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bbPRODIJCCION DE InJ REACTIVO DE LATEX PARA EL DIAGNOSTICO DE LA E,WERMEDAD DE CHAGAS"
Proyecto So. 47 - S?
Presentado por
Licda. Vivian Lucrecia Matta Rios
Licda. María Eugenia Paredes Sánchez
Licda. María Paula de León Granados
Licda. Ana Margarita Paz Morales
Licda. Amanda Gálvez Figueroa
Tiempo de duración: 2 de mayo de 1998 al 3 1 de julio de 1 999
Unidad Ejecutora: Departamento de Citohistologia, Facultad d~ Ciencias Químicas ECRETAKIA SAL J j E y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guat
Guatemala, Agosto de 1999
No. Página
1. Resumen
11. Introducción
111. Antecedentes
1 . La enfermedad de Chagas 2. Diagnóstico 3. Técnicas de aglutinación con partículas de látex
IV. Objetivos
V. Metodología
1. Producción 2. Evaluación del reactivo 3. Promoción del reactivo 4. Comercialización y distribución
VI. Resultados y discusión
VII. Conclusiones
VIII. Recomendaciones
IX. Bibliografía
X. Información financiera
XI. Anexos
L RESUMEN
El presente proyecto de investigación, tuvo como principal propósito la producción
masiva de un reactivo de látex, para su posterior comercialización y distribución a nivel nacional.
Para lograr alcanzar este objetivo las actividades se dividieron en cuatro fases. La
primera, consistió en la estandanzación del cultivo a gran escala, de la línea celular y del parásito
T~panosoma cruzr, la cual nos permitiría obtener suficientes parásitos para la preparación del
reactivo. Los parásitos obtenidos fueron almacenados a -70°C y se obtuvo suficiente cantidad
para la producción de 286 kits de 100 pruebas c/u.
La segunda etapa, consistió en la evaluación del reactivo a fin de determinar las
condiciones adecuadas de almacenamiento y la eficiencia del reactivo en el proceso de muestras
evaluando sobre todo el comportamiento ante varios controles negativo y positivo. El reactivo
pudo también ser comparado con la prueba de ELISA de la casa comercial ABBOTT
Laboratorios y con los reactivos producidos en el Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo,
Brasil, obteniéndose una correlación bastante buena. Así también se participó en el estudio
"Trypanosoma cruzi y seguridad sanguínea: una evaluación en Bancos de Sangre y prácticas de
transfusión en Guatemala", el cual se realizó en la Universidad del Valle de Guatemala.
En la tercera etapa se inició la promoción del reactivo para lo cual se realizaron varias
reuniones con las autoridades del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social (MSPAS) para
dar a conocer el reactivo y lograr el interks de las autoridades para que el reactivo sea utilizado
por todos los laboratorios clínicos y bancos de sangre de la red nacional. Así también se participó
en varias actividades científicas con el fin de dar a conocer la importancia de realizar un
adecuado diagnóstico de la enfermedad y los beneficios que presenta el reactivo producido por el
Departamento de Citohistología denominado Cruzi-Látex.
La cuarta etapa es la distribución y comercialización del reactivo para lo cual se elaboró
el material de empaque, inserto y de propaganda.
El objetivo principal del presente proyecto fue la producción de un reactivo de látex para
el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas en el departamento de Citohistología de la Fac. de
CCQQ y Farmacia, utilizando con dicho propósito una cepa guatemalteca aislada de un paciente
con enfermedad de Chagas aguda. Para ello primero se estandarizó el cultivo de las células de
fibroblastos y los tripomastigotes de T. cruzi a las condiciones de cultivo in vitro en gran escala,
los cuales fueron cultivados en botellas de 75 cm2 a fin de facilitar su manejo y evitar la
contaminación bacteriana.
A la fecha se ha obtenido antígeno suficiente para la preparación de 220 kits de reactivo
(100 pruebas cada uno) los cuales serán envasados y empacados conforme la demanda y
solicitud del reactivo por los consumidores . Para la estandarización y evaluación del reactivo se
utilizaron 1 1,000 pruebas.
Esta prueba presenta las ventajas de ser sencilla, rápida, económica y no requerir de
ningún equipo o material sofisticado, pudiendo ser utilizado en bancos de sangre y en el área
rural y además utilizar una mínima cantidad de suero (3 pl).
Para la promoción del reactivo se realizaron varias reuniones con las autoridades del
Ministerio de Salud para que éste reactivo sea utilizado en los diferentes laboratorios y bancos
de sangre de la red nacional y así unificar el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. Así
también se programaron dos actividades científicas, una se realizó el miércoles 24 de agosto y la
otra se realizará para mediados de noviembre, ambas dirigidas al personal que labora en los
diferentes hospitales nacionales y privados.
La producción del reactivo será una actividad constante y autofinanciable y su objetivo
primordial será satisfacer la necesidad nacional.
LII. ANTECEDENTES
1. La enfermedad de Chagas
Es uno de los problemas de salud más importantes en la región de las Américas. Es una
enfermedad parasitaria de curso agudo y crónico causada por T. c r m . La fase aguda es de corta
duración y frecuentemente pasa inadvertida, puede presentar fiebre, dolor muscular, vómitos,
diarrea, hepatoesplenomegalia, inflamación del sitio de entrada (chagoma), inflamación de
nódulos linfoides y miocarditis. En esta etapa la enfermedad es diagnosticada únicamente en el
1-2% de los pacientes, se presenta a cualquier edad, pero en las áreas endémicas los nifios
menores de 10 años son los más afectados. La etapa crónica se desarrolla varios años despuks de
la infección inicial, puede presentar patología cardíaca, digestiva y neurológica (1). Se estima
que de 46 a 48 millones de habitantes de las áreas rural y urbana están infectados con
Trypanosoma cruzi y que alrededor de 100 millones están en riesgo de adquirirla
T. cruzi es un protozoo que varía de tarnafio, posee un núcleo central y un cinetoplasto
voluminoso que tiene un blefaroplasto que se extiende por el borde de la delgada membrana
ondulante que tiene pocos pliegues y sale por el extremo anterior como flagelo libre. Se presenta
en la sangre en forma de tripomastigote flagelado de 15 - 20 pm de largo y de grosor variable,
con el extremo posterior puntiagudo y con flagelo. Dentro de las células se encuentra en forma
de amastigote que se multiplica intracelularmente (2). Los hospederos son el hombre, animales
silvestres y domésticos, siendo el vector los redúvidos de los géneros Panstrongylus, Rhodnius y
Triatoma. La infección de los vertebrados se hace por contaminación con deyecciones después
de una reproducción cíclica durante 8 a 20 días en el intestino de la chinche, durante la noche, el
insecto pica al hombre, generalmente en la unión de las superficies cutáneas y mucosas, puesto
que la chinche defeca frecuentemente en el momento de alimentarse, la contaminación posterior
es fácil. También se producen infecciones por transfusión de sangre infectada, de madre a hijo
durante el embarazo, transplantes de órganos y accidentes de laboratorio.
En Guatemala se ha estimado una prevalencia de 500,000 casos y estudios anteriores
realizados en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia han evidenciado que la enfermedad
de Chagas es un serio problema de salud en Guatemala, habiéndose reportado como única forma
clínica la miocardiopatía y se desconoce si las otras formas clínicas están realmente ausentes o si
éstas han pasado inadvertidas (3-1 8). Sin embargo los datos reportados por la Dirección General
de Servicios de Salud son de 25 a 50 casos anuales, demostrando que no existe un reporte real de
la enfermedad (19). La presentación clínica de la enfermedad observada en Guatemala y en otros
países es diferente, por lo que se ha atribuido a un gran número de variables, siendo las dos más
importantes la diversidad en la composición genética del hospedero y la presencia de diversas
poblaciones del parásito (20-28).
2. Diagnóstico
En la fase aguda, a partir de la segunda semana de infección un examen microscópico de
sangre fresca o una gota gruesa teaida con Giemsa pueden revelar la presencia de tripomastigotes
circulantes. El xenodiagnóstico es bastante sensible y se basa en la multiplicación de T. cm-; en
el tubo digestivo de los triatomas los cuales al alimentarse de sangre de un paciente infectado
presentan al parásito en sus heces aproximadamente 15 - 20 días después (29).
La detección de anticuerpos séricos contra componentes de T. cruz; ha sido uno de los
principales soportes para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas ya que otros métodos de
diagnóstico como el xenodiagnóstico y hemocultivo tienen limitaciones considerables (30).
Estos anticuerpos, tanto IgG como IgM, pueden ser detectados en el suero del paciente
usualmente después de las prímeras manifestaciones clínicas de la fase aguda de la infección por
T. cruzi. La fase crónica dura toda la vida, siendo clínicamente aparente o no y los anticuerpos
IgG son detectados regularmente.
A la fecha se han utilizado una gran variedad de knicas inrnunológicas para la detección
de anticuerpos, los cuales utilizan parásitos muertos o fracciones parasitarias. Esta mezcla
compleja no proporciona informacibn sobre las diferencias patológicas entre las diferentes
formas clínicas de la enfermedad (3 1). Entre las diversas pruebas srrológicas disponibles para el
diagnóstico se encuentran: fijación del complemento (FC o prueba de Guerreiro-Machado),
hemaglutinación indirecta (HAI), inmunofluorescencia indirecta (IFI), inmunoensayo enzimático
(ELISA), aglutinación directa con o sin tratamiento del suero con 2-mercaptoetanol (AD y 2-
MEAD) (32,33). La prueba de fijación de complemento, desarrollada por Guerreiro y Machado
en 1913, cada vez es menos utilizada debido a las dificultades para la estandarización y para la
producción de un antígeno adecuado (34). Para detectar anticuerpos IgM en la fase temprana de
la enfermedad la pnieba recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), es TFI
seguida por la combinación de 2-MEAD y AD. Para detectar anticuerpos IgG en la fase
indeterminada y crónica son recomendadas HAI, ELISA, IFI, aglutinación de látex y FC (35).
