compuestos fenolicos con ir
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7/25/2019 Compuestos Fenolicos Con IR
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A n a l . I n s t . Bot. Cavanil les 32 (1): 215-267 (1975)
C O M P U E S T O S F E N O L I C O S
EN PYRUS PYR STER
B U R G S D .
por
E. FUERTES-LASALA, M. F E R N A N D E Z , L. M A RTN EZ,
M. C. GARCTA-MINA y F. A. VEGA
I. I N T RO D U CCI N
Los polifenoles y en especial los flavono ides, e stn siendo inve sti
gados in tensamente en las p l a n t a s ; se han consegu ido resu l t ados muy
p ro me t ed o re s en los l t imos aos , t an to en la solucin de p ro b l emas
qu imio taxonmicos como en la relacin de los diferentes t ipos de flavo
noides con la evolucin f i logent ica en el reino vegetal .
Es tas sus tanc ias
se
encue n t ran amp l iamente represen tadas
en las
p lan
tas vascu lares , es t ando comple tamente ausen tes
en las
C r i p t g a m a s
;
tan slo
se han
identificado unos pocos flavonoides
en las
Briofi tas ,
q ue se consideran primit ivos segn
H A R B O R N E
(1067), basndose en
los conocimientos actuales sobre su biosntesis y dis t r ibucin en el re ino
vegeta l .
Los pol i fenoles se pueden identificar con relativa facilidad por m
todos c romatogrf i cos y espec t ro fo tomt r i cos , a par t i r de pequeas
mu es t r a s de mater ial f resco e incluso de p lan tas conservadas en her
barios
(HARBORNE, 1072; P A R I S , 1971).
El es tudio
de los
polifenoles
en los
frutos t iene gra n in ters debido
a que estas sustancias influyen en sus carac te res o rgano lp t i co s : co lo r ,
s ab o r y t e r s u ra ( C R U E S , 1948: B A T E - S M I T H , 1954; S W A I N , 1962).
T amb i n se han relacionado es tas sus tancias con la res is tencia a las
infecciones ( H U L M E y E D N E Y , 1960).
CH A L L I CE y W E S T W O O D (1972), examinando las ho jas y cor tezas de
dist intas especies de
Pyrus,
frente a infecciones de h o n g o s y bac ter i as ,
af i rman que no hay cone xin en tre com pone ntes fenl icos y resistencia
a infecciones , aunque en a lgunos casos la presencia de c ie r to componen-
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24 ) SALES DEL INSTITUTO BOTNICO A. J. C A V A N I LLES . TO M O X X X I I , VOL. I
te co inc ide aparentemente con la resistencia a la infeccin. Segn esto,
en c ier tas c ircunstancias la presenc ia de de te rminados compues tos fen-
l icos puede servir para diferenciar individuos resis tentes e individuos
sensibles
y
hacer predicciones respecto
a la
resistencia
a a
infeccin.
Por todas es tas razones nos parec i in te resante el es tudio de los
compues tos fenl icos en
Pyrus pyraster,
c on t inua ndo los trabajos real i
z a d o s
en
e s t e De pa r t a m e n to
en
diferentes var iedades cult ivadas
de
Pyrus
communis
L.
Pyrus pyraster
B u r g s d . es una especie muy res is ten te a
las infecciones de h o n g o s y bac te r ias y se uti l iza para pie de injer tos
de peras cultivadas en N a v a r r a (*).
El es tudio compara t ivo ent re las var iedades cult ivadas y
Pyrus pyras
ter nos hizo apreciar a lgunas diferencias cuanti ta t ivas y cuali ta t ivas
e n t r e
los
diferentes compuestos fenlicos.
Se han hecho numerosas inves t igac iones en las hojas del g ne r o
Pyrus
( W I L L I A M S ,
1964) ;
CH A L L I CE
y
W I L L I A M S ,
1968, 1968a). Los com
pone n te s del epica rpo es tn menos es tudiados . Son no ta b le s los t r a ba
j o s de JO SL Y N y P E T E R S O N (1956), DUGGAN (1969), N O R T J E y K O E P -
P EN (1905) y H E RM A N N (1970).
