LILIANA V. MUSCHIETTI Cátedra de Farmacognosia, IQUIMEFA (UBA-CONICET). Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de

Buenos Aires. Buenos Aires, Argentina.

ESTRATEGIAS PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS

NATURALES. BIOPROSPECCIÓN DE DROGAS CON

ACTIVIDAD TRIPANOCIDA Ilheus, 27 al 30 de Octubre de 2014

World Health Organization: First WHO report on neglected tropical diseases: working to overcome the global impact of neglected tropical diseases, David WT. Crompton and Patricia Peters, Eds.; 2010, WHO Press, Geneva, Switzerland. ISBN 978 92 4 1564090. WHO/HTM/NTD/2010.1

Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana

Leishmaniasis

Tripanosomiasis Africana Humana o enfermedad del

sueño

Global Plan To Combat Neglected Tropical Diseases 2008–2015. World Health Organization WHO 2007. http://www.uta.edu/chagas/images/LHbar.jpg. http://www.seti.cl/si

Enfermedades abandonadas (NTDs)

Número de casos

estimados

< 1.000

1.000 - 99.999

100.000 - 999.999

≥ 1.000.000

Casos estimados no oficiales

Estatus de la

transmisión del vector

Países sin transmisión vectorial

Países con transmisión vectorial accidental

Países con transmisión vectorial

Distribución mundial de los casos de enfermedad de Chagas y el estatus de transmisión vectorial

WHO. First WHO Report on Neglected Tropical Diseases 2010. Working to overcome the Global Impact Neglected Tropical Diseases. SBN9789241564090; 2010

Enfermedades infecciosas causadas por protozoarios

Parásitos

Enfermedad Ocurrencia Mortalidad DALY´s

Plasmodium spp.

Malaria 219 millones de

nuevos casos*

660,000

muertes*

33,976,000

Leishmania spp.

Leishmaniasis

300,000 nuevos

casos de VL cada año

Approx.

40,000

muertes

debido a VL

1,974,000

** 1 millón de nuevos

casos de CL cada año

Trypanosoma spp.

Tripanosomiasis

Africana Humana

20,000 casos

1,673,000**

Enfermedad de

Chagas

Aprox. 10 millones de

casos ***

14,000***

700.000***

DALY´s: Disability Adjusted Life Years *En 2010, de acuerdo al World Malaria Report 2012. **The Global Burden of Disease Report, WHO, 2004. *** Peter J. Hotez et al. The new HIV/AIDS of the Americas PLoS Negl Trop Dis 2012; 6(5): e1498. doi:10.1371/journal.pntd.0001498.

http://magazinedelbuenayre.blogspot.com.ar/2011/02/la-salud-i-enfermedad-de-chagas.html

Triatoma infestans http://www.parbio.es/blog/trypanosoma-cruzi/

Trypanosoma cruzi

Ciclo biológico de Trypanosoma cruzi

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx

Epimastigote

Tripomastigote

Amastigote

Enfermedad de Chagas: la muerte silenciosa

http://www.msaludjujuy.gov.ar/epidemiologia/

A

Período agudo

• Generalmente asintomático

• Signo de Romanha

• Fiebre, anorexia, malestar general

• Mueren el 5% de los chicos infectados

Período latente o intermedio

• Generalmente asintomático con serología positiva

• Caracterizado por una lenta multiplicación de los parásitos.

Período crónico

• Sistema nervioso central y periférico

• Megalopatías: Cardiomegalia megaesófago, megacolon

4-14 días 20-30 años

Benznidazol

- Desarrollado en 1974 (Laboratorio Roche)

- Baja eficacia (10-20% cura parasitológica) en la fase crónica

- Efectos adversos: dolor abdominal, nauseas, vómitos,

mialgias, neuropatía periférica, polineuritis, parestesias

Nifurtimox

-Desarrollado en 1960 (Laboratorio Bayer)

- Baja eficacia (10-20% cura parasitológica) en la fase crónica

- Efectos adversos: dolor abdominal, nauseas, vómitos,

anorexia, psicosis, cefalea, convulsiones, neuropatía periférica

http://dndi.org/diseases-projects/diseases/chagas/current-treatment.html

Dife

ren

tes e

nfo

qu

es para e

l de

scub

rimie

nto

d

e fárm

acos p

ara la en

ferm

ed

ad d

e C

hagas

• Terapia combinada

• Investigación de drogas utilizadas para el tratamiento de otras patologías

• Modificación de drogas ya existentes con el fin de mejorar la eficacia

Estrategias a corto y

mediano plazo

• Focalizadas al descubrimiento de nuevas entidades químicas (NCEs)

• Productos naturales

• Diseño y síntesis de nuevas moléculas (diseño racional)

• QSAR, Modelado molecular, HTS.