La especificidad de las pruebas puede variar de manera considerable por lo que existe
desacuerdo entre los grupos de investigadores acerca de la adecuada aplicación e interpretación
de las técnicas serológicas para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Es por ello que la
OMS recomienda el empleo de al menos dos pruebas serológicas con principios inmunológicos
diferentes para confirmar la infección (36-39).
Uno de los factores que influye en la especificidad de las pruebas es el tipo antígeno
utilizado en la preparación del reactivo, pudiendo ser el parásito completo o una mezcla
compleja de los componentes extraídos de los diferentes estadíos del parásito, así como la gran
diversidad morfológica del parásito tanto inter como intraespecie, por lo que es conveniente
realizar el diagnóstico con cepas autóctonas o nativas.
Es importante siempre recordar que pueden obtenerse reacciones falsas positivas
principalmente debido a las reacciones cruzadas con los anticuerpos desarrollados contra otros
agentes infecciosos. Para resolver estos problemas se han utilizado polipéptidos recombinantes
que contienen epitopos antigénicos de T. cm-i los cuales deben inducir la respuesta inmune en
la mayoría de los pacientes chagásicos. Estos antígenos deben ser comunes a todas las cepas de
T. cruzi , no producir reacciones cruzadas con otras enfermedades especidmente con T. Rangeli
y ser de fácil obtención a través de una metodología reproducible. A la fecha se han obtenido
varios péptidos, pero están aún en fase de investigación pues la respuesta obtenida no ha sido la
deseada (34). Lafaille y cols. están realizando estudios en Rio de Janeiro para clonar los genes
del tripomastigote con el fin de determinar cuales son los genes estadío-específico o importantes
para el diagnbstico. Hasta la fecha se han obtenido dos clonas cuyos polipéptidos fiieron
reconocidos por los sueros de pacientes chagásicos, por lo que se están realizando más estudios
con el fin de obtener un reactivo puro para el diagnóstico. Por otro lado en Buenos Aires, Ióa-ez
y col. han clonado varios epitopos de T. cruzi expresados tanto en epimastigotes, tripomastigotes
o ambos. De ellos, al menos diez han mostrado ser antigénicamente activos en la infección (40).
3. Técnica de Aglutinaci6n con Partículas de L4tex
La aglutinación de los tripanosomas para detectar anticuerpos específicos, ha sido
utilizada desde 1900 cuando Laveran and Mesnil usaron éste procedimiento para estudiar el
suero de ratas infectadas con T. Iewrsr . Posteriomente Packchanian utilizó el antígeno de 7: cruzr
para el estudio de animales infectados. Muniz y Freitas utilizaron esta prueba para demostrar la
presencia de anticuerpos a T. cruzr, no solo en infecciones experimentales, sino también en
casos humanos de la enfermedad de Chagas tanto aguda como crónica (4 1).
Vattuone and Yanovsky desarrollaron un antígeno utilizando epimastigotes de T. cm-i
tratados con tripsina, el cual fue estabilizado por fijación con formalina. La reacción con este
reactivo se realizó en microplacas plásticas y se completaba en 18 horas con muy buen resultado
(42). Posteriormente Ross obtuvo antígeno de T. brucei, T. vivax, T. congoleme y T. rhodesieme
por desintegración ultrasónica y preservación con formalina y lo utilizó en un test de
aglutinación en tubo, el cual podía ser leido después de 1 - 2 horas pero se obtenían mejores
resultados si las lecturas se realizaban después de 24 horas (43).
Hoshino-Shimim y col. en 1974 desarrollaron un test de floculación en lámina, el cual
utiliza un antígeno liofilizado que se obtiene por tratamiento ultrasónico de formas de cultivo de
T. cruzi . Este test presentó las ventajas de ser fácil y rápido de realizar, tener buena sensibilidad,
una especificidad del 96 % y detectar tanto infecciones crónicas como agudas, pero presentó
reacciones falsas positivas con toxoplasmosis aguda y blastomicosis suramericana.
Recomendando el uso de éste reactivo en el tamizaje de los donadores de bancos de sangre (41).
Esta técnica ha sido también utilizada para otros microorganismos. En 1993, Matsumoto
y cols. desarrollaron un test automatizado para la determinación de los anticuerpos treponémicos
en sueros sifilíticos. Esta prueba no necesitó pretratamientos con soluciones especiales y no se
observó interferencia de sustancias como bilirrubina, hemoglobina, triglicéridos y factor
reumatoideo (44). Spindler y cols. desarrollaron un reactivo de látex para el diagnóstico de
infecciones por citomegalovirus, el cual fue adaptado en placas de microtitulación con lectura
fotométrica. Esta modificación fue comparado con ELISA, demostrando un 97.6% de
concordancia. Los autores recomendaron su uso por su facilidad, rapidez y posibilidad de
automatizacibn (45). En 1994, Nantulya reporta el uso de un reactivo de látex para la detección
de antigenos circulantes de Trypanosoma evansi, obteniendo una buena correlación entre los
resultados parasitológicos, sugiriendo que este reactivo puede ser utilizado en el campo para el
diagnóstico rápido de la infección en animales (46). Kayang y col. desarrollaron un reactivo para
el diagnóstico de infecciones por T. brucei, T congolenese y T. vivax en ovejas, carneros y
ganado vacuno, el cual tuvo una sensibilidad mayor del 98.3% para las tres especies y una
especificidad mayor del 97.5%. Este reactivo presentó la ventaja de poder examinar a los
animales en el campo(47).
En Guatemala, en 1994 dentro de las actividades desarrolladas en un proyecto de
investigación realizado en conjunto con la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, el
Ministerio de Salud y la Misión Técnica Japonesa, se desarrolló un reactivo de aglutinación de
partículas de látex para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. Este reactivo fue
desarrollado en el Departamento de Citohistología bajo la asesoría del Dr. Tetsuo Yanagi. Como
antígeno se utilizb tripomastigotes de una cepa guatemalteca aislada de un paciente con
enfermedad aguda y residente de la población de Santa Mana Ixhuatán, Santa Rosa. Este
reactivo fue estandarizado y evaluado en un población endémica y en pacientes con
sintomatología de Chagas. En la poblacibn endémica se encontró una buena correlación con otras
pruebas serológicas , ya que al compararlo con el reactivo de hemaglutinación indirecta de la
compaííía comercial ~erodiagnostic~ se obtuvo un índice de Kappa de 0.50, mientras que al
compararlo con el reactivo de aglutinación con partículas de gelatina de la compañía comercial
~ u j i r e b i o ~ el índice de Kappa obtenido fue de 0.76. En la evaluación realizada en población con
sintomatología sugestiva de Enfermedad de Chagas se encontró un índice de Kappa de 1.0 para
ambos reactivos comerciales. Al evaluarse con el cultivo in vitro de epimastigotes se obtuvo una
sensibilidad y especificidad del 100%. Cuando se comparó con la técnica considerada como
estándar de oro (IFI) la sensibilidad obtenida fue de 98% y la especificidad de 86% (48,49). Esta
prueba presenta la ventaja de ser sencilla, rápida, económica, no requiere de ningún equipo o
material sofisticado por lo que puede utilizarse en bancos de sangre y en el área rural, utiliza una
mínima cantidad de suero (3 p1) y las placas pueden ser almacenadas por largos periodos de
tiempo. Es importante aclarar que esta prueba no puede utilizarse como prueba única para
realizar el diagnóstico sino como una prueba de tamizaje y todo suero positivo debe confirmarse
con otra metodología más específica como ELISA y/o Inrnunofluorescencia.
Por otro lado, tomando en cuenta que la enfermedad puede ser transmitida por la
transfusión de sangre y sus derivados, es importante que todas las unidades que van a ser
utilizadas en hemoterapia, sean tamizadas también para esta enfermedad, previniendo la
infección por esta vía, para lo cual se sugiere que este reactivo sea utilizado en los diferentes
bancos de sangre del país.
Con este proyecto se desea producir este reactivo para su distribución a laboratorios
clínicos tanto públicos como privados a fin de unificar el diagnóstico de la Enfermedad de
Chagas y por lo tanto tener una mejor apreciación de la prevalencia de la enfermedad en el país.
La fase inicial que tuvo duración de un año incluyó: a) información y difusión sobre la
necesidad de la aplicación de esta prueba a todas las instituciones responsables de diagnóstico
del país; b) estandarización de Ia técnica y la posterior producción masiva de reactivo; c)
evaluación y establecimiento de la forma de almacenaje, transporte y de distribución del
reactivo.
IV. OBJETIVOS
l . Unificar el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas utilizando un reactivo producido con
una cepa nativa.
2. Estandarizar los reactivos para su uso a gran escala.
3. Producir en gran escala el reactivo de aglutinación rápida de látex.
4. Distribuir y comercializar el reactivo a los bancos de sangre y laboratorios de hospitdes
nacionales y privados.
5 . Prestar el servicio de confirmación de muestras positivas o con resultados dudosos.
6. Prestar el servicio de control de calidad a los diferentes laboratorios que realizan el
diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas.
