recolección, aislamiento e identificación de cepas de bacterias...
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INFORME FINAL PROYECTO 1401
Recolección, aislamiento e identificación de cepas de bacterias nativas de Jutiapa y Chimaltenango, del género Rhizobium kguminosarum biovar phaseoü, para el aprovechamiento de la fijación biológica de nitrógeno
en el cultivo de frijol.
Unidad ejecutara: ICTA/FODECYT
Período: Enero 2003 - Enero 2004
Investigsaores Ing. Agr. Juan José Soto Dominguez
Inga Agra. Alma Maritza García Chaclán
Guatemala, mayo 2004
RECONOCIMIENTO
Tesista Srita. Claudia Lorena Cmanza Meléndez Por su apoyo en la fase de microbiología
Laboratorio de Análisis h4icrobiológicos y de Referencia Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Universidad de San Carlos de Guatemala
Por permitir el uso de sus instalaciones para este proyecto
Ing. Agr. Edgar Edgardo carrillo Por su colaboración en la etapa de campo
INDICE
No . de órden No . Página . 1 INTRODUCCION .....................................................-.................................... 01
. 2 ANTECEDENTES .......................................................................................... O1
3 . OBJETIVOS .................................................................................................... 08
4 . HIPOTESIS ..................................................................................................... 08
5 . METODOLOG IA. ..............-................. . .... .................................................. O8
5.1 Reconocimiento preliminar de áreas ............................................................ 09
.............................................. 5.2 Contacto con agricultores y visitas de campo 09 . r .................................................................................. 5.3 Recoleccion de nódulos 10
5.4 Preparación de muestras de nódulos in situ .. ....... .. .... - ..- ............... ., .......... 10
5.5 Aislamiento de los rizobios de los nódulos ................................................... 10
5.6 Identificación de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli ....................... 10 . . 5.7 Preservacion de la cepas ................................................................................ 11
......................................................................... 5.8 Toma de muestras de suelo 11
5.9 Análisis de suelos ........................................................................................... 11 5.10 Trabajos de gabinete ................................................................................... 12
............................................................................................... 6 . RESULTADOS 12
.. ...... 6.1 Resultados de microbiología ..,............... ... ... ........................................ 12
6.2 Resultados del muestreo de suelos ............................................................... 15
7 . CONCLUSIONES ......................................................................................... 25
8 . RECOMENDACIONES ............................................................................... 26
9. BIBLIOGRAFIA
10 . ANEXOS
11 . FOTOGRAFIAS
RECOLECCION, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE CEPAS DE BACTERIAS NATIVAS DE JUTIAPA Y CHIMALTENANGO DEL GENERO
Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli, PARA EL APROVECHAMIENTO DE LA FIJACION BIOLOGICA DE NITROGENO EN EL CULTIVO DE FRIJOL
Ing. Agr. Juan José Soto Domínguez * Inga. Agra. Alma Maritza García Chaclán*
RESUMEN
La ejecución del proyecto se realizó a través de la recolección, aislamiento e identificación de cepas de Rhizobium nativas de nuestro país y la ubicación de zonas geográficas donde existe mayor disponibilidad de las mismas, con el propósito de aprovechar la capacidad que poseen de formar asociaciones simbióticas con las leguminosas. Con el aprovechamiento de la fijación biológica de nitrógeno se tiene un beneficio social al reducir los costos de producción, ya que la misma influye directamente en la baja del consumo de fertilizantes químicos nitrogenados, y un beneficio ambiental al evitarse la contaminación de los recursos suelo y agua causada por las fuentes químicas de nitrógeno. El objetivo principal del proyecto fue el de aislar e identificar cepas de bacterias nativas de Rhizobiurn de los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango. Como resultado se obtuvieron 1 1 1 muestras de nódulos de las cuales se lograron aislar 64 cepas, que según su reacción el laboratorio nos indica que son bacterias sospechosas de pertenecer al género Rhizobium; según su reacción 4, no pertenecen al género rhizobium y 36 fueron negativas. Las bacterias sospechosas fueron sometidas a prueba de infectividad en 6 diferentes diluciones y en medio estéril para observar su infectividad en semillas desinfestadas de frijol de la variedad ICTA Hunapú. De las 64 cepas aisladas, únicamente se comprobó que 21 cepas sospechosas, sí pertenecen al género Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, ya que el resto se vio afectada por problemas de contaminación por hongos en las semillas y por falta de tiempo en el proyecto no fue posible realizar nuevas infecciones con las cuales hubiéramos obtenido un mayor número de cepas. Se realizaron determinaciones de macro y micronutrimentos, potencial de hidrógeno, contenido de materia orgánica y clase textura1 a 11 1 muestras de suelo, determinándose que los suelos donde se efectuaron los muestreos de suelo y nódulos son suelos con buena fertilidad. Para textura se determinó que para el departamento de Jutiapa los suelos son predominantemente de textura arcillo y franco arcillo arenosa, y para Chimaltenango las texturas predominantes fueron franco arenosa y franco arcillo arenosa. Según análisis estadístico, solamente se encontró correlación entre el contenido nutricional, el pH y el contenido de materia orgánica, dentro de las muestras de suelo donde crecieron los nódulos de donde se aisló cepas de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli.
* Investigadores de ICTA
Con esta investigación se desea despertar una mayor conciencia del papel que juega la fijación simbiótica del nitrógeno atmosférico en la producción de leguminosas, y por otra parte, que sirva como fuente de referencia para la aplicación de la técnica cuyo objetivo final es llegar al agricultor. Dado el carácter interdisciplinario del tema, profesionales de diferentes especialidades estuvieron directamente involucrados en el mismo.
Palabras Claves: Rhizobium, frijol, fijación biológica, cepas, nódulos.
1. INTRODUCCION
El frijol, (Phuseolus vulguris L.) denominado como Mesoamericano, tiene su centro de
origen en Guatemala y el Sur de México y al igual que el Maíz, han pasado por una serie
de procesos en su evolución y domesticación, tanto como el proceso morfológico de la
planta, como su cultivo, a tal forma que actualmente en la mayoría de los casos, éstos se
han convertido en especies con bondades agronómica sobresalientes, principalmente para
el componente rendimiento, y estas sólo se logran con grandes cantidades de fertilizante
químico, lo cual viene a afectar dos aspectos, como lo son: el económico, aumentando en
forma considerable los costos de producción, principalmente en los últimos años que el
precio se ha incrementado considerablemente, afectando al pequeño y mediano agricultor.
