camila Zárate ................................... 12
Figura 4. Perfil de coliformes totales en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018) ................................. 13
Figura 5. Perfil de coliformes fecales en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018) ................................ 13
Figura 6. Perfil de E. Coli en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018) ................................................. 13
Figura 7. Registro fotográfico de la toma de muestra .................................................................... 14
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de floculación y sedimentación....................................... 14
Figura 9. Registro fotográfico del proceso de floculación y sedimentación ................................... 15
Figura 10. Diagrama de flujo del proceso de concentración de (oo)quistes .................................... 16
Figura 11. Registro fotográfico del proceso de concentración de (oo)quistes por centrifugación .... 17
Figura 12. Diagrama de flujo del proceso de extracción de ADN .................................................. 19
Figura 13. Registro fotográfico de los choques térmicos en el proceso de extracción de ADN ....... 20
Figura 14. Diagrama de flujo del proceso de preparación de la solución MasterMix...................... 21
Figura 15. Diagrama de flujo del proceso de construcción de la curva de estandarización ............. 21
Figura 16. Diagrama de flujo para la preparación de los mix de reacción ...................................... 22
Figura 17. Diagrama de flujo del proceso de siembra de pozos ..................................................... 22
Figura 18. Configuración del montaje de la placa ......................................................................... 23
Figura 19. Montaje de la placa en el termociclador ....................................................................... 23
Figura 20. Configuración del perfil térmico .................................................................................. 24
Figura 21. Quiste de Giardia del control positivo AccuSpike ........................................................ 25
Figura 22. Quiste de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá........................................ 25
Figura 23. Dos quistes de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá ................................ 26
Figura 24. Quiste de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá........................................ 26
Figura 25. Quiste de Giardia en la muestra procesada del río Teusacá ........................................... 27
Figura 26. Gráfica de amplificación de Giardia correspondiente al ensayo 4 ................................. 29
Figura 27. Curva estándar de Giardia correspondiente al ensayo 4 ................................................ 30
Figura 28. Gráfica de amplificación de Cryptosporidium correspondiente al ensayo 4 .................. 30
Figura 29. Curva estándar de Cryptosporidium correspondiente al ensayo 4 ................................. 31
Figura 30. Sedimento pegado a las paredes de los tubos de centrifuga .......................................... 33
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1. Introducción
Giardia y Cryptosporidium son parásitos protozoarios que se distribuyen ampliamente alrededor
del mundo. Ambos tienen numerosas especies, algunas de las cuales son infecciosas para los seres
humanos (Ongerth, 2013). Representan un reto en el tratamiento de agua para consumo humano, ya
que sus formas infecciosas como quistes y ooquistes son persistentes en el ambiente aún en
condiciones adversas en donde no tienen alimento disponible, y además son resistentes a
desinfectantes utilizados en el tratamiento de agua convencional tales como el cloro (Sánchez, et al.
2018). Adicionalmente, tienen la capacidad de causar infecciones aun cuando se encuentran en bajas
concentraciones (Sánchez et al. 2018).
Esto parásitos generan enfermedades gastrointestinales como la giardiasis y la cryptosporidiosis,
que pueden causar la muerte a niños de primera infancia cuando no se tratan a tiempo, o a personas
con condiciones de inmunodeficiencia (Certad, Viscogliosi, Chabé y Cacciò, 2017). Se transmiten a
seres humanos después del contacto directo o indirecto con el parásito en sus etapas transmisivas
(como quistes y ooquistes), mediante la ruta fecal-oral, que incluye consumo de agua y alimentos
contaminados (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017a).
A nivel mundial, se han reportado numerosos brotes causados por estos parásitos protozoarios.
Entre los años 2004 y 2010, se reportaron 199 brotes transmitidos por agua, Cryptosporidium fue el
agente infeccioso en 60% de ellos y Giardia en el 35% (Baldursson & Karanis, 2011). Y entre los
años 2011 y 2016 se reportaron 381 brotes, el 63% de ellos fue causado por Cryptosporidium, y el
37% restante fue causado por Giardia (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017b).
En Colombia, diferentes estudios han demostrado la amplia distribución de estos parásitos en el
territorio nacional. El estudio de Sánchez et al. (2018) ha comprobado la presencia de las especies
infecciosas de Giardia y Cryptosporidium en fuentes de agua superficiales y en plantas de tratamiento
de agua para consumo humano, incluso después de la etapa de cloración, en los municipios de Ipiales,
Pasto, Túquerres y Tumaco del departamento de Nariño. Por otro lado, el estudio de Triviño-Valencia,
Lora, Zuluaga y Gomez-Marin (2016) también comprobó la presencia de estos parásitos protozoarios
en el efluente de plantas de tratamiento de agua potable en el departamento de Quindío, especialmente
en zonas rurales. Además, en la cuenca alta del río Bogotá, el estudio de Alarcón, Beltrán, Cárdenas
y Campos (2005) encontró quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium en el agua que sale del
grifo de las casas en zonas rurales del municipio de Villapinzón en el departamento de Cundinamarca,
y en aguas residuales vertidas directamente al río Bogotá.
Debido a las consecuencias que tienen para salud humana y al riesgo que representan para la salud
pública, es importante comprender, medir y controlar la transmisión de estos microorganismos a
través del agua. Para esto, es necesario monitorear su presencia en plantas de tratamiento de agua
potable y en fuentes de agua superficial destinadas a tratamiento para el consumo humano (Ongerth,
2013). Para llevar a cabo ese control, se han desarrollado diferentes técnicas de concentración y
detección de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium.
La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) desarrolló una técnica de
captura e identificación de (oo)quistes por filtración y microscopía de fluorescencia, que ha sido usada
desde el año 1999 y modificada por última vez en el año 2012. Esta técnica ha demostrado tener
eficiencias de recuperación variables entre 21% y 100% (Betancourt & Querales, 2008) y requiere de
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equipos robustos y de alto costo, además de personal altamente capacitado para su desarrollo. Por lo
anterior, a pesar de ser una técnica estandarizada y efectiva, la viabilidad de su aplicación es baja,
especialmente en zonas rurales en donde dos de los principales retos son la falta de recursos
económicos y de personal capacitado.
Además de esta técnica, hay otros métodos para capturar e identificar los quistes de Giardia y los
ooquistes de Cryptosporidium. La metodología propuesta por Versey, Slade, Byrne, Shepherd y
Fricker (1993), que sigue siendo usada en la actualidad, consiste en la concentración de (oo)quistes
por medio de la floculación, sedimentación y centrifugación de la muestra, y tiene una efectividad de
hasta 69%. En cuanto a la detección de (oo)quistes, técnicas de extracción de ADN que utilizan kits
ya existentes, y técnicas de biología molecular como la qPCR han demostrado su efectividad, ya que
son capaces de identificar la cantidad de (oo)quistes que había inicialmente en un volumen de agua,
de manera rápida y costo-efectiva (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017a).
Teniendo en cuenta las limitaciones económicas en las que se encuentran las zonas rurales del
país, la presencia de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium en las fuentes de agua
superficiales y en las plantas de tratamiento de agua potable, y la efectividad de técnicas alternativas
como la de Versey et al. (1993), éste proyecto de investigación tiene como fin aportar al estudio de
las técnicas alternativas, poniéndolas en práctica y evaluando su efectividad, con el propósito de que
en el futuro dichas técnicas puedan ser implementadas, y permitan el control y seguimiento de los
parásitos Giardia y Cryptosporidium en los acueductos de las ciudades, y sobre todo en los
acueductos de las zonas rurales del país.
2. Objetivos
2.1. Objetivo general
- Concentrar los quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium a partir de la floculación,
sedimentación y centrifugación de una muestra de agua por medio de técnicas alternativas
que sean económicamente viables en Colombia.
2.2. Objetivos específicos
- Concentrar los quistes de Giardia y ooquistes Cryptosporidium a partir de la floculación,
sedimentación y centrifugación de una muestra de agua.
- Verificar la presencia de (oo)quistes en la muestra tomada a partir de microscopía.
- Extraer el ADN de los (oo)quistes haciendo uso del kit QIAmp DNA mini kit.
- Utilizar la técnica PCR en tiempo real (qPCR) para cuantificar la cantidad de (oo)quistes de
Giardia y Cryptosporidium presentes en un volumen de agua.
- Identificar las etapas en las que las técnicas alternativas de concentración de (oo)quistes estén
fallando o puedan ser mejoradas.
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3. Marco teórico
3.1. Normatividad en Colombia
En Colombia la resolución 631 de 2015 expedida por el Ministerio de Ambiente y Desarrollo
Sostenible, que regula los valores límites máximos permisibles en los vertimientos puntuales a
cuerpos de aguas superficiales y a los sistemas de alcantarillado público, no establece un valor
aceptable sobre la presencia de los parásitos protozoarios Giardia y Cryptosporidium. Esta resolución
incluye los vertimientos a aguas superficiales hechos por plantas de tratamiento de agua residual.
En cuanto a calidad del agua para riego de cultivos agrícolas, el decreto 1076 de 2015 del sector
Ambiente y Desarrollo Sostenible, establece en el artículo 2.2.3.3.9.5. “Criterios de calidad para uso
agrícola” los valores máximos permisibles para coliformes totales y fecales, pero no hace mención a
los parásitos Giardia ni Cryptosporidium (Departamento Administrativo para la Función Pública,
2018).
Por otro lado, el decreto 2115 de 2007 expedido por el Ministerio de Ambiente y Desarrollo
Sostenible que regula la calidad del agua para consumo humano, establece que el valor aceptable para
parásitos como Giardia es de cero (0) quistes, y para Cryptosporidium es de cero (0) ooquistes por
volumen de agua fijado según la metodología utilizada. En el artículo 22 del mismo decreto, se
establece que las autoridades sanitarias y las empresas prestadoras del servicio deben llevar un
seguimiento y control sobre la presencia de estos parásitos, sólo en regiones en las que los mapas de
riesgo lo indiquen.