V. METODOLOGIA
1. Producci6n
El procedimiento para la preparacibn del reactivo de látex para el diagnóstico de
enfermedad de Chagas incluye los siguientes pasos:
1.1 Cultivo celular
1.1.1 Preparación de reactivos
Se prepararon los reactivos necesarios para el establecimiento y mantenimiento de las
ceIulas estos incluyen:
Solución de carbonato ácido de sodio (NaHC03) al 10°h
Solución de L-glutamina al 2.98%
Medio de cultivo Minimum essential mediurn (MEM) incompleto
Solución de tripsinaEDTA
Medio de cultivo MEM completo
Solucibn buferada de fosfatos (PBS pH 7.4)
1.1.2 Desarrollo del cultivo celular
a. Las células NBMH (fibroblastos de corazón de ratón recién nacido) que se encontraban
almacenadas en nitrógeno líquido fueron descongeladas, suspendidas en medio MEM y
colocadas en botellas estériles (25 cm2) para cultivo.
b. Cuando las cdlulas alcanzaron su crecimiento óptimo fueron tripsinadas para poder
realizar subcultivos celulares.
c. Los subcliltivos celulares se prepararon lavando las células dos veces con PBS, luego éste
se descartó y se agregó a las botellas tripsinaEDTA, con el objeto de desprender las
células, las cuales fueron transferidas a tres botellas estériles de 25 cm2 (sub-cultivos).
d. Las botellas fueron incubadas a 37°C hasta lograr una capa de cClulas uniforme, que
cubriera la superficie plana del fondo de cada botella.
e. Este proceso se repitió sucesivamente hasta obtener un total de 44 botellas con adecuado
crecimiento celular, listas para ser infktadas con el parásito.
1.2 Cultivo del parásito
1.21 Preparación de reactivos
Medio de cultivo Liver inffussion tryptose (LIT)
Medio de cultivo MEM completo
1.2.2 Proliferación del parásito
a. Se descongeló la cepa de T. crwr (MHOM/GT/95/SMI-07) aislada de un paciente
chagásico agudo, la cual estaba almacenada en nitriogeno líquido (epirnastigotes).
b. La cepa de T. cruz, fue suspendida en medio LIT, inoculada en una botella de 25 cm2, e
incubada a 26°C hasta que se obtuvo un crecimiento masivo.
c. Se reaIizaron subcultivos del parásito, hasta obtener crecimiento adecuado del estadío de
epimastigote de T. cm-i, en un total de 10 botellas de cultivo.
d. Los epimastigotes fueron agregados a 40 botellas conteniendo una capa de células, las
cuales fueron incubadas a 37°C.
e. Cada 48 horas, las botellas con la monocapa de células y parásitos, fueron evaluadas
microscópicamente para observar el aparecirniento de los estadíos de arnastigote y
posteriormente de tripomastigotes. Así también se realizó cambio de medio de cultivo.
f. Cuando la cantidad de tripomastigotes observada fue abundante, se iniciaron los conteos
de parásitos, eligiendo las botellas que contuvieran como mínimo un total de 106
parásitos.
g. Con el objeto de minimizar la probabilidad de contaminación de las botellas, se realizó
paralelamente la evaluación del uso de botellas de mayor volumen (75 cm2), las cuales
fueron pobladas con el equivalente de células necesarias para tres botellas peque-as, y
por el éxito obtenido, este procehmiento quedó estandarizado.
h. Paralelamente se mantiene una botella con epimastigotes de T. cruzi en medio LIT a 26
"C.
Obtención y purificación de los parásitos
Preparación de reactivos
Para este paso se prepararon los siguientes reactivos
Solución salina de fosfato - glucosa (PSG)
Carboxi-metil celulosa (CM-celulosa)
Medio de cultivo con Carbonato (10%)
Preparación de la columna de CM-celulosa
Se armó la columna con un anillo, soporte de metal y una jeringa de 50 m1 de plástico, sin
aguja y con el extremo delgado hacia abajo. En el extremo se le adaptó una manguera
plástica delgada con una pinza para regular la velocidad de goteo del líquido eluyente. La
velocidad de elucibn no debe de ser mayor de 6 - 8 m1 por minuto.
Se colocó un pedazo de lana de vidno, humedecida con agua destilada, en el fondo de la
jeringa, se agregb la suspensión de CM-celulosa a manera de formar una columna 3
compacta de 30 cm evitando la formación de burbujas de aire dentro de la columna.
Se agregó aproximadamente 50 m1 de medio con carbonato o solución de PSG y se dejb
eluir hasta que llegara a una altura de 5ml arriba de la celulosa.
Paralelamente, en forma aséptica se recolectó el medio de las botellas que tenían una
buena cantidad de tripomastigotes y se colocó en tubos de centrifuga cónicos de 50 ml.
Se agregó medio fresco a las botellas con células infectadas para la obtención de nuevos
parásitos.
Se centrifugb los tubos que contenían los parásitos durante 10 minutos a 3000 rprn.
Se aspiró el medio y se recolectaron todos los parásitos en un solo tubo.
Los parásitos se suspendieron en medio (máximo 40 ml) y se homogenizó la suspensión.
Se eluyeron los parásitos en la columna, recolectándose todos los eluídos en los cuales se
observaron formas tripomastigotas. Al aparecer epimastigotes se dejó de recolectar.
Los eluidos con tripomastigotes fueron centrifugados y el sedimento se lavó con PBS tres
veces.
En una cámara de Neubauer se realizó el conteo de los parásitos.
El sedimento conteniendo los parásitos fue almacenado a - 70 "C en un tubo eppendorf.
1.4. Sensibilización de partículas de Iátex.
1.4.1. Preparación de reactivos
Los reactivos utilizados en esta fase fueron los siguientes:
Acido clorhídrico (HCl) 6N, 3N y 1N.
Solución de 2-amino-2-metiI- 1 -propano1 (AMP) 1 M.
Solución de 2-amino-2-metil-l-propano1 0.2 HCl, pH 8 con Anda de Sodio
1.4.2. Preparación de1 antigeno:
a. Se descongeló uno de los viales que contenían los tripomastigotes purificados, los que
fueron suspendidos en solución de AMP 0.2 M hasta obtener una concentración de lo6
parásitos. La suspensión se homogenizó con agitador tipo vortex.
b. La suspensión se congeló (- 70 "C) y descongeló (37 "C) cinco veces. Entre cada proceso
se homogenizó la suspensión con vortex.
C. La suspensión fue sometida a un proceso de sonicación por 15 minutos.
d. La suspensión fue centrifugada a 10,000 rpm por 10 minutos y se descartó el sedimento.
El sobrenadante se almacenó a - 70 "C hasta el momento de su uso.
1.43 SensibiIización de las particulas de lhtex
a. La suspensión conteniendo las particulas de látex se agitó por inversión continuamente
hasta suspender todas las ~ ' c u l a s de látex contenidas en el mismo.
b. Las partículas se suspendieron en solución de AMP 0.2 M y se agitaron por inversión
para mezclarlas completamente, este constituyó el primer lavado de partículas.
c. La suspensión fue centrifugada a 6,000 rpm durante 5 minutos. Pasado el tiempo de
centrífugación, el sobrenadante fue aspirado cuidadosamente para no remover las
partícdas de látex sedimentadas.
d. Las partículas sedimentadas keron suspendidas nuevamente en el AMP y se repitió dos
veces más el procedimiento de los incisos b y c.
e. Luego de la tercera lavada de partículas éstas fueron suspendidas en el volumen de AMP
adecuado para conservar el volumen original.
f. Las partículas de látex ya lavadas fueron colocadas en un tubo y se dio inicio al proceso
de sensibilización de las mismas adicionando igual cantidad de la solución de antígeno
preparado en el inciso 1.4.2.
g. El tubo conteniendo el reactivo fue incubado a 37 "C un mínimo de 90 minutos.
h. El reactivo se lavó dos veces con solución de AMP 0.2 M HCI. Luego de cada lavado se
centrifugó con las condiciones descritas en los incisos b y c.
1. El sedimento de partículas obtenidas se suspendió en AMP-HCI 0.2 M- Azida de Sodio.
J. Se realizaron pruebas cun los controles positivo y negativo para evaluar el reactivo.
2. Evaluación del reactivo
Se elaboraron 33 m1 de reactivo, el cual fue suficiente para realizar 6,600 pruebas. Con
este reactivo elaborado se cumeron muestras controles positivos y negativas conocidas
evaluándose el resultado obtenido, así como el tipo de aglutinación producido. Esta evaluación
se realizó periódicamente (cada mes) a fin de observar si el reactivo presentó alteración o
cambios en la apariencia fisica (aglutinación, cambio de color, coagulación, contaminación
bacteriana, etc.). Al mismo tiempo que se procesaron los controles negativo y positivo, se
incluyeron 41 sueros de pacientes que acudieron al departamento de Citohistología para que se
les realizara o confirmara el diagnóstico de la enfermedad de Chagas.
Se realizó la comparación de los resultados obtenidos con nuestro reactivo de látex y el
reactivo de ELISA de la compañía ABBOTT Diagnósticos, el cual utiliza el equipo Quantum.
Para ello se recolectó una muestra de suero & 1002 sefioras embarazadas que acudieron al
hospital de Gineco-Obstetricia del Seguro Social a su control prenatal. Estas muestras fueron
evaluadas por la misma persona y el mismo lote de reactivo. La técnica de ELISA se realizó de
acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Por otro lado, se utilizaron 6000 pruebas para el estudio "Trypanosoma cruti y segundad
sanguínea: Una evaluación en Bancos de Sangre y prácticas de transfusión en Guatemala" el cual
esta siendo realizado por la Licda. Nidia Rizzo y el Dr. Byron Arana de la Universidad del
Valle.
Se solicitó la colaboración de la Dra. Eufrosina Umezawa, Directora del laboratorio de
Protozoología del Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Brasil; para que se confirmaran
los resultados que se estaban obteniendo con el reactivo de látex. Para ello se seleccionaron 185
sueros que se encontraban almacenados en -70 "C, pertenecientes a varios estudios realizados por
este departamento en los últimos aííos, los que se enviaron a dicho laboratorio para su proceso.
Se realizaron gestiones en los diferentes bancos de sangre a fin de obtener plasma de
pacientes positivos y negativos para la Enfermedad de Chagas, éstos fueron evaluados por vanas
técnicas serológicas para confirmar la positividad o negatividad a T. cruzi. y serán incluidos
como controles en cada kit
3.. Promoción del reactivo
Se preparó un documento informativo sobre la Enfermedad de Chagas y la importancia
de su diagnóstico para ser publicado en el periódico Prensa Libre.