Estrategias a largo plazo

Pink R., Hudson A., Mouries MA., Bending M. Opportunities and challenges in antiparasitic drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2005 Sep;4(9):727-40.

Fármaco ideal

• Cura parasitológica en todas las fases de la enfermedad

• Efectivo por vía oral

• Bajo costo

• Sin efectos colaterales o teratogénicos

• No sea necesaria hospitalización

• No induzca resistencia

http://www.dndi.org/diseases-projects/diseases/chagas.html

Pink R., Hudson A., Mouries MA., Bending M. Opportunities and challenges in antiparasitic drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2005 Sep;4(9):727-40.

Molécula HIT

• Activa in vitro

• IC50: < 1 μg/ ml

• SI: > 10 (CC50/IC50)

Molécula líder

• Activa in vivo

• No tóxica para los animales a la dosis efectiva

• Activa in vitro contra cepas resistentes

• Obtención de análogos

Molécula candidata

Candidato clínico

• Activa in vitro (actividad cercana a las drogas stds)

• Activa in vivo (modelos en fase crónica) • Administración oral • Buen SI frente a diferentes líneas

celulares de mamíferos

• Ensayos de mutagenicidad

• Perfil metabólico y farmacocinético

• Mecanismo de acción conocido

Proceso de descubrimiento de nuevas drogas con actividad

tripanocida

Artemisia annua Artemisinina

Arteether Artemether

Cinchona calisaya

Quinina

Cloroquina

Mefloquina

Drogas antimaláricas

BIOPROSPECCIÓN DE POTENCIALES DROGAS CON ACTIVIDAD TRIPANOCIDA:

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA EN EL PERÍODO 2000-2010

L. Muschietti, V. Sulsen, V. Martino. Bioprospection of Potential Trypanocidal Drugs: A Scientific Literature Survey over the Period 2000–2010, In: Studies in Natural Products Chemistry, Elsevier B.V, Vol. 39, pp. 297-336, 2013. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-444-62615-8.00009-62013

Trypanocidal

Trypanosoma cruzi

Antiparasitic

Antitrypanosomal

Medicinal Plants

Natural compounds

Plant extracts

Medline: Título y resúmen

Scopus: Título, resúmen y palabras

claves

Idioma inglés

Estrategia de búsqueda bibliográfica

Criterio de selección de los artículos

Identificados en Medline (n=268)

Identificados en Scopus (n=1353)

Registros totales (n=1621)

Criterios de exclusión • Otros parásitos

• Compuestos naturales de otros orígenes (organismos marinos, hongos, bacterias)

• Registros duplicados • Sin actividad reportada

• Información incompleta/No disponibilidad del texto completo

Artículos seleccionados (n=191)

Extracción de datos

Género, especie y familia

Plantas medicinales

Usos etnomédicos

Género, especie y familia

Plantas medicinales

Usos etnomédicos

Estrategias metodológicas

Screening biológico

Fraccionamiento guiado por bioensayo

Técnicas híbridas

Estrategias metodológicas

Screening biológico

Fraccionamiento guiado por bioensayo

Técnicas híbridas

Grupo fitoquímico/ clases de compuestos Grupo fitoquímico/ clases de compuestos

Bioensayos in vitro (epimastigotes, tripomastigotes, amastigotes)

Bioensayos in vivo

Bioensayos in vitro (epimastigotes, tripomastigotes, amastigotes)

Bioensayos in vivo

Síntesis de análogos/derivados semisintéticos

Estudios de QSAR

Mecanismo de acción

Síntesis de análogos/derivados semisintéticos

Estudios de QSAR

Mecanismo de acción

A partir de la información obtenida de los usos

tradicionales de las plantas

A partir de datos quimiotaxonómicos

Recolección aleatoria

Observación de campo

Criterios de selección de las plantas

Especies seleccionadas por sus etnomédicos

Annona crassiflora (Annonaceae)

Alcaloides isoquinolínicos

Guatteria australis (Annonaceae)

Alcaloides isoquinolínicos

Oxalis erythrorhiza (Oxalidaceae)

Heptadecil-5-metoxifenol y embelina (3,6-dihidroxi-2-

undecilbenzofenona)

Feresin et al., 2003. J. Ethnopharmacol 88:241-247. Tempone et al. , 2005. Phytomedicine 12 : 382–390.