II.
M A T E RI A L
Y
MTODOS
1.
Material estudiado
Los epica rpos de
Pyrus pyraster
B ur gsd .
F r u t o de 1,3-3,5 x 1,8-3,5 cm., g loboso o tu r b ina do , de color ama
r i l lo , mar rn o negro , pedice lo de lgado de 1-5,5 cm. de longitud, c l iz
pers is ten te (F lora Europaea , 1968) . Madurac in en la pr imera quincena
de octubre. Se recolect en la local idad de Azpil icueta , Valle del Baz tn
(Navarra) .
2.
Mtodos
e
extraccin
y
purificacin
a ) Extraccin
Los e x t r a c tos se rea l iza ron a par t i r de los epica rpos , to ta 'mente
e x e n t o s de pulpa , con e tanol85 por 100. P ara ev i ta r oxidac iones d urante
(*)
Datos suministrados
por la
Excma. Diputacin Foral
de
Navarra.
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COMPUE ST OS FE NL ICOS E N FYRU S PYRASTE R B URG SD. 2 4 7
1 pr oc eso , se aad i bisulfi to sdico al 1 po r 100 (VUATAZ et al., 1059),
al rededor de 2 mi . por cada 100 g . de mater ial f resco. Los extractos
e tan l i cos se concen t ra ron en ro tavapor
( B C H I ,
mod. R) a pequeo
volumen .
h) Purificacin y fraccionamiento
Se el iminaron ceras y clorofi las t ratando el ext racto con ter de
pe t r leo , segu idamente e l ex t rac to acuoso se ex t ra jo con ace ta to de
t i lo .
Es te ex t rac to se concen t r en ro tavapor has ta pequeo vo lumen
y se conserv seco sobre pentxido de fsforo.
La reaccin acuosa contena gran cant idad de pol meros de azca-
x e s ;
se el iminaron por precipi tacin con concentraciones crecientes de
etanol. Para recuperar los polifenoles del precipitado se uti l iz la fi l
t racin rpida por pol iamidas . Las pol iamidas (Ul t ramid Pulver
B . A. S. F . , Ludw igshafe n) se t ra tar on prev iam ente, para el iminar los
monmeros solubles , con metanol cal iente durante quince minutos , lavn-
-dolas despus con metanol hasta conseguir que el l quido de lavado
pa sara t ra ns pa re nt e; despus se lavaron con metan ol 20 y 50 por 100
y agua. En algunos casos se emple la mezcla dimet i l - formamidacin-
c i d o ac t i co -ag u a -e t an o l (5 : 1 0 : 3 0 : 2 0 , v / v )
( E N D R E S
y
H R M A N N ,
1963).
El precipi tado de pol meros , l levado a un grado de pur, se mezcl con
las pol iamidas en la proporcin de 10:1 , se lav con agua des t i lada y por
lt imo se extrajo con metanol. Se repit i la operacin con el agua para
asegurar la recuperacin de los pol i fenoles
( S I O U D
y
L U C H ,
1966). El
extracto metanl ico se concentr y reuni con la fraccin acuosa solu
ble en etanol . A es te conjunto se le denominaba extracto acuoso.
3.
Mtodos cromato grficos
a ) Cromatografa de papel
Se ut i l iz la cromatografa preparat iva en papel para separacin de
polifenoles, segn la tcnica de
W I L L I A M S
et al. (1952). Los extractos
disuel tos en etanol o metanol se apl icaron a pl iegos de papel What-
m an t nm. 1 y 3 M M . L os c rom atog ram as se desar ro l l a ron en fo rma
descenden te , en cmaras Shandbn (Pang las Chromato tank SAA, 2195)
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ANALES DEL INSTIT UTO BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X I I , VOL. I
con los disolventes AW, BAW y PhW. Las bandas sealadas a la luz uv
se cortaron y eluyeron en etanol 70 por 100.