El día 12 de junio de 1998, se participó como conferencista en el Simposium
"Diagnóstico de infecciones obtenidas por Transfusión", en el cual participaron profesionales
Químicos Biólogos, practicantes EPS de la carrera de Química Biológica de los diferentes
Hospitales Nacionales, estudiantes de los últimos anos de la carrera, personal técnico de
laboratorio y de banco de sangre. Esta actividad se llevó a cabo en el auditorium de la Cámara de
indusiria.
Se participó en varias reuniones con el Lic. Miguel Torres, Jefe del Laboratorio Central
de Referencia del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social.
Se participó como conferencista en el curso de especialización de Inrnunohematología y
Banco de Sangre el cual se imparte a profesionales Químicos Biólogos, donde se impartió la
clase "Enfermedad de Chagas transfusional"
Del 23 al 24 de octubre de 1998, se participó en el Taller de seguimiento para la
Eliminación de la Enfermedad de Chagas en Centroamérica, organizado por el Ministerio de
Salud Pública y la Organización Panamericana de la Salud.
Los días 17 y 18 de febrero se asistió al Taller para la creación de la red nacional de
Bancos de Sangre, el cual se llevó a cabo en las instalaciones del Colegio de Profesionales y fue
organizado por la Comisión de Bancos de Sangre y la Oficina Panamericana de la Salud.
El jueves 18 de marzo de 1999 se asistió al Hospital Nacional de Jalapa para dictar la
conferencia titulada "Epidemiología de la Enfermedad de Chagas".
El día miércoles 25 de agosto se llevó a cabo el curso "Cnizi-Látex: una nueva
alternativa para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas, el cual se realiz6 en el Laboratorio
de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia como parte de las actividades
de Congreso "A las Puertas del Año 2000 organizado por la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia. Esta actividad se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacia en la ciudad. El programa de esta actividad incluyó:
14:OO a 14:45 Descripción de la enfermedad de Chagas, diagnóstico y epidemiología
Licda. María Eugenia Paredes Sánchez
14:45 a 15:30 Estudios de evaluación y presentación del reactivo Cruzi-Látex
Licda. Vivian Lucrecia Matta Rios
15:30 a 16:OO Coffee Break
16:OO a 17:30 Taller práctico sobre el uso del reactivo Cnizi-Látex
Licda. María Paula de León Granados
Licda. Arnanda Elisa Gálvez Figueroa
17:30 a 18:OO Plenaria
Licda. Ana Margarita Paz Morales
La otra actividad planificada está dirigida al personal técnico y profesional que labora en
la red nacional de laboratorios clínicos y bancos de sangre del Ministerio de Salud Pública y
Asistencia Social. La duración de la misma será de ocho horas y se cubrirá el diagnóstico de la
Enfermedad de Chagas, tanto serológico como parasitológico, así como el uso y ventajas del
reactivo Cnizi-látex. Esta actividad está programada para la segunda quincena del mes de
noviembre próximo.
4. Comercialización y distribucibn
Se realizaron las consultas necesaria para conocer el trámite para la obtención de la
patente del reactivo.
Se solicitó una cotización para el diseiío de la presentación del empaque, propaganda e
inserto del reactivo de látex a la agencia de publicidad "Opción". Se elaboró la información
necesaria para el inserto, empaque, y otro material que pudiera servir de promoción. El pasado
mes de mayo este material fue entregado a la Srita. Tatiana Salazar, editora-disefíadora de
CONCYT para la preparación del material y su posterior impresión.
VL RESULTADOS Y DISCUSION
La primera actividad del proyecto consistió en la descongelación de la células NBMH
las que también se encontraban almacenadas a -70 "C. El cultivo de células se inició con dos
botellas rotuladas como Lp, y Lp,. Estas botellas se evaluaron cada 48 horas, se les cambió
medio y cuando se observó que el crecimiento de células fue el adecuado y que cubrió el área
completa de la botella se realizaron subcultivos. Se trabajo un total de 44 botellas, siendo Lp, y
Lp, los originales y Lp, a Lp, los subcultivos. Estas fueron utilizadas para realizar otros
subcultivos llegando a tener 125 botellas de 25 cm' para finales de julio de 1998 (tabla No. 1).
Tabla No. 1. Su bcultivos celulares
Las botellas Lp,, a la Lp, presentaron contaminación con hongos en el mes de Junio, por
lo que tuvieron que ser descartadas.
Se observó que el número de botellas a utilizar para la producción masiva iba a ser mayor
de 125 ya que el área disponible para el cultivo es muy reducida, por ello el riesgo a sufrir
contaminación ya fuera por bacterias u hongos era muy alto. Por otro lado el mantenimiento de
un gran número de botellas implicaría un consumo mayor de reactivos y de tiempo. Por tal
motivo a paríir de las células no contaminadas, en el mes de Julio se realizó un nuevo subcultivo
utilizando para ello botellas con una capacidad mayor (75 cm'), con el fin de evaluar los
beneficios que representa.
Al mismo tiempo se realizó el crecimiento de T. cruzi cepa MHOM/GT/95/SMI-07, la
cual se encontraba almacenada a -70°C. Esta fue cultivada en medio LIT a 26 'C. Al observarse
un crecimiento adecuado el número de botellas con parásitos aumentó a diez, las que se
evaluaron periódicamente con el fin de observar presencia de turbidez en el medio, forma y
numero de parásitos y determinar si el cultivo estaba progresando satisfactoriamente. El tiempo
necesario para que la cepa se estableciera después de la descongelación y se multiplicara
adecuadamente en las diez botellas fue de dos meses. 2
Cuando las botellas de 75 cm de células mostraron un buen crecimiento, se
infectaron simultáneamente botellas de ambos tamaños, para ello se inocularon las botellas de 25 2 6
cm con 0.5 m1 de una solución que contenía 9.2 X 10 parásitos/ml mientras que las botellas de
75 cm2 con 1.5 m1 de la misma solución El propósito fue evaluar la proliferación de parásitos,
determinar el tiempo necesario para la producción adecuada de parásitos y para el mantenimiento
de las células sin que se observe desprendimiento celular, es decir evaluar la vida media y la
productividad de las botellas de mayor tamaiío para considerar la posibilidad & trabajar
únicamente con ellas. Se evaluó también la tripsinización, crecimiento y población en los
cultivos de los dos tipos de botellas simultáneamente.
AI iniciar esta evaluación se observó que el tratamiento de las células con tripsina para
realizar los subcultivos estaba dando cierto problema ya que era dificil desprender las células de
la superficie & las botellas. El tiempo que se dejaban las células con tripsina no era suficiente y
éste no podía prolongarse ya que se altera la morfología de las células con riesgo de que pierdan
su funcionalidad. Se realizó entonces una revisión bibliográfica de los cultivos celulares
observándose que la solución de PBS (Dulbecco) que se estaba utilizando no era la adecuada, por
lo que se preparó una nueva solución libre de Magnesio y Calcio, ya que éstos cationes pueden
interferir inhibiendo el desprendimiento de las células. Se pudo observar que con esta nueva
solución las células se desprendieron fácilmente de la superficie de las botellas.
A finales del mes de agosto se observó contaminación con bacilos, lo cual según la
Iiteratura revisada, probablemente se debía a la mala esterilización de los materiales y reactivos
utilizados para el cultivo celular. Por tal motivo se solicitó asesoría de la casa comercial Merck
centroamericana para que nos indicaran el proceso a seguir para evaluar si el horno para
esterilización en seco y el sutoclave estabaii funcionando correctamente. El departamento de
Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia proporcionó ampollas con
Bacillus stearotItermophylus (Stenkon Bioindicador ', Merck), que es la bacteria sugerida por la
casa comercial para controlar el proceso de esterilización.
Se realizaron varios controles tanto al autoclave como al horno, encontrando que todo el
proceso de esterilización en seco (usada para esterilizar pipetas) y el proceso de autoclaveado
(para esterilizar soluciones y reactivos) se llevan a cabo correctamente.
Así también se realizaron controles de esterilidad a 37 OC a las botellas que contienen
suero bovino fetal (FBS) y suero de ternero recién nacido WCS) para evaluar su esterilidad No
se pudo encontrar la causa de la contaminación de la línea celular, por lo que probablemente se
debiera a errores en la manipulación. Por ello se tuvo que descartar todo el lote de botellas con
línea celular e iniciar nuevamente el cultivo, usando para ello células almacenadas en nitrógeno
líquido.
Al eliminar el riesgo de contaminación y el problema con la tripsinización, se inició la
comparación de ambas botellas. Estas fueron evaluadas cada dos días para verificar la
morfología celular, velocidad de crecimiento, infección intracelular del parásito y ausencia de
contaminación. Todas las botellas se comportaron de la misma forma, ya que en todas se observó
gran cantidad de amastigotes dentro de los primeros tres días posteriores a la inoculación, y
luego de seis días empezaron a producir tripomastigotes. El primer recuento de parásitos se
realizó ocho días después de la infección y posteriormente a intervalos de dos a tres días (tabla
No. 2).
Como puede observarse en la tabla No. 2, el número de parásitos obtenidos en una botella 2 2
de 75 cm es ligeramente mayor que la recuperada en tres botellas de 25 cm . Al aplicar el
estadístico "z" con un 95% de nivel de confianza se obtuvo un dato calculado de 0.5476, el cual
es menor que el '2" teórico de 1.96, lo que nos indica que no existe diferencia estadísticamente
significativa entre el número de parásitos obtenidos utilizando una botella de 75 cm2,
comparados con 3 botellas de 25 cm2. Sin embargo, el utilizar botellas grandes permite la
manipulación de un menor número de botellas, se disminuye el riesgo de contaminación y se
incrementa el área disponible para que las dlulas proliferen. Basándose en estos resultados se 2
tomó la decisión de trabajar únicamente con botellas de 75 cm .