Extracción con disolventes

Material vegetal

Extracto(s) activo

Gran escala

Bioensayo (in vitro)

Bioensayo (in vitro) Fraccionamiento guiado por bioensayos

Fracción(es) activa(s)

Aislamiento y purificación del compuesto(s)

Compuesto(s) activo(s)

Extracto B Extracto C

Determinación estructural (UV, IR, MS, NMR, Rayos X, etc.)

Bioensayo del compuesto(s) activo utilizando distintas concentraciones para determinar la potencia

Ensayos in vivo y estudios toxicológicos Estudios clínicos

Solicitud de patente Solicitud de homologación

Producción farmacéutica y marketing

Extracto A

Etapas a cumplir en un proceso general de descubrimiento de drogas de origen natural

Sarker et al. 2006. Natural Product Isolation: an overview. In: Natural Products Isolation Humana Press, New Jersey, pp 1-26

Técnicas híbridas Técnicas de acoplamiento

HPLC/MS

Técnicas de acoplamiento HPLC/MS-MS

Técnicas de acoplamiento HPLC/NMR

Técnicas de acoplamiento HPLC/DAD

Dereplicación Proceso que permite identificar a priori, en los extractos,

compuestos que ya han sido estudiados previamente antes de ser sometidos a un bioensayo.

Identificación de alcaloides naftilisoquinolínicos de especies de las familias Ancistrocladaceae y Dioncophyllaceae con actividad antiparasitaria

http://www-organik.chemie.uni-wuerzburg.de/lehrstuehlearbeitskreise/bringmann/fields_of_research/natural_product_analysis/G. Bringmann et al., J. Nat. Prod. 63 (2000) 1465–1470; J. Nat. Prod. 65 (2002) 1096–1101; Phytochemistry 60 (2002) 389–397; Phytochemistry 62 (2003) 631–636; J. Nat. Prod. 66 (2003) 1159–1165; J. Nat. Prod. 67 (2004) 743–748; J. Nat. Prod. 67 (2004) 2058–2062; Phytochemistry 69 (2008) 1065–1070.

Tipos de compuestos más representativos con actividad sobre Trypanosoma cruzi

5% 6%

32%

17%

17%

3% 11%

9%

Columna1

Lignanos

Quinonas

Terpenoides

Alcaloides

Flavonoides

Cumarinas

Otros fenólicos

Miscelaneos

Studies in Natural Products Chemistry, Elsevier B.V, Vol. 39, pp. 297-336, 2013. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-444-62615-8.00009-62013

Figure 1. Most represented class of trypanocidal bioactive compounds for which trypanocidal activity has been reported in the period 2000–2010.

Subclases de compuestos terpenoides con actividad sobre Trypanosoma cruzi

15%

10%

22% 26%

24%

3%

Ventas

Monoterpenos

Sesquiterpenos

Diterpenos

Triterpenos

STLs

Esteroides

Studies in Natural Products Chemistry, Elsevier B.V, Vol. 39, pp. 297-336, 2013. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-444-62615-8.00009-62013

Figure 1. Subclasses of terpenoid compounds with trypanocidal activity reported in the period 2000–2010. STLs, sesquiterpene lactones

Bioensayos

97.4%

2.6%

Ensayos in vitro

Epimastigotes de T. cruzi

Tripomastigotes de T. cruzi (parásitos recombinantes β-

galactosidasa)

Amastigotes de T. cruzi intracelulares

Ensayos in vivo Paso más importante para ensayos

más avanzados (mecanismo de acción y estudios farmacodinámicos)

Información sobre activación o desactivación metabólica

Desventaja: se requiere de 50 a 100 veces mas de compuesto

Identificación de blancos potenciales en Trypanosoma cruzi

Caracterización de la secuencia del genoma de T. cruzi (2005)

Análisis proteómico

Identificación de características específicas del ciclo de vida del

parásito

Nuevas dianas y líneas de investigación

Cruzipaína Dihidrofolato reductasa (DHFR)

Dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH)

Esterol 14α-desmetilasa (CYP51)

Escualeno sintasa (SQS) Triosefosfato isomerasa (TIM)

Tripanotiona reductasa (TryR)

Tripanotiona sintetasa (TryS)

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)