Para el control de las separaciones, as como para identificaciones-,
comparacin con productos de referencia, valores de Rf en distintos
disolventes, separacin de los productos de las degradaciones e iden
tificaciones de los mismos^ se realiz la cro matog rafa tridimensional
ascendente en papel Whatmant nm. 1 en diferentes disolventes, los
cuales se dan, junto con sus caractersticas, en la tabla 1.
T A B L A
1
Disolventes utilizados en el desarrollo de los cromato gramas
A br e v i a tu r a s D i so lve n t e s
AW 4c . ac t ico-a gua
BA W n- bu t a no l - a c t i c o - a gua
SBA se c - bu t a no l - a c t i c o - a gua
B P W n - b u t a n o l - p i r i d i n a - a g u a
B B z P W n - b u t a n o l - b e n c e n o - p i r i d i n a - a g u a
PhW f e no l - a gua
M isoBCFW me t i l i sobu t i l c e tona - f r mic o- a gua
WE tM CA C a gua - e t a no l - me t i l e t i l c e tona - a c e t i l a c e tona
CfMtMC c loroformo-metanol -met i le t i l - ce tona
Proporcin
2:98
15:85
4:1:5
70:2:28
14:3:3
5:1:3:3:3
70:30
14:3:2
65:15:15:5
60.26:14
Capa *
m
m
c. s.
c. s.
m
m
m
c. s.
m
m
m, mezc la ; c . s . , capa super ior .
b) Crom atografa en capa delgada
Se emplearon mezclas de celulosa/poliamidas (2:1) en capas de 0,5-
0,8 mm. de espesor. La mezcla de 12 g. de celulosa Mn 300 G (Machery,
Nagel & Co., Duren) y 6 g. de poliamidas (Woelm), se suspendi
en 30 mi. de metanol y 60 mi. de agua.
Tambin se han utilizado poliamidas acetiladas Mn-Poliamid-DC-GAC
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C O M P U ES TO S F EX O U C O S EN P Y R U S P Y R A S TER BU R G S D . 249-
(Machery, Nagel & Co., Duren); 15 g. de poliamidas acetiladas se
suspendieron en 60 mi. de agua. Estas mezclas se agitaron en agitador
mecnico (Gallenkamp SD 110) durante diez minutos; se extendieron-
sobre placas de vidrio con el extensor regulable Shandon.
Los desarrollos cromatogrficos se efectuaron en cmaras Shandon
multiplaca Rf. 2845 para desarrollos de 20 x 20 cm. y Shandon de
desarrollo mltiple Rf. 3005 para placas de 40 x 20.
Los disolventes WEtMCAC y CfMtMC (tabla 1) fueron los ms
utilizados. El control de las operaciones as como la comprobacin de
la pureza de las sustancias se realiz por cromatografa bidimensional
con poamidas/celulosa (90:30), con espesor de capa de 0,3 mm.
c)
Reacciones de color
Para la pulverizacin de los cromatogramas se emplearon los siguien
tes reactivos:
difenil-(2-aminoetoxi)-borano al 1 por 100 en metanol (NETJ, 1957)
acetato bsico de plomo, disolucin saturada
(GAGE et al.,
1951)
azul de bromofenol al 0,005 por 100 en etanol
(BUCH et al,
1952)
cido p-toluensulfnico al 3 por 100 en etanol. Calentar el cromato-
grama a 100 cinco minutos (Roux, 1957)
p-nitroanilina d iazo tada : 5 mi. de p-nitroanilina al 0,5 po r 100'
en HC1 2 N aadiendo 0,5 mi. de nitrato sdico al 0,5 por 100 y 15 mi. de
acetato sdico al 20 por 100 inmediatamente antes de su uso; una vez
seco el crom atogra ma pulverizar con carbona to sdico al 20 po r 100'
(SWAIN, 1953)
reactivo de Roux (1952): 2 g. de sacarosa p. a., 10 mi. de HC1 con
centrado y 90 mi. de etanol absoluto; calentar el cromatograma un
minuto a 95
peryodato potsico-cido barbitrico: reactivo I, solucin de pota
sa al 2 por 100 en agua; reactivo II, disolver a saturacin peryodato
potsico en cido actico al 25 por 100 en agua; reactivo III, disolucin-
de 0,1 g. de cido barbitrico en 1 mi. de piridina, 2 mi. de agua y
10 mi. de metanol. A los treinta minutos de pulverizar el cromatogra
ma con el reactivo I, se pulveriza con el II y a los quince minutos con-
el reactivo I II . Calentar el cromatog rama a 100 cinco minutos ( M I
CH AUD, 1965).