El otro aspecto, quizás, sea el más importante, es el daño que ocasiona al contaminar el
medio ambiente, principalmente a fuentes de aguas, tanto subterráneas, así como la que
provoca a ríos, lagos y océanos por escorrentía.
Dentro de las necesidades más urgentes que se han determinado en países en desarrollo,
está la de encontrar alternativas para una buena producción de frijol, sin usar como fuente
de Nitrógeno, fertilizante químicos. Una buena alternativa está en lograr una buena
simbiosis entre cepas de bacterias del género Rhizobium y genotipos de frijol (Phuseolus
vulguris L.)
2. ANTECEDENTES
En estudios anteriores efectuados por el ICTA y Facultad de Agronomía de la Universidad
de San Carlos de Guatemala, con apoyo de PNUD y del CIAT en Cali Colombia; se
evaluaron cepas de rhizobium provenientes de CIAT y del CIA de la Universidad Nacional
de Costa Rica, seleccionándose algunas cepas para las localidades donde se evaluaron, pero
el comportamiento de éstas es bastante irregular, debido a múltiples factores,
a características de suelo, como: textura, composición química y pH. Así
como temperatura y precipitación de 10s lugares donde se evaluaron.
Pero el principal aspecto, es lograr una buena simbiosis entre leguminosa-rhizobium
principalmente si este fuera con cepas nativas, puesto que están viviendo en su mejor
medio y cualquier cepa que se introduzca no puede competir con ellas, principalmente por
su adaptación al medio y por el número de bacterias que existen en el suelo. Sin embargo
algunas de las cepas nativas no son tan efectivas, mientras que otras son bastante
competitivas y efectivas. Así como el papel que juega una planta receptiva que favorezca
la formación de nódulos en mayor cantidad para facilitar la fijación de nitrógeno del aire.
La fijación de Nitrógeno ocurre por la asociación simbiótica que establece la planta con
algunas bacterias de la familia de las Rhizobiaceae; estas bacterias infectan las raíces de la
planta e inducen la formación de nódulos radicales, en el interior de las cuales se realiza la
fijación, con la intervención de la enzima nitrogenasa, localizada en el interior de los
rizobios. Las bacterias le ceden el nitrógeno fijado a la planta y a su vez, ésta le suministra
al nódulo los carbohidratos que provee la energía necesaria para el proceso de fijación.
Por ser un proceso en el cual intervienen dos organismos diferentes - una planta
(leguminosa) y una bacteria (rizobio)- el estudio y manejo de esta asociación simbiótica
requiere del trabajo de agrónomos y microbiólogos.
El nitrógeno está presente en los tejidos verdes de las plantas en concentraciones
relativamente altas (entre 1 y 4%), y en algunas semillas en concentraciones mayores, por
lo que se le considera un macronutriente primario, junto con el fósforo y el potasio.
Aunque, en general, los suelos minerales tienen contenidos totales de nitrógeno muy
superiores a los requeridos por los cultivos, casi todo este elemento se encuentra en forma
de materia orgánica y anualmente sólo se mineraliza una pequeña fracción (1 a3% del
nitrógeno total (3). Debido a esta liberación lenta del nitrógeno orgánico, el nitrógeno
frecuentemente se convierte en un elemento limitante para la producción de cultivos.
La conversión N2 a la forma reducida tiene una elevada demanda de energía, debido a la
estabilidad del enlace triple de la molécula de N2. Esta energía se requiere como energía de
activación, ya que la reacción completa libera energía. La reducción del N2 ocurre de dos
maneras: a nivel industrial, mediante el proceso de fabricación de fertilizantes, o a nivel
biológico. Por la fijación de nitrógeno atmosférico.
El proceso industrial utilizado para la fabricación de fertilizantes nitrogenados, denominado
proceso de HABER-bosch, tiene una demanda de energía debido a los requerimientos de
hidrógeno, alta temperatura y presión. Por ejemplo, el requerimiento para producir una
tonelada de amonio es de aproximadamente 1000m2 de gas natural o aproximadamente una
tonelada de petróleo (87 barriles) (1 8).
La fijación biólogica de nitrógeno es un proceso que también implica una alta demanda de
energía, pero en este caso se obtiene de la radiación solar en condiciones ambientales de
temperatura y presión. Esto es posible debido a la presencia de la enzima nitrogenasa,
catalizadora d e 1 a reacción. d e aquí S e origina 1 a i mportancia que t iene el proceso d e 1 a
fijación biológica de nitrógeno para la agricultura y la necesidad de desarrollar una
tecnología adecuada para maximizar el aprovechamiento de este recurso.
Aspectos importantes que hay que tomar en cuenta en este estudio, es la presencia de
algunos compuestos orgánicos e inorgánicos de nitrógeno inhiben la fijación de N2. Esta
inhibición puede ser en tres niveles: en el primero, se inhibe la actividad de la enzima
nitrogenasa; en el segundo se inhibe la síntesis de nueva enzima por el producto final de la
reacción, el NH3, y por otros compuestos nitrogenados; y, en el caso de la simbiosis con las
leguminosas, ocurre un tercer nivel de inhibición, ya que la presencia de N mineral inhibe
la formación de nódulos radicales.
La familia Leguminosae es muy amplia, con alrededor de 750 géneros y una 20,000
especies, incluyendo plantas cultivadas, numerosos árboles, plantas herbáceas y arbustos,
las cuales desempeñan una función importante en diversos ecosistemas. Las leguminosas
tienen una importancia particular en la alimentación humana (granos) y animal (forrajes), al
igual que 1 a e conomia d el nitrógeno d el S uelo, ya q ue 1 a m ineralización d e S us r esiduos
constituye un aporte de nitrógeno disponible.
Las leguminosas se caracterizan por tener hojas compuestas, fmtos en forma de vaina y, la
mayoría de ellas, nódulos radicales fijadores de nitrógeno.
Según la clasificación de (24), la familia Leguminosae consta de tres subfamilias:
Papilionoideae, con aproximadamente 400 géneros y 14,000 especies, entre las cuales se
encuentran casi todas las leguminosa de importancia agrícola. Son plantas herbáceas,
raramente arbustos o árboles, la mayoría de ellas forman nódulos fijadores de nitrógeno.