Angustifolin (IC50= 130µM)

Scopoletin (IC50= 260µM)

Rauianin (IC50= 93µM)

Phebalosin (IC50= 190µM)

Osthol (IC50= 210µM)

Chalepin (IC50= 64µM)

Bergapten (IC50= 347µM)

Isoangenomalin(IC50= 145µM)

Sesalin (IC50= 123µM)

Scopoletin (IC50= 260µM) Sesalin

(IC50= 123µM)

Estructura de GAPDH de T. cruzi acomplejada con chalepina

Inhibidores de la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) de T. cruzi

Paulo Vieira et al. Strategies for the isolation and identification of trypanocidal compounds from the Rutales. Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 3, pp. 617–622, 2001.

de Marchi A. A et al. (2004). New 3-piperonylcoumarins as inhibitors of glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gGAPDH) from Trypanosoma cruzi. Bioorganic & Medicinal Chemistry,12, 4823–4833.

Nuevas 3-piperonilcumarinas como inhibidores de GAPDH de Trypanosoma cruzi

El diseño se basó en las estructuras de productos naturales (hits) identificados previamente.

Los derivados sintetizados más activos son aquellos que contienen un anillo heterocíclico en posición 6.

Estudios de modelado molecular por docking sugieren un modo diferente de unión para los derivados más activos, cuando se los compara con la chalepina.

Diseño basado en la estructura tridimensional de la diana. Estudios de docking

Nuria Campillo, Pedro González Naranjo, Juan Antonio Paez Prosper (2012). Anales de la Real Academia Nacional de Farmacia, 78, 34-61

Diana Estructuras cristalográficas Mecanismo de acción

Hipoxantina fosforibosil- transferasa (HGPRT)

1P17, 1P18, 1P19, 1I0I, 1I0L, 1I13, 1IL14, 1TC2, 1TC1

Captura de purinas y

Cruzipaína 1AIM,1EWL,1EWM,1EWO,1EWP,1F29,1F2A,1F2B,1F2C, 1ME3,1ME4,1U9Q,2AIM,2EFM,2OUL, 2OZ2

Responsable de la actividad proteolítica

Tripanotiona reductasa (TR) 1GXF, 1AOG, 1NDA Síntesis y metabolismo del tripanotiona

Farnsesil pirofosfato sintetasa (FPPS) 3IBA,EICK,3ICM,3ICN,3ICZ,3ID0,1YHK,1YHL,1YHM

Biosíntesis de ergosterol

Transialidasa 1MR5,1MS0,1MS1,1MS3,1MS4,1MS5,1MS8,1MS9,1S0I,1S0J,2AH2

Transferencia de Residuos de ácido siálico

Gliceraldehido-‐3-‐fosfato deshidrogenasa (GAPDH)

1K3T,1ML3,1QXS,3DMT

Víametabólicade oxidacióndela glucosa

C14α esterol demetilasa 2WUZ,2WXZ Biosíntesis de esteroles de membrana

Tabla 1. Dianas representativas con estructura tridimensional

Nectandra megapotamica

Ganschisandrine

(1NDA)

Piper regnelli

Eupomatenoid (1GXF)

Pterodon pubescens

Geranylgeraniol

(1NDA y 1GXF)

Baccharis retusa

5,6,7-trihidroxi4′-

metoxiflavona

(1NDA)

Arrabidaea triplinervia

Alpinitina

(1NDA)

Persea americana

1,2,4-trihidroxiheptadec-

16-ene

(1GXF)

(hidrocarburos oxigenados)

Stephanie F. McCulley and William N. Setzer. An In-Silico Investigation of Anti-Chagas Phytochemicals. Current Clinical Pharmacology, 2014, 9, 205-257 205

Investigación In Silico de ligandos naturales

Tamizaje de alto rendimiento

High Throughput Screening Techniques (HTS)

Proceso que permite el ensayo simultáneo de un gran número de compuestos, en forma automatizada, para

medir su actividad como antagonistas o agonistas de un blanco biológico particular

El objetivo del HTS es acelerar el proceso de descubrimiento de nuevas drogas a través del ensayo de

una gran librería de compuestos (10,000- 100.000 compuestos /día)

A pesar que la técnica HTS se ha convertido en el modo preferido de descubrimiento de fármacos por gran parte de la industria farmacéutica, sólo recientemente se ha

utilizado en la búsqueda de nuevos medicamentos para las enfermedades parasitarias abandonadas

Inhibición del crecimiento de epimastigotes de T. cruzi (Tulahuen) para cada

extracto

Especies vegetales Extracto % Inhibición del crecimiento DS

100 µgml 10 µgml

Ambrosia tenuifolia AT(PA)-EO 81.110.79

43.333.14

AT(PA)-EA 24.931.69 n.d.