Este control debió ser implementado en un plazo máximo de 3 años después de la expedición de
este decreto para poblaciones de 500.000 habitantes en adelante, y en un plazo máximo de 8 años
después de la expedición de este decreto para poblaciones de 10.000 habitantes en adelante. Es decir
que en Colombia a partir del año 2015, todos los acueductos de poblaciones de más de 10.000
habitantes deberían tener procedimientos establecidos para el control de los parásitos Giardia y
Cryptosporidium, siempre y cuando los mapas de riesgo lo determinen necesario.
El seguimiento y control sobre la presencia de Giardia y Cryptosporidium debe estar
documentada en los boletines del Sistema de Información de la Vigilancia de la Calidad del Agua
para Consumo Humano (SIVICAP). Sin embargo, estos boletines no hacen mención a ninguno de
estos parásitos protozoarios, pues se enfocan solamente en el control de coliformes totales y
Escherichia coli, como se muestra en los boletines publicados por el Instituto Nacional de Salud en
los años 2016 a 2018 (Instituto Nacional de Salud, 2018) lo cual refleja un vacío de información
respecto a la exposición de la población a estos parásitos.
3.2. Técnicas estandarizadas de concentración y detección de (oo)quistes
La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA), estandarizó el método 1623.1
de 2012 como método idóneo para detectar la presencia de (oo)quistes de Giardia y Cryptosporidium
en una muestra de agua. Esta técnica se divide en 3 etapas, la filtración, la elución y separación, y
finalmente la enumeración de (oo)quistes.
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Para la etapa de filtración, debe tomarse una muestra de entre 10 y 100 litros de agua y filtrarse
en el menor tiempo posible. Los equipos sugeridos y validados por la EPA son el Filta-Max Foam
Filter o las cápsulas Envirochek HV; en esa etapa también es necesario el uso de los reactivos Tween
20 y PBS a pH 7,4 (USEPA, 2012).
Para la elución, se hace un lavado del filtro con Laureth 12, Tris 1M con pH de 7,4, EDTA 0,5M,
antiespumante y agua deionizada. Posteriormente, el eluente se centrifuga para sedimentar los
(oo)quistes, y se aspira el sobrenadante, de manera que los quistes queden concentrados en el pellet.
Este pellet es sometido a otro proceso en el que los ooquistes y quistes se hacen paramagnéticos
mediante la unión de perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-Cryptosporidium y anti-
Giardia, es decir, los ooquistes y quistes paramagnéticos se separan de los materiales extraños
utilizando un imán, y los materiales extraños se descartan (USEPA, 2012). Esta técnica se demonima
separación inmunomagética (IMS).
Finalmente, para la etapa de enumeración, los quistes y ooquistes se tiñen en un portaobjetos con
anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia y DAPI, un marcador fluorescente que se une
a regiones del ADN enriquecidas con los aminoácidos adenina y timina. La muestra teñida se examina
utilizando microscopía de fluorescencia (FA) y contraste de interferencia diferencial (DIC). Estas
técnicas de microscopía proporcionan un mayor contraste entre el fondo y la muestra, lo que ayuda
significativamente a revelar la morfología interna del parásito y, posteriormente, proporciona una
mejor visualización e identificación en comparación con la microscopía óptica. El análisis cualitativo
se realiza escaneando cada portaobjetos en busca de objetos que cumplan con las características de
tamaño, forma y fluorescencia de los ooquistes de Cryptosporidium o quistes de Giardia, y el análisis
cuantitativo se realiza contando el número total de objetos en la diapositiva que cumplen con los
criterios de FA, DAPI y DIC para quistes y ooquistes (USEPA, 2012).
3.3. Técnicas alternativas de concentración de (oo)quistes
Vesey et al. (1993) propuso una nueva técnica de concentración de ooquistes de Cryptosporidium,
también aplicable a quistes de Giardia, que consiste en la floculación, sedimentación y centrifugación
de una muestra de agua, obteniendo como resultado un pellet en el que se encuentran concentrados
los ooquistes. Esta técnica se basa en la diferencia entre el peso relativo del parásito y el peso relativo
de las impurezas flotantes y las partículas; fue propuesta después de numerosos experimentos en los
que se probó cuáles eran los floculantes óptimos para la sedimentación de los ooquistes, y cuáles eran
los rangos de pH más apropiados para aumentar la efectividad del proceso de floculación y
sedimentación.
La técnica consiste en tres pasos, el primero es la floculación. Se toma una muestra de agua de 10
litros, se agregan 100 mL de cloruro de calcio 1M y 100 mL de bicarbonato de sodio 1M, y se agita
vigorosamente por 15 minutos. Estos fueron escogidos como los floculantes y las cantidades óptimas
después de algunos ensayos. El cloruro de calcio no se perturbaba tan fácilmente durante el proceso
de sedimentación comparado con otros floculantes clásicos como el sulfato de aluminio. Además,
presentaba porcentajes de recuperación de ooquistes del 64%, contrario al sulfato de aluminio que
mostraba porcentajes de recuperación del 59%. Para determinar qué cantidad de floculante debía
adicionarse, Vesey et al (1993) explica que al utilizar menores cantidades de floculante, la
recuperación de ooquistes disminuía, mientras que si se usaban mayores cantidades la recuperación
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de ooquistes permanecía igual, por lo que 100 mL de cada reactivo fue la cantidad óptima para un
volumen de agua de 10 litros (Vesey et al. 1993).
El segundo paso es el proceso de sedimentación. Para empezar este proceso debe agregarse
hidróxido de sodio 2M hasta que el pH de la muestra llegue a 10, y agitar vigorosamente por 15
minutos. Este valor de pH resultó óptimo después de numerosos ensayos en los que menores valores
de pH disminuían el porcentaje de ooquistes recuperados, y mayores valores de pH mantenían igual
los porcentajes de recuperación (Vesey et al. 1993). Una vez la muestra está mezclada de manera
homogénea con los reactivos, el periodo de sedimentación debe ser de 4 horas a temperatura ambiente
de acuerdo a Vesey et al. (1993). Otros autores como Alarcón et al. (2005) sugieren un periodo de
sedimentación de 24 horas a temperatura ambiente, pues demostraron que este es el tiempo óptimo
para la máxima recuperación de (oo)quistes antes de que estos se re-suspendan.
El tercer paso es el proceso de centrifugación. Una vez concurridas las 24 horas del proceso de
sedimentación, se retiran al menos 8 litros de sobrenadante y se vierte lo que resta de la muestra en
varios tubos de centrífuga cónicos o falcon. Se centrifugan a 3.000g por 10 minutos, y se retira el la
mitad del volumen inicial en cada tubo como sobrenadante. Se ajusta el pH a 7,4 con PBS después
de retirar el sobrenadante de cada tubo y se repite el proceso de centrifugación, succión del
sobrenadante y ajuste del pH hasta que el volumen de la muestra total sea de 50 mL.
Debido a que los (oo)quistes pueden pegarse a las paredes del balde en el que se hizo el proceso
de sedimentación, se hace un lavado de los mismos utilizando 200 mL de Tween 80 al 1% y 200 mL
de PBS. Como parte del lavado Vesey et al. (1993) propone agregar 200 mL de ácido sulfámico
directamente a la muestra, este paso es omitido por Alarcón et al. (2005). El producto de este lavado
debe ser sometido al mismo proceso de centrifugación y ajuste de pH previamente descrito.
3.4. qPCR como técnica de detección y cuantificación de (oo)quistes
Para un mejor entendimiento de la técnica qPCR o PCR en tiempo real, es necesario explicar los
fundamentos de la PCR. La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica varias veces una
secuencia específica de ADN utilizando una enzima polimerasa que es capaz de copiar la secuencia
blanco (la muestra) de manera exacta. Así, una serie de amplicones son generados con un
comportamiento teórico aproximado a 2n (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
Los elementos básicos de una PCR son: las cadenas de ADN (muestra) que funcionan como
molde para que la enzima sintetice nuevas cadenas, los primers que son secuencias de
oligonucleótidos que delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y deben ser específicos
para esa secuencia, la enzima Taq polimerasa que construye las nuevas cadenas, y los dNTP’s que
son las bases nitrogenadas sobre las que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN
(Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
La reacción cuenta con tres etapas. En la etapa de desnaturalización las cadenas de ADN se
separan debido a las altas temperaturas; en la etapa de hibridación los primers se unen al extremo 3’
del templado previamente separado, y en la etapa de extensión la enzima Taq polimerasa actúa sobre
el complejo templado-primer y empieza su función catalítica agregando los dNTP’s
complementarios. Finalmente, la detección y la cuantificación de la secuencia amplificada se realizan
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al final de la reacción después del último ciclo de PCR, e involucran procedimientos posteriores como
la electroforesis en gel agarosa y el análisis de imágenes (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
Ahora bien, en la qPCR es posible medir el producto que se va generando en cada ciclo en tiempo
real, en vez de hacerlo al final de toda la reacción. Lo anterior es una modificación a la etapa de
hibridación previamente descrita, en la que ya no sólo se usan los primers específicos para la
secuencia de interés, sino que además se usan marcadores fluorescentes que emiten luz cuando se
incorporan al ADN (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013). De esta manera, por la replicación
de cada molécula de ADN (por cada amplicon), habrá una señal de fluorescencia asociada
aumentando con el número de ciclos.
La utilización de la técnica qPCR para detectar e identificar (oo)quistes de Giardia y
Cryptosporidium cobró importancia debido a que estos parásitos protozoarios pueden encontrarse en
muy bajas concentraciones y aun así ser altamente infecciosos (Sánchez et al. 2018), y la qPCR es un
método sensible que detecta y cuantifica ácidos nucleicos a concentraciones muy bajas, por lo que
tiene aplicaciones importantes en este ámbito. Además, es el método molecular que ha tenido mayor
desarrollo en la detección de microorganismos provenientes de ambientes acuáticos, identificando su
fuente y siendo capaz de cuantificarlos (Aw y Rose, 2012).
