comercializada en el mercado caraguay de la ciudad de...
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN.
TEMA:
Escherichia coli O157:H7 EN CARNE BOVINA MOLIDA
COMERCIALIZADA EN EL MERCADO CARAGUAY
DE LA CIUDAD DE GUAYAQUIL.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO
PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICO Y
FARMACÉUTICO.
AUTORES:
CATAGUA SUAREZ BRYAN ROGGER.
CEREZO BANDERA JHONNATAN ALEJANDRO.
TUTOR:
BLGO., GUSTAVO SAÚL ESCOBAR VALDIVIESO, M.Sc.
CO -TUTORA:
Q.F., MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO, Mg
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
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INFORME ANTIPLAGIO DEL SISTEMA URKUND
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AGRADECIMIENTO
Agradecemos principalmente a Jehová Dios por la vida de nosotros y
de nuestros padres, por habernos ayudado a culminar la carrera y
brindarnos la fuerza y ganas necesarias para seguir adelante ante las
diferentes adversidades de la vida, y por la sabiduría que nos impartió en
todo momento y en todo tiempo.
Agradecemos a nuestros Padres por habernos ayudado en todo
momento y tiempo antes la adversidad que se presentaron en la vida.
Agradecemos también a nuestros tutores ya que, más que tutores son
amigos, los cuales nos ayudaron a hacer esta tesis de maravilla, y sacar
buena calificación.
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a nuestros tutores ya que, más que tutores son amigos, los cuales nos
ayudaron a hacer esta tesis de maravilla, y sacar buena calificación.
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ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL ........................................................................................... xvi
ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................... xx
ÍNDICE DE ANEXOS ....................................................................................... xxi
RESUMEN ...................................................................................................... xxiii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
EL PROBLEMA. ................................................................................................. 4
Justificación. ................................................................................................... 4
Formulación del problema. ............................................................................. 4
Objetivos. ........................................................................................................ 4
Objetivo general. ......................................................................................... 4
Objetivos específicos. ................................................................................. 4
Hipótesis ......................................................................................................... 5
Variable de estudio. ........................................................................................ 5
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................... 6
I.1. Carne. ....................................................................................................... 6
I.1.1. Composición química de la carne. .................................................... 7
I.1.2. Consumo. ........................................................................................... 7
I.2.Escherichia coli. ......................................................................................... 8
I.2.1. Características generales del grupo coli. .......................................... 9
I.2.2. Signos clínicos. ................................................................................ 10
I.2.3. Período de incubación. .................................................................... 13
I.2.4. Duración de la enfermedad. ............................................................ 13
xvii
I.2.5. La toxina Shiga. ............................................................................... 13
I.2.6. Locus LEE. ....................................................................................... 15
I.2.7. Otros factores de virulencia de ECEH............................................. 17
I.2.8. Movilidad de factores de virulencia en ECEH. ................................ 18
I.2.9. Ciclos replicativos de los fagos ....................................................... 19
I.2.10. Inducción del ciclo lítico. ................................................................ 22
I.2.11. Bacteriófagos Stx. .......................................................................... 22
I.2.12. Bacteriófagos Stx en el medio ambiente. ...................................... 23
I.3. Tratamiento. ............................................................................................ 24
I.4. Prevención. ............................................................................................. 24
I.5. Epidemiología. ........................................................................................ 25
I.6. Sistema BBL Crystal de Identificación. .................................................. 28
I.7. Características del método. .................................................................... 28
I.7.1. Reproducibilidad. ............................................................................. 28
I.7.2. Precisión de la identificación. .......................................................... 28
I.7.3. Limitaciones del método. ................................................................. 29
I.8. Mercado Caraguay. ............................................................................... 30
Glosario ............................................................................................................ 31
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................... 32
II.1. Métodos científicos empleados en la investigación. ............................. 32
II.1.1. Método Teórico. .............................................................................. 32
II.2. Metodología. .......................................................................................... 32
II.3. Tipo de investigación. ............................................................................ 34
II.4. Diseño de Investigación. ....................................................................... 34
II.5. Población y Muestra. ............................................................................. 34
xviii
II.6. Materiales y Equipos. ............................................................................ 34
II.6.1. Material de campo. ......................................................................... 34
II.6.2. Material fungible para el laboratorio. .............................................. 34
II.6.3. Equipos. .......................................................................................... 35
II.6.4. Reactivos ........................................................................................ 35
II.7. Procedimiento. ....................................................................................... 36
II.7.1. Aislamiento microbiológico. ............................................................ 36
II.7.2. Detección de E. coli O157:H7 mediante el sistema de identificación
BBL Crystal. ................................................................................................... 36
CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. .............................................. 37
III.1. Técnica de recolección de información. ............................................... 37
III. 2. Análisis e interpretación de resultados. .............................................. 37
DISCUSIÓN ...................................................................................................... 42
CAPITULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................ 43
Conclusión .................................................................................................... 43
Recomendaciones ........................................................................................ 44
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................. 45
ANEXOS. .......................................................................................................... 52
xix
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Ilustración 1.Daño renal provocado por las toxinas Stx1 y Stx2 administradas
a la misma dosis en primates no humanos ......................................................... 14
Ilustración 2. Mecanismo de ingreso y acción de las toxinas Stx .................. 15
Ilustración 3. Ciclo de los bacteriófagos. ......................................................... 21
Ilustración 4. Vista aérea del Mercado Caraguay............................................ 30
Ilustración 5. Presencia de Escherichi coli en muestras de carne molida
bovina .................................................................................................................... 37
Ilustración 6. Presencia de otros microorganismos (MO) en carne molida
expendida en el mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil. ........................ 38
Ilustración 7. Presencia del serotipo E. coli O157:H7 carne bovina molida. .. 39
Ilustración 8. Evaluación de la condición de expendio de la carne molida. .... 40
xx
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Países mayor consumidores de carne a nivel mundial ....................... 7
Tabla 2. Características de los grupos de Escherichia coli causantes de
diarrea. .................................................................................................................. 10
Tabla 3. Serotipos y serogrupos más comunes de E. coli no O157:H7 ......... 12
Tabla 4. Proteínas efectoras sintetizadas por el sistema de secreción tipo III.
............................................................................................................................... 17
Tabla 5. Proteínas efectoras vía sistema de secreción tipo III no LEE. ......... 18
Tabla 6. Brotes asociados con Escherichia coli O157:H7 por el consumo de
alimentos contaminados en Estados Unidos. ...................................................... 27
Tabla 7. Presencia de Escherichia coli en las muestras analizadas .............. 37
Tabla 8. Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas ... 38
Tabla 9. Conservación del producto. ............................................................... 40
Tabla 10. Porcentaje de muestras que se expendieron a 4ºC y 28ºC. ........... 40
Tabla 11. Condición higiénica de los locales clasificados por categorías según
la escala de Likert ................................................................................................. 41
xxi
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el
mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil. ................................................... 53
Anexo 2. Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta. ............ 61
Anexo 3. Tabla de resultados según el sistema BBL Crystal. ........................ 63
Anexo 4. Tabla bioquímica de identificación de microorganismo más comunes
............................................................................................................................... 65
Anexo 5. Preparación de agar agua de peptona ............................................. 66
Anexo 6. Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta. ........................ 66
Anexo 7. Preparación de agar soya tripticasa. ................................................ 66
Anexo 8. Preparación de agar SIM .................................................................. 67
Anexo 9. Preparación de agar Citrato Simmons. ............................................ 67
Anexo 10. Preparación de agar Ureasa. ......................................................... 67
Anexo 11. Preparación y siembra de la muestra............................................. 68
Anexo 12. Procedimiento de pruebas bioquímicas ......................................... 68
Anexo 13. Protocolo de trabajo para la identificación de E. coli O157: H7
mediante el Sistema BBL™ Crystal™ .................................................................. 69
Anexo 14.Croquis del mercado Caraguay ....................................................... 71
Anexo 15. Tabla de resultados para la interpretación de las reacciones
bioquímicas ........................................................................................................... 72
Anexo 16. Croquis de los sitos referenciales de venta de carne bovina molida
del mercado Caraguay .......................................................................................... 73
Anexo 17 Limpieza y desinfección del área de trabajo con alcohol. .............. 73
Anexo 18. Homogenización de la muestra en agua peptonada. .................... 74
Anexo 19. Incubación de placas con agar biliado rojo neutro cristal violeta. . 74
Anexo 20. Incubación de colonias características en tubos con agar TSI ..... 75
xxii
Anexo 21.Tubo con agar TSI recientemente sembrados ................................ 75
Anexo 22. Tubo de agar TSI a las 24 horas de incubación. ........................... 76
Anexo 23. Tubos con agar tripticasa soya a las 24 de incubación ................. 76
Anexo 24. Kit BBL Crystal para la identificación del serotipo O157:H7 .......... 77
Anexo 25. Paneles de BBL Crystal después del periodo de incubación ........ 77
Anexo 26. Panel de identificación BBL Crystal a las 24 horas de incubación 78
Anexo 27. Nivel de confianza y validez del biotipo para Escherichia coli según
el programa de análisis BBL Crystal. ................................................................... 78
Anexo 28. Incorrecta manipulación de la carne molida en el mercado
Caraguay previo a la venta. .................................................................................. 79
Anexo 29. Personal moliendo la carne bajo condiciones antihigiénicas y sin
ningún tipo de protección ...................................................................................... 79
Anexo 30. Carne molida expuesta a la intemperie en el Mercado Caraguay. 80
xxiii
RESUMEN
Introducción: Escherichia coli O157:H7 es una amenaza general para la salud
pública y se ha visto implicada en muchos brotes de colitis hemorrágica. En
Ecuador no existen datos estadísticos que confirmen la presencia de esta
bacteria en los diferentes mercados de venta de carne molida bovina Objetivo:
Detectar la presencia de Escherichia coli O157:H7 productora de la toxina Shiga
en carne bovina molida comercializada en el mercado Caraguay de la ciudad de
Guayaquil. Diseño del estudio: tipo descriptivo, observacional con un diseño no
experimental. Material y método: las muestras recolectadas fueron
debidamente pesadas, enriquecidas y sembradas en agar cristal violeta rojo
neutro bilis y agar TSI. Posteriormente la bacteria Escherichia coli (E. coli) fue
identificada mediante pruebas bioquímicas y aislada en agar soya tripticasa, para
luego ser almacenadas a 4ºC y analizadas por el Sistema BBL Crystal E/NF.
Resultados: la presencia de Escherichia coli en la carne bovina molida se
encontró un 81 %, y en un 0 % el serotipo O157:H7. Conclusión: las muestras
contaminadas por E. coli resultaron ser negativas para el serotipo O157:H7. Se
pudo evaluar además las áreas de ventas de acuerdo a las condiciones de
almacenamiento y proceso de la carne molida, expendida en el mercado
Caraguay, dando como resultado un 60 % en la calificación de bueno según la
escala de Likert.
Palabras claves: Escherichia coli, toxina Shiga, carne bovina molida, Sistema
de Identificación BBL Crystal.
xxiv
ABSTRACT
Introduction: Escherichia coli O157: H7 is a general threat to public health and
has been implicated in many outbreaks of hemorrhagic colitis. In Ecuador there
are no statistical data to confirm the presence of this bacterium in the different
markets for the sale of bovine ground beef. Objective: Detect the presence of
Escherichia coli O157: H7 that produces the Shiga toxin in ground beef sold in
the Caraguay market of the city of Guayaquil. Study design: descriptive,
observational type with a non-experimental design. Material and method: the
samples collected were duly weighed, enriched and seeded in neutral red crystal
violet bile and TSI agar. Subsequently, the bacterium Escherichia coli (E. coli)
was identified by biochemical tests and isolated on trypticase soy agar, to be
stored at 4ºC and analyzed by the BBL Crystal E/NF System. Results: the
presence of Escherichia coli in the ground beef was 81%, and in 0% the serotype
O157:H7. Conclusion: the samples contaminated by E. coli turned out to be
negative for serotype O157: H7. It was also possible to evaluate the sales areas
according to the conditions of storage and processing of the ground beef, sold in
the Caraguay market, resulting in 60% in the rating of good according to the
Likert scale.
