Extracción de compuestos bioactivos

Se pesó 1.5 g de la muestra a analizar (fruta fresca, concentrado de fibra dietética total), se le añade 30 ml de metanol / agua (50:50) a pH 2.0 acidificado con ácido clorhídrico, posteriormente se procede a licuar durante 1 minuto, con una potencia de 600 watt a 29000 rpm. A continuación se lleva a centrifugación por 15 minutos a 5000 rpm. Se separa el sobrenadante y el residuo se lo somete a una segunda extracción con acetona / agua (70:30), repitiéndose el licuado y la centrifugación. Posteriormente estos sobrenadantes se mezclan y se los lleva a un baño termostático a 50°C para precipitar otros componentes, se almacenan en congelación a -12°C hasta realizar los análisis de capacidad antioxidante. (CALIXTO, S. FULGENCIO, D. JIMÉNEZ, A. 2003).

MÉTODO ABTS

Inicialmente el ABTS es oxidado por medio del persulfato de potasio (K2S2O8) para formar el catión radical ABTS•+ que es cuantificable a una longitud de onda de 734 nm. El ABTS•+ es un catión radical estable debido a su capacidad de deslocalizar el electrón desapareado entre los átomos de nitrógeno de su estructura. De esta manera, el ABTS•+ puede reaccionar con el compuesto antioxidante (empleando el reactivo Trolox como antioxidante estándar), ocasionando la formación del ABTS (incoloro) y la oxidación del compuesto antioxidante. Entre mayor es la CA del compuesto, mayor es la decoloración generada sobre el ABTS•+ debido a que se cuantifica la decoloración del cromóforo ABTS•+ ocasionada por el proceso de reducción. (OSMAN, A..; WONG, K.; FERNYHOUGH, A. 2006).

Según la metodología el radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,42mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Este reactivo se mantiene estable por 2 a 3 días si se guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,02) a 734 nm y 25ºC. La absorbancia se mide cada 30 s después de la adición de 1.0 ml de la solución ABTS•+ a 100 μl de muestra, homogenizada durante 30s en forma continua durante 6 minutos. La disminución de la coloración es expresada como el porcentaje de inhibición de ABTS, la cual es comparada con una curva estándar del antioxidante sintético de referencia, trolox (20-200μmol/l). Los resultados se expresan como μmol de trolox equivalente por gramo de muestra fresca.

MÉTODO DE FOLIN & CIOCALTEAU

El método de Folin–Ciocalteau es utilizado para determinar los Polifenoles Totales utilizando el reactivo Folin - Ciocalteu (solución de ácido fosfomolíbdico y ácido fosfowolfrámico) que oxida los compuestos polifenólicos a fenolatos en medio alcalino, formando un complejo de molibdeno – tungsteno de color azul.Se mezcló 20μl de muestra, 1μL solución Folin & Ciocalteau (0,2 N) y 500 μl de Na2CO3 (75 g/l). La mezcla es homogenizada y calentada a 45 ºC, se mide la absorbancia a 765 nm. La absorbancia final de cada muestra es comparada con una curva estándar de ácido gálico (40-200 mg/l).Los resultados fueron expresados como μmol equivalentes de ácido galico (GAE) por gramo de muestra fresca 22.

Metodología experimentalPreparación de las muestras: Se trabajó con frutas sanas y firmes que fueron lavadas con agua destilada; el aguaymanto entero fue licuado durante 30 segundos; la papaya de monte se cortó en mitades para eliminar el mucílago interno y se procedió a licuar durante 1minuto; las tunas fueron peladas y licuadas durante 30 segundos; el tomate de árbol fue separado en

cáscara, pulpa y pepas; cada uno de éstos fue licuado durante 1 minuto; todas las frutas fueron inmediatamente usadas para la preparación de extractos.