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2 5 0 ANALES DEL INSTITU TO BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X II , VOL. I
4. Identificaciones
Para las ident i f icaciones se real izaron las degradaciones qumicas
adecuadas y se ut i l izaron mtodos cromatogrficos y espect rofotom-
t r icos.
a) Degradaciones qumicas
Hidrl is is acida. La hidrl is is acida se real iz generalmente para los
O-gl icosl idos , en el HC1 2 N-e tanol 70 po r 100 (1:1 ) a ref lu jo du ran te
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C O M P U ES TO S F EN O LIC O S EN P Y R U S P Y R A S TER BU R G S D .
251
b)
Mtod os espectrofotomtricos
Lo s espec t ros se rea l iza ron en un espec t rofo tm etro Ze iss P M Q I I
con cubetas de cuarzo. Para la observacin de los desplazamientos de
los mximos de absorc in se u t i l iza ron los reac t ivos s iguientes :
t r ic loruro de a luminio : 0 ,5 por 100 en e tanol absolu to Merck
( H O
ROWITZ, 1957)
eti la to sdico: 2,5 g. de sodio metal en 100 mi. de e tanol absoluto
M e r c k
( M A N S F I E L D
et al.,
1 9 5 3 ;
J U R D
y
H O R O W I T Z ,
1957)
ace ta to sdico: d iso luc in sa turada en e tanol absolu to Merck
(JURD
y
H O R O W I T Z , 1 95 7)
brico-aceta to sdico: cido br ico 0,15 M se sa tura con aceta to
sdico
( JU RD ,
1956).
Tambin se h ic ie ron espec t ros con t r ic loruro de a luminio en meta
nol y t r ic loruro de a luminio-cido c lorhdr ico
( M A B R Y
et al., 1970).
La espec t roscopia i r se rea l iz en un espec t rofo tmetro Pe rk in-
Elmer , mod. 257, con pas t i l la s de bromuro pots ico (0 ,5 mg. de com
pues to 250 de de bromuro pots ico) .
5.
Estimacion es cuantitativas
Los ext rac tos pa ra la s va lorac iones cuant i ta t ivas se rea l iza ron a pa r
t i r de e tanol 85 por 100. Se e l iminaron ceras y pigmentos con ter de
petrleo. A la f raccin acuosa se le precipi taron los polmeros de az
ca res con e tanol absolu to . Al prec ip i tado se le recupera ron los pol i fe -
noles re ten idos por t r a tamiento con pol iamidas , s iguiendo e l mismo
mtodo que hemos ya indicado en la prepara t iva .
Pa ra la va lorac in de an toc ianinas y leucoantoc ianinas . se prepar
un extracto diferente . Los picarpos exentos de pulpa
r
e ex t ra je ron
con metanol 80 por 100, aforando directamente , s in ninguna otra ope
rac in de f racc ionamiento ( S C H M I D , 1966).