Tabla No. 2. Recuentos de tripomastigotes de T. cmti en las botellas de cultivo
6 Nota: los recuentos se expresan en numero de parisitos x 10 .
Las botellas con células fueron evaluadas periódicamente y cuando la cantidad de
parásitos fue la adecuada éstos fueron recolectados asépticamente. En esta suspensión se pueden
encontrar diferentes estadíos del tripanosoma así como células que se desprenden de las botellas.
Para la producción del antígeno únicamente se utilizan tripomastigotes, por lo que para obtener
una suspensión pura se preparó una columna de CM-celulosa para realizar la purificación por
intercambio catiónico, ya que tanto las células como los epimastigotes y tripomastigotes
metacíclicos presentan mayormente una carga eléctrica positiva por lo que son atrapados en la
columna, mientras que los tripomastigotes por su carga eléctrica negativa son eluidos en la
columna.
La columna de CM-celulosa se preparó en una jeringa plástica, la que se colocó con el
extremo delgado hacia abajo, al cual se adaptó una manguera plástica y una pinza para regular la
velocidad de elución la cual debe ser constante y no mayor de 6 a 8 milminuto. Para preparar la
columna se hidrató 24 horas antes la celulosa con agua destilada hasta que formar una
suspensión de consistencia adecuada. Esta celulosa hidratada se colocó en la jeringa y se preparó
una columna compacta de una altura de aproximadamente 2 - 3 pulgadas. El pH de la columna
posteriormente se cambió utilizando para ello el buffer fosfato salino de glucosa. En las
primeras obtenciones de antígeno se utilizó CM-celulosa marca WACO catalogo No. 035-
15225, y fitr necesario modificar el pH de ácido a básico antes de iniciar la elución & los
parásitos. Posteriormente se utilizó CM-celulosa marca Sigma catálogo E-2020, la cual poseía
un pH básico por lo que no fue necesario agregar el buffer fosfato salino de glucosa para
modificar el pH. Así también, se observó que con ésta última celulosa, la columna fue más dificil
de preparar ya que se compactaba demasiado, por lo que la velocidad de elución fue mas lenta.
Al terminar de eluir los parásitos éstos fueron lavados con solución salina fosfatada por
tres veces y posteriormente se realizó el recuento de los mismos utilizando una cámara de
Neubauer. Estos parásitos fueron almacenados a -70 "C por tiempo indefinido.
La recolección de parásitos se ha realizado desde el mes de noviembre de 1998 a la fecha
y en la tabla No. 3 se indican los recuentos obtenidos. Es importante mencionar que la
concentración de pmhitos más adecuada para la preparación del reactivo es lo9. Así también
debe indicarse que la recolección de parásitos debió de ser suspendida del 18 de diciembre de
1998 al 8 de enero de 1999, ya que la instalaciones del Departamento de Citohistología estuvieron
cerradas por período de vacaciones. Este período de receso nos obligó a que a principios de
enero se empezara nuevamente con el cultivo celular; por lo que al obtener 100 botellas con
monocapa de células, éstas fueron infectadas con 0.5 m1 de epirnastigotes y fue necesario
esperar nuevamente a que se estableciera la infección para iniciar nuevamente la recolección de
los parásitos.
Como se puede obszrvar en la tabla No. 3 a la fecha se ha recolectado un total de 55 m1
de parásitos, los que permitirán la producción de 110 rnl de reactivo, es decir reactivo suficiente
para realizar 36,666 pruebas si la cantidad utilizada e5 3 u1 (36 kits de 10n pruebas c/u). Sin
embargo si se utilizan 5 esl, el número de pruebas que se pueden realizar son 22,000 (22 ka'ts de
100 pruebas c/u).
Tabla No. 3. Recuentos de cultivo a gran escala de tripomastigotes de Trypanosorna cmzi
A partir de enero se utilizó medio MEM suplementado con antibióticos (Penicilina G y
Estreptomicina), con el fin de disminuir la posibilidad de contaminación de los cultivos de la línea celular. Sin embargo, se observó una disminución en la velocidad de crecimiento y
proliferación de las mismas, por lo que se decidió trabajar sin ellos, únicamente trabajando con
un mayor cuidado a fin de evitar cualquier contaminación.
Los frascos conteniendo subcultivos de linea celular, así como los de células infectadas con parásitos se evaluaron dos veces por semana. Esta evaluación consistió en observación al
microscopio, cambio de medio, tripsinización cuando se consideró conveniente y la recolección
de parbitos para obtención de antígeno.
En lo que se refiere a la preparación de reactivo, a pesar que la técnica ya estaba estandanzada, se realizaron varias evaluaciones con diferentes formas de almacenaje, entre ellas
goteros de vidrio, tubos eppendorf y frascos plásticos. Se pudo concluir que el reactivo puede ser almacenado en cualquier recipiente ya que no sufre ninguna alteración, aglutinación o
disminución de la reactividad, lo más importante es que antes de su uso se realice una buena agitación y que siempre se almacene de 2 - 8 "C. Se observó que si se almacena a temperaturas
más bajas el reactivo sufre coagulación, lo que imposibilita su uso. Por otro lado, se evaluó la
forma en que el reactivo puede ser dispensando. Se compararon agujas cortadas de calibre tipo
tuberculina, 23 G X 1 114, 22 G 1 112, 21 G 112 o puntas plásticas para pipetas automáticas que
dispensan de 3 - 5 pl. Las diferentes pruebas realizadas nos demostraron que al usar aguja sin
importar el calibre de la misma, existe el riesgo que el reactivo se seque dentro de la aguja, por lo que ésta se tapa y ya no es posible dispensar nuevamente reactivo. Este reactivo que se solidifica
dentro de la aguja, altera también la concentración del reaciivo remanente en el recipiznte y por consiguiente los resultados obtenidos durante el proceso de las muestras no serán confiables.
Para evitar este problema se decidió que el reactivo se envasará en tubos eppendorf con capacidad de 1000 m1 y para dispensarlo se recomendará el uso de pipetas serológicas que dispensen de 3 a 5 pl.
A la fecha se han preparado 33 m1 de reactivo de látex, suficiente para realizar 11,000
pruebas. El cual ha servido para la estandanzación del mismo, en e s difxentes procesos.
El primero, se realizó periódicamente en el Departamento y consistió en ofrecer el
senricio de diagnóstico y10 confirmación a los laboratorios clínicos o pacientes que lo solicitaron. De febrero a la fecha se han procesado 41 muestras de sueros, las cuales fueron procesadas
paralelamente con los controles positivo y negativo. Para ello se utilizci el mismo lote de reactivo producido a principios de afio, y permitió evaluar la respuesta obtenida en cada uno de los
controles, el grado de aglutinación, nivel de diferenciacibn entre un resultado positivo y un neg~tivo, apariencia y color del reactivo. En las 41 rnuestrs procesadas se pudo observar que el
jpdo de aglutinación fue siempre claro y definido, el cual permitió evaluar con facilidad la
negatividad o positividad del mismo. A través de los ocho meses no se ha observado ninguna
diferencia en la respuesta obtenida con los controles. En relación a los resultados obtenidos con las 41 muestras referidas, 33 fueron negativas y 9 positivas (21.95%). Todas las muestras que
dieron un resultado positivo fueron confirmadas con otra metodología como puede observarse en la Tabla No. 4. Los reactivos utilizados de Hemaglutinación Indirecta, de Aglutinación con
partículas de Gelatina y de ELISA son comerciales, mientras que los de Inmunofluorescencia son
preparados en el departamento con cepas guatemaltecas.
Tabla ic'o 4. Confirmación de las muestras nositivas en Aaiutinación de Partículas de LBtex
No. Látex Hemaglutinación Aglutinación con mas Indirecta partículas de Gelatina
1 Positiva Positiva > 1:256 ELISA: Positivo
2 Positiva No se realizó >1:256
3 Positiva Positiva >1:256
4 Positiva Positiva 1:128
5 Positiva Positiva 1:128
6 Positiva Positiva 1 :64
Positiva >1:256
8 Positiva No se realizó 1:128 Inmunofluorescencia 1 :40
ELISA: Positivo 9 Positiva Positiva 1512 Inmunofluorescencia
El segundo proceso de evaluación se realizó comparando nuestro reactivo cclr? el método de ELISA de la compañía ABBOTT. Esta decisión se tomó basándose en que en Ia mayoría de
bancos de sangre de la ciudad, se utiliza ese reactivo para el diagnóstico de la enfirmedad de
Chagas. Para ello se recolectó una muestra de suero de 1002 seíioras embarazadas que acuden al servicio de laboratorio del Hospital de Gineco-obstetricia para realizar su control prenatal. Estas
muestras fueron procesadas simultaneamente con el reactivo de látex y el de ABBOTT. Los resultados obtermidos se pueden observar en !a tabla No. 5. El índice de concordancia obtenido
fue de 0.99, un índice de Kappa de 0.99, índice de co-positividad de 0.57 y un índice de co-
negatividad de 0.99.
Tabla No. 5 Comparaci6n de los reactivos de lhtex - USAC y ELISA - ABBOTT
ELISA ABBOTT
Todas las muestras positivas y con resultados diferentes en las dos metodologías, fueron
confirmados por una tercera técnica que fue la Inmunofluorescencia Indirecta, obteniéndose los
siguientes resultados: siete de las muestras positivas por ambos métodos fueron positivas
también por Inmunofluorescencia y una fue negativa. De las cuatro muestras que dieron positivo
por Látex, pero negativo el ELISA, dos dieron resultados positivos en Inrnunofluorescencia, una
fue positiva y la última dio resultado dudoso. Al evaluar las seis muestras positivas para ELISA
y negativas para Látex, cinco fueron negativas con Inmunofluorescencia y una con resultado dudoso.