Entre sus géneros están: Lupinus, Lotus, Arachis, Pisum, Phaseolus, Vigna, Glycine,
Centrosema, Pueraria, Stylosanthes.
Los rizobios son bacterias del suelo, caracterizadas por su habilidad para infectar las
leguminosas e inducir la formación de nódulos fijadores de N2 en las raíces.
Hasta hace poco se consideró que la familia Rhizobiaceae incluía dos géneros: Rhizobium
agrobacterium, sin embargo en el manual de Bergey (Jordan, 1984), el género Rhizobium
se subdividió en dos grupos, teniendo en cuenta la tasa de crecimiento la producción de
acidez o alcalinidad en medios de cultivo levadura manitol (LM), la disposición de los
flagelos, la composición de la base del ADN y los géneros de plantas hospedantes con las
cuales establecen simbiosis: En el género Brasyrhizobium, se ubicaron las bacterias de
crecimiento lento, que producen alcalinidad en medio LM. Las bacterias de crecimiento,
rápido, que producen acidez en medio de cultivo LM, se clasificaron en el género
Rhizobium; en adelante se denominará con el nombre común de "rizobios" a las bacterias
pertenecientes a los dos géneros.
La necesidad de combatir el hambre en el mundo, requiere básicamente la estrategia de una
producción de menor costo preservando al mismo tiempo los recursos naturales. Uno de los
medios más importantes para poner en marcha esta estrategia es la nutrición integrada de
las plantas, y se espera que en los años venideros los procesos biológicos contribuyan
sustancialmente al logro de tal objetivo.
El Rhizobium es un género de bacterias que tienen la capacidad de formar nódulos en las
raíces de las leguminosas, sin embargo, no cualquier Rhizobium forma nódulos en
cualquier leguminosa, por esta razón el Rhizobiurn se clasifica en especies o grupos de
inoculación según las leguminosas que infecte. Los Rhizobium son bacterias del suelo y
sus diferentes especies existen en diferentes proporciones según el tipo de suelo y las
leguminosas que se cultivan en él.
Para el aislamiento y caracterización de Rhizobium del suelo es necesario utilizar la
leguminosa hospedera. Si el suelo contiene el Rhizobium específico para una leguminosa,
al sembrar la leguminosa formará nódulos. Entonces es posible extraer el Rhizobium
específico de esos nódulos.
Influencia del ambiente sobre la fijación biológica de nitrógeno
Existe una gran diversidad de factores ambientales que influyen directamente en la eficacia
de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, en la fijación de nitrógeno, entre ellos se pueden
mencionar los siguientes:
Nitrógeno inorgánico: La presencia de nitrógeno inorgánico en el suelo, procedente de
fertilizantes inhibe la fijación de nitrógeno. El tamaño de los nódulos y su cantidad es
menor cuanto existen niveles relativamente altos de nitrato y amonio. Por otro lado bajas
concentraciones de nitrógeno inorgánico estimula la nodulación (1 9).
pH del Suelo: En la mayona de leguminosas la infección de Rhizobium no ocurre en pH
menores a 5. El crecimiento de Rhizobium también se ve influenciado por pH bajos. Esta
inhibición de la simbiosis en suelos ácidos, se debe a la concentración de iones hidronio, a
la toxicidad resultante del hierro y aluminio principalmente (3 1,19).
Temperatura: la temperatura óptima de crecimiento de Rhizobium es de 30 grados Celsius
(25).
Fósforo y potasio: son macronutrimentos esenciales para el crecimiento de la planta, por lo
que su presencia en el suelo se asocia con leguminosas vigorosas y de buen crecimiento
macronutrimentos: El cobalto estimula marcadamente la utilización de nitrógeno
atmosférico por las leguminosas, se cree que esto se debe a que estimula la proliferación y
metabolismo de Rhizobium dentro de la raíz. Los micronutrientes son necesarios tanto para
la leguminosa como para Rhizobium, y por ende para una simbiosis efectiva (19,25).
Estudios realizados en Guatemala
En Guatemala, el primer estudio sobre Rhizobium fue realizado en 1974 por Aguilera, el
cual consistió en la evaluación de 14 cepas de Rhizobium phaseoli en tres variedades de
frijol común. De estas cepas evaluadas 8 fueron traídas del Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y 6 fueron cepas nativas de la colección del ICTA; algunas de
estas cepas nativas resultaron ser efectivas para las variedades de frijol estudiadas, en
cambio algunas cepas del extranjero no fueron efectivas, se piensa que se debe a las
condiciones ambientales diferentes (1).
En 1980, Pellecer evalúo la eficiencia relativa que se produce en el rendimiento de grano, al
inocular dos variedades de frijol común con cepas mixtas nativas comparadas con una cepa
estándar c omo c ontrol. Este e S u no d e 1 os p rimeros e studios d e evaluación d e n itrógeno
reportados en Guatemala. Se obtuvieron muestras de plantas de Jutiapa y Parramos, se
esterilizaron nódulos, a partir de ellos se prepararon suspensiones para inocular en los
terrenos de frijol. Las cepas mixtas nativas mostraron ser eficientes, resaltando aquella
proveniente del suelo de condiciones más pobres (Parramos), sin embargo no superaron a la
cepa estándar CLAT 57. Es importante resaltar que en este estudio no se purificaron ni
identificaron las cepas nativas, ya que la evaluación se realizó directamente de
suspensiones de los nódulos recolectados (27).
CENTRO cc
En 1982, Méndez evaluó 9 cepas proporcionadas por el CIAT, de las cuales dos
(CIAT 390, 407) resultaron ser las más eficientes para las variedades de fnjol utilizadas
(15)-
En 1 986, C ampos r ealizó u n n uevo e studio d e aislamiento d e R hizobium d e S uelos d e
Guatemala, Chimaltenango, Santa Rosa y Sacatepéquez. Se muestrearon un total de 28
suelos, lográndose aislar 26 cepas. Primero se realizó muestre0 de suelos, posteriormente se
sembró semillas de frijol en bolsas que contenían las muestras de suelo recolectadas, luego
se evaluó la eficiencia de fijación biológica de nitrógeno; y por último se procedió a aislar
las cepas de los mejores nódulos obtenidos (6). Posterionnente en un estudio realizado por
Miyares, se analizaron trece de las cepas nativas aisladas, su evaluación se realizó a nivel
de invernadero en jarras de Leonard, seleccionándose 4 cepas efectivas para las variedades
de frijol negro Quetzal y Jutiapan (22).