AT(R)-EO 34.555.14 n.d.

AT(R)-EA 0 n.d.

Ambrosia scabra AS(PA)-EO 73.890.79

69.030.98

AS(PA)-EA 30.912.96 n.d.

AS(R)-EO 49.657.37 n.d.

AS(R)-EA 0 n.d.

Eupatorium buniifolium EB(PA)-EO 75.002.87

57.769.75

EB(PA)-EA 80.177.31

78.881.83

Eupatorium candolleanum EC(PA)-EO 48.674.89 n.d.

EC(PA)-EA 66.839.38 n.d.

Baccharis spicata BS(PA)-EO 42.717.05 n.d.

BS(PA)-EA 10.646.02 n.d.

BS(R)-EO 71.163.26

52.855.10

BS(R)-EA 0 n.d.

Lippia integrifolia LI(PA)-EO 75.681.91

34.4612.42

LI(PA)-EA 90.951.83

71.234.11

Satureja parvifolia SP(PA)-EO 88.850.48

58.115.73

SP(PA)-EA 75.437.92

71.1210.36

Gentianella achalensis GA(PA)-EO 65.917.07 n.d.

GA(PA)-EA 62.801.22 n.d.

Cuphea glutinosa CG(PA)-EO 20.831.96 n.d.

CG(PA)-EA 5.563.93 n.d.

Cuphea carthagenensis CC(PA)-EO 22.223.61 n.d.

CC(PA)-EA 0 n.d.

Cuphea ingrata CI(PA)-EO 29.175.26 n.d.

CI(PA)-EA 0 n.d.

Los resultados se expresan como la media DS (n=2). nd: no deteminado.

Screening de actividad sobre T. cruzi de plantas medicinales Argentinas

Parasitol Res (2006) 98: 370–374. DOI 10.1007/s00436-005-0060-4

Figura 1. Inhibición del crecimiento de epimastigotes de T. cruzi por las fracciones F1AT-F5AT de A. tenuifolia

F1AT F2AT F3AT F4AT F5AT 0

25

50

75

100 72 h

% inhib

itio

n

F1AT F2AT F3AT F4AT F5AT 0

25

50

75

100100 g/ml

10 g/ml

120 h

% inhib

itio

n

American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2007 ,77 (4):654-659.

Figura 2. Inhibición del crecimiento de epimastigotes de T. cruzi por las fracciones F1AS-F5AS de A. scabra

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Po

rce

nta

je d

e in

hib

ició

n

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Po

rce

nta

je d

e in

hib

ició

n

72 h 120 h

F5AS F5AS

F1AS 100 µgml

F1AS 10 µgml

F2AS 100 µgml

F2AS 10 µgml

F3AS 100 µgml

F3AS 10 µgml

F4AS 100 µgml

F4AS 10 µgml

F5AS 100 µgml

F5AS 10 µgml

Psilostachyin

OO

O

OO

OH

Peruvin

O

OO

OH

Psilostachyin C

O

O

OO

Psilostachina Peruvina Psilostachina C

Ambrosia tenuifolia Ambrosia scabra

Compuestos

IC50

epimastigotes (µg/ml)

IC50

tripomastigotes (µg/ml)

IC50

amastigotes (µg/ml)

SI

(Tripomastigotes)

Psilostachina1 1.22 0.76 5.88 33.8

Peruvina1 1.65 52.8 n.d 0.7

Psilostachina C2 0.6 3.5 0.9 13

Actividad tripanocida in vivo de psilostachina1

10 15 20 250

5

10

15

20control

compuesto A

benznidazol

Días post-infección

Pará

sito

s/m

l sangre

(x10

5)

control benznidazol compuesto A0

5

10

15

20

**

Pará

sito

s/m

l sangre

(x10

5)

10 20 30 40 500

25

50

75

100

benznidazol

compuesto A

control

Días post-infección

Sobre

vid

a (

%)

psilostachina

control

benznidazol

psilostachina benznidazol control

control

benznidazol

psilostachina

**p<0.01

Actividad tripanocida in vivo de psilostachina C2

0 5 10 15 200

5

10

15

20control

benznidazol

compuesto D

Días post-infección

Pará

sito

s/m

l sangre

(x10

5)

10 20 30 400

25

50

75

100 control

benznidazol

compuesto D

Días post-infección

Sobre

vid

a (

%)

0

5

10

15

* *

Pará

sitos/m

l sangre

(x10

5)

control benznidazol

psilostachina C

control

benznidazol

psilostachina C

psilostachina C benznidazol control

*p<0.05

1 Antimicrobial Agents and Chemotherapy.2008, 52, 2415-2419. 2 International Journal of Antimicrobial Agents. 2011, 37 ,536–543.