La valoracin de polifenoles tota les se real iz por e l mtodo de
HORAK
(1956) por color imetr a con e l react ivo cido sulfanl ico diazo
tado , modif icado por FU E RT E S- L A SA L A (1973). A 5 mi. del problema
disuelto en etanol 96 por 100 se le aadi 5 mi. de amonaco al 10
-por 100, seguido de 2,5 mi. de cido sulfanl ico recin preparado. Las
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2 5 2 ANALES DEL INSTITUTO BOTNICO A. T. CAVANILLES. TOMO XX XI I, VOL. I
lec turas se hic ieron a los veinte minutos despus de aadir e l react ivo-
de c ido su l fan l ico , en un color metro Bauch & Lomb a 510 nm. La
recta de cal ibrado se construy con soluciones e tanlicas de querci tr i -
na : de 5 a 20 mcg/ml .
Reactivo: 1 g. de cido sulfanl ico, a l que se le aadi 1 mi. de
cido c lorhdr ico a l 37 por 100, se afor a 1 l i t ro de agua dest i lada
A 100 mi. de esta disolucin se aadi inmediatamente antes de uso 1 g.
de ni tr i to sdico.
Los g l ics idos de f lavonol se va lora ron por e l mismo mtodo ante
r ior , pero en medio cido
( H O R A K ,
1957) . Los extractos se desarrol la
ron en pape l con A W ; las man chas de g l ics idos de f lavonol obse rva
das a la luz uv se recor taron y e luyeron en 5 mi. de amonaco a l 0,5-
po r 100. A los t re int a m inuto s se adic ion 1 mi. de cido sulfanl ico
diazo tado y a los c inco min utos se aa diero n 2 mi. de HC1 1 N ; las
lecturas se hic ieron a 410 nm frente a un blanco preparado de la misma
manera . La rec ta de ca l ibrado se t r az c romatogra f iando cant idades
crecientes de una solucin e tanlica de querci tr ina de 5 mg/10 mi. y
despus de desa r ro l la r e l c romatograma en AW, se procedi como en
los ex t rac tos .
En la valoracin de los cidos fenlicos se han ensayado los s iguien
tes mtodos : co lor imetr a con c ido su l fan l ico d iazotado; e spec t ro-
fotometra uv. en medio rjcuoso ( P A E C H y R U C K E N D O R F , 1.055) y espec-
trofotometr a en medio a lcal ino. Con ninguno de e l los hemos obtenido-
resultados sa t isfactor ios, por lo que se hizo una est imacin cromato-
grf ica segn e l tamao e intensidad de las manchas en los cromato-
g r a m a s (FUERTES-LASALA, 1973).
Las an toc ianinas se va lora ron por e l m todo de S C H M I D (1966). Se
toman 3 4 mi. de extracto de metanol 80 por 100 y se lee la extincin-
a 530 nm. en e l co lor metro Bausch & Lomb, an tes y despus de aadi r
un 1 por 100 de HC1 conc. Los clculos se hacen ut i l izando e l coef ic iente
de extincin molar del c ianidn 3-galactsido, 3,43 x 10* (SIEGELMAN y
H E N D R I C K S , 1958) . La valoracin de las leucoantocianinas se real iz
por e l m todo de SCHMID (1966): 25 mi. del extracto de metanol 80 '
por 100 se mezclaron con 0,3 g. de poliamidas, t ra tadas previamente
como se ha descr i to en la preparat iva . La mezcla se concentr a seque
dad en evaporador rota tor io en vaco para e l iminar e l metanol , despus-
se lav con agua y se filtr. El f iltrado se volvi a mezclar con otros-
0,3 g. de poliamidas y de nuevo se f i l t r.
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COMPUESTOS FENLICOS EN PYR US P YRASTER B URGSD. 253
Las pol iamidas
con las
leucoan toc ian inas adsorb idas
se
mezclaron
c o n 20 mi. debu tano l -c ido c lo rh d r i co (5 :1 ,v/v) quecontenan 0,6 mg.
de Fe *
1
com o sulfato . La mezcla se calent a bao mar ia duran te ve in te
mi n u t o s .