Este estudio fue importante porque también permitió determinar la prevalencia de
anticuerpos a Tcruzi en esta pobIaci6n y establecer si se hace necesaiio instituir esta prueba en
el control prenatal de toda mujer embarazada por el riesgo de la infección congénita. El
porcentaje de prevalencia obtenido fue de 0.80 %, el cual se calculó tomando en cuenta
únicamente el número de muestras positivas a las dos pruebas utilizadas en este estudio,
porcentaje que se consideró bajo para justificar establecimiento de esta prueba en la rutina
prenatal.
El tercer proceso incluyó una de evaluación tanto del reactivo como de la metodohgía de
aglutinación látex. Para ello se participó en el estudio de "Typanosoma cruzi y seguridad
sanguínea: LJna evaluación en Bancos de Sangre y prácticas de transfusión en Guatemala", el
cual está siendo conducido por la Universidad del Valle de Guatemala. Uno de los propósitos
de participar en este estudio, fue evaluar la eficiencia de nuestro reactivo al ser comparado con
otras metodologías que serán aplicadas durante el desarrollo del mismo, así como de la
apliabilidad de esta técnica sencilla en un n h e r o de muestras grande Para el efecto se
proporcionó reactivo suficiente para 9000 pruebas y se entren6 al personal a cargo, sobre el
procedimiento, manejo e interpretación de la prueba. Este entrenamiento t u ~ o duración de una semana y se llevó a cabo en las instalaciones del Departamento de Citohistología, Posteriormente se visitaron las instalaciones de la Universidad del Valle para revisar la forma en que se
realizaría el procedimiento. Fue nuestra responsabilidad realizar el control de calidad tanto de las
pruebas realnadas como de la interpretación de resultados. Para ello recibimos 226 muestras selecciona&s al azar, las cuales fueron procesadas por la Universidad del Valle y en el
Departamento de Citohistología. Al comparar los resultados se obtuvo un 7.6% de discrepancia
debido en su mayoría, a que pruebas negativas fueron consideradas como positivas por la
Universidad del Valle. Es de nuestro conocimiento que todas las muestras ya fueron evaluadas y
que se está realizando el análisis estadístico correspondiente, por lo que aún no se ha
proporcionado el informe final de esta investigación. Es de nuestro interés conocer los
resultados, ya que simultáneamente las muestras recolectadas fueron procesadas con el reactivo de ELISA de ABBO?T Laboratorios, todo suero positivo en por lo menos una metodología, fue
enviado a la Cruz Roja Americana para su confirmación por radioinmunoprecitación (RIPA).
Con el fin de conocer el grado de confiabilidad del reactivo producido y su
comportamiento en relación a otros reactivos producidos con cepas de T. c r z i brasileñas, se solicitó la colaboración de la Dra. Eufrosina Umezawa, Directora del laboratorio de
Protozoología del Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Brasil; para que se confirmaran
los resultados que se estaban obteniendo con el reactivo de látex. Solicitamos esta coiaboraci6n
ya que se deseaba conocer ia correlación de nuestro reactivo con el preparado por la Dra.
Umezawa quien utiliza epimastigotes de la cepa brasileña "Y" (cepa ampliamente utilizada en
trabajos de investigación a nivel mundial). Para ello se seleccionaron 252 sueros que se
encontraban almacenados en -70 OC, pertenecientes a varios estudios realizados por este departamento en los últimos afíos, los que se enviaron a ese laboratorio para su proceso. Todos
estos sueros habían sido procesados con el reactivo de látex y los resultados tanto positivos como
negativos confínnados con al menos dos técnicas más, entre ellas: Inmunofluorescencia,
aglutinación con partículas de gelatina, hemocultivo, Inmunodifusión radial. En Sao Paulo, los
sueros fueron procesados con la técnica de ELISA utilizando como antígeno, el extracto protéico de epimastigotes (ELISA-EPI) y ELTSA con una mezcla de cinco péptidos sintéticos. Los resultados se resumen en las Tablas No. 6 y No. 7.
Tabla No. 6. Comparación del reactivo de látex con la técnica de ELISA , utilizando epimastigotes. Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo
Es importante mencionar que de los 57 sueros que dieron positivo en látex y negativo el
ELISA, 25 tenían como única prueba positiva la reacción de látex y en el reporte existía la
observación que la aglutinación observada fue leve (+). Mientras que 26 tenían al menos dos
pruebas positivas (Inmunofluorescencia Indirecta; Aglutinación de partículas de Gelatina,
Fujirebio"; Inmunodifusión), por lo cual nosotros habíamos confirmado la positividad de la
muestra, y seis muestras tenían cultivo positivo para T. cruzi, las doce muestras positivas por
ELISA y negativas por Látex, tenían al menos dos pruebas negativas por los métodos antes
mencionados. Pudiera ser que el reactivo preparado en Sao Paulo con una cepa brasileÍía no haya
sido reconocido por los anticuerpos de los pacientes, y que esta ausencia de reacción sea
derivada de las diferencias que existen entre las cepas de T. cm-i guatemaltecas y brasileñas, lo
cual reforzaría nuestra sugerencia que el diagnóstico debe de realizarse con antigenos obtenidos
de cepas del pa's, pues se ha observado variación antigénica entre las cepas de diferentes países.
Es importante mencionar que el índice de correlación obtenido es 0.73, el índice de Kappa de
0.48, el índice de co-positividad de 0.88 y el de co-negatividad de 0.99.
Al evaluar los resultados obtenidos por el ELISA que usó como antigeno una mezcla de
cinco péptidos sintéticos se obtuvo un índice de concordancia de 0.87, un índice de Kappa de
0.75, un índice de co-positividad de 1 .O y de co-negatividad de 0.77.
Tabla No. 7. Comparación del reactivo de 14tex con la técnica de ELISA , utilizando una mezcla de cinco péptidos sintéticos. Instituto de .Medicina Tropical de Sao Paulo
Se obtuvo la colaboración de la Licenciada Sonia González, Jefa del Banco de Sangre del
Hospital de Gineco-Obstetricia y de la Licenciada Nancy Ayala Jefa del Laboratorio del Hospital
Nacional de Chiquirnula, quienes nos proporcionaron plasmas de pacientes positivos y negativos
para Enfermedad de Chagas, y negativos para HIV, Hepatitis B y C. Estos plasmas fueron
evaluados por varias técnicas serológicas para confirmar la presencia o ausencia de anticuerpos
a T. crzci , posteriormente &ron alicuotados y almacenados a -70°C. Estos plasmas serán
incluidos en cada kit como control positivo y negativo.
Durante el tiempo que duró el proyecto se preparó una serie de reactivos, los cuales
fueron utilizados, primero en el proceso de establecimiento de los cultivos celulares, parasitarios
y celular infectado, ya que por sus características especiales requieren de un cambio constante de
medios de cultivo. Segundo, en la estandarización de la producción del reactivo de látex, y
producción de 66 kits que fueron utilizados para el proceso de evaluación del reactivo y, tercero
en la obtención del antígeno suficiente para la futura preparación de 220 kits, los que serán
comercializados.
En la tabla No. 8 se detalla el total de reactivos usados en el '-.;.nscurso de la
investigación.
Tabla No. 8. Reactivos utilizados en la preparación del reactivo de látex
Para iniciar la promoción del producto se preparó un documento informativo sobre la
enfermedad de Chagas y la importancia de su diagnóstico, para que fuera publicado en el
periódico Prensa Libre (Anexo No. 1). Así también se prepararon varias fotografias y los
fothgrafos de Prensa Libre nos visitaron para conocer el área de trabajo y tomaron otras
fotografías. Sin embargo esta publicación nunca se realizb.
Se participó como conferencista en el Simposium "Diagnóstico de infecciones obtenidas
por Transfusión", el cual se llevó a cabo en el auditorisim de la Cámara de industria contándose
con una asistencia de 77 personas, incluyendo profesionales Químicos Biólogos, practicantes
EPS de la carrera de Química Biológica de los diferentes Hospitales Nacionales, estudiantes de
los últimos afios de la carrera, personal técnico de laboratorio y de banco de sangre. Es este
simposium se enfatizb sobre la necesidad de estandarizar el diagnóstico de la enfermedad de
Chagas y se hizo ver que el Departamento de Citohistología se encontraba estandarizando una
nueva metodología para el diagnóstico de la Enfemedad de Chagas, la cual seria ofrecida en
fecha prbxima en los diferentes Hospitales, Bancos de Sangre y laboratorios c Iínicos, públicos y
privados, lo cual despertó mucho interés entre los participantes.
Se elaboró la información necesaria para el inserto, empaque y otro material que sirva de
promoción, la cual fue entregada a la Srita. Tatiana Salazar de CONCYT a finales de mayo para
la preparación del material y su posterior impresión.
Se decidió que el nombre del reactivo fuera "Cruzi-látex" y que la presentación de los
kits fuera de 100 pruebas. En los Anexos 2-4 se adjunta el formato del inserto, empaque y
material de propaganda, los cuales serán utilizados para la promoción del reactivo
Se participó en varias reuniones con el Lic. Miguel Torres, Jefe de la Red Nacional de
Laboratorios del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social a fin de organizar lo siguiente:
a. Que el reactivo de látex producido por este departamento sea utilizado en todos los
hospitales y laboratorios clínicos de la red nacional del Ministerio de Salud Pública.
b. Que el departamento de Citohistología se encargue del control de calidad en el
diagnóstico de la Enfermedad de Chagas a nivel nacional y que siga funcionando como
centro nacional de referencia de esta enfermedad.
C. Que se establezca un procedimiento de control que permita que los reactivos que se
vendan en Guatemala presenten un alto porcentaje de sensibilidad y especificidad.
En estas reuniones se acordó que el reactivo podrá ser utilizado en los 22 departamentos
del país así como las autoridades solicitaron se les proporcionara el reactivo a un precio especial.