Keywords: Escherichia coli, Shiga toxin, grounded beef meat, I.D System BBL
Crystal.
1
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli es una bacteria bacilo gramnegativo, móvil, anaerobio
facultativo que forma parte de la flora intestinal tanto de animales como del ser
humano. Este, posee una gran variedad de cepas, las cuales en su gran mayoría
son considerados inofensivos (Rodríguez, 2012). Sin embargo, no todas las
especies de este microorganismo son iguales, siendo algunas de ellas
patógenas (FAO, 2011). Actualmente se han estudiado más de 100 serotipos de
esta bacteria, considerándose a la E. coli O157:H7 verotoxigénica como la más
perniciosa (Usera, 2012).
E. coli O157:H7 fue reconocido por primera vez en 1982 en Estados Unidos,
como causante de un brote alimentario en hamburguesas, produciendo diarrea
sanguinolenta severa; desde entonces, la mayoría de las infecciones reportadas
provienen de comer carne molida poco cocida. El índice de prevalencia de este
microorganismo en países como Francia y Estados Unidos es menor del 1%, en
comparación con otros países como Egipto, Estambul y México que sobrepasa el
2% (Tanaro et al, 2016).
La ingesta de E. coli O157:H7 se debe principalmente al consumo de
alimentos, agua o productos contaminados con excretas de animales portadores,
proveniente principalmente del ganado bovino (contaminación cruzada o el mal
cocimiento de los alimentos), además de ello esta bacteria posee resistencia a
condiciones ácidas de ambientes (3,7 – 3,9), por lo que puede trasmitirse a
través de otros alimentos como la mayonesa y la sidra, manteniéndose hasta 55
días a 5°C (Tanaro et al, 2016). La enfermedad que causa esta bacteria puede
ser leve o severa y se presenta a los 1 a 8 días del ingreso de la bacteria, la
dosis requerida para enfermar parece ser del orden de 10 a 100 células por g ó
cc (Michanie, 2013).
2
Otra patología que afecta al 5 % de los infectados, es el Síndrome Urémico
Hemolítico (SUH), un tipo de insuficiencia renal que en el 4% de los casos
detectados ha ocasionado la muerte, mientras que aquellos que logran
recuperarse experimentan fallas renales, complicaciones neurológicas y otras
secuelas por mucho tiempo (Michanie, 2013). Bravo et al (2013), menciona que
este microorganismo forma parte de la flora intestinal del ganado bovino, siendo
éste su principal reservorio, encontrándose en mayor frecuencia en terneros que
en ganado adulto.
Estudio realizado por Michanie et al (2013), confirman que los alimentos
mayoritariamente involucrados en brotes de E. coli O157:H7 son: carne picada
insuficientemente cocida, jugo de manzana no pasteurizado (pH 3,5), yogur,
vegetales crudos (brotes de alfalfa), salame, lechuga, quesos, leche cruda y
otros, siendo las hamburguesas el alimento con mayor número de brotes
alimentarios registrados en Estados Unidos, debido a que la carne molida resulta
ser un buen vehículo cuando ésta no tiene la manipulación adecuada y se
ingiere sin tener un buen grado de cocción (65-75ºC).La población más
vulnerable a este patógeno es la población infantil y los adultos mayores, con
una tasa de letalidad de 5%-10%, cuando los pacientes desarrollan Síndrome
Urémico Hemolítico (Méndez et al, 2013).
El consumo de carne a nivel mundial es elevado siendo Argentina el país
latinoamericano más consumidor, y que además consta con la mayor incidencia
a nivel mundial del SUH, afectando a 17 de cada 100.000 niños(as) menores de
5 años (Reyes et al, 2013). En el Ecuador el consumo de carne per cápita es de
alrededor de 9 kg al año, siendo Manabí, Loja, Pichincha, Azuay, Chimborazo,
Tungurahua, Cotopaxi y Carchi las provincias que lideran la demanda de carne
en el país. (Pérez, 2015).
Debido al bajo consumo de este alimento, y lo costoso que resulta investigar
este microorganismo, los estudios relacionados a la presencia de E. coli
O157:H7 en carne es muy reducida, dada esta significancia el presente trabajo
tiene como finalidad aportar a la sociedad en general información sobre la
3
calidad microbiológica de la carne molida que se expende en el mercado
Caraguay de la Ciudad de Guayaquil, uno de los principales mercados del sur de
la ciudad.
4
EL PROBLEMA.
Justificación.
Actualmente en la ciudad de Guayaquil, no existen investigaciones sobre la
presencia del serotipo O157:H7 productora de la toxina Shiga perteneciente a
Escherichia coli en productos cárnicos, siendo una de las principales causas del
Síndrome Urémico Hemolítico. Es necesario investigar si este patógeno se
encuentra presente en la carne molida bovina que es consumida periódicamente
por los habitantes de esta ciudad, debido a que existe información de un índice
elevado de paciente con enfermedades renales en el Ecuador (14.107 pacientes
en el 2017), que bien podría ser por causa de este serotipo (MSP, 2018).
Formulación del problema.
¿La carne bovina molida expendida en el Mercado Caraguay de la ciudad de
Guayaquil es portadora de la cepa de E. coli O157:H7?
Objetivos.
Objetivo general.
Detectar la presencia de E. coli O157:H7 productora de la toxina shiga en
carne bovina molida comercializada en el mercado Caraguay de la ciudad de
Guayaquil.
Objetivos específicos.
1. Determinar presencia de los microorganismos en carne molida bovina
expendida en el mercado la Caraguay de la ciudad de Guayaquil
2. Determinar la presencia del serotipo E. coli O157:H7 productora de la
toxina shiga en carne bovina molida comercializada en el mercado
Caraguay de la ciudad de Guayaquil mediante el sistema BBL crystal
3. Evaluar las condiciones de almacenamiento y el área del proceso de la
carne molida expendida en el mercado Caraguay.
5
Hipótesis
En el mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil se expende carne bovina
molida contaminada en un 20% con la cepa E. coli O157:H7 productora de la
toxina Shiga.
Variable de estudio.
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de E. coli 0157:H7
Operacionalización de las variables.
.
Variable: UFC de E. coli 0157:H7
Conceptualización: Es un microrganismo de la familia Enterobacteriaceae que
se encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre
caliente
Indicador: Presencia
6
CAPÍTULO I.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1. Carne.
El Codex Alimentarius define la carne como “todas las partes de un animal
que han sido dictaminadas como inocuas y aptas para el consumo humano o se
destinan para este fin”. La carne se compone de agua, proteínas y aminoácidos,
minerales, grasas y ácidos grasos, vitaminas y otros componentes bioactivos, así
como pequeñas cantidades de carbohidratos (FAO, 2016).
La carne fresca por su contenido nutricional y su alto valor de actividad de
agua (Aw) está considerada dentro del grupo de los alimentos altamente
perecederos, al igual que la mayoría de los productos elaborados con ella; sin
embargo, de acuerdo a sus características particulares, el tipo de
microorganismos presentes puede variar. A pesar de que el músculo como tal,
es prácticamente estéril, los alimentos preparados con base en carne son muy
susceptibles a la contaminación y ofrecen las condiciones necesarias para el
crecimiento de microorganismos involucrados en daños y enfermedades de
origen alimentario. En este tipo de productos, sobre todo frescos o con procesos
defectuosos, los microorganismos se multiplican rápidamente, especialmente a
temperaturas por encima de la de refrigeración, resultando en pérdidas de
calidad y/o problemas de salud pública. (Romero y Álvarez, 2017).
La presencia de patógenos en la carne cruda es un problema imposible de
solucionar. Ninguno de los procedimientos disponibles actualmente puede
proporcionar una carne roja, cruda, libre de patógenos. A pesar de este riesgo, la
carne y las hamburguesas se suelen consumir crudas o mal cocidas. Esto ha
producido en los últimos años brotes de infección humana por E. coli O157:H7,
que podrían haberse evitado si la temperatura interna de cocción hubiera
alcanzado los 65ºC
7
I.1.1. Composición química de la carne.
Orozco (2013) menciona que la composición química de la carne, varía con la
especie animal y con la edad; en general se puede decir que cuanto más joven
sea el animal, el contenido de agua de la carne será mayor y menor su contenido
en grasa. En su composición general se dan los siguientes porcentajes: agua
80%, proteínas del 20-30% (miosina, actina, globinas, elastina, colágeno,
mioglobina, tropomiosina y troponinas), grasas del 5-30% (incluye colesterol y
vitaminas liposolubles), glúcidos, cuyo porcentaje oscila entre el 0,1-0,5 y por
último vitaminas y sales minerales.
I.1.2. Consumo.
La carne puede formar parte de una dieta equilibrada, aportando valiosos
nutrientes beneficiosos para la salud. En algunos países industrializados como
Estados Unidos su consumo per cápita es alto, a comparación a los países en
desarrollo que reportan un consumo inferior a 10 kg por persona. La ingesta
deficiente de carne trae consigo subnutrición y malnutrición principalmente en
niños y adultos mayores. Asimismo, se estima que en el mundo más de 2000
millones de personas sufren carencias de vitaminas y minerales fundamentales,
en particular vitamina A, yodo, hierro y zinc, elementos que se encuentran en la
carne (Romeu, 2012). En la tabla 1 puede destacarse los principales países
consumidores de carne en el mundo:
Tabla 1. Países mayor consumidores de carne a nivel mundial (Forbes, 2015).
No. País Consumo Per cápita de carne al año (Kg.)
1 Australia 93
2 Estados Unidos 91.1
3 Israel 86
4 Argentina 84.7
5 Uruguay 82.9
8
Los principales contaminantes de la carne son los agentes microbiológicos, ya
que además de provocar su degradación, ocasionan enfermedades a quienes la
consumen, pudiendo destacarse entre ellos los siguientes patógenos:
Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus,
Clostridium perfringens Clostridium botulinum, Escherichia coli O157:H7,
Campylobacter spp, Listeria spp (Romeu, 2012).
I.2.Escherichia coli.
Escherichia coli se describió por primera vez en 1885 por el pediatra alemán
Theodore Escherich. Fue nombrada inicialmente como “Bacterium coli
commune”, pero en 1919 fue renombrada con el nombre actual en honor a su
descubridor (Romeu, 2012).
Escherichia coli es una bacteria bacilo Gram-negativo, móvil, anaerobio
facultativo que forma parte de la flora intestinal tanto de animales como del ser
humano, considerados en su gran mayoría como organismos comensales
inofensivos (Rodríguez, 2012). Sin embargo, no todas las especies de E. coli son
iguales, siendo algunas de ellas patógenas, capaz de producir intoxicaciones
alimentarias, debido a la producción de toxinas (FAO, 2011).
Desde el punto de vista taxonómico su clasificación es la siguiente:
Phylum Proteobacteria.
Clase Gammaproteobacteria.
Orden Enterobacteriales.
Familia Enterobacteriaceae.
Género Escherichia.
Especie Escherichia coli (Romeu, 2012).