Ambrosia elatior (Asteraceae)

Cumanina

Fig. 1 Actividad tripanocida in vivo de cumanina: (A) niveles de parasitemia, (B) curva de sobrevida durante el período de infección aguda

IC50(epi)=12 µM IC50(tripo)=180 µM IC50(amas)= 8 µM

Fig. 2 Isobolograma que describe el efecto de la combinación de (A) cumanina y psilostachina y (B) cumanina y benznidazol Plos Negl Trop Dis. 2013, 7 (10): e2494. doi:

10.1371/journal.pntd.0002494

Enhidrinaa Polimatina B Uvedalina

Fraccionamiento guiado por bioensayo de EO

Cromatografía en columna

FE: Si gel, FM: Hx, EtOAc, MeOH

Fracciones activas:

F2B, F3A y F3B

Determinación de la actividad tripanocida de EO sobre epimastigotes de T. cruzi

100 y 10 μg/ml

72 h

95.1 % (100 μg/ml) y 87.6% (10 μg/ml)

Smallanthus sonchifolius (Asteraceae)

Hojas

Extracto orgánico (EO)

(CH2Cl2100%)

Fig. 4. Citotoxicidad de enhidrina, uvedalina y polimatina B en células Vero

Fig.1. Inhibición del crecimiento de epimastigotes de T. cruzi por enhidrina, uvedalina y polimatina B

Fig. 2. Efecto de enhidrina, uvedalina y polimatina B sobre tripomastigotes de T. cruzi

Fig.3. Efecto de enhidrina, uvedalina y polimatina B sobre T. cruzi amastigotes

Tropical Protozoan Diseases: Natural Product Drug Discovery and Development. Special Issue. ECAM, ID 627898, http://dx.doi.org/10.1155/2013/627898

SI: Índice de selectividad; n.a: sin actividad

Compuestos

Uvedalina Polimatina B Enhydrina

IC50 (µM) en epimastigotes

1.09 4.90 0.84

IC50 (µM) en tripomastigotes

25.0 n.a 33.4

IC50 (µM) en amastigotes 3.34 9.02 5.17

CC50 (µM)en células Vero

46.8 147.3 46.5

SI (amastigotes/células Vero)

14.0 16.3 9.0

PBMC viabilidad (20µM) %

101.7 88.2 98.2

• Las diversas formas de vida de estos parásitos pueden diferir drásticamente

en su sensibilidad frente a un fármaco en particular

• Es importante investigar las diferentes formas de vida de estos parásitos

Sonchifolina 8β-angeloyloxy-9α-hydroxy-14-oxo-acanthospermolide

Molecules, 2010, 15, 545-553.

Vacuolización citoplasmática, ligero aumento en cuerpos multivesiculares, hinchamiento mitocondrial

acompañado por deformidad del kinetoplasto.

Figure XX

ms

mi

N

mi

mi

N

N

Vac

Vac

F

ms

mi

N

mi

mi

N

N

Vac

Vac

ms

mi

N

mi

mi

N

N

Vac

Vac

F

K

mi

miN

N

F

F

mi

KK

mi

miN

N

F

F

mi

K

K

F

F

mimi

mv

NK

F

F

mimi

mv

N

V ac

Vac

m i

m v

m v

N

KF

N

Vac

V ac

Vac

m i

m v

m v

N

KKFF

NN

Vac

A B

C D

Fig. 1. Efecto de la psilostachina sobre la ultraestructura de epimastigotes de T. cruzi

Fig. 2. Efecto de la psilostachina C sobre la ultraestructura de epimastigotes de T. cruzi

Vacuolización en el citoplasma aparición de estructuras multilamelares y anomalías como la presencia de múltiples kinetoplastos y flagelos.