En 1988, Contreras evaluó en campo cuatro cepas de Rhizobium del CIAT, este estudio fue
realizado en conjunto con la facultad de agronomía, el Instituto de Ciencia y Tecnología
Agrícola (ICTA) y el CIAT. Dos cepas son procedentes de Colombia y dos son nativas de
Guatemala aisladas por Aguilera en 1980. De las cuatro estudiadas la CIAT 632 presentó
buenos resultados, y mostró ser capaz de competir con los fertilizantes nitrogenados en la
variedad de fnjol Quinak-ché (12).
Por último en 1990, Carrillo evaluó cuatro cepas procedentes del CIAT y las comparó con
una cepa nativa; dicha cepa nativa presentó un rendimiento muy alto (7).
Además se han realizado otros estudios sobre Rhizobium, relacionados con su producción a
gran escala para uso comercial; el estudio en 1990, realizado por Castellanos se basó en
comparar e 1 cultivo continuo a gran e scala d e una c epa d e R hizobium p haseoli ( ICAITI
0063), que fue seleccionada en base a su respuesta a la fijación biológica de nitrógeno.
Obteniéndose mayor beneficio con el cultivo continuo (8).
3. OBJETIVOS
3.1 General
Aislar e identificar cepas nativas de Rhizobium en dos zonas productoras de frijol
3.2 Específicos
3.2.1 Aislamiento del Rhizobium legurninosarum procedente de nódulos de plantas de
frijol para la identificación de cepas nativas de cada sitio muestreado.
3.2.2 Identificar las localidades con mayor variabilidad de cepas nativas del género
Rhizobium leguminosarum.
3.2.3 Determinar las caractensticas físicas y químicas de los suelos donde se realizó el
muestreo.
Hi = Se logrará aislar cepas del género Rhizobium
Hz = Las cepas aisladas de Rhizobium no pertenecen a Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli.
5. METODOLOGIA
Para la realización del proyecto de investigación fue necesario colectar nódulos de plantas
de frijol, así como la toma de muestras de suelo de los sitios donde se colectaron los
mismos.
Los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango son dos grandes áreas productoras de frijol
por lo que se trabajó un total de 25 municipios: 13 municipios en Jutiapa y 12 municipios
en Chimaltenango. Dentro de los 25 municipios se ubicaron los puntos de muestreo, para
obtener al final 11 1 muestras colectadas tanto de nódulos procedentes de plantas de frijol
como de muestras de suelo.
Los Municipios muestreados fueron los siguientes:
JUTIAPA
Jutiapa, Quezada, El Progreso, Santa Catarina Mita, Asunción Mita, Atescatempa,
Yupiltepeque, Moyuta, Agua Blanca, Comapa, Conguaco, Zapotitlán y Jerez.
CHIMALTENANGO
Parrarnos, San Andrés Itzapa, San Martín Jilotepeque, Zaragosa, San Juan Comalapa,
Patzicia, Santa Cruz Balanyá, Patzún, Tecpán, Santa Apolonia, El Tejar y Chimaltenango.
Tanto el trabajo de laboratorio como de gabinete se desarrolló en el Laboratorio de Suelo,
Agua y Planta del ICTA (Bárcena, Villa Nueva), La Estación Experimental del ICTA en
Chimaltenango, y el Laboratorio de Microbiología de La Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia de la USAC.
5.1 Reconocimiento preliminar de las áreas
En un reconocimiento preliminar se seleccionaron los municipios donde se sembró el
cultivo de frijol del cual se extrajeron los nódulos, así como la selección del sitio para la
toma de muestras de suelo.
5.2 Contacto con Agricultores y visitas de campo
Para la realización del proyecto se hizo necesario contar con la colaboración de los
agricultores productores de frijol, por lo que fueron visitados 243 agricultores, de los cuales
se logró una participación de 125 agricultores, sin embargo por razones inherentes al tipo
de trabajo, como cambio de cultivo a sembrar, únicamente fue posible contar con 11 1 de
ellos para la colecta de muestras de nódulos que servirán para la fase de aislamiento e
identificación de cepas de Rhizobiwn y la toma de muestras de suelo que sirvieron para la
identificación de las características fisico-químicas de los suelos donde creció el cultivo.
Además se realizaron constantes visitas de campo con el propósito de identificar el estado
de crecimiento vegetativo del cultivo de frijol en las parcelas seleccionadas y poder así
llevar un control sobre el momento adecuado de muestre0 (etapa de inicio de floración).
5.3 Recolección de Nódulos
Para la recolección de los nódulos que servieron para el aislamiento de Rizobios se
seleccionaron de 10 a 15 plantas vigorosas con hojas verdes y sanas, de las cuales se
tomaron alrededor de 50 nódulos vivos e intactos, preservándolos en frascos de vidrio con
material desecante (gel de sílica) hasta su siembra en el Laboratorio de Microbiología para
el aislamiento e identificación.
5.4 Preparación de muestras de nódulos in situ
Por ser necesaria la preservación de los nódulos para su traslado al laboratorio, se procedió
después de cada muestre0 a la separación de las raíces de la parte vegetativa de las plantas
de fiijol, a la limpieza del número de nódulos presentes en cada una de las raíces de las
plantas muestreadas, identificación, conservación en sílica gel y por último a su
almacenamiento en hieleras para su traslado final al laboratorio. (ver foto 1)
5.5 Aislamiento de los Rizobios de los nódulos
Esta etapa se realizó en el Laboratorio de Microbiología y la técnica utilizada fue la descrita
por Vincent, Somasegaran (30,28) y El Centro Internacional de Agricultura Tropical (10 );
en la cual se procedió a rehidratar los nódulos por 24 horas, luego se desinfectaron con
Hipoclorito de calcio al 3 % y se sembraron en Agar manitol-levadura más azul de
bromotimol. Las cajas se incubaron a 26 grados centígrados por 5 días. A las colonias
sospechosas s e 1 es realizó 1 a T inción d e Gram y 1 a p meba d e m ovilidad. Las c epas que
presentaron morfología colonial característica de Rhizobium, coloración amarilla
(producción de ácido) y además eran bacilos Gram negativo móviles, se consideraron como
bacterias sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Estas cepas se
conservaron en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral. (ver foto 2)
5.6 Identificación de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli
En e 1 Laboratorio d e S uelos S e realizó 1 a fase de autenticación d e l os cultivos a islados
mediante la infección de semillas de frijol (Phaseolus vulgaris) por las cepas aisladas. Para
ello se utilizó la técnica de Número más probable (NMP), realizándose seis diluciones y
cuatro repeticiones por dilución. Además se utilizó como control negativo una planta de
cuatro repeticiones por dilución. Además se utilizó como control negativo una planta de
Phaseolus vulgaris sin infectar. Se consideró Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli,
aquellas que fueron capaces de inducir a la nodulación en las plantas de frijol común.