La qPCR se ha implementado con primers que corresponden a diferentes genes de los parásitos
protozoarios Giardia y Cryptosporidium teniendo resultados positivos. Algunos ejemplos son el
estudio de Alonso, Amorós y Cuesta (2009) en el que fue usado el gen β-giardin para la detección de
Giardia, el estudio de Sánchez et al. (2018) previamente mencionado en el que los primers eran
específicos para la enzima glutamato deshidrogenasa (gdh) en la detección de Giardia y el gen gp60
para la detección de Cryptosporidium, o el estudio de Guy, Payment, Krull y Horgen (2003) en el que
se usó el gen COWP para la detección de Cryptosporidium, entre otros.
Una de las principales ventajas de la qPCR sobre la PCR, es que al monitorear las reacciones
durante la fase de amplificación exponencial de la reacción, es posible determinar la cantidad inicial
de muestra (Staggs, 2013), lo que en el caso del presente estudio, significa determinar la cantidad de
quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium presentes en un volumen de agua. Además, es una
técnica que requiere menor tiempo de procesamiento en el laboratorio que otras técnicas
estandarizadas, y puede procesar muestras con composiciones fisicoquímicas complejas, incluyendo
aceites, grasas y materia orgánica (Sánchez et al. 2018).
3.5. Comparación de las técnicas de concentración y detección de (oo)quistes
Los métodos de concentración de (oo)quistes han sido evaluados de acuerdo a las eficiencias de
recuperación que presentan, a los costos en los que incurren y a su viabilidad de aplicación. Sobre el
método 1623.1 de la EPA descrito previamente, se han reportado eficiencias de recuperación
variables. De acuerdo a Efstratiou, Ongerth y Karanis (2017a), la eficiencia de recuperación de quistes
de Giardia oscila entre el 40 y 60% y la eficiencia de recuperación de ooquistes de Cryptosporidium
oscila entre el 30 y 50%. Mientras que de acuerdo a Becancourt y Quereles (2008), el método de la
EPA tiene eficiencias que varían entre el 21 y el 100%. Por otro lado, el método propuesto por Vesey
et al. (1993) cuenta con eficiencias de recuperación de ooquistes del 69%.
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La primera etapa de ambos métodos es la concentración de los (oo)quistes. El método 1623.1 de
la EPA logra esta concentración por medio de la filtración de la muestra, y el método de Vesey et al.
(1993) lo hace por medio de la floculación, sedimentación y centrifugación de la muestra. Cuando se
usa el método 1623.1 la capacidad para recuperar los parásitos depende en gran medida de la calidad
del agua analizada. A medida que aumentan la turbidez y las concentraciones de partículas, esta tarea
se vuelve progresivamente desafiante (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017a). Autores como Kim,
Jung, y Lee (2006) han reportado porcentajes de pérdida de ooquistes de hasta el 70%. Por el
contrario, con el método de Vesey et al. (1993), la floculación y sedimentación se desarrollan sin
mayores problemas sin importar la turbiedad de la muestra.
En la segunda etapa, el método 1623.1 cuenta con un paso adicional antes de la identificación de
los (oo)quistes, y es la purificación o limpieza de la muestra concentrada por medio de la técnica IMS
descrita previamente. Este es un paso que no es reemplazado en el método sugerido por Vesey et al.
(1993), en el que después de la centrifugación, la muestra está lista para que los (oo)quistes sean
detectados e identificados. Debido a la falta de purificación de la muestra, la técnica de Vesey et al.
(1993) obliga a que la metodología utilizada para la posterior identificación de (oo)quistes sea de alta
sensibilidad, pues en el proceso de sedimentación (sobre todo en aguas crudas) la cantidad de sólidos
y partículas sedimentadas es considerablemente alta, lo que puede generar interferencias.
En relación con las técnicas utilizadas para detectar e identificar (oo)quistes, la técnica de
microscopía de fluorescencia (FA) adoptada por el método 1623.1 de la EPA, que consiste en contar
el número de (oo)quistes previamente teñidos, tiene como principal problema la incapacidad de
identificar las especies o genotipos de los parásitos aislados, lo cual es pertinente para establecer
riesgos para la salud pública (Rosado-García, Guerrero-Flórez, Karanis, Hinojosa y Karanis, P.,
2017). Por el contrario, las técnicas de biología molecular ofrecen una alternativa metodológica en
el estudio de los parásitos protozoarios porque su sensibilidad y especificidad son mayores que las de
los métodos tradicionales (Sánchez et al. 2018). Una de las grandes ventajas de estas técnicas es que
permiten la discriminación de microorganismos en los niveles de genotipos y especies, información
que puede ser relevante para evaluar las fuentes de infección en humanos y en el estudio de los riesgos
potenciales que generan los parásitos protozoarios (Sánchez et al. 2018).
En cuanto a la viabilidad de los métodos desde el punto de vista económico y de accesibilidad, el
método 1623.1 es conocido por requerir personal de laboratorio altamente capacitado y equipos
robustos y de alto costo que no son fácilmente reemplazados. Lo anterior puede ser la razón por la
cual son pocas las empresas de servicios públicos y entidades de vigilancia que han podido
implementar el método en América Latina (Rosado-García et al. 2017). El gasto total para procesar
una sola muestra de agua oscila entre los $250 y los $400 dólares estadounidenses, y cuando se
incluye el costo de los equipos y el mantenimiento necesario para completar el procedimiento, el
costo aumenta aproximadamente a $75.000 dólares (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017a).
Las consecuencias del alto costo que tiene el método 1623.1 se ven principalmente reflejadas en
la imposibilidad de su implementación, no sólo en América Latina, sino también en Oceanía y África.
Efstratiou, Ongerth y Karanis (2017a) encontraron por medio de su revisión bibliográfica, que el 73%
de las investigaciones sobre técnicas de detección de Giardia y Cryptosporidium que usaron el
método 1623.1 hasta el año 2017, se habían hecho en Norte América o Europa, el 20% en Asia, el
4% en Latinoamérica, el 3% en Oceanía y el 1% en África. De igual manera, Rosado-García et al.
11
(2017) encontró que de 50 estudios sobre métodos de concentración y detección de Giardia y
Cryptosporidium hechos en Latinoamérica hasta el año 2016, 28 utilizaron técnicas de filtración, pero
sólo 3 utilizaron el método 1623.1, empleando las cápsulas Envirochek o el equipo FiltaMax.
En Colombia, el método 1623.1 es empleado por el Instituto Nacional de Salud y por la Empresa
de Acueducto de Bogotá, y no es empleado de manera continua, sino como un control esporádico
sobre la calidad del agua en piscinas o la calidad de los cuerpos de agua que abastecen los sistemas
de tratamiento para consumo humano. No se encontraron reportes sobre la puesta en marcha de este
método en otras ciudades del país, y tampoco en zonas rurales en donde las enfermedades de origen
hídrico continúan siendo un problema común.
Por lo anterior, el estudio y desarrollo de métodos alternativos rentables es crucial para que las
posibilidades de detección de parásitos protozoarios como Giardia y Cryptosporidium sean
alcanzables, y se logre un patrón de investigación equitativamente dividido (Efstratiou, Ongerth y
Karanis, 2017a). De esta manera, métodos de floculación, sedimentación y centrifugación se
presentan como una alternativa eficiente a las técnicas de filtración estandarizadas, debido a su
equipamiento básico y menores costos (Efstratiou, Ongerth y Karanis, 2017a; Vesey et al. 1993).
4. Materiales y métodos
De acuerdo a la revisión bibliográfica realizada y a las ventajas y desventajas que presenta cada
técnica de concentración y detección de (oo)quistes, se diseñó un procedimiento experimental con el
propósito de cumplir con los objetivos planteados inicialmente. Este procedimiento se muestra en la
Figura 1, y se describe de manera detallada en los siguientes incisos.
Figura 1. Diseño del procedimiento experimental
4.1. Toma de muestras
La toma de muestras se hizo sobre el río Teusacá en el municipio de La Calera, a la altura del
kilómetro 2 de la vía La Calera - Sopó durante los meses de marzo y abril del 2019 (ver Figuras 2 y
3). Allí se encuentra ubicada la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR) del municipio de
La Calera.
12
Figura 2. Ubicación geográfica del lugar de muestreo. Imagen tomada de Google Earth
Figura 3. Lugar de la toma de muestra. Imagen tomada por Camila Zárate
Se escogió este lugar como lugar óptimo para la toma de muestras, debido a que en estudios
previos sobre la calidad del agua del río Teusacá se encontró que había un pico en la concentración
de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli inmediatamente después de la descarga de la PTAR
(Zárate, Cabanzo, Becerra y Barragán, 2018) como se observa en las Figuras 4, 5 y 6. Por lo anterior,
se supuso que sería más probable encontrar los parásitos Giardia y Cryptosporidium en ese punto.
Además, se tuvo en cuenta la hora a la que la PTAR hace la descarga de agua al río, con el fin tomar
la muestra justo en ese momento y asegurar la captura de mayor cantidad de microorganismos.
13
Figura 4. Perfil de coliformes totales en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018)
Figura 5. Perfil de coliformes fecales en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018)
Figura 6. Perfil de E. Coli en el río Teusacá, (Zárate et al., 2018)
La preparación de los materiales se hizo el mismo día de la toma de muestras para cada ensayo,
y consistió en la esterilización con radiación UV de dos baldes de 10 litros. Estos fueron sumergidos
alrededor de 10 cm a contracorriente aproximadamente en la mitad del cauce, de acuerdo a las
recomendaciones de American Public Health Association (1998). Posteriormente fueron
14
transportados manteniendo su temperatura alrededor de los 8°C, y finalmente fueron refrigerados a
4°C por un periodo de aproximadamente 15 horas. En la Figura 7 se observa este procedimiento.