La
so luc in ro ja t ransparen te ,
una vez
fra,
se
afor
a 25 mi.
La ex t inc in
se
ley
a 550 nm.
frente
a un
b lanco p reparado exac ta
men t e i g u a l . Los clculos se hicieron uti l izando el coeficiente de ext in
c in molar del c lo ruro de cianidina, 2,45 x 10* (SIEGELMAN y HEN-
IJRICKS,
1957).
III. RESULTADOS
1. Examen cromato grfico e los extractos
Se hizo un con t ro l c rom atogrf i co b id imens ional en papel , a los
extractos acetato
de
etilo
y
acu o s o .
La
f igura
la
represen ta
el
cor res
| )ond ien te al ace t a t o de et i lo . El ex t rac to acuoso p resen t las mismas
m a n c h a s
de
flavono ides, uno s pocos cidos fenlicos
y
t r azas
de
pol
m e r o s de azcares que no se haban el iminado en las operac iones de
fraccionamiento
y
purificacin antes indicadas.
Por c romatograf a b id imens iona l
en
placa delgada
de
po l i amidas /
celulosa
(fig. IB),
aparec ie ron
en el
ex t r ac t o
de
ace ta to
de
etilo
7
sustancias
con
caracter s t icas
de
f lavonoide.
Por
pulverizacin
de los
c ro ma t o g ramas
con
acetato bs ico
de
p lomo
y
difenil-(2-aminoetoxi)-
borano, pudim os apreciar
dos
t ipos
de
ag l i conas .
Las
sustancias
1, 3,
4,
5 de
color naran ja f luorescente
y las
sustancias
2, 6 y 7 de
color
amar i l lo -verdoso f luorescen te
a la luz uv.
2. Aislamiento e los polifenoles
Po r d es a r ro l l o
en AW 2 por 100 se
separaron
la
may o r p a r t e
de los
cidos fenlicos (fraccin H) de los flavonoides (fraccin F). De la
fraccin
H se
ais laron
los
principales componentes
C y P
median te nue
vo desarrol lo en BAW.
La fraccin
F,
c ro ma t o g ra f i ad a
en AW 15 por 100, dio
l u g a r
a
t res
t a n d a s muy p r x i mas . Cad a una de ellos se purific de las o t r a s por
nuevos desar ro l los
en AW 15 por 100.
D e la b an d a F, se aislan las sustancias 3 y 6 con relativ a facilidad.
D e
la
fraccin
F
2
,
t ras nu me rosos ensayos ,
se
ob tuv ieron
las
sustan-
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2 5 4 ANALES DEL INSTITUT O BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X II , VOL. I
c ias 1 y 2 por c romatograf a p repara t iva en pape l , con BAW, pero
en pequea cant idad, ya que, dada la proximidad de las bandas , fue
necesario despreciar zonas de in terferencia y repet i r los desarrol los
numerosas veces .
Fig. 1. Crom atogramas de extracto de acetato de etilo ; A) en papel W hatmant nme
ro 1 (28,5 x 23), revelado con cido p-toluensulfnico. Disolventes: 1, BAW ; 2, AW
15 por 100. F, flavonoides ; L, leucoantocianinas ; C, clorognicos ; P, cidos p-cuma-
roilqunicos. B) En capa delgada de poliamidas/celulosa (20 x 20), revelados con difenil-
(2-aminoetoxi)-borano. Disolventes: 1, WEtMCAC ; 2, CfMtMC. Sustanc
:
as numeradas:
flavonoides ; sustancias sin num era r: cidos fenlicos.
La banda F
a
, cromatografiada en BAW, dio lugar a dos fracciones
de las cuales se obtuvieron por cromatografa preparat iva en papel ,
con PhW las sus tancias 4 y 5 , 7A y 7B.
Los di ferentes procesos real izados en el f raccionamiento y separa
cin de las sustancias en los extractos se indican en el esquema I.
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