(ver fotos 3, 4,5,6,7 y 8)
5.7 Preservación de las cepas
Para conservar su estabilidad y viabilidad genética se preservaran las cepas en tubos con
agar manitol-levadura y aceite mineral, en condiciones adecuadas de temperatura.
(ver foto 9)
5.8 Toma de muestras de suelo
En cada uno de los lugares donde se colectaron los nódulos se realizó un muestre0 de
suelos con el propósito de identificar las condiciones fisicas y químicas donde se han
desarrollado los mismos.
Las muestras de suelo se trasladaron al Laboratorio de Suelo, Agua y Planta del Instituto de
Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA) para la determinación de potencial de hidrógeno,
contenido de materia orgánica, clase textual, porcentaje de nitrógeno total, y contenidos de
fósforo, potasio, calcio, rnagnesio, cobre, hierro, manganeso y Cinc; de acuerdo a las
siguientes metodologías.
5.9 Análisis de suelos
Para la determinación de los parámetros involucrados se siguieron las siguientes
metodologías. (ver foto 10)
--A
Kj eldalh Mehlich 1 (Colorimetna)
Mehlich 1 (EAA) Mehlich 1 (EAA)
Determinación Potencial de Hidrógeno
Contenido de Materia Orgánica --
Análisis Granulomético b -----
1 :2.5 en agua -----
~ouvoucos
5.10 Trabajo de Gabinete
Registro de datos, análisis de información, discusión de resultados, elaboración de
informes parciales y final.
6. RESULTADOS
6.1 Resultados de Microbiología
En la tabla No. 1 se puede observar que se aislaron 64 muestras de bacterias sospechosas de
- --
MUESTRAS Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos Cepas no sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos Muestras negativas Muestras perdidas
TOTAL
pertenecer al género Rhizobium Zeguminosarum biovar phaseoli y 36 muestras de 11 1 fueron
negativas ( 32%).
TABLA NO, 2 CEPAS AISLADAS SOSPECHOSAS DE Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli PARTIR DE NÓDULOS.
CANTIDAD ---
64 4 36 7
111
PORCENTAJE
58 4 32 6
1 O0
Las muestras negativas durante el primer análisis de aislamiento, se sometieron a un segundo
análisis. Inicialmente se recuperaron 48 cepas, y con el segundo análisis 16 cepas más. El
índice de recuperación se aumentó en un 25 %, por lo que se puede decir que el número de
análisis realizados a las muestras aumenta la recuperación de las bacterias (tabla No. 2).
MUESTRAS Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos ( ler análisis) Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos 1 2do análisis)
TOTAL DE CEPAS --
CANTIDAD
48 16 64
PORCENTAJE
75 25 1 O0
TABLA NO. 3 IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS SOSPECHOSOS DE Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli AISLADOS
1 Cepas sin infectar 13 20
DESCRIPCI~N Cepas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli Cepas sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar ~haseoli no infectivas
De las 64 cepas de bacterias aisladas sospechosas de Rhizobium leguminosarum
biovar phaseoli, el 33% (tabla No. 3) se identificó positivamente, pues fueron cepas capaces
de infectar la variedad de fijjol común estudiada ( ICTA-HUNAPU). Estas 21 cepas que
infectaron el fnjol común tienen alta probabilidad de ser Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli
CANTIDAD
21
11
Cepas muertas TOTAL DE CEPAS SOSPECHOSAS
El 17% (tabla No.3) no se identificaron como Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli pues
no fueron infectivas en plantas de fiijol. Pueden existir cepas que se encuentren naturalmente
en simbiosis con el frijol, pero que su capacidad de infección sea limitada. Otro aspecto que
puede afectar es la variedad de fnjol utilizada, ya que puede ser que no sea la óptima para
estas cepas que fueron negativas.
PORCENTAJE
33
17
TABLA NO. 4 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
19 64
JUTIAPA
30 1 O0
TABLA NO. 5 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO
1 1 San Martín Jilotepeque 1 6 O O 1 ~a tzún 2 2 1 O 0
CHIMALTENANGO ( El Tejar 1 O O
Tecpán Patzicia Santa Polonia
Del departamento d e Ju tiapa S e obtuvieron 1 7 c epas ( t abla N o. 8 ), 1 os municipios d e m ayor
cantidad de cepas fueron Jutiapa y Santa Catarina Mita; del municipio de Jutiapa se analizaron
25 muestras y de estas 6 fueron capaces de infectar, por lo que se obtuvo el 24 % de positividad.
Por otro lado de Santa Catarina Mita se analizaron 15 muestras y de estas 6 fueron capaces de
infectar, por lo que en este municipio el porcentaje de positividad ( 40%) es mayor que Jutiapa.
Entonces se puede decir que el municipio donde existió mayor porcentaje de cepas de Rhizobium
es Santa Catarina Mita. Además el tamaño nodular de estas 6 muestras oscilaba entre 3-4 mm.
Lo que indica que son nódulos muy activos, y estas cepas podrían resultar ser muy efectivas en la
fijación biológica de nitrógeno.