1. Esterilización con radiación UV.
2. Toma de muestra.
3. Transporte de la muestra. Figura 7. Registro fotográfico de la toma de muestra
4.2. Proceso de floculación y sedimentación
De acuerdo con lo recomendado por Alarcón et al. (2005) y Vesey et al. (1993), para la etapa de
floculación se agregaron a la muestra 100 mL de carbonato de calcio 1M, 100 mL de bicarbonato de
sodio 1M, y se agregó hidróxido de sodio 2M hasta que se ajustara el pH de la muestra a 10, de
manera que el proceso de floculación y sedimentación fuese más efectivo. Posteriormente se mezcló
vigorosamente por 15 minutos, y se dejó sedimentar por 24 horas a temperatura ambiente. El objetivo
de esta etapa fue sedimentar los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium presentes en
la muestra, de manera que se redujera el volumen de agua a procesar en la posterior etapa de
centrifugación. En la Figura 8 se observa un diagrama de flujo que resume esta etapa del proceso, y
en la Figura 9 se observa la formación de flocs al instante en el que se agregan los reactivos de
floculación y la muestra después de 24 horas del inicio del proceso de sedimentación.
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de floculación y sedimentación
15
1. Formación de flocs en el proceso de
floculación.
2. Muestra sedimentada después de 24 horas.
Figura 9. Registro fotográfico del proceso de floculación y sedimentación
4.3. Concentración de (oo)quistes
Se usó una bomba peristáltica para retirar 9 litros de sobrenadante que fueron desechados, y se
recuperó 1 litro de agua con sedimentos en tubos de centrífuga de 250 mL que tienen fondo semi-
redondo. Algunos residuos del proceso de sedimentación quedaron adheridos a las paredes de los
baldes, por lo que se hizo un lavado utilizando 50 mL de PBS con pH de 7,4 y 50 mL de Tween 80;
el producto de este lavado también se dispuso en tubos de centrífuga de acuerdo a las
recomendaciones de Alarcón et al. (2005). De esta manera, se tenían cuatro tubos con muestra y un
tubo con lavado.
El propósito del proceso de centrifugación fue concentrar los (oo)quistes en el fondo de los tubos
y retirar el sobrenadante, de manera que se redujera aún más el volumen de la muestra que sería
posteriormente sometida al proceso de extracción de ADN. Entonces, de acuerdo al procedimiento
sugerido por Alarcón et al. (2005), se hicieron al menos tres ciclos de centrifugación a 3000g por 10
minutos, asegurando que el frenado de la ultracentrífuga se hiciera en al menos 7 tiempos con el fin
de evitar la re-suspensión de (oo)quistes.
Después de la finalización de cada ciclo, se retiraba el sobrenadante de cada tubo en el menor
tiempo posible, se medía el pH, se ajustaba con PBS a 7,4, y se continuaba con el siguiente ciclo de
centrifugación. El número de ciclos dependía de la facilidad con la que ajustara el pH en cada ensayo.
Generalmente, se partía de un volumen de 250 mL de muestra en cada tubo, se retiraba el
sobrenadante hasta obtener la mitad del volumen inicial, se ajustaba el pH y se continuaba con el
siguiente ciclo, posteriormente se retiraba el sobrenadante y se repetía el proceso hasta obtener un
volumen de aproximadamente 30 mL en cada tubo. Al finalizar se almacenaron las muestras a una
temperatura de 4°C. En la Figura 10 se observa el diagrama de flujo de este proceso, y en la Figura
11 se observa el registro fotográfico.
16
Figura 10. Diagrama de flujo del proceso de concentración de (oo)quistes
1. Uso de bomba peristáltica para retirar
sobrenadante.
2. Partículas adheridas a la pared del balde.
17
3. Repartición de 1 litro de muestra y sedimento
en tubos de centrífuga de 250 mL.
4. Lavado del balde con PBS y Tween 80.
5. Sedimento y muestra después del primer ciclo
de centrífuga.
6. Sedimento y muestra después del último
ciclo de centrífuga. Figura 11. Registro fotográfico del proceso de concentración de (oo)quistes por centrifugación
4.4. Extracción de ADN
Para llevar a cabo la extracción de ADN se utilizó el kit QIAmp DNA mini kit y se siguieron las
instrucciones del fabricante, haciendo algunas modificaciones de acuerdo a los resultados obtenidos
en cada ensayo, y a lo recomendado por Plutzer, Torokne y Karanis (2010). Este procedimiento se
hizo con la muestra de agua del río Teusacá previamente procesada, y con el control positivo
AccuSpike™, donado a este proyecto por el Instituto Nacional de Salud.
Primero, se agregaron 20 µL de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, luego se
agregaron 200 µL de muestra en el mismo tubo, y haciendo una modificación a lo indicado por el
manual, se agregaron 180 µL de buffer ATL. Para mezclar la solución se hizo vortex por 15 segundos.
El propósito de estos reactivos es asegurar que la lisis de los (oo)quistes sea eficiente.
Después, el manual del fabricante recomienda incubar la muestra por 10 minutos a 56°C, sin
embargo, diferentes autores han recomendado someter la muestra a choques térmicos con nitrógeno
líquido, con el fin de romper las paredes de los (oo)quistes. Plutzer, Torokne y Karanis (2010)
18
proponen someter la muestra a baños de agua a 90°C por 2 minutos, seguidos de enfriamiento con
nitrógeno líquido hasta que la muestra se congele, y repetir este procedimiento 10 veces. En los
primeros ensayos de extracción de ADN siguiendo esta recomendación, no se obtuvo suficiente
cantidad de material genético en la muestra final, por lo que se decidió a 5 el número de choques
térmicos, ya que era posible que estuvieramos destruyendo las paredes de los (oo)quistes en los
primeros ciclos y perdiendo el ADN.
Continuando con las instrucciones del fabricante, se centrifugó el tubo de 1,5 mL por 1 minuto a
8.000g, se agregaron 200 µL de etanol puro, y se hizo vortex por 15 segundos para remover las gotas
al interior de la tapa. Después, se agregó esta mezcla en una columna de centrifugado (spin column)
dada por el fabricante, se puso el spin column en un tubo de recolección de 2 mL y se centrifugó a
6.000g por 1 minuto. Este fue el primer “lavado” o purificación de la muestra, en donde se descarta
el residuo que queda en el tubo de recolección y se conserva el spin column/filtro en donde está el
ADN.
Después, se agregaron 500 µL de buffer AW1 al spin column y esta se puso en un nuevo tubo de
recolección de 2 mL, se centrifugó a 6.000g por 1 minuto y nuevamente se descartó el residuo que
quedó en el tubo de recolección. Este procedimiento se repitió agregando 500 µL de buffer AW2 y
centrifugando a 20.000g por 3 minutos. Para eliminar cualquier posible residuo del buffer AW2, el
spin column se puso en un tubo eppendorf de 2 mL y se centrifugó a 20.000g por 1 minuto,
descartando el residuo.
Finalmente, el spin column se colocó en un nuevo tubo eppendorf de 1,5 mL, se agregaron 50 µL
de buffer AE y se incubó la muestra a temperatura ambiente por 1 minuto. Se centrifugó a 6.000g por
1 minuto, y esta vez se descartó el spin column, pues este último paso fue la elución del filtro en el
que estaba el ADN, obteniendo la muestra final en el tubo eppendorf.
La concentración de ácidos nucleicos contenida en la muestra final se cuantificó usando el
espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop 2000, y una vez concluido este proceso la muestra
fue almacenada a -20°C. En la Figura 12 se muestra el diagrama de flujo de este proceso, y en la
Figura 13 se muestra el registro fotográfico de los choques térmicos.
19
Figura 12. Diagrama de flujo del proceso de extracción de ADN
1. Choque térmico frío con nitrógeno líquido.
2. Muestra congelada después del choque
térmico.
20
3. Choque térmico caliente con baño maría a
aproximadamente 90°C.
4. Resultado del choque térmico con calor.
Figura 13. Registro fotográfico de los choques térmicos en el proceso de extracción de ADN
4.5. Detección y cuantificación de Giardia y Cryptosporidium mediante qPCR
Para identificar si el ADN extraído de la muestra efectivamente correspondía a (oo)quistes de
Giardia y Cryptosporidium, se utilizó el kit Giardia intestinalis A-F Glutamate Dehydrogenase (gdh)
gene genesig Advanced para la detección de Giardia y el kit Cryptosporidium Oocyst wall protein
(COWP) gene genesig Advanced para la detección de Cryptosporidium. Estos kits están diseñados
para la cuantificación in vitro de genomas para cada parásito. Para el caso de Giardia, la enzima gdh
desempeña un papel importante en el metabolismo de los carbohidratos, la asimilación del amoniaco,
la síntesis de aminoácidos y el catabolismo (Yee y Dennis, 1992). Y para el caso de Cryptosporidium
el gen COWP codifica una proteína fundamental para mantener la integridad de las paredes de los
ooquistes, permitiendo que el parásito resista a condiciones ambientales adversas (Guy et al. 2003).
Los kits fueron utilizados en ensayos separados para Giardia y para Cryptosporidium
respectivamente.
Este proceso se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante y se dividió en cinco grandes
etapas: la preparación de la solución MasterMix, la preparación de la curva de estandarización, la
preparación de los mix de reacción en el protocolo de detección, la siembra de los pozos y la
configuración del montaje de la placa para el uso del termociclador Agilent Technologies modelo
Mx3005P, en el que se llevaron a cabo las reacciones.