Inicialmente se distribuirá en los departamentos de Zacapa, Chiquimula, Jalapa, Santa Rosa, El
Progreso y Jutiapa, en los cuales se iniciará un programa de control de vectores el que estará a
cargo del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social, Universidad de San Carlos,
Universidad del Valle y Misión Japonesa. El consumo mensual estimado para estos seis
departamentos es de 3,500 pruebas.
En el curso llevado cabo el día miércoles 24 de agosto denominado Curso-Taller "Cnizi-
látex: una nueva alternativa para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas" (Anexo No.5). Se
contó con la participación de 17 profesionales, los cuales se detallan en la tabla No.9.
En este curso taller los participantes tuvieron la oportunidad de utilizar el reactivo,
interpretar una reacción positiva y una negativa, así como trabajar con muestras conocidas y
desconocidas. Algunos de ellos proporcionaron muestras de sus laboratorios y pudieron
comparar el resultado obtenido con Cruzi-Látex con el obtenido por ellos con reactivos
comerciales. Entre los comentarios vertidos por los asistentes están los siguientes:
- De fácil utilización, práctico y la interpretación es bastante clara.
- Reactivo útil, práctico y de fácil interpretación. - La técnica es rápida, fácil de realizar e interpretar
Tomando en cuenta el precio de los reactivos de látex que se encuentran en el mercado y
los insumos necesarios para la producción del Cruzi-Látex, se acordó que el precio por un kit de
100 pruebas será de seiscientos quetzales. Los fondos que se obtengan con la venta del reactivo,
serán utilizados para garantizar una producción contínua y serán manejados por la facultad de
Ciencias Químicas y Farmacia a través de un Fondo Privativo.
Como producto final se desea el registro de patente del reactivo de látex para el
diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Se habían iniciado los trámites para la obtención de la
patente, sin embargo se nos informó que estos trámites serán realizados por los abogados de
CONCYT.
VII. CONCLUSIONES
1. Se llego al acuerdo con las autoridades del Ministerio de utilizar el reactivo de látex - "Cnizi -látex" en la red de Laboratorios Clínicos y Bancos de Sangre del Estado para
unificar el diagnóstico de la enfermedad de Chagas.
2. Se logró la estandarización del cultivo celular (fibroblastos de corazón de ratón) y los
tripomastigotes de T. crwi, a las condiciones de cultivo in vitro en gran escala.
3. Durante el proceso de masificación, no se observó diferencia estadísticamente 2
significativa en el número de parásitos obtenidos al trabajar con botellas de 25 cm y 75
cm2, sin embargo se decidió trabajar con las de 75 cm2 por facilidad de manejo y evitar
el aparecimiento de contaminación.
4. A la fecha se produjeron 33 m1 de reactivo de látex, equivalente a 6,600 pruebas, con
muy buenos resultados, y se obtuvo antígeno para 220 kits de 100 pruebas cada uno, los
cuales están listos para la comercialización.
5. Se realizó el diseño del empaque, inserto y propaganda para la promoción y
comercialización del reactivo.
6. Durante las diferentes reuniones con el Lic. Miguel Torres, Jefe de la red Nacional de
Laboratorios Clínicos del MSPAS, se estableció, que cualquier muestra que requiera
confirmación en el diagnóstico de Enfermedad de Chagas, será referida al Departamento
de Citohistología, para su evaluación. Además en el inserto del producto se indica que
cualquier duda o confirmación podrá ser atendida en este departamento.
7. Se tiene contemplado prestar el servicio de Control de Calidad a todos los laboratorios
que consuman el reactivo "Cruzi-Látex". Este consistirá en el envío periódico de
muestras desconocidas y en la recepción de todas aquellas muestras que los usuarios
deseen enviar para su evaluación.
Tabla No. 9 Participantes en el Curso-Taller "Cruzi-Látex: una nueva alternativa para el
diagnóstico de enfermedad de Chagas*
Loarca Urnatia 1 Nacional de Salamá
VIII. RECOMENDACIONES
A. Del Proyecto
1. Realizar reuniones periódicas con las autoridades del Ministerio de Salud, para que, tan
pronto como el material de empaque esté disponible, pueda hacerse oficial el uso del
reactivo "Cruzi-Látex" para la unificación del diagnóstico de Enfermedad de Chagas a
nivel Nacional.
2. Llevar a cabo la actividad programada para el mes de noviembre a fin de dar a conocer
el reactivo "Cmi-Látex", a un mayor número de profesionales del sector salud.
3. Garantizar que la producción del reactivo "Cruzi-Látex", sea una actividad constante y
autofinanciable.
4. Realizar el servicio de confirmación de las muestras con resultados dudosos, así como el
servicio de control de calidad en una forma constante, a fin de mejorar el diagnóstico de
la enfermedad y además mantener una constante evaluación del reactivo.
5. Agilizar la obtención de la Patente del reactivo.
BIBLIOGRAFIA
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LUFORMACION FINANCIERA
Descripción del Presupuesto Global del Proyecto
INFORMGCION FINANCIERA
Descripción del Presupuesto Global del Proyecto
1 B. Gastos programados y pendientes de efectuar
a. Documentación e información b. Publicación de resultados c. Registro de Patentes d. Gastos no previstos
XL ANEXOS
Anexo No. 1
PRODUCCION DE UN REACTIVO DE LATEX PARA EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
;Qué es la enfermedad de Chagas? Es una infección conocida también como Tripanosomiasis americana que representa un
problema de salud pública en todo el continente americano, desde el sur de Texas en Estados Unidos hasta la Patagonia, en Argentina. Los reportes & la Organización Mundial de la Salud estiman que aproximadamente 18 a 20 millones de habitantes de Ias áreas rurales y urbanas padecen esta enfermedad y que al menos 90 millones se encuentran a riesgo de adquirirla.
El agente causal es un parásito microscópico, protozoario flagelado Ilarnado Trypanosoma cmr, el cual a través de la sangre del humano y de algunos otros mamíferos, invade células de órganos importantes como el corazón, esófago e intestino.
La enfermedad presenta varios estadíos: 1) Fase aguda, de corta duración, la cual puede presentarse con fiebre, dolor muscular, vómitos, diarrea, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, taquicardia, miocarditis y algunas lesiones neurológicas. En esta etapa un examen de sangre evidencia la presencia del parásito. 2) Fase indeterminada o silenciosa, en donde el individuo no presenta síntomas, los exámenes radiológicos y electrocardiográficos son normales, aunque los exámenes de sangre son positivos a las pruebas serológicas y el parásito puede ser detectado ocasionalmente. Durante esta etapa, el paciente constituye un importante reservorio de la infección y contribuye a mantener el ciclo de la vida del parásito. 3) Fase crónica, la cual tiene un desarrollo de varios a-os y puede presentarse en varias formas, dependiendo del órgano afectado. La forma cardíaca presenta manifestaciones clínicas que dependen del grado de lesión al músculo del c o d n o miocardio. Se encuentra insuficiencia cardíaca o amtmias. La arritmia más importante es la fíbrilación ventricular y es probablemente el mecanismo de la muerte súbita observada en los pacientes. La forma digestiva, puede involucrar cualquier porción del tracto digestivo, siendo los mas comúnmente afectados el esófago y el colon. En la etapa crónica también es posible encontrar daiio al sistema nervioso central, que ocasiona convulsiones, anormalidades psiquiátricas y muerte.
¿Cómo se transmite? La forma más común de transmisión de este parásito es a través de la picadura del insecto
vector (o portador), conocido comúnmente en Guatemala como chinche picuda o telepate, aunque su nombre varía en cada región. El insecto es un redúvido, que se alimenta de la sangre humana o animal. Al succionar sangre de una persona infectada, ingiere el parásito, el cual lleva a cabo una fase de su ciclo vital dentro del intestino del insecto. El parásito es eliminado por las heces de la chinche, la cual defeca al mismo tiempo que succiona sangre de un segundo individuo, el cual al rascarse en el sitio de la picadura facilita la introducción del parásito al organismo. Cuando el parásito se encuentra en el torrente sanguíneo es capaz de infectar otros órganos.
Otras formas de transmisión de Trypanosoma crzui pu xkn ser por transfusión de sangre contaminada, por transplante de órganos infectados o por vía transplacentaria, en la cual una madre con la enfemedad puede infectar al feto.
;Cómo se realiza el diagnóstico? Un signo muy característico de la enfermedad en la etapa aguda, es el llamado Signo de
Romaña, el cual consiste en edema o hinchazón de los párpados de uno de los ojos, aunque se observa en muy pocos casos.
Debido a que los otros síntomas de la enfermedad pueden sugerir una gran cantidad de otras enfermedades, la única manera de saber si se trata de la enfermedad de Chagas es por un examen de sangre.
El diagnóstico también se complementa con estudio radiológicos y electrocardiográficos en los pacientes en etapa crónica.
Enfermedad de Chagas en Guatemala En nuestro pis , la forma más frecuente de adquirir la enfermedad es por la vía del
vector, ya que las condiciones climaticas, los tipos de vivienda con material de construcción de adobe y bajareque, techos de paja, las costumbres y la falta de educación e higiene, favorecen la supe~vencia y reproducción del insecto. Las chinches habitan en las gnetas de las paredes, detr$s de almanaques y otros objetos colgados, cerca de las camas y en los lugares donde se mantienen los animales domésticos, principalmente las gallinas.
La enfermedad fue detectada desde 1932 y desde entonces se han realizado múltiples estudios para establecer las áreas afectadas, así como la prevalencia de la infección. Actualmente se sabe que los departamentos de Guatemala de mayor riesgo son: Chiquimula, Santa Rosa, Jutiapa y Alta Verapaz, seguidos de Zacapa, Baja Verapaz y Quiché, aunque es posible encontrar casos casi en toda la República, a causa de las migraciones.