2 2 2
Parramos San Andrés ltzapa Santa Cruz Balanyá Comalapa
TOTAL
El resto de municipios (Comapa, Quezada, Agua Blanca y el Progreso) analizados presentaron de
1-2 cepas, debido a la cantidad de sitios muestreados.
o Chimaltenango 1 O
En Chimaltenango, se recolectó menos muestras por municipio, pues únicamente 23
corresponden a este departamento; de las cuales 5 cepas se probaron para infección, y cuatro de
estas fueron positivas, las cuales corresponden a Patzún, Tecpán y Santa Polonia.
o O
1 O 1 pp
1 1 1 3 23
las cepas más infect ivas fueron la 43, 41, 46, 23 y 31. Se dice que fueron las más infectivas
50 O 50
O O O O 21
O O O O
l
debido a que nodularon en casi todas las diluciones y repeticiones realizadas. Estas cepas de
infectividad alta podrían ser muy efectivas para la fijación de nitrógeno. Aunque no siempre
existe relación entre infectividad y efectividad. La cepa No. 41 fue aislada de la Aldea el
Quebracho 1, Santa Catanna Mita; la cepa 41 de La Barranca, Santa Catarina Mita; la cepa 46 de
El Ovejero 1, El Progreso; la cepa 23 de El Retiro 11, Quezada y la cepa 31 de La Lagunita 11,
Jutiapa.
Por otro lado el 34% de resultados negativos, se puede deber a los siguientes aspectos:
El hipoclorito de calcio es un desinfectante fuerte, que se utilizó para esterilizar la parte
externa de los nódulos, Si estos se encuentran dañados, el hipoclonto de calcio
penetra matando las bacterias que se encuentran en su interior.
El tamaño de los nódulos: 33 de las muestras negativas fueron nódulos con un diámetro
de 1-3 mm. Y según Quispel y Martin los nódulos activos son de mayor tamaño
Además según Quispel, las plantas pueden formar pseudonódulos; estos nódulos falsos
se forman debido a la proliferación de células corticales y epiderrnales; que ocurre con
Rhizobium incapaces de nodular al huésped especificado y podría darse con ausencia
de bacteria.
6.2 Resultados del muestre0 de suelos
El objetivo de esta actividad es el de evaluar el efecto de las caractensticas físicas y
químicas del suelo sobre la formación de simbiosis del cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris
L.) con las bacterias del género Rhizobiurn 1 egurninosarurn, b iovar p haseoli. Trabajo
realizado conjuntamente con el estudio de aislamiento e identificación de cepas de
Rhizobium.
Se analizó un total de ciento once muestras (11 1) procedentes de los departamentos de
Jutiapa y Chimaltenango. Dentro de las características químicas del suelo, se procedió a
evaluar las condiciones nutricionales de los mismos, realizándose la determinación del
contenido de macronutrimentos (potasio, calcio, magnesio, fósforo y nitrógeno), y
micronutrimentos (cobre, hierro, manganeso y cinc).
Así mismo, fueron evaluados el potencial de hidrógeno (pH), contenido de materia
orgánica, contenido de arena, arcilla y limo y se les determinó la clase textura1
correspondiente, obteniéndose una amplia gama de valores por lo que fue necesario tomar
como referencia los diferentes rangos encontrados, según la localidad muestreadas. (ver
tablas)
Dentro de los resultados obtenidos no se encontró ninguna tendencia que permitiera
apreciar alguna correlación dentro de los parámetros evaluados y la presencia o ausencia de
bacterias del género Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli
TABLA NO. 6 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
Como se aprecia en las tablas No.6 y No. 7 al analizar el contenido de calcio, magnesio,
potasio, fósforo y nitrógeno de cada uno de los suelos donde fueron colectadas las muestras
de nódulos, se encontró que se tenían rangos muy variables ya que los valores para calcio
estuvieron dentro de 0.2 a 23.5 cmolkg, para potasio de 0.01 2 cmolkg, magnesio 0.01 a
9.8 cmol/kg, fósforo de 1 a 243 mg/kg. y el rango del porcentaje para nitrógeno que según
la literatura es uno de los factores determinantes estuvo del 0.05 a 0.4 %. En base a los
resultados anteriores, se dice que la fertilidad de la mayoría de los suelos muestreados es
alta.
Es importante mencionar que tanto para el departamento de Jutiapa como para
Chimaltenango se mantuvo esta característica de fertilidad
TABLA NO. 7 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO
TABLA NO. 8 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
% nitrógeno (N)
0.08 - 0.13 0.14
0.12 - 0.16 0.15 - 0.18 0.16 - 0.24 0.08 - 0.2
0.15 0.16 - 0.19 0.06 - 0.18
0.07 0.04 O. 1
mglkg fósforo (P)
22 - 37 11 - 12
15-30 O1 - 08 54 -101 O1 - 10
42 04 -11
21 - 146 14 1 O 21
cmollkg magnesio
(Mg) 0.03 - 0.07 0.05 - 0.07
0.04 - 0.1 0.04 - 2.04 0.01 - 0.05 0.03 - 0.04
0.04 0.02 - 0.1 1 0.59 - 1.23
0.24 0.87 0.54
Cmollkg potasio (K)
0.24 - 0.3 0.04 - 0.64
0.26 - 0.48 0.63 - 0.73 0.38 - 0.42 0.28 - 0.55
0.61 0.24 - 0.52 0.39 - 0.6
0.01 0.02 0.29
Municipio
Santa Cruz Balanyá Patzicia
Patzun Tecpán Santa Apolonia 'san Martín Jilotepeque Zaragosa Comalapa El Tejar Parramos San Andrés ltzapa Chimaltenango
cmollkg Calcio (Ca)
2.44 - 6.21 3.19 - 4.69
4.59 - 5.94 4.51 - 8.01 3.99 - 20.39 2.48 - 6.16
3.23 2.21 - 5.05
10.09 - 19.86 7.14 13.38 8.85
En la tabla No. 8 se observa que los análisis del contenido nutricional del suelo tienen los
siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos en el departamento de Jutiapa
como sigue, cobre 0.1 a 12 mgkg, hierro 0.2 a 29.5 mgíkg, manganeso de 0.02 a 80 mgkg
y cinc de 0.012 a 18 mglkg.
TABLA NO. 9 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO
El análisis del contenido nutricional del suelo para el departamento de Chimaltenango
reportó los siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos como sigue, cobre 0.1
a 4 mgkg, hierro 0.2 a 29.6 mgkg, manganeso de 0.01 a 32 mgkg y cinc de 0.05 a 14.71
mgkg.
En base a los resultados anteriores, se dice que 1 a fertilidad de la mayoría de los suelos
muestreados es alta.