La solución MasterMix es donde se encuentra la enzima Taq Polimerasa encargada de llevar a
cabo la replicación, ésta se encuentra liofilizada para asegurar su conservación, así que el primer paso
fue agregar 525 µL de buffer de re-suspensión. Ya que el termociclador utiliza la molécula
fluorescente ROX, también es necesario agregar 200 µL de ROX a la MasterMix. Este proceso de
muestra en la Figura 14.
21
Figura 14. Diagrama de flujo del proceso de preparación de la solución MasterMix
La segunda etapa del proceso fue la construcción de la curva de estandarización. En esta etapa se
tuvieron en cuenta recomendaciones realizadas por los proveedores, en los que se modificaron las
instrucciones del fabricante. Se agregaron 18 µL de buffer en 6 tubos marcados del 2 al 7. El
fabricante recomienda agregar 90 µL en tubos marcados del 2 al 6, es decir, hacer una dilución menos.
Esta decisión se tomó por dos razones; la primera es que en ensayos previos en los que se utilizó el
mismo kit, ya se había hecho una dilución más de la recomendada por el fabricante y esta había
amplificado bien en la qPCR, y la segunda, es que una dilución más permite identificar
concentraciones de copias/µL más bajas, lo que nos permitía ampliar el rango de detección de Giardia
y Cryptosporidium en caso de que las concentraciones de material genético obtenidas tras la
extracción de ADN fueran bajas.
De esta manera, se agregaron 2 µL del control positivo de cada parásito (en los respectivos
ensayos) al tubo 2, el fabricante recomienda agregar 10 µL. Se hizo vortex por 15 segundos, se
tomaron 2 µL del tubo 2 y se agregaron al tubo 3, se hizo vortex por 15 segundos y se repitió el
proceso continuando con la dilución hasta el tubo 7. De esta manera, se tenían 6 tubos con
concentraciones de 2x104 copias por microlitro, hasta 0,2 copias por microlitro. Este proceso se
resume en la Figura 15 presentada a continuación.
Figura 15. Diagrama de flujo del proceso de construcción de la curva de estandarización
22
La tercera etapa fue el protocolo de detección. En este protocolo deben prepararse dos mix de
reacción, uno que se agrega a los pozos en los que se construye la curva de estandarización (mix de
reacción 1), y otro que se agrega a los pozos que contengan la muestra (mix de reacción 2), en este
caso el pozo que contenga el control positivo AccuSpike o el agua del río Teusacá. El mix de reacción
1 contiene 10 µL de MasterMix, 1 µL de primer específico de cada parásito y 4 µL agua libre de
ADN. El mix de reacción 2 contiene 10 µL de MasterMix, 1 µL de primer específico para cada
parásito, 1 µL de control de extracción interno y 3 µL de agua libre de ADN. Se recomienda que
siguiendo estas proporciones, se preparé mayor cantidad de mix de reacción de acuerdo al montaje
del ensayo, ya que estas proporciones son lo que debe contener 1 pozo. En este caso, se tenían 18
pozos para la construcción de la curva y 1 pozo con muestra, por lo que las cantidades del mix de
reacción 1 se multiplicaron por 18, y las cantidades del mix de reacción 2 permanecieron iguales. Los
diagramas de flujo de estos procesos paralelos se presentan en la Figura 16.
Figura 16. Diagrama de flujo para la preparación de los mix de reacción
La cuarta etapa fue la siembra de los pozos. Se agregaron 15 µL del mix de reacción 1 a cada
pozo de la curva de estandarización, y se agregaron 5 µL de las diluciones realizadas de acuerdo al
montaje establecido, de esta manera, cada pozo tenía 20 µL en total. Después, se agregaron 15 µL del
mix de reacción 2 a los pozos que iban a contener la muestra, y se agregaron 5 µL de la muestra a los
respectivos pozos. De esta manera, había 18 pozos para hacer la curva de estandarización, un pozo
con la muestra y un pozo como control negativo en el que sólo había 20 µL agua libre de ADN. Este
proceso de resume en la Figura 17 y el montaje de la placa final se puede observar en las Figuras 18
y 19.
Figura 17. Diagrama de flujo del proceso de siembra de pozos
23
Figura 18. Configuración del montaje de la placa
Figura 19. Montaje de la placa en el termociclador
La quinta y última etapa fue la configuración del protocolo de amplificación y el uso del
termociclador. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se programaron 2 minutos a 95°C para la
activación enzimática y 50 ciclos que consistían en 10 segundos a 95°C para la desnaturalización y 1
minuto a 60°C para el anillamiento. Esta configuración se observa en la Figura 20.
24
Figura 20. Configuración del perfil térmico
5. Resultados
5.1. Visualización de quistes de Giardia por microscopía
Se montaron placas con lugol parasitológico para visualizar los quistes de Giardia en diferentes
momentos del proceso; esto se hizo con dos propósitos. El primero fue identificar si efectivamente
había quistes en el lugar en el que se hacía el muestreo, y el segundo fue identificar en qué parte del
experimento se perdían los quistes en caso de que los resultados de la extracción de ADN no fueran
positivos después de los procesos de floculación, sedimentación y centrifugación. Todas las imágenes
que se muestran en esta sección fueron tomadas con un objetivo de 40X. No se montaron placas para
visualizar los ooquistes de Cryptosporidium debido a que estos requieren de una tinción ácido alcohol
resistente o tinción de Ziehl-Neelsen y no se contaba con este reactivo.
Primero, se montaron placas tomando como muestra el sistema de control positivo AccuSpike,
en el que según las especificaciones del producto había aproximadamente 100 quistes de Giardia y
100 ooquistes de Cryptosporidium contenidas en cada vial (ver Anexo 1). Se observó un objeto que
parecía tener la forma de un quiste de Giardia, pero no tenía la coloración esperada, como se observa
en la Figura 21 a continuación.
25
Figura 21. Quiste de Giardia del control positivo AccuSpike
Segundo, se montaron placas tomando como muestra el agua del río Teusacá sin procesar, es
decir, antes de los procesos de floculación, sedimentación y centrifugación. En el montaje de la
primera placa se observó lo que parecían ser 4 quistes de Giardia que tomaron la coloración esperada.
Este resultado confirma la presencia de quistes en el lugar de toma de muestra, y además confirma
que tras el tratamiento primario y segundario de agua residual en la PTAR del municipio de La Calera,
estos parásitos protozoarios no son removidos. Los quistes pueden observarse en las Figuras 22, 23 y
24.
Figura 22. Quiste de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá
26
Figura 23. Dos quistes de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá
Figura 24. Quiste de Giardia en la muestra sin procesar del río Teusacá
Tercero, se montaron placas con el sobrenadante retirado de la muestra después de los procesos
de floculación y sedimentación, con el fin de determinar si en este se estaban removiendo quistes, lo
cual significaba un error en el experimento. En estas placas no se observó ningún quiste, por lo que
se asumió que todos se habían sedimentado como era esperado.
Finalmente, se montaron placas con el sobrenadante de dos de los tubos con muestra después de
haberlos sometido al primer ciclo del proceso de centrifugación. Se observó sólo un quiste de Giardia
en el montaje de 2 placas, como se muestra en la Figura 25. Esto quiere decir que una de las posibles
fuentes de pérdida de quistes es el momento en el que se retira el sobrenadante para disminuir el
volumen de muestra de 1 litro a 50 mililitros. Lo anterior, es considerado un error en el montaje
experimental.
27
Figura 25. Quiste de Giardia en la muestra procesada del río Teusacá
5.2. Concentración de material genético obtenido tras extracción de ADN
La concentración de ácidos nucleicos en la muestra final obtenida tras el proceso de extracción
de ADN debía ser de al menos 60 ng/µL para facilitar el posterior desarrollo de la qPCR. Sin embargo,
en los ensayos 2 y 3 en donde se extrajo ADN a partir de la muestra del río Teusacá, esta concentración
no superó los 18,4 ng/µL, como se muestra en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 2: muestra del río Teusacá - 7 de Marzo
Tabla 2. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 3: muestra del río Teusacá - 21 de Marzo
Por lo anterior, tomamos la decisión de hacer el proceso de extracción de ADN al control positivo
AccuSpike con el propósito de verificar que en este paso del experimento no se estuvieran perdiendo
(oo)quistes. El resultado se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Concentración de ácidos nucleicos, ensayo 4: control positivo AccuSpike - 28 de Marzo
# Sample ID User name Date and Time Nucleic Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type Factor
1 Admin 3/7/2019 10:52:31 AM 0,3 ng/µl 0,006 -0,006 -1,03 0,06 DNA 50
2 Admin 3/7/2019 10:59:58 AM -0,3 ng/µl -0,005 -0,004 1,34 -0,36 DNA 50
3 5 Admin 3/7/2019 11:00:56 AM 5 ng/µl 0,099 0,055 1,82 0,15 DNA 50
4 1 Admin 3/7/2019 11:02:16 AM 18,4 ng/µl 0,368 0,194 1,9 0,4 DNA 50
5 5,2 Admin 3/7/2019 11:10:14 AM 2,2 ng/µl 0,045 0,013 3,35 0,1 DNA 50
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# Sample ID User name Date and Time Nucleic Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type Factor
1 Admin 3/21/2019 12:15:34 PM 0,9 ng/µl 0,018 0,01 1,79 0,27 DNA 50
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# Sample ID User name Date and Time Nucleic Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type Factor
1 Admin 28/03/2019 14:23 -0,5 ng/µl -0,009 -0,024 0,38 0,27 DNA 50
2 m1 Admin 28/03/2019 15:33 20,2 ng/µl 0,404 0,253 1,6 0,89 DNA 50
28
La diferencia entre la concentración de ácidos nucleicos del ensayo 2 (Tabla 1) y la del ensayo 4
(Tabla 3) no fue significativa, y ya que la extracción de ADN del ensayo 4 se hizo a partir del control
positivo AccuSpike, se decidió continuar con la qPCR y comprobar que la extracción había sido
exitosa. Así mismo, decidimos llevar a cabo el proceso de qPCR con la muestra del río Teusacá que
había presentado una concentración de ácidos nucleicos de 18,4 ng/µL. De esta manera, se hizo una
nueva medición de la concentración de ácidos nucleicos de esta muestra, obteniendo como resultado
que la concentración actual (10 de mayo) era de 15,8 ng/µL, como se observa en la Tabla 4.