¿Cómo prevenir la enfermedad de Chagas? El tratamiento de la enfermedad tiene un costo elevado y no existe una vacuna para
prevenirla. El único método para prevenir la transmisión por la vía del vector es eliminarlo. Esto se logra mediante fumigación de las paredes y modificando algunos aspectos de la vivienda. Es importante no tocar las excretas de los insectos, guardar los animales domésticos dentro de un corral, mantener las casas siempre limpias, para evitar que las chinches vivan dentro de las casas y de esta manera se disminuye el riesgo de contraer la enfermedad.
La transmisión de la enfermedad por la vía transfusional puede evitarse, examinando la sangre que se va a transfundir y asegurándose de que está libre de la infección.
Proyecto de Producción de Reactivo para el diagndstico de la enfermedad de Chagas Durante el período de 1992 a 1996, el Departamento de Citohistología de la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos, participó en un grupo multidisciplinario de investigación de la Enfermedad de Chagas como parte de un convenio entre USAC-Ministerio de Salud Pública-Agencia de Cooperación Internacional de Japón (JICA), para el estudio de Enfermedades Tropicales en Guatemala. Nuestro grupo enfocó sus esfuerzos a la optiniización del diagnóstico de la enfermedad de Chagas en el laboratorio. Durante este lapso, se llevó a cabo una importante transferencia de tecnología con Japón, obteniéndose entre muchos otros resultados, la producción y estandarización de un reactivo para el diagnóstico serológico de esta infección, el cual presenta múltiples ventajas.
Hasta 1993, el diagnóstico serológico de la enfermedad & Chagas se realizaba con reactivos coinerciales producidos en el extranjero, cuya aplicación a la fecha no ha sido posible
en todos los laboratorios, centros de diagnóstico y bancos de sangre del país, por diversas razones. Desde entonces se trabajó en la estandarización de un reactivo producido en nuestro laboratorio, que presentara alta especificidad y sensibilidad, aparte de otras ventajas. El reactivo producido se basa en la técnica de aglutinación rápida de partículas de látex, que puede realizarse en menos de cinco minutos, con mínimas cantidades de muestra y reactivo, por lo que resulta altamente económica. Además se preparó con productos de parásitos aislados de pacientes guatemaltecos, lo cual representa también una ventaja. Esta técnica fue utilizada en varios estudios y comparada con otras metodologías de referencia y demostró una buena sensibilidad y especificidad para el diagnóstico.
Es propdsito de este grupo de investigadores producir este reactivo en mayor escala, a fin de comercializarlo y ponerlo a disposición de todos los bancos de sangre y laboratorios de Guatemala a un costo accesible. Esto permitirá estandarizar el diagnóstico de la enfermedad, mantener un programa de control de calidad y mejorar el registro de casos a nivel nacional.
A N E X O No. 2
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Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla. 3ra Avenida 13-28 zona 1 PEZ;. 230-2664
Reactivo listo para su uso.Pruducido con una cepa de T. Cruzi l USO: Reactivo de aglutinación para el diagnóstico cualitativo y semicuantitativo de la Enfermedad de Chagas.
DBSCRIPCION: La enfermedad de Chagas, tambibn conocida como Tripanosomiasis Americana. es considerada como uno de los pmblemas de salud pública mbs imponentes en América Central y Ambrica del Sur. Es una enfermedad pmpia del hombre y o tms mamlfems, caracterizbndose por afectar a la poblacidn rural de escasos recursos económicos. Se ha estimado que en toda Arnbrics, 16 - 18 mdlones de personas padecen la enfermedad en su estad(o crónico y que anualmente 50.000 pacientes mueren por su causa.
El agente etiológico de la enfermedad es el pmtozoo flagelado T i p e n o m e cmzi, el cual se encuentra en reservorioa humanos y animales. Este parbsito es transmitido en la mayoría de los casos a los humanos y o tms mamlfems por chinches. las cuales al succionar sangre del hospedem. defecan eliminando asl el parbsito. Tambibn puede transmitirse vía transplacentaria. por transfusión de sangre contamineda o por transplante de brganos contaminados.
En relación a la enfermedad se conocen varios estadios: una fase aguda de corta duración. una indeterminada o silenciosa donde el individuo es cllnicamente asintom4tico y por Último una fase crónica de varios arios de desarrollo.
La etapa aguda, cuya manifestación es poco frecuente. se caracteriza por f i eb re , do lor muscular . vómi tos . d ia r rea . l in fadenopat la . hepatoesplenomegalia, tequicardia y miocarditis. El diagndstico en esta fase debe hacerse mediante la observación del paresito en sangre y la deteccidn de anticuerpos tipo IQM e IgG especlficos al parbsito.
La forma crbnica. se caracteriza por lesiones en órganos como corazón, esdfago y colon. siendo la mbs frecuente la lesión cardlaca. Las manifestaciones que se observan incluyen insuficiencia cardlaca. arritmia8 y muerte súbita. El diagnóstico en esta etapa se realiza principalmente por enticuerpos tipo IgG.
PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO: El reactivo permite visualizar la reacción antlgeno-anticuerpo. Para ello, partfculas de lbtex de color azul han sido sensibilizadas con un extracto soluble del parásito en estadlo tripomastigote. hsteriormente. el suero que contiene los anticuerpos tanto IgG como IgM. se hace reaccionar en pmporciones iguales con el reactivo de lbtex y si esta reaccidn ocurre se observar6 aglutinación.
REACTIWI: 1. Reactivo de lbtex sensibilizado con T: cmzi. 2. Suero control positivo (rojo1 3. Suem control negativo [verdel
Nota: todos los reactivos son preservados con azida de sodio. Las sueros controles han sido evaluados para HIV, Hepatitis C y entigeno de superficie de Hepatitis B. pem deben ser manipulados como material potencialmente infeccioso.
Estos reactivos son para USO DIAGNOSTICO exclusivamente.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: Refrigerar a 2 - 8 "C. No congelar.
MUESTRA: Suem o plasma heparinizado/EDTA puede ser utilizado. Debe evitarse el usar muestras con contaminación bacteriana. Le hemólisis no interfiere en la prueba. Si la muestra no puede ser pmcesada inmediatamente deber6 almacenarse en congelación y evitar congelaciones- descongelaciones repetidas.
7.1 Preparacidn de Reactivos y Muestra
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up!z~e3g!~a~ ns wed e31u39a eun ap ~ 9 u ~ez!l!an ou86a3au sa se!ouaaia~ip ap ~0683 tg ~603aa(8uiaaen8 ou 603I6pJed ap souaBjaue uez!l!an anb sopoa?w aiaua easandsai el ue sauo!3e!~e~ awehlasqo uapand aob A ooailewaaen0 oquq.13 m!s90eq3 aauatoed un ep optuaaqo oaua!uiels!e un ap soua6jaue ez!l!an o4aoeai aisa anb JeJap!suoo aauewodw! sa u?!qwea j s ~
'e!oua%a.Ionyounwul a ~ ~ 1 1 3 'eaoai!pul ug~oeu!anlBeuia~ ouioo e314j3adsa s9w e3!~3qa eun souaw le u m opeo!g!~a~ as aqap o.a!sod opealnsai opoa anb A a!ez!uiea un sa eqanid eaea anb ~ e y o w aauewodw! 63 :IZND ewosauedil oa!sgJed 18 m61 0 381 sodJano!aue ap epuasaid el 83!pU! 8~!3!60d Ugl338i3.I eun
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.opuo4 un e~auoo ug!meai el ~ a a i A ' ~ H O A aD el ouioo aaua~edsue~n e3eid 1 eun uqq o oouelq opuq ap eoeld ~a!nbleno as~ez!(!an apana u?!¿ ::a ti1 8JEu .?
.o.a!sod a y wans la anb 81 ua up!onl!p ew!alq el opueo!pu! ~ e ; l i ~ q u l 'p 1
'o~!aeBau opealnsai un Jauaaqo emeq up!on(!p epeo u03 oA!aea!leno la anb leno! oaua!ui!paowd la Jez!leatj '3
so(nBgo3 A eeuopea!d!3aid se1 Jeu!ui!la e ~ e d up!3nl!p el ~sz!(eai ap saaue opeBn4uauao eee aians la anb aauewodui! s3 '['osa '8: 1. 'p: L 331 z: L. ug!onl!p el ap J!wed e sqqop seuo!onl!p ua sad o e3!0910!6!4 eu!les ugpnlos ua wans la ~!nl!a 'q
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xtuialqwd saians ep w a s epeo u03 sope6a3wd ~ a 6 uaqap on!ae8au A on!a!sod saloJauo3 s o l 'a
'Up!338ai e1 Jwasqo A soanu~ui E ~~aa!w 'aLuJoj!un olnmjo un opueuiJo4 Jelozayy 'sa~wauoo 601 ap A ~eB!asa~u! e cuan6 lap [[u S - €1 peppueo leno! ~eBaiBv 'p
.anbas as ug!suedsns easa anb Jea!y Lienlma e swans sol ap olnmj~lo epe3 ua xaapl ap ugtsuadsns el ap (u S - E ~ e B a i 8 ~ '3
'oseJ4 (ap e~apedea el ua opyaqpe apanb M!aoeai la anb ~ e a ! ~ 3 .oauau!pas ehiasqo as ou A au+iq!un sa up!suadsne 81 anb Jehiasqo easeq xaaql ap o~!aoeai la Jelozayy 'q
.o~!aeBau A o~!a!sod ealwauoo 601 A JenleM e swans 601 ap ug!o!sod el eoeld el ua ~eoytauapl 'e
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A N E X O No. 4
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LON KILIMANJARO
Licda Carmen Isabel '/e/eldsquez
Licda &fin Barquero t j l ian Barrantes Lchavarría
NOTA: Los trabajos l ibres t i e n e n 12 m i n u t o s p a r a presentación y 3 para responder preguntas.