9
I.2.1. Características generales del grupo coli.
Actualmente existen 6 categorías principales de E. coli capaces de provocar
patologías: E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli enteropatogénica (ECEP), E.
coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli productora de toxina shiga (ECEH), E. coli con
adherencia difusa (ECAD), E. coli enteroagregativa (ECEA) (Esquivel et al,
2010). Este microorganismo fermentador de glucosa con producción de ácido y
gas, presenta entre sus cepas 3 tipos de antígenos: antígeno O: somático
(grupo); antígeno H: flagelar (tipo) y antígeno K: de superficie, asociado al grupo
(Fernández et al, 2003). En función de su serotipo, esta bacteria se clasifica en
dos grupos:
a) Cepas E. coli O157:H7. Este serotipo identificado por primera vez en
1982 es productor de toxinas Shiga capaz de causar enfermedades en
seres humanos (López et al, 2012). Esta bacteria enterohemorrágica no
fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce ß-glocuronidasa. Su
principal reservorio es el ganado bovino, seguido y con menos frecuencia
el ganado caprino, ovino, porcino y avícola, además de otros tipos de
alimentos como frutas y vegetales, mayonesa, jugos de naranja y
manzana no pasteurizados, sobreviviendo en estos últimos durante
varios días.
La transmisión de este microorganismo se debe al ingerir alimentos mal
cocidos sugiriendo estudios como vector de importancia a la mosca
doméstica. Su tratamiento con agentes antimicrobianos es un tema de
controversia, debido a que se han registrado casos en los que ha
originado síndrome urémico hemolítico (López et al, 2012).
b) Cepas no-O157:H7. En la actualidad existe más de 130 serotipos
distribuidos en las distintas categorías de E. coli como muestra la tabla 3,
capaz de superar las frecuencias de aislamientos de la O157:H7. Diarrea
acuosa con dolor abdominal y colitis hemorrágica son algunos de los
síntomas que produce estas cepas. Su reservorio son los mismos
alimentos en los que se encuentra el serotipo O157:H7 incluyendo
además pescado y mariscos (Rodríguez, 2012).
10
Tabla 2. Características de los grupos de Escherichia coli causantes de diarrea (Rodríguez, 2002).
Grupo Síntomas clínicos Epidemiología Factores de
patogenicidad
ECET Diarrea aguda acuosa Niños menores de dos años y diarrea
del viajero
ST y LT, CFA
ECEH SUH, diarrea sangre,
dolor abdominal, fiebre, vómito
Niños y adultos que la adquieren por comer
carne cruda o mal cocida
STX, A/E,
Intimina,
ECEI
Diarrea con moco y sangre o diarrea acuosa,
también se presenta cuadro disentérico
Niños menores de seis meses
Invasividad Plásmido de 140MDa
ECEP Diarrea aguda,
dolor abdominal, vómito, fiebre baja
Niños menores de seis meses hasta dos
años
A/E, BFP Plásmido EAF de 50-
70MDa
ECEA
Diarrea líquida, verde con moco, sin sangre,
diarrea persistente hasta 20 días
Recién nacidos y niños menores de
dos años
Fimbria AAFI y II EASTI
Proteínas Pet y Pic OMP
Plásmido de 60 MDa Citotoxina
ECAD Diarrea acuosa sin
sangre Niños de 1 a 5 años
Fimbria F1845 OMP
LT= toxina termolábil EAF= factor de adherencia de EPEC ST= toxina termo estable OMP= proteína de membrana exteARN
CFA= factor de colonización antigénico STX= toxina shiga BFP= pili con forma rizada EAST= toxina ST de cepas enteroagresivas
I.2.2. Signos clínicos.
La infección en humanos por E. coli O157:H7 puede ser desde asintomática
(raramente) hasta capaz de desarrollar diarrea aguda acompañada con sangre,
calambres abdominales severos, y/o síndrome urémico hemolítico. En algunos
casos el infectado se recupera rápidamente en una semana, mientras que en
otros su cuadro clínico evoluciona desfavorablemente a colitis hemorrágica en
cuestión de días. Vale mencionar que si la colitis no es tratada a tiempo puede
provocar en el paciente necrosis intestinal, perforación o el desarrollo de
estenosis en el colon (Sotelo, 2014).
Es posible observar la presencia de náuseas, vómitos, deshidratación y fiebre
en el paciente, aunque esta última generalmente está ausente, por lo que es
muy común que los médicos emitan un diagnóstico de que la enfermedad tratada
11
responde a etiologías no infecciosas (Departamento de Salud de la Florida,
2017). Existe un tipo de insuficiencia renal llamada síndrome urémico hemolítico
(SUH) la cual suele comenzar a medida que la diarrea está mejorando.
Aproximadamente el 2-7% de las infecciones por E. coli O157: H7, desarrollan
SUH
Este síndrome se caracteriza porque produce insuficiencia renal,
trombocitopenia y anemia hemolítica (Eymann et al, 2016). Se encuentra
presente en el 16% de los pacientes que experimentan colitis hemorrágica,
siendo los niños (menores de 5 años), ancianos y personas inmunodeprimidas
quienes son más propensos a padecerla (Sotelo, 2014).
No siempre estos tres síntomas son indicadores de SUH, debido a que
existen pacientes con SUH que presentan anemia hemolítica y/o trombocitopenia
con poca o ninguna enfermedad renal, mientras que otros no desarrollan
trombocitopenia y/o anemia, pero presentan insuficiencia renal aguda. Otros
síntomas de tipo extra intestinal también han sido reportados, tales como:
accidentes cerebro vasculares, edema cerebral, convulsiones, derrame pleural,
sobrecarga de líquidos y síndrome disneico en adultos (Sotelo, 2014).
La púrpura trombocitopenia trombótica (TTP) es otra consecuencia potencial
de la infección con un organismo productor de toxina Shiga. Es común en
individuos adultos (especialmente ancianos) y aunque sus síntomas son
similares al SUH, se diferencia de ésta en el grado relativo de insuficiencia renal,
ya que es menos probable que causen daño renal, pero afecta con mayor
intensidad al SNC (accidente cerebro vascular, convulsiones, coma) resultando
en muchos casos mortal para el individuo. Por su parte se denomina SUH al
trastorno infantil que típicamente implica insuficiencia renal, de los cuales el 85%
de los niños se recupera sin daños permanentes; sin embargo, si el paciente no
es tratado a tiempo se pueden producir complicaciones renales crónicas que
abarcan desde hipertensión, insuficiencia renal crónica hasta insuficiencia renal
en etapa terminal (Martínez, 2015).
12
Tabla 3. Serotipos y serogrupos más comunes de E. coli no O157:H7
(Rodríguez, 2002)
ECET ECEI ECEP ECEA ECEH
O6:H- 28ac:H- O18 O3:H2 O1:MN O23:H7 O85:H10 O117:H7
O6:H16 O29:H- O26:H- O15:H18 O1:H1 O23:H16 O85:H23 O117:H7:K1
O8:H- O112ac:H- O26:H11 O44:H18 O1:H2 O25:H- O86:H10 O117:H14
O11:H27 O124:H- O55:H- O77:H18 O1:H20 O25:H11 O88:H- O117:H19
O15:H11 O124:H7 O55:H6 O86:H- O1:HNT O26:H- O91:H- O118:H16
O20:H- O124:H30 O55:H7 O111:H21 O2:H1 O26:H2 O91:H10 O118:H30
O25:H- O135:H- O86:H- O127:H2 O2:H2:K1 O26:H8 O91:H14 O119:H-
O27:H- O143:H- O86:H34 ONT:H10 O2:H6 O26:H11 O91:H21 O119:H5
O27:H7 O144:H- O111:H- O2:H7 O26:H21 O98:H- O120:H19
O27:H20 O152:H- O111ab:H2 O2:H27 O26:H32 O98:H- O121:H-
O80 O167:H5 O119:H6 O4:H40 O27:H- O98:H8 O121:H8
O85:H7 O125ac:H21 O5:H- O39:H4 103:H- O126:H-
O114:H21 O126:H- O5:H16 O39:H8 O103:H2 O126:H2
O115:H21 O126:H2 O6:H- O45:H- O103:H4 O126:H8
O126:H9 O126:H27 O6:H1 O45:H2 O103:H6 O126:H21
O128ac:H
27
O127:H21 O6:H29 O45:H7 O103:H25 O126:H27
O139 O128ab:H2 O8:H- O50:H- O104:H7 O128:H12
O148:H28 O128:H12 O8:H14 O55:H- O109:H2 O137:H41
O149:H4 O142:H6 O8:H21 O55:H6 O110:H- O141:H-
O149:H10 O158:H23 O9ab:H- O55:H7 O110:H19 O144:H-
O153:H45 O11:H49 O55:H10 O111ab:H- O145:H-
O159:H- O14:H- O55:H- O111:H2 O145:H16
O159:H4 O15:H- O60:H- O111:H7 O145:H25
- ECET = E. coli enterotoxigénica,
- ECEP = E. coli enteropatogénica,
- ECEI = E. coli enteroinvasiva
- ECEH = E. coli productora de toxina
shiga,
- ECEA = E. coli enteroagregativa
13
I.2.3. Período de incubación.
La incubación puede variar entre doce y sesenta horas (López & Guevara,
2004). La transmisión de animales a humanos puede darse durante visitas a los
parques, zoológicos y las granjas (Martínez, 2015), mientras que entre humanos
ocurre frecuentemente en el hogar, centros de atención infantil y asilos a través
del consumo de alimentos contaminados (Washington State Department of
Health, 2009).
I.2.4. Duración de la enfermedad.
La enfermedad suele durar entre 5 a 10 días después del periodo de
incubación y se trata únicamente cuando los síntomas que presenta el paciente
son: diarrea de intensidad variable, fiebre leve o ausente y calambres
abdominales. Cuando el paciente desarrolla SUH o PTT su tiempo de duración
es de 1 a 2 semanas, pero puede prolongarse en casos más severos
(Departamento de Salud de la Florida, 2017). El 8% de las personas que
padecen el SUH presentan un funcionamiento renal anormal después de
algunos años, con complicaciones de por vida, tales como: presión alta, ataques
o parálisis con resultados mortales en algunos casos (ANMAT, 2017).
I.2.5. La toxina Shiga.
Escherichia coli O157:H7 es capaz de producir toxinas shiga como las Stx1 y
la Stx2. Los genes de ambas toxinas se encuentran localizados en la secuencia
de bacteriófagos atemperados, y aunque son estructural y funcionalmente
similares (Stx1) a las producidas por la Shigella dysenteriae tipo I, su homología
aminoacídica (Stx2) con este patógeno es del 58%. Las toxinas Shiga son un
tipo de Holo toxinas de tipo AB5, formada por seis subunidades proteicas; una
de tipo A y cinco de tipo B. La subunidad A (32 kDa) está encargada de la parte
catalítica de la toxina, mientras la subunidad B es el responsable de la unión con
las células eucariotas mediante la interacción con su receptor de membrana
específico: la globotriaosilceramida > Gb3 < (Martínez, 2015).
14
La conformación espacial y la tasa de disociación entre la toxina y los
glicolípidos es diferente entre las dos shiga toxinas (Martínez, 2015). Según
Vivanco la Stx2 es 1000 veces más tóxica que la Stx1, capaz de producir mayor
mortalidad y daño hepático a dosis menores que la provocada por la Stx1 (2011)
(Ilustración 1).
Ilustración 1.Daño renal provocado por las toxinas Stx1 y Stx2 administradas a la
misma dosis en primates no humanos (Martínez, 2015).