Tabla 4. Concentración de ácidos nucleicos del ensayo 2: muestra del río Teusacá – 10 de Mayo
5.3. Resultados qPCR
Se hicieron tres ensayos, dos con la muestra final obtenida de la extracción de ADN del control
positivo AccuSpike, y uno con la muestra final obtenida de la extracción de ADN del agua del río
Teusacá que tenía una concentración de ácidos nucleicos de 15,8 ng/µL. Para el ensayo en el que se
usó agua del río Teusacá los resultados no fueron positivos y la muestra no amplificó para ninguna
de las concentraciones de la curva de estandarización, teniendo un Ct de cero. Lo anterior significa
que el material genético contenido en la muestra no correspondía a los parásitos Giardia ni
Cryptosporidium. Los resultados de los ensayos en los que se usó el control positivo AccuSpike se
describen a continuación.
El primer ensayo se hizo con los primers y las curvas de calibración de Giardia, y el segundo se
hizo con los primers y las curvas de calibración de Crypstosporidium. En ambos ensayos se incluyó
una muestra con agua libre de ADN como blanco, y esta muestra no amplificó para ninguno de los
dos casos. Además, para ambos casos se construyó una curva de estandarización como se describió
previamente, haciendo una serie de diluciones por triplicado para determinar más fácilmente la
cantidad inicial de copias de los respectivos genes que contenía la muestra.
Para el caso de Giardia las curvas de amplificación obtenidas dieron buenos resultados y se
observa un aumento de fluorescencia a mayor número de ciclos. La curva de amplificación que más
se asemejó a la curva que corresponde a la muestra fue la de menor dilución, es decir 0,2 copias por
µL. Lo anterior tiene sentido, ya que la concentración de ácidos nucleicos leída en el Nanodrop fue
baja (20,02 ng/ µL) a pesar de ser el control positivo. Este resultado se observa en la Figura 26.
De igual manera, la curva de calibración obtenida también fue un resultado positivo, con una
eficiencia del 97,2% y una pendiente de la curva de -3,391. De acuerdo al manual correspondiente al
equipo (Life Technologies, s. f.), las eficiencias deben estar entre el 90 y el 110%, lo que corresponde
a una pendiente entre -3,58 y -3,1. Este resultado se observa en la Figura 27 y los resultados
individuales para cada pozo en el montaje de la placa se observan en el Anexo 2.
El Ct es el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia supera el límite de detección. En
la Figura 27 se observa el número inicial de copias en el eje X y el Ct en el eje Y, y se puede ver que
el número de copias correspondientes a la muestra es de aproximadamente 0,3 copias para un Ct de
# Sample ID User name Date and Time Nucleic Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type Factor
1 bl Admin 5/10/2019 11:17:02 AM -10,6 ng/µl -0,213 -0,182 1,17 0,32 DNA 50
2 bl Admin 5/10/2019 11:26:40 AM 8,5 ng/µl 0,171 0,107 1,6 0,41 DNA 50
3 bl Admin 5/10/2019 11:37:23 AM 0,3 ng/µl 0,007 0,013 0,55 0,29 DNA 50
4 ensayo 2 Admin 5/10/2019 11:50:53 AM 15,8 ng/µl 0,317 0,154 2,06 0,63 DNA 50
29
42. A mayor concentración de material genético en la muestra habrá mayor fluorescencia, y por lo
tanto el Ct requerido será menor, por lo que es importante recalcar que la cantidad de material genético
contenida en el control AccuSpike es considerablemente baja, pues fue necesario que transcurrieran
más de la mitad de los ciclos para que esta se manifestara.
En cuanto a Cryptosporidium, las curvas de amplificación también dieron buenos resultados, y al
igual que con Giardia, la curva que más se asemeja a la muestra es la de menor concentración. Sin
embargo, la dilución correspondiente a la muestra no se encuentra entre las curvas estandarizadas de
acuerdo a la gráfica, por lo que se sabe que su concentración es menor que 0,2 copias, pero no se sabe
qué tan alejada de este valor se encuentra al no tener otra frontera de comparación. Así, en la curva
de estandarización se observa una eficiencia de 123,3% y una pendiente de -2,866. De acuerdo al
manual del equipo, eficiencias mayores al 100% pueden darse cuando hay presencia de inhibidores
en algunos de los reactivos utilizados o en la muestra. Este resultado se observa en las Figuras 28 y
29 y los resultados individuales para cada pozo se observan en el Anexo 3.
Este resultado confirma que el proceso de extracción de ADN llevado a cabo fue satisfactorio,
valida las recomendaciones realizadas por autores como Plutzer, Torokne y Karanis (2010) y la
reducción en el número de choques térmicos de 10 a 5. Además, confirma que efectivamente se puede
extraer el ADN de los quistes que lleguen a esta etapa del proceso, después de pasar por las etapas de
floculación, sedimentación y centrifugación. Adicionalmente, comprueba que la detección de los
parásitos protozoarios Giardia y Cryptosporidium es posible aun cuando están presenten en muy
bajas concentraciones. Sin embargo es necesario hacer dos aclaraciones, la primera es que ya que
para el caso Cryptosporidium las diluciones con las que se construyeron las curvas de estandarización
no fueron suficientes, es necesario explorar la posibilidad de hacer mayor número de diluciones, para
obtener un resultado más fácilmente cuantificable cuando las concentraciones de material genético
sean muy pequeñas. Y la segunda es que este ensayo debe repetirse numerosas veces desde el proceso
de extracción de ADN, con el fin de tener mayor concentración de ácidos nucleicos en el producto
final de la extracción, y así lograr que el desarrollo de la qPCR sea más efectivo.
Figura 26. Gráfica de amplificación de Giardia correspondiente al ensayo 4
30
Figura 27. Curva estándar de Giardia correspondiente al ensayo 4
Figura 28. Gráfica de amplificación de Cryptosporidium correspondiente al ensayo 4
31
Figura 29. Curva estándar de Cryptosporidium correspondiente al ensayo 4
5.4. Cuantificación de quistes y ooquistes
Los kits utilizados para la detección de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium están
diseñados para la cuantificación de los genomas de cada parásito, y los resultados que arrojan son el
número de copias de un gen específico que se encontraron en una muestra, por lo que es necesario
hacer una transformación de número de copias a número de (oo)quistes. Por consiguiente, se llevó a
cabo una revisión bibliográfica con el fin de identificar cómo hacer esta transformación teniendo en
cuenta las características biológicas de cada parásito, es decir, la cantidad de copias de los genes de
interés (gdh y COWP) que hay en cada (oo)quiste.
Giardia es un parásito protozoario que se encuentra en dos formas, como quiste cuando está bajo
condiciones ambientales no favorables y como trofozoíto (su forma flagelada) cuando las condiciones
ambientales le favorecen. Su ciclo de vida empieza cuando los hospederos (humanos o animales)
ingieren el quiste por medio de agua o alimentos contaminados. Después de esta etapa, el quiste llega
al intestino delgado en donde se da un proceso de exquistación en el que cada quiste es capaz de
liberar dos trofozoítos, que a su vez son capaces de volver a su forma enquistada una vez son
expulsados por el hospedero. Cada quiste cuenta con 4 núcleos, y cada trofozoíto cuenta con 2 núcleos
(CDC, 2017). Por otro lado, Cryptosporidium es un parásito protozoario que también se encuentra en
dos formas, una es como ooquiste (su forma resistente a condiciones adversas) y otra es como
esporozoíto. Cada ooquiste es capaz de liberar 4 esporozoítos cuando se da el proceso de exquistación
(CDC, 2015).
Estudios como el de Guy et al. (2003) y Yang et al. (2014) usaron esta información de los parásitos
para hacer la transformación de número de copias de un gen a número de (oo)quistes. El estudio de
Guy et al. (2003) indica que el gen COWP presente en Cryptosporidium es un gen de única copia, por
lo que solo se encuentra una vez en cada núcleo, y ya que cada ooquiste de Cryptosporidium contiene
4 núcleos (1 núcleo por cada esporozoíto), 4 copias del gen COWP corresponden a un ooquiste de
32
Cryptosporidium. Por otro lado, el estudio de Yang et al. (2014) indica que el gen gdh presente en
Giardia también es un gen de única copia, y ya que cada quiste contiene 4 núcleos haploides, 4 copias
de este gen corresponden a un quiste de Giardia.
Los datos asociados a las curvas de estandarización obtenidas de la qPCR que se muestran en las
Figuras 27 y 29 indican el número de copias de los genes gdh y COWP que había inicialmente en
cada muestra, y desde el cual empezó la replicación. Para el caso de Giardia, la cantidad inicial del
gen gdh fue de 0,2755 copias (ver Anexo 2), y para el caso de Cryptosporidium la cantidad inicial del
gen COWP fue de 0,01163 copias (ver Anexo 3). De acuerdo a los estudios de Guy et al. (2003) y
Yang et al. (2014), el número de (oo)quistes presentes en la muestra se calcula como sigue:
0,2755 copias del gen gdh
4= 0,0688 quistes de 𝐺𝑖𝑎𝑟𝑑𝑖𝑎
0,01163 copias del gen COWP
4= 0,0029 ooquistes de 𝐶𝑟𝑦𝑝𝑡𝑜𝑠𝑝𝑜𝑟𝑖𝑑𝑖𝑢𝑚
Estos resultados indican que el material genético extraído usando el kit QiAmp mini kit
corresponde a los parásitos Giardia y Cryptosporidium, y que efectivamente era necesario hacer una
dilución más de la recomendada por el fabricante para poder detectar la baja concentración de copias
que había en la muestra. Sin embargo, debido a que son números muy pequeños no corresponden
efectivamente a un número real de (oo)quistes presentes en una muestra de agua, por lo que es
necesario repetir el proceso de extracción de ADN con el fin de obtener una mayor concentración de
ácidos nucleicos en la muestra final, de manera que la cuantificación de (oo)quistes a partir de esta
información sea más acertada.