Preparación de los extractos:A. Fenoles totales y capacidad antioxidante con los métodos DPPH y ABTS: Para todas las muestras se pesó 2,5 gramos de muestra y se añadió 12,5 mL de metanol; se homogenizó la muestra con un agitador magnético durante 15 minutos y se almacenó el extracto durante 24 horas a 4°C en oscuridad; luego, se procedió a centrifugar el homogenizado durante 20 minutos a 5000 rpm; el sobrenadante se guardó para análisis posteriores y el precipitado fue eliminado.Para los ensayos con DPPH, se tomó alícuotas del extracto obtenido: para aguaymanto, tomate de árbol y tuna se tomó 150 mLy para papaya de monte 50 mL.Para los ensayos de ABTS, se tomó 50 mLdel extracto de aguaymanto y papaya de monte y 150 mLdel extracto de tuna y tomate de árbol.

B. Vitamina C: Los extractos para la determinación de vitamina C en frutas se preparó según Luximon-Ramma. (Luximon-Ramma, A.; Bahorun, T. and Crozier, A. 2003. Antioxidant actions and phenolic and vitamin C contents of common Mauritian exotic fruits. Journal of the Science of Food and Agriculture. 83. 496-502.)

2.5 Determinación de la actividad antioxidante2.5.1 Medición de la actividad antioxidanteLa actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado. Según Clarkson, (1995), la medición de una muestra oxidante, pueden usarse intermediarios o productos finales para valorar la actividad antioxidante.La actividad antioxidante de una muestra no puede ser determinada basándose solo en un ensayo de prueba. En la práctica se realizan muchos modelos de test in vitro (tabla 1) para evaluar la actividad antioxidante de la muestra de interés; sin embargo, es necesario considerar que los modelos presenten diferentes variaciones puede dificultar un poco la comparación de los resultados entre un método y otro.Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías: (1) Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) y (2) Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones (ET) (Huang et al., 2005).

Tabla 1. Clasificación de los modelos de ensayo in vitro según su modo de reacción ET o HAT

Los ensayos basados en la transferencia de electrones (ET) involucran una reacción redox con el oxidante como un indicador del punto final de reacción.La mayoría de los ensayos basados en HAT monitorean una reacción cinética competitiva, generalmente están compuestos de un generador de radical libre sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Los ensayos basados en HAT y ET fueron desarrollados para medir la capacidad de atrapar radicales libres, en lugar de la capacidad preventiva antioxidante de una muestra (Huang et al., 2005). En la figura 7 se muestran las reacciones específicas para los ensayos basados en la transferencia de electrones y en la transferencia de átomos de hidrógeno.En los últimos años se han adoptado un amplio rango de ensayos espectrofotométricos para medir la capacidad antioxidante de los alimentos, muestras biológicas y extractos vegetales. Usualmente los ensayos antioxidantes in vitro utilizan un captador de radicales libres y son relativamente sencillos de realizar. Entre los ensayos de captación de radicales libres, el método DPPH● es el más rápido, es simple

(no incluye muchos pasos) y de menor costo en comparación con otros modelos. Por otro lado, el ensayo de decoloración ABTS•+ se puede aplicar a antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos (Alam et al., 2012). Por lo anterior, estos dos métodos son los más utilizados.

Ensayo ABTS+ (Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico)La generación del radical ABTS●+ constituye la base de uno de los métodos espectrométricos que han sido aplicados para medir la actividad antioxidante total de soluciones o sustancias puras y mezclas acuosas. El ensayo original de ABTS●+ estaba basado en la activación de la metilmioglobina con peróxido de hidrógeno en presencia de ABTS para producir un radical catión, en presencia o ausencia de antioxidantes. Este fue criticado debido a que la reacción rápida de los antioxidantes, contribuye a la reducción del radical ferrilmioglobina. Unformato más apropiado para el ensayo consiste en la técnica de decoloración, en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reacción con los antioxidantes (Re et al., 1999).