En la actualidad existen 3 subtipos de Stx1 (Sxt1a, Stx1c y Stx1d) las cuales
tienen una similitud genética del 96%. La Stx2 posee 7 subtipos: Stx2a, Stx2b,
Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f y Stx2g, con un 84% de homología en su genoma, a
excepción del clúster Stx2a, Stx2c y Stx2d que son muy idénticas. Vale
mencionar que cada subtipo dependiendo si hay 1 o más nucleótidos de
diferencia en su secuencia pueden tener una o varias variantes; tal es el caso de
la Stx2 cuyas variantes son Stx2a-O113-CL-3 y Stx2a-O157-A397. La
importancia de los subtipos es que ha permitido asociarlos con las enfermedades
que produce esta bacteria, como, por ejemplo, los subtipos Stx2a y Stx2c están
asociados al SUH, mientras que aquellos que producen efectos más leves están
relacionados con Stx1a y Stx2g (Martínez, 2015).
15
Si un individuo ingiere alimentos contaminados, la toxina shiga de este
patógeno entra en contacto con las células endoteliales, actuando sobre los
glóbulos blancos de la submucosa, generando una respuesta inflamatoria y un
aumento de la expresión del receptor (Gb3). Una vez que la subunidad B se
encuentra unido al receptor de membrana, la subunidad A de la Stx se incorpora
a la célula por pinocitosis, en donde se reducirá a un fragmento denominado A1
(Vivanco, 2011).
La subunidad A altera la función de los ribosomas al cortar una fracción de
purina de ARNr 28S, inhibiendo irreversiblemente la síntesis proteica causando
la muerte celular (Vivanco, 2011). Por un mecanismo aún no completamente
esclarecido, la toxina podría alcanzar la circulación sistémica y junto a otros
factores tanto bacterianos como del huésped, producir daño vascular en sitios
del endotelio ricos en receptores específicos para la Stx (Fernández et al, 2011).
Ilustración 2. Mecanismo de ingreso y acción de las toxinas Stx (Martínez, 2015).
I.2.6. Locus LEE.
Los genes que comprenden el LEE (Locus of Enterocyte Effacemente) de E.
coli son utilizados por algunas cepas para para llevar a cabo un mecanismo de
destrucción de los eritrocitos llamado “attaching and effacing” o adhesión y
borrado de los enterocitos, provocando cambios en su citoesqueleto y la
16
posterior eliminación de las microvellosidades intestinales una vez que la
bacteria haya acumulado la actina polimerizada en el polo apical. Estos locus
están conformados por 5 operones, de las cuales el LEE1, LEE2 y LEE3
codifican para un sistema de secreción de tipo III “SST3” (Cabañas, 2014).
LEEse divide en tres partes: el sistema transportador de proteínas efectoras, las
proteínas que llevan a cabo las funciones de adhesión y las proteínas efectoras
(Martínez, 2015).
El sistema SST3 es el encargado de trasportar las proteínas efectoras hacia
la célula diana. Este sistema formado por 20 genes no es único de ECEH, sino
de otras bacterias gram negativas como Hafnia Alvei y Citrobacter rodentium que
también lo utilizan para infectar a humanos, animales y plantas. El SST3 posee
una serie de chaperonas que le permiten a las proteínas efectoras ser más
eficientes, es decir, mejora el reconocimiento y estabilidad hacia el sustrato
(Martínez, 2015).
La proteína encargada de la unión patógeno-enterocito es la Intimina
(codificada por el gen cromosomal eae, presente en el locus LEE). Esta proteína
de membrana requiere la presencia de su receptor Tir o “translocated intimin
receptor” (transcrito y secretado por el SST3) para que se produzca la unión,
proliferación de la actina y formación del pedestal en la célula eucariota,
produciendo lesiones sobre los enterocitos. Dada la importancia que tiene el gen
eae en el desarrollo de la infección, la CDC recomienda que, al momento de
emitir un informe de casos de infección por ECEH, se proceda además de la
detección de las toxinas shiga, la presencia del gen eae (Martínez, 2015).
Además del Tir existen otras proteínas efectoras secretadas por el sistema de
secreción tipo III (SST3) teniendo cada una de ellas funciones distintas (tabla 4).
17
Tabla 4. Proteínas efectoras sintetizadas por el sistema de secreción tipo III (Martínez, 2015).
Proteína efectora Función
Map, EspF Disrumpe las uniones entre enterocitos y altera el
potencial de membrana de la mitocondria.
EspB, EspH Modula el citoesqueleto, reduciendo el número de
fibras de estrés.
EspG Destruye los microtubulos por debajo del lugar de
unión de la bacteria.
EspZ Regula la acción de proteínas efectoras.
I.2.7. Otros factores de virulencia de ECEH.
Además de los factores de virulencia antes descritos, existen otros factores
que utilizan estas bacterias para afectar al humano, los cuales pueden
encontrarse codificados en el genoma bacteriano, o a su vez en elementos
genéticos móviles de determinados serotipos. Estos factores se pueden dividir
en 6 grupos: proteasas, toxinas, fimbrias, factores necrotizantes, adhesinas no
fimbriales y proteínas efectoras (Martínez, 2015).
Fimbrias: Existen diferentes tipos de fimbrias en E. coli las cuales ayudan
a colonizar la célula enteritica. Dentro de las ECEH podemos encontrar
de seis tipos: fimbrias F9, fimbrias largas polares(LpF), pili de ECEH
(HCP), pili común (ECP), fimbrias de E. coli de unión a laminita (ELF) y
las fimbrias que fermentan el sorbitol codificadas en un plásmido.
Toxinas: La enterohemolisina (HylA) es una toxina producida por las
cepas SETC, que actúa lisando los grupos hemos de las células
eucariotas. Estas bacterias son además capaces de producir la Cytolethal
disting toxin (Cdt), la toxina enteroagregativa termoestable (EAST1) y la
citotoxina subtilasa (SubAB), esta última produce estrés en el retículo
endoplasmatico, dando lugar a la muerte celular.
Factores necrotizantes: Existen tres tipos de factores necrotizante: CNF1,
CNF2 y CNF3, esta última considerada la más patógena en humanos
18
Proteasas: Se han descritos distintos tipos de proteasas, tales como: la
catalasa/peroxidasa (KatP), la metaloproteasa (StcE) o la serin proteasa
(EspP), esta última promueve la hemorragia, ya que inhibe el factor de
coagulación V.
Adhesinas no fimbrilares: dentro de las adhesinas no fimbriales se
encuentran: el factor inhibidor del ciclo celular (Cif), proteína capaz de
bloquear el ciclo celular, induciendo la formación de fibras de estrés para
una adhesión focal.
Proteínas efectoras: Estas proteínas son secretadas por el SST3, las
mismas que están resumidas en la siguiente tabla (Martínez, 2015).
Tabla 5. Proteínas efectoras vía sistema de secreción tipo III no LEE (Martínez, 2015).
Proteína Función
EspJ Inhibir la fagocitosis por macrófagos.
EspK Mejorar la colonización intestinal.
EspM
Inducir la formación de fibras de estrés tras la infección de las
células huésped y alterar la arquitectura de la monocapa
epitelial.
NleA Inhibir la secreción proteica de la célula.
NleB1
NleB2 Suprimir el sistema inmune bloqueando la vía NF-kB.
NleC,
NleD
Suprimir el sistema inmune y la respuesta inflamatoria
bloqueando las vías NF-kB y JNK.
NleE Inhibir la respuesta inmune vía NF-kB.
NleF Facilitar la colonización intestinal.
I.2.8. Movilidad de factores de virulencia en ECEH.
Los elementos genéticos móviles son segmentos de ADN que pueden
movilizarse dentro de la célula (genoma bacteriano) o a su vez con otras células
(movilidad intercelular). En las cepas SETC se destacan 4 tipos de elementos
19
genéticos móviles, como son: plásmidos, transposones, islas de patogenicidad y
bacteriófagos (Martínez, 2015).
Plásmidos: Los plásmidos son moléculas de ADN circular,
extracromosómico, de distintos tamaños, capaces de multiplicarse dentro
de la bacteria y pasar genéticamente a toda bacteria hija que resulta
durante la división celular. Se replican de forma independiente al
cromosoma bacteriano y los genes que produce se transfirieren por
conjugación entre bacterias. Son los plásmidos quienes le confieren a las
bacterias resistencia a los antibióticos y metales pesados (Santos, 2017).
Islas de patogenicidad (PAI): Es en esta región en donde se codifican los
principales factores de virulencia. Existen muchas PAI, alguna de ellas
móviles, pero la más sobresaliente a efecto de estudio es LEE, esto
debido a que participa en las lesiones A/E.
Transposones: Son fragmentos de ADN que pueden moverse e
integrarse en diferentes regiones del cromosoma o saltar de un genoma a
otro (Martínez, 2015).
Bacteriófagos: Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan y lisan
bacterias de manera especie específica, consisten fundamentalmente de
material genético y proteínas. La estructura de los fagos, es determinada
por sus proteínas de envoltura cuya función principal es la de proteger al
material genético fágico. Estas proteínas pueden además proveer al fago
de: cuello, cola, fibras caudales, laminas básales y/o espículas. Los fagos
como todos los virus son parásitos obligados intracelulares, es decir
necesitan estar dentro de una bacteria para poder replicarse y en este
sentido, los fagos han desarrollado dos ciclos replicativos los cuales son
ciclo lítico o ciclo lisogénico (Segundo et al, 2010).
I.2.9. Ciclos replicativos de los fagos
Dependiendo del resultado de la infección de la célula huésped, los fagos
pueden presentar dos ciclos diferentes: ciclo lítico o ciclo lisogénico. El primer
ciclo lo llevan a cabo los fagos virulentos, en donde estos viriones se adhieren a
20
los receptores de membrana bacteriana, para penetrar su ácido nucleico al
interior de la célula, provocando el desarrollo intracelular de sus componentes
fágicos y la liberación de la progenie viral (Martínez, 2015).
El ciclo lisogénico lo realizan los fagos atemperados, el mismo que
comprende los mismos pasos que el lítico, solamente que después de la
penetración, el ácido nucleico del fago se inserta en el cromosoma bacteriano y
se replica como si fuera un gen más de la bacteria (Martínez, 2015). Este ciclo
está comprendido de 5 etapas los cuales son:
Absorción: Los bacteriófagos se fijan a la superficie celular de manera
específica, para lo cual, utilizan las fibras de la cola o alguna estructura
análoga para unirse a los receptores membranales de las bacterias. Cada
tipo de bacteriófago se une a unos receptores específicos, los cuales
pueden ser lipopolisacáridos, ácidos teicoicos, flagelos o el pili.
Penetración: Es el proceso en el que el virus hace penetrar su material
genético en la célula en cuestión. Aquí, el fago para perforar la pared
bacteriana y liberar su ADN en el interior de la bacteria, utiliza una
lisozima que se encuentra en su cola. Una vez insertado el material
genético, el ADN se circulariza a través de los extremos cohesivos,
utilizando las ligasas del huésped, para ser menos accesible a las
exonucleasas bacterianas. Además, el ADN posee bases modificadas
para evitar la degradación por las endonucleasas bacterianas.
Síntesis de los ácidos nucleicos y las proteínas virales: El fago dentro de
la célula bacteriana sintetiza ARN, el cual será utilizado para la formación
de proteínas víricas y enzimas que ayudarán a la destrucción del ADN
bacteriano. Durante la síntesis, el ADN puede ser modificado para evitar
ser degradado por las endonucleasas bacterianas en el proceso de
replicación, como sucede en el caso de los fagos T4 que sintetizan un
análogo a la cisteína glicosilada.