Otro método de cuantificación se fundamenta en la construcción de una curva estándar que
permita asociar el Ct obtenido tras el desarrollo de la qPCR con un número inicial de (oo)quistes.
Este proceso consiste en hacer el conteo de (oo)quistes previo al desarrollo de la qPCR. Para llevar
esto a cabo, el proceso de concentración de los (oo)quistes debe estar estandarizado, y se debe tener
la capacidad de purificar la muestra obtenida después del proceso de floculación y centrifugación con
el fin de facilitar la visualización de los (oo)quistes.
Para hacer el conteo previo se recomienda hacer uso de las cámaras de Neubauer, que son un
portaobjetos con rejillas generalmente utilizados para contar microorganismos que no se pueden
cultivar, como es el caso de Giardia y Cryptosporidium (Nolan et al. 2013). El proceso consiste en
tomar una alícuota de 1 mL de la muestra y hacer el conteo de microorganismos que hay en ella, para
posteriormente llevar a cabo el proceso de qPCR. El resultado de la qPCR será un Ct que corresponde
al número de (oo)quistes contados inicialmente. Para la construcción de la curva, hay que repetir este
procedimiento con un número conocido de (oo)quistes, es decir, desarrollar la qPCR con 1, 5, 10, 20,
hasta 100 (oo)quistes por microlitro, y repetir al menos tres veces el procedimiento para cada
concentración, de tal manera que la desviación de los Ct obtenidos sea menor a ±0,2. Así, en futuros
experimentos será posible asociar el Ct obtenido con un número inicial de (oo)quistes.
33
6. Discusión de resultados
6.1. Proceso de concentración de (oo)quistes
El proceso de concentración de (oo)quistes fue la etapa del experimento que presentó mayores
complicaciones y que depende de mayor número de variables. La primera variable es la presencia o
ausencia de (oo)quistes en el lugar de la toma de muestra. Esta variable trató de disminuirse al hacer
la visualización de (oo)quistes en el microscopio sobre el agua sin procesar. De acuerdo a dicha
visualización, sí hay (oo)quistes en la muestra. La segunda variable es la presencia o ausencia de
(oo)quistes en las diferentes etapas del proceso de concentración. Esta variable también trató de
disminuirse por medio de la visualización de los (oo)quistes. En esta se encontró que algunos
(oo)quistes se perdían al retirar el sobrenadante de los tubos después de cada ciclo de centrifugación.
Esto puede deberse a que el sobrenadante no se retira de los tubos lo suficientemente rápido como
para evitar la re-suspensión de los (oo)quistes, por lo que sería necesario el uso de más de una bomba
peristáltica para agilizar este proceso.
Además, es importante recalcar que los tubos de centrifuga utilizados en el proceso de
concentración no eran tubos cónicos como lo recomiendan los estudios de Vesey et al. (1993) y
Alarcón et al. (2005), sino que eran tubos de fondo semi-redondo. Debido a esto, el sedimento en el
que se espera que se encuentren lo (oo)quistes no quedaba en el fondo de los tubos sino sobre las
paredes de los mismos, lo que facilita la re-suspensión de los parásitos. Esto se puede observar en la
Figura 30.
Figura 30. Sedimento pegado a las paredes de los tubos de centrifuga
Debido a que la concentración inicial de (oo)quistes en la muestra es desconocida, no es posible
saber si en esta etapa del proceso se están perdiendo todos los (oo)quistes que contenía la muestra, o
si la concentración de (oo)quistes que queda es insuficiente para llevar a cabo los procesos de
extracción de ADN y de qPCR, aunque de acuerdo a las instrucciones de los kits de detección, estos
serían capaces de detectar desde 2 copias de un gen por microlitro si se hacen 5 diluciones como
recomienda el fabricante, lo que equivale a 0,5 (oo)quistes. Es decir que el kit permite detectar desde
1 (oo)quiste presente en una muestra de agua.
Por lo anterior, es crucial que en futuros experimentos se contamine la muestra antes de su
procesamiento con un número conocido de parásitos, por ejemplo utilizando controles positivos para
Giardia y Cryptosporidium tales como el control AccuSpike. Y también es necesario que se lleven a
34
cabo la mayor cantidad de ensayos posibles, de manera que se pueda detectar exactamente en qué
etapa del proceso se da la pérdida de (oo)quistes. En el caso en que estos controles no puedan usarse,
es necesario que se tenga información sobre la cantidad esperada de (oo)quistes que puede ser
encontrada en el lugar de la toma de muestra, esto con el fin de comparar esta información con los
resultados obtenidos. En el caso de este proyecto, ningún estudio que esté publicado ha estimado la
concentración de Giardia ni Cryptosporidium en la zona de estudio.
Otra variable a tener en cuenta, es el hecho de que la muestra final en la que se encuentran
concentrados los (oo)quistes no sea sometida a un proceso de purificación. Es posible que los
(oo)quistes queden “atrapados” entre los flocs de carbonato de calcio, bicarbonato de sodio e
hidróxido de sodio. Además, los reactivos utilizados para la floculación de los (oo)quistes pueden
interferir con los reactivos del proceso de extracción de ADN. Lo anterior no se ha estudiado, debido
a que un diseño experimental como este no está estandarizado, y en los estudios encontrados, una vez
se da el proceso de concentración, la detección de (oo)quistes se hace por medio de microscopia o
microscopia de fluorescencia y no por medio de extracción de ADN y qPCR.
6.2. Extracción de ADN
De acuerdo a las especificaciones del producto, el control positivo AccuSpike utilizado como
muestra para llevar a cabo la extracción de ADN, tiene un volumen de 2 mL (2000 µL), y contiene
100.3 quistes de Giardia y 100 ooquistes de Cryptosporidium (ver Anexo 1). Para el proceso de
extracción de ADN se tomó una muestra de 200 µL. A continuación se calcula un estimado del
número de (oo)quistes que debe contener esta muestra.
200µL ∗100,3 quistes de 𝐺𝑖𝑎𝑟𝑑𝑖𝑎
2000 µL= 10,03 quistes de 𝐺𝑖𝑎𝑟𝑑𝑖𝑎 en 200µL
200µL ∗100 ooquistes de 𝐶𝑟𝑦𝑝𝑡𝑜𝑠𝑝𝑜𝑟𝑖𝑑𝑖𝑢𝑚
2000 µL= 10 ooquistes de 𝐶𝑟𝑦𝑝𝑡𝑜𝑠𝑝𝑜𝑟𝑖𝑑𝑖𝑢𝑚 en 200µL
Tras el proceso de extracción de ADN, se obtuvo que la concentración de ácidos nucleicos de la
muestra final era de 20,2 ng/µL, lo cual en teoría representa la concentración de ácidos nucleicos que
corresponde a 10,03 quistes de Giardia y 10 ooquistes de Cryptosporidium. Para confirmar los datos
obtenidos, es necesario repetir el proceso de extracción de ADN numerosas veces hasta que haya
consistencia entre los diferentes resultados. Esto permite concluir si el proceso de extracción de ADN
está siendo tan efectivo como puede ser, es decir, si la concentración de material genético obtenida
efectivamente corresponde a 10,03 quistes de Giardia y 10 ooquistes de Cryptosporidium o si esta
debería ser mayor.
Ahora bien, el resultado obtenido tras la extracción de ADN a partir del control positivo
AccuSpike funcionó, pues esta muestra fue amplificada en el proceso de qPCR confirmando la
presencia de los (oo)quistes. Sin embargo, debido a que la concentración es muy baja, la amplificación
35
obtenida no se encuentra entre las curvas de calibración construidas a partir del kit utilizado en la
qPCR, lo cual dificulta la cuantificación del número de (oo)quistes.
Es importante resaltar que los controles AccuSpike fueron donados a esta investigación por el
Instituto Nacional de Salud, debido a que son controles que vencieron en diciembre de 2017 (ver
Anexo 1), por lo que no son válidos para el diagnóstico de Giardia y Cryptosporidium, pero siguen
siendo válidos para trabajos investigativos. Ninguno de los controles se había abierto hasta el
momento de esta investigación (abril de 2019) por lo que no se considera que hayan estado expuestos
a contaminación. Sin embargo, se considera que su fecha de vencimiento puede interferir en la
integridad de los (oo)quistes. Si bien su material genético seguirá contenido en los viales, es posible
que los (oo)quistes se hayan desnaturalizado con el paso del tiempo, aun cuando los controles fueron
almacenados a 4°C como lo sugieren las indicaciones del producto.
En relación con la extracción de ADN realizada a partir de la muestra de agua procesada del río
Teusacá, se considera que las dificultades del proceso experimental no recaen sobre el proceso de
extracción de ADN sino sobre el proceso de concentración de (oo)quistes previamente realizado. Lo
anterior, debido a que se confirmó que el proceso de extracción de ADN funciona aun cuando se
tienen bajas concentraciones de ácidos nucleicos (como en el caso del control AccuSpike), y
concentraciones similares a esta fueron obtenidas después de procesar la muestra de agua del río
Teusacá.
6.3. qPCR
Las 6 diluciones realizadas para construir la curva de estandarización de Giardia y
Cryptosporidium en el desarrollo de la qPCR (ver Figuras 27 y 29), y la información brindada por los
estudios de Guy et al. (2003) y Yang et al. (2014), indican que el kit utilizado es capaz de detectar
desde 0,05 hasta 5.000 quistes de Giardia u ooquistes de Cryptosporidium, lo que corresponde a la
división por 4 de la dilución más concentrada y la dilución menos concentrada, es decir 2x104 y 0,2
copias/µL respectivamente.