La técnica mejorada para la generación del radical catión ABTS+, implica la producción directa del cromóforo ABTS●+ verde-azul a través de la reacción entre ABTS y el persulfato de potasio (K2S2O8). Este presenta tres máximos de absorción a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La adiciónde los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado de decoloración como porcentaje de inhibición del radical catión ABTS●+ está determinado en función de la concentración y el tiempo; asi como del valor correspondiente usando el Trolox como estándar, bajo las mismas condiciones.

2.6 Contenido de fenoles totales por el reactivo de Folin-Ciocalteu (F-C)El ensayo de Folin-Ciocalteu (F-C) es un método comúnmente utilizado en el área de agroquímica e industrias alimenticias, por su simplicidad, por la disponibilidad comercial del reactivo y por ser un procedimiento ya estandarizado (Singleton et al., 1999). Inicialmente, fue aplicado al análisis de proteínas tomando como ventaja la actividad del reactivo frente al residuo de proteína, tirosina (que contiene un grupo fenol). Muchos años después este ensayo se extendió al análisis de fenoles totales en vino y desde entonces se le ha encontrado muchas aplicaciones.El reactivo de F-C utiliza un mecanismo de reacción de oxidación/reducción, que no es específico para fenoles. De hecho, el ensayo de F-C mide la capacidad para reducir el reactivo de ácido fosfomolibdico/fosfotungstico a un complejo azul que es monitoreado espectrofotométricamente, donde el molibdeno es reducido en el complejo y se da la reacción de transferenciencia de electrones entre el Mo(iv) y el reductor como se muestra en la figura 10 (Huang et al.,2005). El método implica la oxidación de fenoles en solución alcalina por el heteropolianión molibdotungstofosfórico amarillo y la medición colorimétricadel molibdotungstofosfato azul resultante. Este complejo azul tiene su máxima absorción dependiendo de su composición fenólica, además del pH de las soluciones implicadas (Cicco et al., 2009).

En el ensayo F-C original, se usa el buffer de carbonato para ajustar el pH y el punto final de reacción se alcanza a los 120 min aproximadamente a temperatura ambiente. Aunque es un tiempo demasiado extenso y dificulta la implementación de un análisis de rutina, aún es utilizado por algunos investigadores. En diferentes trabajos se ha variado concentración del reactivo, alcalinidad y temperatura, buscando una reducción significativa del tiempo necesario para llegar a un estado estacionario. Magalhães et al., (2010)adaptó el método, en el cual se varia la alcalinidad, al reemplazar el buffer de carbonato por una solución de hidróxido de sodio logrando disminuir el tiempo de reacción a 4 min y conseguir resultados altamente confiables. Al final se debe tener muy presente la concentración alcohólica en la mezcla, puesto que según Singleton et al., (1999) el incluir solventes diferentes al agua en las muestras, algunas veces puede interferir la formación de la solución azul.

Soluciones Osmóticas

2. Pesado de edulcorantes: Se pesaron los dos edulcorantes utilizados Sacarosa (350 g) y Miel de abeja (433 g).3. Pesado de agua: La cantidad de agua utilizada fue de 150 g para el jarabe de sacarosa y 67 g para el jarabe de miel de abeja. La cantidad de jarabe para cada tratamiento fue de 500 g.

Soluciones ternarias

La solución osmótica ternaria (sacarosa/ sal/ agua) utilizada en cada corrida experimental fue preparada mezclando cantidades necesarias de sacarosa (40, 50 y 60 g/100g solución) y cloruro de sodio (3, 6 y 9 g/100g), ambos de grado comercial, con adición apropiada de agua destilada de acuerdo al diseño experimental utilizado.

Preparación de los edulcorantes Jarabe de sacarosa: Se diluyeron 200 g de azúcar comercial en agua destilada hasta alcanzar 30o Brix. El pH final 6,0.

Jarabe de miel: Se diluyeron 200 g de miel de abejas en agua destilada hasta alcanzar 30o Brix. El pH final 4,0. Crema de miel: Extraída del panal en su estado natural con 75o Brix y pH 4,5.