Ensamblaje de las partículas fágicas: Se da lugar el empaquetamiento de
los ácidos, en donde el ADN es trasladado al interior de la cápside de los
bacteriófagos, formándose lo que se denomina como cabeza madura.
21
Liberación de las partículas fágicas: Se produce la lisis y muerte celular,
en esta etapa los bacteriófagos utilizan diversas enzimas como las
lisozimas o lisinas para producir la ruptura de la membrana celular, de
modo que se liberan los nuevos viriones (Martínez, 2015).
.
Después de la infección, los fagos atemperados pueden entrar tanto en el
ciclo lítico como en la lisogenia. Esta capacidad de decidir, viene dada por la
presencia de proteínas reguladoras implicadas en el proceso. Hay varias
proteínas reguladoras, pero son dos las más importantes: el represor Cl
(promueve la lisogenia) y la proteína Cro (promueve el ciclo lítico). Si en los
fagos prevalece la proteína Cro, se bloquea la producción de Cl y comienza el
ciclo lítico, mientras que, si prevalece el represor, el Cro se inhibe iniciándose el
ciclo lisogénico. Sea cual sea el caso, las dos proteínas procuran fijarse en
primer lugar a los promotores Or y Ol de la célula en cuestión, para anular la
transcripción de la otra proteína, dando como resultado la producción o no de
proteínas víricas (Martínez, 2015).
Ilustración 3. Ciclo de los bacteriófagos (Segundo et al, 2010).
22
I.2.10. Inducción del ciclo lítico.
La inducción del ciclo lítico puede darse dependiendo de las condiciones tanto
ambientales como intracelulares en la que se encuentre la célula diana. La vía
más frecuente está relacionada con factores que estimulan en el microorganismo
mecanismos de defensa capaz de promover la supervivencia celular en
condiciones de daño del ADN (Martínez, 2015).
La proteína RecA forma parte fundamental de esta vía, debido a que está
encargada de la recombinación homóloga, por lo tanto, cuando se encuentra
activa, ejerce la función de proteasa y cataliza la degradación del Cl cortando el
vínculo alanina-glicina de esta, generando que los niveles de Cro aumenten
proporcionalmente a medida que disminuye la presencia de Cl, dando inicio de
esta manera el ciclo lítico (Martínez, 2015). Estos factores son:
Los antibióticos: Los betalactámicos y las quinolonas, (ciprofloxacina, o el
trimethoprim) son algunos de los antibióticos que inducen las respuestas
SOS en las bacterias. La mitomicina C es otro medicamento que, aunque
no es antibiótico también generan dichas respuestas, ya que aplicado en
altas concentraciones puede inducir la formación de fagos.
Inductores eucariotas: Hormonas como la norepinefrina y componentes
celulares como los neutrófilos, provocan la activación del ciclo lítico
cuando estos producen daño al ADN.
Luz ultravioleta: Se ha observado que al intentar reducir o inactivar la
población bacteriana usando luz UV o altas presiones hidrostáticas se
produce un aumento del número de fagos (Martínez, 2015).
I.2.11. Bacteriófagos Stx.
Las dos subunidades de la Stx en E. coli, son codificadas por bacteriófagos.
Estos fagos son atemperados y su estructura genética es de tipo lamboide. Su
estructura incluye genes tempranos, tardíos y muy tardíos. Los genes stx se
encuentran ubicados en la región de genes tardíos, entre los promotores de lisis
23
y los genes de lisis. Cuando el profago Stx induce su ciclo lítico, comienza la
transcripción de las proteínas de lisis y durante este proceso se produce la
expresión de los genes Stx, aumentando los niveles de toxina en el medio
intracelular (Martínez, 2015).
La lisis de la célula causada por los fagos libera la toxina al medio
extracelular. Dado que la toxina shiga está directamente relacionada en el
desarrollo del SUH, el uso de antimicrobianos puede incrementar su riesgo de
padecerlo y esto se debe en gran parte al consumo de ciertos antibióticos, los
cuales provocan un aumento de la densidad poblacional de los fagos. Los fagos
Stx presentan mosaicismo genético, derivado de fenómenos de recombinación
con otros miembros de la familia o fagos que pueden coexistir en el cromosoma
bacteriano. Los tamaños de estos virus varían entre 42.6 kb y 66.4 kb y suelen
tener tres tipos de morfologías: Podoviridae, Siphoviridae, y en menor medida
Myoviridae (Martínez, 2015).
Los fagos Stx pueden unirse a diferentes receptores membranales, proceso
que es necesario para producir la infección en la célula bacteriana. Estos
receptores membranales son: FadL, LamB y BamA (también llamado YaeT, en
E. coli) este último un complejo de diferentes lipoproteinas muy utilizados por los
fagos Stx de cola corta (Podoviridae). Los fagos de tipo lamboide suelen
codificar genes que transcriben proteínas útiles para los bacteriófagos que se
encuentran en el estado de profago. Estos genes también conocidos como
genes moron o genes de accesorios, no contribuyen a las funciones líticas o
lisogénicas, pero contribuyen a la virulencia de la bacteria. (Martínez, 2015).
I.2.12. Bacteriófagos Stx en el medio ambiente.
Cuando se induce el ciclo lítico en fagos Stx se contribuye a la liberación de
las partículas víricas al medio ambiente. La presencia de fagos Stx en el
ambiente, puede favorecer la aparición de nuevas cepas ECEH. Tanto así, que
se han logrado detectar hasta 104 copias genéticas/mililitro (CG/ml), de fagos Stx
libres en agua residual. En procesos como la cloración o la radiación UV, se ha
24
observado que, comparando la reducción de densidad poblacional en unidades
logarítmicas entre fagos Stx y cepas ECEH, las cepas ECEH disminuyen más
rápido su densidad poblacional e incluso hasta no detectarlos, a diferencia de los
fagos Stx que reducen lentamente su carga poblacional (Martínez, 2015).
I.3. Tratamiento.
Mattar et al (2011), mencionan que no existe un tratamiento específico para la
infección por E. coli O157:H7, sino terapia de soporte y manejo de
complicaciones para la anemia y la insuficiencia renal aguda (diálisis). El uso de
antibióticos para el tratamiento de infección por Escherichia coli O157:H7 puede
ser nocivo, porque el rompimiento de las bacterias por algunos antibióticos
puede incrementar la liberación de toxinas, además, de que mata la microbiota
nativa intestinal incrementándose la absorción sistémica de las toxinas.
I.4. Prevención.
Las principales medidas de prevención para reducir la transmisión e infección
por E. coli O157:H7 son:
Asegurar prácticas de higiene y refrigeración durante el faenamiento
del ganado.
Aplicar controles en los puntos críticos de la elaboración de
alimentos.
Asegurar una correcta y homogénea cocción de la carne. La bacteria
se destruye a los 70oC.
Tener especial cuidado con la cocción de la carne picada, ya que
generalmente se cocina bien la parte superficial, pero no en el
interior, permaneciendo la bacteria viable.
Asegurar la correcta higiene de las manos y utensilios de cocina.
Deben lavarse siempre con agua y jabón antes y durante la
preparación de los alimentos y después de manipular carne cruda.
25
Lavar las manos con agua y jabón luego del contacto con mascotas o
después de ir al baño.
Evitar el consumo de alimentos en lugares con animales que pueden
ser portadores (Antman et al, 2014).
I.5. Epidemiología.
La notificación de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron un
aumento exponencial a partir de su primera descripción en 1982. Este
comportamiento de patógeno emergente refleja, tanto un aumento real en el
número de infecciones, como así también una mejora en los sistemas de
vigilancia de las enfermedades asociadas y de los métodos de detección. Su
emergencia generó una gran preocupación a nivel mundial por el número de
personas afectadas y por los distintos vehículos de transmisión identificados
(carnes, vegetales, alimentos ácidos, aguas de consumo y recreación, etc.), lo
que llevó a la OMS a promover estrategias de prevención y control (Celso, 2014)
En Asia hay pocos reportes de infecciones por ECEH O157, salvo en Japón a
partir del brote masivo con más de 10.000 afectados en 1996, posiblemente por
falta de sistemas de vigilancia. En Australia las infecciones por ECEH no-O157,
fundamentalmente O111: NM, son más frecuentes que las de O157. Respecto a
Latinoamérica, en Colombia se comunicó en forma preliminar que E. coli
O157:H7 fue el agente causal del 7,2% de los casos de diarrea y que el 6,5% del
ganado era portador de este patógeno. En Chile y Argentina, ECEH O157 y no-
O157 está asociado a casos de diarrea y SUH. Durante el año 2002, se informó
el primer caso que vincula a E. coli O157:H7 con episodios de diarrea
sanguinolenta o SUH en Uruguay. En Paraguay a partir del año 2001 se
comenzaron a notificar casos de diarrea asociados a E. coli O157:H7, después
de la implementación de un programa regional de control de las enfermedades
emergentes y reemergentes. Estos hallazgos demuestran la importancia de las
enfermedades asociadas a ECEH en la Latinoamérica. (Rivas et al, 2008).
26
Los países en los cuales hay mayor incidencia de infecciones por ECEH,
sobretodo O157:H7, son Nueva Zelanda, Argentina y EE.UU. Se cree que es
debido a los hábitos alimenticios, tales como el consumo de cantidades
abundantes de carne (Argentina) o el abuso de la comida “fast-food” (EEUU). Sin
embargo, en los últimos años están proliferando las infecciones asociadas al
consumo de vegetales (tabla 7). Casos como los sucedidos en Suecia en 2005 y
Canadá en 2006 se debieron a que las hortalizas (lechugas y espinacas) fueron
irrigadas con agua de un arroyo cercano contaminado con heces de ganado
provocando un brote alimenticio dando como resultado cinco muertos y 205
enfermos (FDA, 2017).
27
Tabla 6. Brotes asociados con Escherichia coli O157:H7 por el consumo de
alimentos contaminados en Estados Unidos (FDA, 2017).
SHU= Síndrome Urémico Hemolítico
Año Número
de Estados
Tipo de alimento
Personas infectadas
Personas muertas
Personas que desarrollaron
SHU
2009
8 Carne molida
de res 26 2 5
30 Galletas
preenvasadas 72 0 10
9 Carne de res 23 0 2
2010
5 Queso 38 0 1
16 Carne de res 21 0 1
2011
9 Lechuga 58 0 3
4 Bolonia 14 0 0
3 Avellanas 8 0 0
2012 5
Verduras de hoja pre
empaquetadas
33 0 2
2013 4 Ensalada
fresca picada 33 0 2
2014 4 Carne molida
de res 12 0 0
2016
2 Alfalfa 11 0 0
5
Carne de vaca, ternera
y productos de bisonte
11 0 1
2017 12 Mantequilla 32 0 9
28
I.6. Sistema BBL Crystal de Identificación.
El sistema de identificación BBL Crystal (ID) de bacterias entéricas/no
fermentadoras (E/NF) sirve para la identificación de bacterias aerobias Gram-
negativas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae así como también de
los bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores de glucosa
aislados con más frecuencia (BD, 2016).
Los análisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF ID están basados en la
utilización y degradación de sustratos específicos por parte de los
microorganismos detectados por distintos sistemas indicadores. Las reacciones
de fermentación detectan la capacidad de un aislado para metabolizar los
carbohidratos en ausencia de oxígeno atmosférico, y las reacciones de oxidación
están basadas en la capacidad de un organismo para metabolizar el sustrato
siendo el oxígeno el aceptor final de electrones. Ambas reacciones se detectan
normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el sustrato del análisis.