Efecto de las STLs polimatina B, uvedalina y enhydrina sobre la ultraestructura de T. cruzi

A nivel ultraestuctural se observa que la STL uvedalina (2.5 μg/mL) induce un hinchamiento mitocondrial (Fig.1C).

Polimatina B (2.5 μg/mL) y enhydrina (5 μg/mL) producen grandes deformidades y vacuolización sobre los parásitos (Fig. 1B y D).

Figura 1. Efecto de las SLs sobre la ultraestructura de T. cruzi. Control sin tratamiento (A) o tratado con 2.5 μg/mL de polimatina B (B), uvedalina (C) o con 5 μg/mL enhydrina (D) durante 48 h. N: núcleo, F: flagelo, V: vacuolas, K: kinetoplasto, Ac: acidocalcisoma. Aumento: 3000x.

Los resultados demuestran que las plantas representan una fuente

importante de moléculas con actividad tripanocida

La mayoría de los compuestos han sido ensayados solamente mediante ensayos

in vitro

Una amplia gama de dianas terapéuticas están actualmente bajo investigación. Sin embargo, son escasos los ensayos para los

compuestos de origen vegetal

CONCLUSIONES

Optimización de moléculas líderes: obtención de análogos para poder continuar con las siguientes etapas

La aplicación de diferentes estrategias metodológicas como dereplicación, HTS,

química combinatoria (obtención de análogos)

Existen pocos protocolos estandarizados. Es necesario un conjunto mínimo de criterios para garantizar resultados

confiables

TRABAJO INTERDISCIPLINARIO

BOTÁNICA, FARMACOGNOSIA, FARMACOLOGÍA, MICROBIOLOGÍA, TOXICOLOGÍA, QUÍMICA MEDICINAL

Cátedra de Farmacognosia, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, IQUIMEFA (UBA-CONICET)

Dra. Virginia Martino, Dra. Liliana Muschietti, Dra. Valeria Sulsen, Dra. Flavia Redko, Farm. Jerónimo Ulloa, Farm. Belén Carballo, Lic. Daniela Baffaro, Farm. Greta Maravilla, Ezequiel Moreno.

Grupos colaboradores

• Dr. Emilio Malchiodi, Dra. Fernanda Frank, Dra. Silvia Cazorla. Cátedra de Inmunología, IDEHU (UBA-CONICET), Facultad de Farmacia y Bioquímica and Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Junín 956 (1113), Buenos Aires, Argentina.

• Dra. Albertina Moglioni, Dra. Liliana Finkielsztein. Cátedra de Química Medicinal. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.

• Dr. Cesar Catalán Instituto de Química Orgánica, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Prov. de Tucumán, Argentina.

• Dr. Miguel Sosa Instituto de Histología y Embriología "Dr. Mario H. Burgos", Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo-CONICET, Prov. de Mendoza, Argentina.

• Dra. Roser Vila, Dra. Blanca Freixa. Unitat de Farmacologia i Farmacognòsia, Facultat de Farmacia, Universitat de Barcelona, Barcelona, España.

MUCHAS

GRACIAS MUITO

OBRIGADO

Glaciar Perito Moreno

Cataratas del Iguazú Quebrada de Humahuaca

Ciudad de Buenos Aires

Medicina tradicional

Ensayos clínicos

controlados

In vitro

In vivo

Análisis fitoquímico Aislamiento de

compuestos puros

D

R

C

B

R

A

Fraccionamiento guiado por bioensayo

C1

C2

Gertsch, J. 2009. How scientific is the science in ethnopharmacology? Historical perspectives and epistemological problems. J Ethnopharmacol., 122, 177-183.

Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae)

canthin-6-one

canthin-6-one N-oxide

5-methoxycanthin-6-one

Fig.1 Efecto de Bz (50 mg/kg/día) y canthin-6-one (5 mg/kg/día en la parasitemia de ratones BALB/c infectados con T. cruzi (CL)

Tabla 1. Efecto de Bz, canthin-6-one (1) y extracto crudo de alcaloides de Z. chiloperone en ratones con infección aguda por T. cruzi

Ferreira ME, Nakayama H, de Arias AR, Schinini A, de Bilbao NV, Serna E, Lagoutte D, Soriano-Agatón F, Poupon E, Hocquemiller R, Fournet A. Effects of canthin-6-one alkaloids from Zanthoxylum chiloperone on Trypanosoma cruzi-infected mice. J Ethnopharmacol. 2007 ;109(2):258-63.