La curva de amplificación obtenida para Giardia que se observa en la Figura 26 sugiere que es
necesario mejorar la desviación entre las tres réplicas de cada dilución, especialmente en las
diluciones más bajas, que corresponden a 2 y 0,2 copias/µL. En el caso de Cryptosporidium, las curvas
se comportan de manera diferente, y la desviación es mayor en las concentraciones más altas. Para
mejorar estos resultados, son necesarias numerosas repeticiones del proceso de qPCR con el fin de
identificar si el error se debe propiamente al kit, especialmente en el caso de Cryptosporidium, o si el
procedimiento experimental puede ser mejorado.
En cuanto al procedimiento experimental, es importante recalcar que la última dilución realizada
(0,2 copias/µL) no está incluida en las instrucciones del fabricante, y se hizo de acuerdo a
recomendaciones hechas en estudios previos y debido a que la concentración de ácidos nucleicos
obtenida tras la extracción de ADN fue baja (20,2 ng/µL). Esto puede explicar por qué para el caso
de Giardia la desviación en las concentraciones más bajas es tan alta, pues el kit no está propiamente
diseñado para llegar a esa dilución. Además, se resalta que los kits utilizados en el proceso de qPCR
vencieron en febrero del 2018, lo cual agrega incertidumbre en el experimento. También se resalta
que si bien los reactivos para la preparación de la MasterMix fueron abiertos por primera vez durante
el experimento actual (abril de 2019), los primers y controles específicos para Giardia y
36
Cryptosporidium utilizados en el protocolo de detección fueron abiertos en agosto del 2016, por lo
que pudieron haber sido contaminados generando interferencias.
7. Conclusiones y recomendaciones
Se logró verificar la presencia de quistes de Giardia en la muestra de agua tomada del río Teusacá
por medio de microscopía, extraer el ADN de los parásitos Giardia y Cryptosporidium a partir del
control AccuSpike haciendo uso del kit QIAmp DNA mini kit, y se desarrolló satisfactoriamente la
técnica qPCR para cuantificar la cantidad de copias de los genes gdh y COWP presentes en la muestra.
Si bien la concentración de (oo)quistes por medio de técnicas alternativas no tuvo resultados
positivos, se concluye que esta investigación aporta a la futura toma de decisiones en experimentos
que utilicen métodos alternativos de concentración de quistes de Giardia y ooquistes de
Cryptosporidium, ya que dejó en evidencia las complicaciones que estas presentan, y los
procedimientos de cada etapa que pueden ser mejorados.
De esta manera, se recomienda que se explore la posibilidad de purificar la muestra final obtenida
tras el proceso de concentración, antes de iniciar el proceso de extracción de ADN, que se usen tubos
cónicos en el proceso de centrifugación, y que se aumente la velocidad a la que se retira el
sobrenadante después de la finalización de cada ciclo.
Se concluye que la baja concentración de ácidos nucleicos obtenida tras la extracción de ADN de
las muestras del río Teusacá no se debe al proceso de extracción de ADN propiamente, sino al proceso
de concentración de (oo)quistes. Lo anterior se puede concluir debido a que al usar un control positivo
en los procesos de extracción, la concentración de ácidos nucleicos fue igualmente baja pero los
resultados de la qPCR fueron positivos.
Se recomienda que se haga un seguimiento a la presencia o ausencia de (oo)quistes en cada etapa
del proceso de concentración por medio de la visualización de los mismos en el microscopio y que se
use un objetivo de 100X, que permite una observación más detallada de los (oo)quistes. Además, se
recomienda hacer la visualización de ooquistes de Cryptosporidium haciendo uso de la técnica de
tinción de Ziehl-Neelsen que es específica para este parásito.
Se recomienda que se continúe con la experimentación en el proceso de extracción de ADN,
aumentando y disminuyendo el número de choques térmicos sobre una muestra que corresponda a un
control positivo que no esté vencido. Además, se recomienda experimentar con el uso de perlas de
vidrio, ya que diversos estudios sugieren que esto permite facilitar la ruptura de la pared de los
(oo)quistes (Sepahvand et al. 2017; Babaei et al. 2011).
Se recomienda que se repita el proceso de qPCR con kits de detección nuevos que no hayan
podido ser contaminados previamente, y que se continúe con la construcción de una curva de
estandarización que tenga una dilución menos a la recomendada por el fabricante, pues esta mostró
resultados positivos.
Se recomienda construir una curva de calibración que permita asociar una cantidad conocida de
(oo)quistes procesada en la qPCR con su respectivo Ct. Lo anterior facilita la posterior cuantificación
de microorganismos, ya que ni Giardia y Cryptosporidium pueden ser cultivados.
37
Finalmente, se recomienda que se haga una revisión bibliográfica sobre la cantidad de material
genético que en teoría debe contener cada (oo)quiste, con el fin de comparar la teoría con la cantidad
de material genético obtenida tras la extracción de ADN. Lo anterior permite validar la extracción de
ADN realizada y facilita la cuantificación de (oo)quistes.
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Universidad de los Andes.
40
9. Anexos
9.1. Anexo 1: Especificaciones del producto AccuSpike
41
9.2. Anexo 2: Resultados de cada pozo correspondientes la qPCR de Giardia
Well Well Type Replicate Threshold (dR) Ct (dR) Quantity (copies) RSq (dR) Slope (dR)
A1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
A1 Standard 1 2479,955 25,4 2,00E+04 0,993 -3,391
B1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
B1 Standard 1 2479,955 29,15 2,00E+03 0,993 -3,391
C1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
C1 Standard 1 2479,955 32,03 2,00E+02 0,993 -3,391
D1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
D1 Standard 1 2479,955 35,9 2,00E+01 0,993 -3,391
E1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
E1 Standard 1 2479,955 39,79 2,00E+00 0,993 -3,391
F1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
F1 Standard 1 2479,955 43,31 2,00E-01 0,993 -3,391
A2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
A2 Standard 2 2479,955 25,71 2,00E+04 0,993 -3,391
B2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
B2 Standard 2 2479,955 29,06 2,00E+03 0,993 -3,391
C2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
C2 Standard 2 2479,955 32,12 2,00E+02 0,993 -3,391
D2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
D2 Standard 2 2479,955 35,48 2,00E+01 0,993 -3,391
E2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
E2 Standard 2 2479,955 40,03 2,00E+00 0,993 -3,391
F2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
F2 Standard 2 2479,955 No Ct No Ct 0,993 -3,391
A3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
A3 Standard 3 2479,955 26,07 2,00E+04 0,993 -3,391
B3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
B3 Standard 3 2479,955 28,94 2,00E+03 0,993 -3,391
C3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
C3 Standard 3 2479,955 32,62 2,00E+02 0,993 -3,391
D3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
D3 Standard 3 2479,955 35,69 2,00E+01 0,993 -3,391
E3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
E3 Standard 3 2479,955 38,93 2,00E+00 0,993 -3,391
F3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
F3 Standard 3 2479,955 41,47 2,00E-01 0,993 -3,391
A4 NTC --- Reference Reference Reference Reference Reference
A4 NTC --- 2479,955 No Ct No Ct 0,993 -3,391
B4 Unknown --- Reference Reference Reference Reference Reference
B4 Unknown --- 2479,955 42,13 0,2755 0,993 -3,391
42
9.3. Anexo 3: Resultados de cada pozo correspondientes la qPCR de Cryptosporidium
Well Well Type Replicate Threshold (dRn) Ct (dRn) Quantity (copies) RSq (dRn) Slope (dRn)
A1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
A1 Standard 1 0,0121 17,79 2,00E+04 0,967 -2,866
B1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
B1 Standard 1 0,0121 21,11 2,00E+03 0,967 -2,866
C1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
C1 Standard 1 0,0121 23,39 2,00E+02 0,967 -2,866
D1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
D1 Standard 1 0,0121 26,68 2,00E+01 0,967 -2,866
E1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
E1 Standard 1 0,0121 30,08 2,00E+00 0,967 -2,866
F1 Standard 1 Reference Reference Reference Reference Reference
F1 Standard 1 0,0121 No Ct No Ct 0,967 -2,866
A2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
A2 Standard 2 0,0121 18,81 2,00E+04 0,967 -2,866
B2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
B2 Standard 2 0,0121 22,26 2,00E+03 0,967 -2,866
C2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
C2 Standard 2 0,0121 23,33 2,00E+02 0,967 -2,866
D2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
D2 Standard 2 0,0121 27,73 2,00E+01 0,967 -2,866
E2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
E2 Standard 2 0,0121 30,68 2,00E+00 0,967 -2,866
F2 Standard 2 Reference Reference Reference Reference Reference
F2 Standard 2 0,0121 32,45 0,2 0,967 -2,866
A3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
A3 Standard 3 0,0121 20,56 2,00E+04 0,967 -2,866
B3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
B3 Standard 3 0,0121 22,79 2,00E+03 0,967 -2,866
C3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
C3 Standard 3 0,0121 24,53 2,00E+02 0,967 -2,866
D3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
D3 Standard 3 0,0121 28,07 2,00E+01 0,967 -2,866
E3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
E3 Standard 3 0,0121 30,02 2,00E+00 0,967 -2,866
F3 Standard 3 Reference Reference Reference Reference Reference
F3 Standard 3 0,0121 34,71 2,00E-01 0,967 -2,866
A4 NTC --- Reference Reference Reference Reference Reference
A4 NTC --- 0,0121 No Ct No Ct 0,967 -2,866
B4 Unknown --- Reference Reference Reference Reference Reference
B4 Unknown --- 0,0121 36,71 0,01163 0,967 -2,866