Los sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen cambios de color que
pueden ser detectados visualmente (BD, 2016).
I.7. Características del método.
I.7.1. Reproducibilidad.
La reproducibilidad de las reacciones con sustrato individual oscila del 96,3 a
100%. La reproducibilidad total de un panel BBL Crystal E/NF es del 99,6% (BD,
2016).
I.7.2. Precisión de la identificación.
El rendimiento del sistema de identificación BBL Crystal E/NF ID fue
comparado con sistemas disponibles actualmente en el comercio utilizando 299
aislados clínicos y cultivos madre. De los 299 aislados clínicos frescos
29
analizados por los métodos actuales de identificación de los laboratorios, el
sistema BBL Crystal ID comunicó correctamente el 96,7% (289), entre ellos 16
casos donde se comunicaron dos o tres organismos y se necesitó un análisis
suplementario para conseguir un resultado válido (BD, 2016).
I.7.3. Limitaciones del método.
Los sistemas de identificación BBL Crystal utilizan un microambiente
modificado; por lo tanto, los valores esperados para sus análisis individuales
pueden diferir de la información establecida previamente con las reacciones de
análisis convencionales. La precisión del sistema de identificación BBL Crystal
E/NF está basada en el uso estadístico de análisis diseñados especialmente y
en una base de datos exclusiva. (BD, 2016).
Solamente deben utilizarse las torundas con aplicador de punta de algodón
para preparar la suspensión de inóculo, ya que algunas torundas de poliéster
pueden hacer que el fluido de inóculo se vuelva espeso. Esto puede producir
una cantidad insuficiente de inóculo para llenar los pocillos. Una vez que se han
sacado las tapas de las bolsas selladas, deben utilizarse en el plazo de 1 hora
para asegurar un rendimiento adecuado. La cubierta de plástico debe
permanecer sobre la tapa hasta que se use (BD, 2016).
El incubador donde están colocados los paneles debe estar humectado para
prevenir la evaporación del líquido de los pocillos durante la incubación. El nivel
recomendado de humedad es el 40 – 60%. Los paneles, después de la
inoculación, deben solamente incubarse mirando hacia abajo (las ventanas más
grandes hacia arriba; la etiqueta mirando hacia abajo) para maximizar la
efectividad de los sustratos. Las colonias deben tomarse de una placa de agar
sangre, tal como agar de soja Trypticase con hematíes de oveja al 5%. El uso de
una placa agar MacConkey es también aceptable. Los sistemas de identificación
BBL Crystal NO están indicados para utilizarlos directamente con las muestras
clínicas (BD, 2016).
30
I.8. Mercado Caraguay.
En el año 2000 se construyó uno de los mercados con mayor concurrencia
del país, el mercado Caraguay. El nombre Caraguay resultó de tomar las
primeras sílabas de la frase ‘Caravana Radial de Guayaquil’. Está ubicado en el
barrio Cuba de la ciudad de Guayaquil, a orillas del estuario de la Ría Guayas,
tiene 62 puestos de venta mayoristas de mariscos, con una venta diaria de más
de 30 toneladas de pescado y mariscos, mercadería que es traída por camiones
desde las diferentes playas del país. Tiene dos ambientes: el primero tiene 720
puestos para 1.200 comerciantes minoristas que laboran desde las seis de la
mañana hasta las cuatro de la tarde, el segundo de 90 puestos de 180
mayoristas que trabajan desde las ocho de la noche hasta las seis de la mañana
(Quiroz, 2015).
Ilustración 4. Vista aérea del Mercado Caraguay (Google Earth, 2018).
31
Glosario
Intimina: Es una proteína, llamada adhesina, que se ancla en la membrana
externa de la bacteria. La bacteria se une primeramente a una célula intestinal
blanco "arponeando" y encajando su receptor, llamado receptor translocador de
intimina (Ecured, 2006).
Pinocitosis: Es un tipo de endocitosis que consiste en la captación de material
del espacio extracelular por invaginación de la membrana citoplasmática. Con
desprendimiento hacia el interior celular de una vesícula que contiene líquido
con posibles moléculas disueltas o partículas sólidas en suspensión (Doctissimo,
2017).
Toxina: Toda sustancia tóxica de origen biológico que provoca una intoxicación
en un organismo. Generalmente, se refiere a aquellas sustancias procedentes de
microorganismos que desencadenan una respuesta inmunitaria (Doctissimo,
2017).
Patogenicidad: Es la capacidad potencial de un microorganismo para producir
una enfermedad y se relaciona con su virulencia (Doctissimo, 2017).
Intoxicaciones alimentarias. - Son las manifestaciones clínicas de toxicidad
consecuente a la exposición a sustancias tóxicas transmitidas por alimentos
tanto sólidos como líquidos, la intoxicación ocurre tras la ingestión de alimentos
contaminados con sustancias orgánicas e inorgánicas, tales como: venenos,
toxinas, agentes biológicos patógenos, metales pesados, etc (Cortés, 2011).
Serotipo. - tipo de microorganismo infeccioso clasificado según los antígenos
que presentan en su superficie celular. Los serotipos permiten diferenciar
organismo nivel de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología
(Sánchez, 2013).
32
CAPÍTULO II.
MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. Métodos científicos empleados en la investigación.
II.1.1. Método Teórico.
El método científico empleado en el presente trabajo de titulación es de tipo
Hipotético – Deductivo, debido a que parte de una hipótesis que busca refutar o
falsear de acuerdo a los resultados obtenidos mediante los procesos
microbiológicos/bioquímicos realizados en el laboratorio de microbiología de la
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.
II.2. Metodología.
La realización del presente trabajo de investigación corresponde a la
identificación de E. coli O157:H7 en carne bovina molida expendida en el
mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil, en la cual se escogieron
aleatoriamente 10 sitios referenciales de venta (Anexo 14). Cada sitio de venta
fue identificado por códigos internos (Anexo 16). El mercado Caraguay se
encuentra en las calles H y General Robles (ingreso por Av. Domingo Comín) y
cuyas coordenadas mediante el sistema de posicionamiento global GPS es:
latitud (-2.226616954176256) y longitud (-79.8873183131218).
33
Flujograma de proceso para el aislamiento e identificación de O157:H7
Homogenización de la muestra
Siembra de colonias caracteristicas en
agar bilis rojo cristal violeta
Cultivo en agar TSI
Pruebas bioquímicas
Siembra de colonias presuntivas E. coli en agar soya tripticasa
Identificación mediante el Sistema
BBL Crystal
Análisis de resultados
34
II.3. Tipo de investigación.
Descriptivo con un enfoque cuantitativo.
II.4. Diseño de Investigación.
El presente estudio es de tipo no experimental de corte transversal, debido a
que la recolección de los datos fue en un tiempo determinado.
II.5. Población y Muestra.
La población y/o lugar de estudio fue en el mercado municipal Caraguay de la
ciudad de Guayaquil. El muestreo utilizado fue de tipo no aleatorio por
conveniencia durante los meses de octubre noviembre y diciembre del año 2017,
recolectándose un total de 100 muestras durante este periodo.
II.6. Materiales y Equipos.
II.6.1. Material de campo.
Fundas herméticas Stowmach.
Hielera.
Rotulador (Marcador).
II.6.2. Material fungible para el laboratorio.
Micropipetas. Mandil.
Tubos de ensayo. Mascarilla.
Cajas petri. Beaker.
Algodón. Varilla de vidrio.
Guantes. Probeta.
Cofia. Espátula.
Espátula. Fiola.
35
II.6.3. Equipos.
Equipo Función Marca
Balanza digital Pesar muestra. Femto
Incubadora Crecimiento y almacenamiento de cultivos bacterianos.
Femto
Micropipetas Empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos.
BD
Vortex Homogeneizador de soluciones. BD
II.6.4. Reactivos
Reactivo Función Marca
Agar Agua de peptona
Medio de enriquecimiento no selectivo, utilizado para recuperar células de
enterobacterias dañadas. BD
Agar Biliado-Rojo
Neutro-Cristal
Violeta.
Medio de cultivo de microorganismos, tanto selectivo, como diferencial, que se usa para
la identificación y enumeración de coliformes. BD
Agar Citrato
Simmons.
Medio utilizado para pruebas bioquímicas. BD Agar Urea
Agar Motilidad
Agar TSI Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias.
BD
Agar soya tripticasa
Medio de cultivo recomendado para la recuperación y aislamiento de toda clase de bacterias, Gram-positivas y Gram-negativas
aerobias
BD
Agua esterilizada. Solventes empleados para disolver los
medios de cultivo ------
Agua destilada.
Alcohol. Solvente utilizado para desinfectar el área de trabajo
Weir
36
II.7. Procedimiento.
II.7.1. Aislamiento microbiológico.
Las muestras fueron debidamente rotuladas obtenidas de los 10 sitios de
ventas del mercado Caraguay y colocadas en una hielera para poder ser
trasladadas al laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad de Guayaquil. Luego se realizó el proceso de pesado,
enriquecido y sembrado en agar cristal violeta rojo neutro bilis y agar TSI. Para la
identificación y aislamiento de E. coli se realizaron pruebas bioquímicas y se
inocularon colonias presuntivas en agar Soya tripticasa. Estas cepas fueron
almacenadas a 4 ºC antes de ser analizadas por el Sistema BBL Crystal E/NF.
II.7.2. Detección de E. coli O157:H7 mediante el sistema de
identificación BBL Crystal.
Se suspendió en un tubo de fluido de inóculo BD BBL Crystal la cepa aislada
E. coli proveniente del agar soya tripticasa. Una vez agitada la muestra se vertió
todo el contenido en el área objetivo de la base o panel. Sosteniendo la base con
ambas manos se movió el fluido suavemente de un lado para otro a lo largo de
toda la pista de la base, hasta que se hayan llenado todos los pocillos. Después
de tapar correctamente las bases se procedió a incubarlos por 20 horas a 37ºC.
Utilizando una fuente de luz y por contraste se realizaron las lecturas de las
muestras incubadas, las cuales fueron registradas e interpretadas con el fin de
obtener el “número de perfil”. Este número luego fue ingresado en un programa
propio del sistema BBL Crystal, permitiendo la identificación de la cepa en
cuestión.
37
CAPITULO III.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
III.1. Técnica de recolección de información.
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa SPSS versión 22.
III. 2. Análisis e interpretación de resultados.
Tabla 7. Presencia de Escherichia coli en las muestras analizadas
Escherichia coli
Frecuencia Porcentaje Porcentaje
válido
Porcentaje
acumulado
Válido
,0 19 19,0 19,0 19,0
1,0 81 81,0 81,0 100,0
Total 100 100,0 100,0
Ilustración 5. Presencia de Escherichi coli en muestras de carne molida bovina
De acuerdo con la ilustración #5 se puede observar que, del total de muestras
analizadas un 81% corresponde a E. coli, mientras que el 19% restante
pertenece a otros microorganismos
38
Tabla 8. Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas
N=100
Escherichia coli 81(81%) Otros microorganismos 19(19%)
klebsiella pneumoniae 11(11%)
klebsiella oxytoca 1(1%)
Proteus mirabilis 5(5%)
Providencia morgani 2(2%)
Ilustración 6. Presencia de otros microorganismos (MO) en carne molida
expendida en el mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil.