Compuesto Tipo de

compuesto

Año de Patente Número de

referencia

2-(Substituted methylidene)-N-[3-

[piperidin-1-yl]propyl]hydrazine

carboximidamides

SP 1990 US4942170

8-Aminoquinolines SP 2001 US20010007031

Anionic or cationic dendrimer SP 2003 US20030129158

Apicidin-derived cyclic tetrapeptides SP 2003 US20030078369

Canthin-6-one from Zanthoxylum

chiloperone

NP 2007 US20070149461

2004 WO04050092A1

2004 WO04050092B1

cubebin and methylpluviatolide NP

2003

WO03080600A1 dibenzylbutyrolactonic lignans NP derivatives

Imidazopyridine SP 2006 US20060293303A1

Inhibitor of cysteine proteases

Oxy substituted

SP 2007 US20070135439

Linear dicationic terphenyls 2007 US20070232621

Manzamine analogs from

Micromonospora

NP 2005 US20050085554A1

Melarsomine dihydrochloride SP 1998 US5770733

Naphtoquinone derivatives SP 1992 US5145975

Nitro-heterocyclics (triazolics and

imidazolics derivatives)

SP 2008 WO008022422A1

1-phenyl-2-aminoethyl naphthalene NP derivative 2004 WO04065349

Phosphorous organic compounds SP 2006 US20066753324

Platinum complexes SP 2005 US20050080131A

Semicarbazone inhibitors SP 2005 US20050182121A1

Substituted quinolines SP 2008 US20087342026

3,3-dimethyl-8-oxoisoquinoline NP derivatives 2004 WO04067514A1

2003 WO03000272A1

Thio-semicarbazone inhibitors SP 2004 US20040014801

Lianet Monzote. A Review of Anti-Parasitic Patents (1988-2008), 2008. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 3, 177-191. V. G. Duschak and A.S. Couto, 2007. An Insight on Targets and Patented Drugs for Chemotherapy of Chagas Disease. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 2, 19-51.

Patentes de compuestos con

actividad tripanocida

(01/1988 - 04/2008)

In Silico Study of Structural and Geometrical Requirements of Natural Sesquiterpene Lactones with Trypanocidal Activity. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2013, 13, 1407-1414.

Estudio de los requerimientos estructurales y geométricos de lactonas sesquiterpénicas con actividad tripanocida

Tabla 1. Actividad tripanocida y citotóxica in vitro de las lactonas sesquiterpénicas 1-15

Los resultados obtenidos demuestran que este tipo de compuestos son potenciales

moléculas líderes con actividad tripanocida. Se observó una importante dependencia

de la actividad anti-T. cruzi con factores estéricos

Only plant families with three or more citations were included. (Data derived from table 1, repeated species were not considered). Amaryllidaceae (Amar); Anacardiaceae (Anac); Ancistrocladaceae (Anci); Annonaceae (Anno); Apiaceae (Apia); Apocynaceae (Apoc); Aristolochiaceae (Aris); Asteraceae (Aste); Bignoniaceae (Bign); Boraginaceae (Bora); Chenopodiaceae (Chen); Clusiaceae (Clus); Euphorbiaceae (Euph); Fabaceae (Faba); Lamiaceae (Lami); Lauraceae (Laur); Liliaceae (Lilia); Melastomataceae (Mela); Meliaceae (Meli); Myristicaceae (Myri); Myrtaceae (Myrt); Piperaceae (Pipe); Rubiaceae (Rubi); Rutaceae (Ruta); Scrophulariaceae (Scro); Solanaceae (Sola); Zingiberaceae (Zing).

Familias más representativas con actividad sobre Trypanosoma cruzi (2000-2010)

Productos naturales de origen vegetal descubiertos desde 1970 que condujeron a un fármaco aprobado entre 1981–2006

Molécula/año Estructura Indicación Droga/Año comercialización

Taxol, 1971 Diterpeno

Antitumoral Paclitaxel/1993 Docetaxel, 1995

Artemisinin, 1977 Lactona sesquiterpénica

Antimalárico Artemisinin, 1987 Artemether, 1987 Artenusate, 1987 Arteether, 2000

Forskolin, 1977 Diterpeno

Vasodilatador Broncodilatador

Colforsin, 1999

Plaunotol, 1977 Diterpeno

Anti úlcera Plaunotol, 1987

Arglabin, 1982 Lactona sesquiterpénica

Antitumoral Arglabin, 1999

A. Ganesan. Current Oipinion in Biological Chemistry 12:306–317