De acuerdo a la ilustración #6 en relación a la presencia de otros MO se
encontró que un 81% correspondió a Escherichia coli, un 19% restante
pertenece a otras bacterias como Klebsiella pneumoniae (11 %), Klebsiella
oxytoca (1%), Proteus mirabilis (5%) y Providencia morgani (2%).El alto índice
de E. coli en las muestras analizadas demuestra que las condiciones en la que
se manipula la carne molida no es la adecuada, ya que esta bacteria es un
indicador de contaminación fecal.
39
Ilustración 7. Presencia del serotipo E. coli O157:H7 carne bovina molida.
En la ilustracion 6 de acuerdo a los estadísticos descriptivos del histograma
para E coli se observa que para el serotipo O157:H7 mediante la técnica del
sistema de identificación BBL Crystal con un nivel de confianza de 0,9974 es
negativo; siendo positivo solo para E. coli
81%
0%0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Escherichia coli Escherichia coli O157:H7
40
Ilustración 8. Evaluación de la condición de expendio de la carne molida.
.
Tabla 9. Conservación del producto.
Local Nº Nº de muestras a 4°C
Nº de muestras a 28°C
1 7 3 2 0 10 3 0 10 4 0 10 5 0 10 6 0 10 7 0 10 8 0 10 9 0 10
10 0 10
Tabla 10. Porcentaje de muestras que se expendieron a 4ºC y 28ºC.
En la presente tabla se observa las condiciones de venta de la carne de
acuerdo a la temperatura de exposición, 1 de 10 locales expende carne a
temperatura controlada a 4°C, mientras que los demás locales expenden carne
a temperatura ambiente, lo que es decir que el 93% de las muestras se
encuentran a temperaturas ambientes. A pesar de esta condición no se reflejó la
presencia de E. coli O157:H7.
7%
93%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Refrigeracion (4°C) Temperatura ambiente
Locales N= 10
Refrigeración (4°C) 7%
Temperatura (28ºC) 93%
41
Tabla 11. Condición higiénica de los locales clasificados por categorías según la
escala de Likert (Anexo 2)
Categoría Nº de visitas Nº positivos para
E. coli
Excelente 0 (0%) -
Muy bueno 31 (31%) 24 (7%)
Bueno 60 (60%) 50 (30%)
Regular 9 (9%) 7 (0.63%)
Malo 0 (0%) -
De acuerdo a las condiciones higiénicas de los 10 sitios de venta de carne
molida, se observa que un 60% de locales presentan buenas condiciones, un
31% para la condición muy bueno y un 9% para la condición regular del total de
los locales visitados, pese a estos resultados se observa que un 7% de la
presencia de E. coli se identificaron en los productos expedidos en la categoría
muy bueno, un 30% para la categoría bueno y un 0.73% para la categoría
regular.
42
DISCUSIÓN
La carne molida fresca de bovino es considerada como el principal reservorio
de E. coli O157:H7 a nivel mundial además de ser considerada como el vehículo
más frecuente de los brotes de colitis hemorrágica y de síndrome urémico
hemolítico (Méndez et al, 2013). A pesar de los resultados obtenidos para el
serotipo O157:H7, se encontró un 81% para E. coli en muestras de carne molida
bovina en el mercado Caraguay en los meses de octubre a diciembre. Estudios
similares reportan resultados negativos para el serotipo estudiado bajos las
mismas condiciones en el mercado el Arenal en Cuenca (Tapia, 2016).
Un estudio realizado por Trueba et al 2013 en la ciudad de Quito en 600
muestras de hisopado rectal de ganado vacuno realizado, el 5% contenían E.
coli O157:H7. Esto supone que, si durante el faenamiento no se aplican buenas
prácticas de higiene, este serotipo puede contaminar la carne muscular durante
la matanza. Esto significa que la actividad en el camal de la ciudad de Guayaquil
puede tener un proceso en óptimas condiciones de higiene, lo que reduce la
contaminación por este serotipo hasta llegar la carne a los sitios de venta de
mercado Caraguay.
Un trabajo realizado en Argentina en el 2015 por Jure et al, demostró que, de
169 muestras de carne molida analizadas desde septiembre del 2004 hasta junio
del 2013, trece resultaron ser positivos para este serotipo. Se deduce entonces
que la frecuencia de detección de E. coli O157:H7 es baja y que se necesita un
número de muestras mayor al empleado en este estudio. Sería interesante hacer
un seguimiento temporal de la carne en mercados para descartar la posibilidad
de un número bajo de animales portadores, como lo sugiere el estudio de
Trueba et al (2013) en Quito.
43
CAPITULO IV.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusión
Con la metodología propuesta por el sistema BBL Crystal E/NF, se pudo
confirmar la presencia o ausencia del serotipo O157:H7. Del 81% de las
muestras analizadas con este sistema, ninguna resultó positiva para el serotipo
de interés, resultando nula la hipótesis planteada. Sin embargo, el estudio
detectó una frecuencia alta de otros agentes microbianos, principalmente E. coli,
aunque en menor porcentaje Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus
mirabilis y Providencia morgani.
Pensamos que el nivel de exposición de la carne molida bovina
comercializada en el mercado Caraguay, fue un factor fundamental para
determinar la presencia de Escherichia coli, otro factor fue las condiciones
higiénicas de los sitios de venta, lo que se demuestra con la presencia de otros
microrganismos existente en esta carne, a lo que se podría sumar la incorrecta
manipulación del producto o el uso de utensilios poco higiénicos, que se utilizan
en estos locales
Se pudo evaluar las áreas de ventas de acuerdo a las condiciones higiénicas
y de almacenamiento de la carne molida expendida en el mercado Caraguay,
dando como resultado un 60 % en la categoría de bueno según la escala de
Likert, esto hace referencia a que los locales en el mercado de la Caraguay
poseen condiciones aceptables para la venta de este producto; sin embargo, la
forma de almacenamiento de los productos expendidos es deficiente ya que en
un 93% de los casos mantenían la carne a temperatura ambiente.
44
Recomendaciones
1. Es necesario incrementar la vigilancia, rigurosidad y el control en los
distribuidores o proveedores del alimento desde el matadero, los
frigoríficos, transporte a los establecimientos minorista, con el fin
asegurar la calidad del alimento “Carne molida bovina” a los
consumidores finales.
2. El personal que labora en los sitios o lugares destinados a la venta de
carne molida, deben mantener en todo momento el producto bajo
condiciones de refrigeración, para evitar que la carne se deteriore o
sufra algún tipo de contaminación cruzada.
3. Se debe rotular y acondicionar las muestras antes de ser enviadas al
laboratorio para su análisis.
4. Todo el proceso de identificación mediante el sistema BBL Crystal
debe realizarse en una campana de flujo laminar, esto para evitar la
contaminación cruzada de modo que los resultados obtenidos no se
vean afectados.
45
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ZAhWsq1kKHQFaDlYQtgMIJw&tbs=lrf:!2m1!1e2!3sIAE,lf:1,lf_ui:2&rldoc=1#rlfi=h
d:;si:,-2.2273935536567464, 9.8900097020607; mv:!1m3!1d1440. 5444625929
88!2d-79.88983535847473!3d .2272729454407214!3m2!1i946!2i555!4f13.1
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52
ANEXOS.
53
Anexo 1. Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el mercado Caraguay de la ciudad de Guayaquil.
Muestras Nº
TSI
Citrato
Simmons
SIM
UREA
Bacteria
Identificada
Pico/ Fondo Producción de
Movilidad Indol Producción de SH2
Gas SH2
1 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
2 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
3 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
4 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
5 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
6 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
7 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
8 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
9 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
10 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
54
11 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
12 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
13 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
14 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
15 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
16 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
17 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
18 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
19 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
20 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
21 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
22 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
23 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
55
24 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
25 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
26 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
27 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
28 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
29 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
30 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
31 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella pneumoniae
32 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
33 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
34 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
35 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
36 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
56
37 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
38 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
39 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
40 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
41 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
42 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
43 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
44 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
45 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
46 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
47 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
48 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
49 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
57
50 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
51 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
52 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
53 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
54 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
55 Alcalino/Ácido - - + + + - + Providencia morgani
56 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
57 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
58 Alcalino/Ácido - - + + + - + Providencia morgani
59 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
60 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
61 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
62 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
58
63 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
64 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
65 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
66 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
67 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
68 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
69 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
70 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
71 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
72 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
73 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
74 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
75 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
59
76 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
77 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
78 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
79 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
80 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
81 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
82 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
83 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
84 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
85 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
86 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
87 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
88 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
60
89 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
90 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
91 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
92 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
93 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
94 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
95 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
96 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
97 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
98 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
99 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
100 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
61
Anexo 2. Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta.
Mercado: Caraguay Fecha: 19/10/2017
Local Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los operarios utilizan mandil visualmente limpio
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los materiales y equipos se encuentran visualmente limpios.
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
La carne molida se mantiene en refrigeración
Si No Si No Si No No No No No
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
No No No No No No No No No No
TOTAL 2 3 4 3 4 3 3 3 3 3 Escala Likert: Excelente = 5, Muy bueno = 4, Bueno = 3, Regular = 2, Malo = 1
Mercado: Caraguay Fecha: 25/10/2017
Local Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los operarios utilizan mandil visualmente limpio
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los materiales y equipos se encuentran visualmente limpios.
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
La carne molida se mantiene en refrigeración
Si No No No No No No No No No
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
No No Si No Si Si No No No No
TOTAL 2 3 4 3 4 4 3 3 3 3 Escala Likert: Excelente = 5, Muy bueno = 4, Bueno = 3, Regular = 2, Malo = 1
Mercado: Caraguay Fecha: 8/11/2017
Local Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los operarios utilizan mandil visualmente limpio
No Si Si No Si Si Si Si Si Si
Los materiales y equipos se encuentran visualmente limpios.
No Si Si No Si Si Si Si Si Si
La carne molida se mantiene en refrigeración
Si No No Si No No No No No No
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
No Si No No No No No Si No No
TOTAL 2 4 3 2 3 3 3 4 3 3 Escala Likert: Excelente = 5, Muy bueno = 4, Bueno = 3, Regular = 2, Malo = 1
62
Mercado: Caraguay
Local Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los operarios utilizan mandil visualmente limpio
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Los materiales y equipos se encuentran visualmente limpios.
No Si Si Si Si Si Si Si Si Si
La carne molida se mantiene en refrigeración
Si No No No No No No No No No
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
No Si Si No No No No Si No No
TOTAL 2 4 4 3 3 3 3 4 3 3 Escala Likert: Excelente = 5, Muy bueno = 4, Bueno = 3, Regular = 2, Malo = 1
63
Anexo 3. Tabla de resultados según el sistema BBL Crystal.
Sistema BBL Crystal
Nº Muestra (E coli) Perfil numérico Coincidencia Bacteria detectada
1 4464446171 0,9957 Escherichia coli
2 4464446171 0,9957 Escherichia coli
3 4464444171 0,9998 Escherichia coli
4 4424446171 0,9957 Escherichia coli
5 4464446171 0,9957 Escherichia coli
6 4464446171 0,9957 Escherichia coli
7 4464646171 0,9992 Escherichia coli
8 4664666571 0,9994 Escherichia coli
9 4464646171 0,9992 Escherichia coli
10 4464446171 0,9957 Escherichia coli
11 4464446171 0,9957 Escherichia coli
12 4464446171 0,9957 Escherichia coli
13 4464446171 0,9957 Escherichia coli
14 4464446171 0,9957 Escherichia coli
16 4464446171 0,9957 Escherichia coli
18 4464646171 0,9992 Escherichia coli
20 4464646171 0,9992 Escherichia coli
21 4464646171 0,9992 Escherichia coli
25 4464446171 0,9957 Escherichia coli
26 4464446171 0,9957 Escherichia coli
27 4464446171 0,9957 Escherichia coli
28 4464446171 0,9957 Escherichia coli
32 4464646171 0,9992 Escherichia coli
33 4464446171 0,9957 Escherichia coli
35 4464646171 0,9992 Escherichia coli
36 4464646171 0,9992 Escherichia coli
37 4464646171 0,9992 Escherichia coli
38 4464446171 0,9957 Escherichia coli
39 4464446171 0,9957 Escherichia coli
40 4464446171 0,9957 Escherichia coli
41 4464646171 0,9992 Escherichia coli
42 4464444171 0,9998 Escherichia coli
43 4464646171 0,9992 Escherichia coli
46 4464446171 0,9957 Escherichia coli
47 4464646171 0,9992 Escherichia coli
48 4464446171 0,9957 Escherichia coli
49 4464446171 0,9957 Escherichia coli
50 4464646171 0,9992 Escherichia coli
51 4464446171 0,9957 Escherichia coli
64
52 4464646171 0,9992 Escherichia coli
53 4464446171 0,9957 Escherichia coli
56 4464646171 0,9992 Escherichia coli
57 5424444171 0,9997 Escherichia coli
61 4464644171 0,9995 Escherichia coli
62 4464446171 0,9957 Escherichia coli
63 4464646171 0,9992 Escherichia coli
64 4464446171 0,9957 Escherichia coli
65 4464646171 0,9992 Escherichia coli
66 4464444171 0,9998 Escherichia coli
67 4664666571 0,9994 Escherichia coli
68 4664646161 0,9992 Escherichia coli
69 4424444171 0,9698 Escherichia coli
70 4464446171 0,9957 Escherichia coli
71 4464646171 0,9992 Escherichia coli
72 4464444171 0,9998 Escherichia coli
73 4464646171 0,9992 Escherichia coli
74 4464444171 0,9998 Escherichia coli
75 4464647171 0,9995 Escherichia coli
76 4464446171 0,9957 Escherichia coli
77 4424646171 0,9998 Escherichia coli
78 4464446171 0,9957 Escherichia coli
80 4464446171 0,9957 Escherichia coli
81 4464446171 0,9957 Escherichia coli
82 4464444171 0,9998 Escherichia coli
83 4464444171 0,9998 Escherichia coli
84 4464444171 0,9998 Escherichia coli
85 4464646171 0,9992 Escherichia coli
86 4464446171 0,9957 Escherichia coli
87 4424446171 0,9957 Escherichia coli
88 4464446171 0,9957 Escherichia coli
89 4464444171 0,9998 Escherichia coli
90 4464444171 0,9998 Escherichia coli
91 4464444171 0,9998 Escherichia coli
92 4464446171 0,9957 Escherichia coli
93 4464446171 0,9957 Escherichia coli
94 4464646171 0,9992 Escherichia coli
95 4464446171 0,9957 Escherichia coli
97 4464444171 0,9998 Escherichia coli
98 4664666571 0,9994 Escherichia coli
99 4464444171 0,9998 Escherichia coli
100 4464444171 0,9998 Escherichia coli
Promedio 0,9974
65
Anexo 4. Tabla bioquímica de identificación de microorganismo más comunes (Carpio, 2017).
ONPG = o-Nitrofenil-β-D-Galactopiranósido
ODC = Ornitina decarboxilasa
LCD = lisina decarboxilasa
SH2 = Gas sulfhídrico
TDA/FDA: triptófano desaminasa / fenilalanina desaminasa
VP = Voges-Proskauer
+ = positivo
- = negativo
V = variable
66
Protocolo de trabajo para la preparación de medios de cultivo
Anexo 5. Preparación de agar agua de peptona
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable...
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Disolver 25,5g de agar agua de peptona en 1 L de agua destilada.
4. Agitar hasta disolución completa.
5. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva por
un minuto para disolver completamente el medio
6. Distribuir volúmenes de 90 ml y 9 ml en recipientes apropiados.
7. Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos
Anexo 6. Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Suspenda 9.77 g del medio en 255 ml de agua esterilizada.
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva por
un minuto para disolver completamente el medio.
5. NO COLOQUE EN EL AUTOCLAVE.
6. Permita el enfriamiento del medio hasta que alcance una temperatura
entre 45–50°C y dispénselo en placas estériles.
Anexo 7. Preparación de agar soya tripticasa.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen
3. Suspenda 3.6 g de agar soya tripticasa en 90 ml de agua destilada
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva por
un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo que
el agar tome forma de pico de flauta.
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Anexo 8. Preparación de agar SIM
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Disolver 2.79 g de agar SIM en 90 ml de agua destilada.
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva por
un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo que
el agar tome forma de pico de flauta.
Anexo 9. Preparación de agar Citrato Simmons.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Suspender 2.07g de agar Citrato Simmons en 90 ml de agua destilada
4. Calentar manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva por
un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo que
el agar tome forma de pico de flauta.
Anexo 10. Preparación de agar Ureasa.
1. Suspenda 3,87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua
destilada.
2. Disolver sin calentar y autoclavar a 121ºC por 15 minutos
3. Transferir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo
que el agar tome forma de pico de flauta.
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Anexo 11. Preparación y siembra de la muestra.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen
3. Suspender 10 g de carne molida en 90 ml de agua de peptona
4. Agitar constantemente por 1 minuto
5. Transferir alícuotas de 1 ml en tubos que contengan 9 ml de agua de
peptona.
6. Agitar los tubos de ensayo y colocar 1 ml de la dilución en una caja Petri,
estando cerca del mechero.
7. Añadir el medio de cultivo bilis rojo neutro cristal violeta cuando este haya
alcanzado los 40ºC.
8. Agitar por rotación la caja petri y dejar solidificar el agar antes de
incubarla por 12 horas a 37ºC.
9. Sembrar por picadura y estría colonias rojas con halos en Agar TSI
10. Incubar los tubos por 12 horas a 37ºC.
11. En caso de algún crecimiento de colonias presuntivas, sembrar en
pruebas bioquímicas para su diferenciación y confirmación: Úrea
(Siembra por picadura y estría), Citrato (Siembra por picadura y estría) y
Sim (Siembra por Picadura).
12. Incubar de 35 a 37ºC por 24 horas.
13. Analizar los tubos con la ayuda de la tabla de pruebas bioquímicas para
Enterobacterias (Anexo 1)
14. Una vez analizados los resultados, los tubos con presencia presuntiva de
E. coli se siembran por picadura y estría en agar soya tripticasa para
posterior análisis en el Sistema BBL Crystal.
Anexo 12. Procedimiento de pruebas bioquímicas
Prueba de motilidad: -
1. Tomar una colonia aislada sospechosa de ser Escherichia coli con un asa
estéril.
2. Introducir sobre el centro del tubo con medio de movilidad y formar una
línea de inoculación, hasta una tercera parte del medio.
3. Incubar de 24-48 horas y observar si presenta enturbiamiento.
69
Producción de indol: Incorporar 2 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interna del tubo (la reacción es inmediata). La formación de un halo rosado es
indicativa de reacción positiva.
Prueba de citrato:
1. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser Escherichia coli
en la superficie del medio (pico de flauta).
2. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.
Nota: Si el medio se torna de color azul es indicativo de reacción positiva.
Prueba de Urea.
1. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser Escherichia coli
en la superficie del medio (pico de flauta).
2. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.
Nota: Si el medio se torna de color rojo rosado es indicativo de reacción
positiva.
Anexo 13. Protocolo de trabajo para la identificación de E. coli O157: H7
mediante el Sistema BBL™ Crystal™
1. Sacar las tapas de la bolsa. Una vez sacadas de la bolsa, las tapas
cubiertas deben utilizarse en el plazo de 1 hora.
2. Tome un tubo de inóculo y etiquételo con el número de muestra.
3. Utilizando una técnica aséptica, con un asa de cultivo estéril, tome una
muestra de la cepa aislada en agar soya tripticasa.
4. Suspenda las colonias en un tubo de fluido de inóculo BD BBL Crystal
para organismos entéricos/heces.
5. Vuelva a taponar el tubo y agítelo en un Vortex durante aproximadamente
10–15 s.
6. Tome una base y marque el número de muestra en la pared lateral.
7. Vierta todo el contenido del fluido de inóculo en el área objetivo de la
base.
70
8. Sostenga la base con ambas manos y mueva el inóculo suavemente de
un lado para otro a lo largo de las pistas hasta que se hayan llenado
todos los pocillos. Haga retroceder cualquier líquido sobrante del área
objetivo y coloque la base en la parte superior de un banquillo.
9. Alinee la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa esté en la
parte superior del área objetivo de la base.
10. Apriete hasta que perciba una ligera resistencia. Coloque el pulgar en el
borde de la tapa hacia la parte media del panel en cada lado y apriete
simultáneamente hasta que la tapa encaje en su lugar (tiene que
escuchar dos “clics”).
11. Coloque los paneles inoculados en las bandejas de incubación. El tiempo
de incubación para los paneles es de 18–20 h a 35–37 °C.
12. Después del período recomendado de incubación, saque los paneles de
la incubadora. Todos los paneles deben leerse hacia abajo (las ventanas
más grandes arriba; la etiqueta mirando hacia abajo) utilizando una
fuente de luz.
13. Consulte la tabla de resultados de las reacciones (Anexo 15).
14. Usar el cuaderno de informes BD BBL Crystal E/NF para registrar las
reacciones.
15. A cada resultado del análisis con un resultado positivo se le asigna un
valor de 4, 2, o 1, correspondiendo a la fila donde está ubicado el
análisis. Se asigna un valor de 0 (cero) a cualquier resultado negativo.
Después se suman los números (valores) resultantes de cada reacción
positiva en cada columna. Se genera un número de 10 dígitos; éste es el
número de perfil.
71
16. El número de perfil resultante y los resultados del análisis fuera de línea
(indol y oxidasa) deben introducirse en un computador en el que se haya
instalado el libro de códigos electrónico del sistema BD BBL Crystal ID,
para obtener la identificación
Sitios de
venta de
carne molida
Anexo 14.Croquis del mercado Caraguay
72
Anexo 15. Tabla de resultados para la interpretación de las reacciones bioquímicas (BD, 2016).
73
SM =Sitio de Venta Anexo 16. Croquis de los sitos referenciales de venta de carne bovina molida
del mercado Caraguay
Anexo 17 Limpieza y desinfección del área de trabajo con alcohol.
74
Anexo 18. Homogenización de la muestra en agua peptonada.
Anexo 19. Incubación de placas con agar biliado rojo neutro cristal violeta.
75
Anexo 20. Incubación de colonias características en tubos con agar TSI
Anexo 21.Tubo con agar TSI recientemente sembrados
76
Anexo 22. Tubo de agar TSI a las 24 horas de incubación.
Anexo 23. Tubos con agar tripticasa soya a las 24 de incubación
77
Anexo 24. Kit BBL Crystal para la identificación del serotipo O157:H7
Anexo 25. Paneles de BBL Crystal después del periodo de incubación
78
Anexo 27. Nivel de confianza y validez del biotipo para Escherichia coli según
el programa de análisis BBL Crystal.
Anexo 26. Panel de identificación BBL Crystal a las 24 horas de incubación
79
Anexo 28. Incorrecta manipulación de la carne molida en el mercado Caraguay previo a la venta.
Anexo 29. Personal moliendo la carne bajo condiciones antihigiénicas y sin ningún tipo de protección
80
Anexo 30. Carne molida expuesta a la intemperie en el Mercado Caraguay