Municipio
Santa Cruz Balanyá Patzicia
Patzún Tecpán Santa Apolonia San Martín Jilotepeque Zaragosa Comalapa ,El Tejar Parramos San Andrés ltzapa Chimaltenango
mglkg cobre (Cu)
0.32 - 0.37 0.33 - 0.34
0.38 - 0.4 3.82 - 4.16 0.42 - 0.44 0.19 - 0.33
0.32 0.36 - 0.4 0.1 1 - 0.37
0.4 0.32 0.16
mglkg cinc (Zn)
0.05 - 0.55 0.05 - 0.08
0.1 1 - 2.95 0.08
1.43 - 14.75 0.06 - 3.6
2.23 0.06 - O1
1.41 - 3.89 0.23 0.3 0.31
mglkg hierro (Fe)
15.2 - 22.5 16.28 - 27.05
10.82 - 29.58 9.97 - 15.08 0.26 - 12.71 15.61 - 28.59
22.1 7 20.24 - 22.84 6.82 - 13.16
5.79 7.57 7.94
mglkg. manganeso
(M n) 3.5 - 6.39
2.91 - 14.46
9.75 - 31 .O4 15.05 - 24.57 25.48 - 32.39 8.85 - 41.71
10.93 9.64 - 22.48 6.99 - 21.1 7
0.01 4.95 2.67
TABLA NO. 10 RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE HIDR~GENO, CONTENIDO DE MATEFUA ORGÁNICA Y CLASE TEXTURAL PREDOMINANTE EN LAS ÁREAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE JUTIAPA
TABLA NO 11. RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE HIDR~GENO, CONTENIDO DE MATERIA ORGÁNICA Y CLASE TEXTURAL PREDOMINANTE EN LAS ÁREAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE CHIMALTENANGO.
Clase Textura1 predominante
Arcilloso Franco arcillo arenoso y arcillosos Arcilloso Arcilloso Franco arcilloso y franco arcillo arenoso Arcilloso Franco arenoso y franco arcilloso Franco arcillo arenoso y arcillosos
% Materia Orgánica (M.O.)
1.21 - 7.93 1.48 - 7.93 1.88 - 6.72 2.02 - 6.59 1.75 - 6.32
4.17 2.55 - 7.53 2.02 - 4.71
Municipio
Sta. Catarina Mita Jutiapa Cornapa Moyuta Quezada Conguaco Asunción Mita Zapotitlán
Potencial de hidrógeno (pH)
4.67 - 6.72 4.8 - 8.09
4.75 - 7.34 4.7 - 6.44 4.91 - 7.51
5.03 4.15 - 6.01 4.99 - 5.69
Jerez
Municipio
Santa Cruz Balanyá Patzicia
El Progreso Agua Blanca Atescatempa Yupiltepeque
Potencial de hidrógeno (pH)
5.49 - 5.55 5.45 - 5.64
% Materia Orgánica (M.O.)
2.29 - 3.63 3.77 - 4.17
Clase Textura1 predominante
Franco arenoso Franco arcillo arenoso
Patzún 5.68 - 5.82 Tecpán 5.5 - 6.32 4.03 - 4.17 Franco arcillo arenoso
5.59 - 6.43 3.53 - 6.21 4.38 - 5.77 5.85 - 5.98
Santa Apolonia Zaragosa Comalapa San Martín Jilotepeque El Tejar Parramos San Andrés ltzapa Chirnaltenango
2.15 - 9.01 1 -75 - 7.66 1 -48 - 2.1 5 1.48 - 6.72
5.05 - 6.6 5.05
4.94 - 5.39 4.76 - 6.32 4.69 - 4.85
4.89 4.58 4.8
Franco arcillo arenosos Franco arcilloso Franco arenoso Franco arenoso
4.3 - 6.32 4.17
3.23 - 4.98 2.69 - 3.63 3.77 - 6.59
3.77 3.23 4.84
Franco arcillo arenoso Franco arenoso Franco arcillo arenoso Arcilloso Franco arenoso y franco arcillo arenoso franco arenoso Franco arcillo arenoso franco arenoso
En las tablas No. 10 y No. 11 se muestran los rangos de los valores encontrados para el
potencial de hidrógeno, el contenido de materia orgánica y la clase textural predominante
tanto para el departamento de Jutiapa como para Chimaltenango respectivamente.
Estos resultados evidencian que para Jutiapa se reportaron valores de pH de 4.1 5 a 8.09, y
Chimaltenango de 4.6 a 6.6. Para el contenido de materia orgánica se tienen rangos de 1.2
% a 9% en Jutiapa y 2.2% a 6.6 % en Chimaltenango.
Para los municipios del departamento de Jutiapa , la clase textural predominante fue la
arcillosa, sin embargo se encontraron suelos franco arenosos, franco arcillosos, franco
arcillo arenosos según el municipio muestreado.
Para los municipios del departamento de Chimaltenango se obtuvo que la clase textural
predominante fue la Franco arcillo arenosa, encontrándose también suelos con clase
textural de franco arenoso, franco arcillosos.
En la siguiente tabla (tabla No. 12) que corresponde a las características fisicas y químicas
de los suelos donde se logró el aislamiento e identificación de Rhizobium leguminosarum
biovarphaseoli, tenemos que para el departamento de Jutiapa, en el municipio de Asunción
Mita el porcentaje de nitrógeno en el suelo estuvo dentro del rango de 0.1 % a 0.3 % ,
valor que corresponde a un moderado contenido de nitrógeno en suelo., el rango de pH se
mantuvo entre 5.1 a 6.7 y la clase textural predominante fue arcillosa, aunque también se
presentó la clase textural franco arcillosa. El contenido de materia orgánica en estos suelos
estuvo dentro del rango de 3% al 8 %, por lo que se le clasificó de moderado a alto
TABLA NO. 12 CARACTERIZACION FÍSICA Y QUÍMICA DE LAS NUESTRAS DE SUELO DONDE SE COLECTARON LAS MUESTRAS DE NODULOS DE LOS CUALES SE AISLÓ Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli .
CARACTERISTICAS FlSlCO QUlMlCAS DE LOS SUELOS DE DONDE SE AISLO RHlZOBlUM
DEPARTAMENTO DE .JüTJAPA
".-. \ct, ratarina Mita I E ~ Ouebracho 1 1 15.18 1 0.61 1 0.06
Municipio
'sta. ~ a t a r i n a Mita ktSl catarina Mita ----- . S ~ ~ . Catarina Mita ctl Catarina Mita
.,---- ---- . sta. Catarina Mita El Quebracho 11 16.14 0.38 0.13
Pozas de Agua 11 7.83 0.28 0.07 I - 1 I I
OI DrnaTRSO (pozas de Aeua 11 1 15.21 1 0.48 1 0.01
Procedencia
La Cuesta del Guayabo 1 El Limón 1 La Unión La Barranca
u1 I .u---- a - 1
El Progreso El Ovejero 1 5.04 ( 0.39 0.00 h t i a n a Amavo Ingenio 1 7.72 1 0.31 0.02 Jutiapa I E ~ Carrizal 1 5 4 6 1 0.69 1 0.06 71itinna I ~ í o La Virgen 11 1 5.16 1 0.01 1 0.02
Ca
8.22 11.62 8.07 11.09
K
0.42 0.86 0.15 0.71
11.42 11.51 19.02
21.32 1 0.02 1 17 1 0.10 1 6.4 1 2.02 1 Francoarcilloarenoso
24.52 22.31
27.04 1 0.04 1 1 1 0.11 1 5.97 1 2.55 1 Arcilloso 6.49 1 0.29 1 29 1 0.12 1 5.12 1 4.03 1 Franco arcillo arenoso
Mg
3.03 0.52 0.05 0.03
0.08 0.06 0.21 0.92 0.08
Cu
0.17 0.41 0.39 0.43
3 1
40
- 4.48
La Lagunita 11 19.57 1.34 0.73 0.45 1.32
25 19
Fe
18.95 5.16 8.93 4.41
0.29 0.25 0.21
4.40 0.12 1 0.11 5.37 16.86 1.47 67 0.15 7.64 -
CHIMALTENANGO
0.34 0.10
8
3.09 1 Arcilloso 3.5 1 Arcilloso
24.76 7.27 11.97
Jutiapa Comapa quezada
Municipio
Patzh Patzun Tecpán Santa Apolonia
70.85 4.02
6.36 6.09 5.59
Textura
Franco arcilloso Arcilloso
6.43 5.8
0.88 2.74 0.09
Cantón Animas Lomas 1 Guachipilín 1 El Retiro 11
Mn
70.14 7.64
0.09 0.18
7.93 7.53 6.59
Procedencia
Saquiyá San Jay Chirijuyú La Mejorana
P
15 1
Zn
1.31 0.22
Arcilloso Franco arcillosos
Franco arcillo arenoso 9.01 2.15
221 79 1
20.38 15.43 5.99
% N
0.16 0.12 0.15 0.24
7 6
Franco arcillo arenoso Franco arcillo arenoso
Ca
5.94 4.59 8.01
20.39
% N
0.1 8 0.18
0.24 0.20 0.12
0.53 0.51 0.71
pH
5.68 5.82 6.32 6.6
0.10 0.1 1
K
0.48 0.26 0.73 0.38
pH
5.01 5.72
7.3 7.34 6.1 8
0.00 84.46 0.32
% M.O. 3.63 3.36 4.03 6.32
% M.O.
2.8 3.77
5.08 6.72
Mg
0.04 0.10 2.04 0.01
Textura
Franco arcilloso Franco arenoso
Franco arcillo arenoso Franco arcillo arenoso
5.38 2.8 2.29
0.46 0.41 0.27
3.77 2.69
Franco Arcilloso Arcilloso
0.56 2.42 8.06
Cu
0.38 0.40 3.82 0.44
Arcilloso Arcilloso
Fe
29.58 10.82 9.97 0.26
Mn
31.04 9.75 15.05 25.48
Zn
0.11 2.95 0.08 14.75
P
15 30 1
101
En la tabla No. 12 también se puede observar que para el municipio de Jutiapa se
obtuvieron rangos del porcentaje de nitrógeno clasificados como moderados (0.1% a
0.3%), pH en rangos de 6.4 a 7.3, y contenido de materia orgánica de 2% a 5% , suelos
predominantemente arcillosos, existiendo también suelos con textura franco arcillo
arenosos.
En el municipio de El Progreso, se determinó que las cepas aisladas fueron de suelos
Franco arcillo arenosos, con alto contenido de materia orgánica, y pH de 5.5 a 6.5
(ligeramente ácido). Las condiciones para Comapa y Quezada también fueron similares.
En general para el departamento de Jutiapa, se dice que se tienen suelos con características
apropiadas para el cultivo de fiijol y su estado nutricional es apto para su desarrollo.
Para el departamento de Chimaltenango se encontró que el rango de contenido de nitrógeno
en el suelo varió de 0.12 % a 0.24 % lo que represente un moderado contenido del
elemento en el suelo.
El rango de pH va de 5.6 a 6.6, y el contenido de materia orgánica de 3.3% a 6.3%, valor
considerado en la interpretación de resultados de moderado alto a alto. La clase textura1
predominante en las muestras que presentaron aislamiento de Rhizobium fue franco arcillo
arenoso (2 muestras), franco arcilloso (1 muestra) y franco arenoso (1 muestra) .
El pH es uno de los factores que tienen un papel determinante en la relación leguminosa-
rizobio ya que como se cita en la literatura, en la mayoría de las leguminosas la infección
de Rhizobium no ocurre en pH menores a 5, tal y como se puede apreciar en (tabla 8) ya
que el valor más bajo de pH reportado fue de 5 .O1
Tanto para el departamento de Jutiapa como para el departamento de Chimaltenango, el
contenido de calcio en el suelo estuvo entre el rango de 5 a 20 mgkg., lo que indica que su
contenido es apropiado para el desarrollo del cultivo ya que las leguminosas son plantas
que demandan de mucho calcio para el proceso de nodulación. Además estimula el
crecimiento del sistema radicular y la formación de nódulos en especies leguminosas
TABLA NO. 13 RESULTADOS OBTENIDOS DE LA CORRELACI~N ENTRE EL CONTENIDO NUTRICIONAL, POTENCIAL DE EIDRÓGENO Y MATERIA DE LOS SUELOS DONDE SE COLECTARON LAS MUESTRAS DE NÓDULOS DE
DONDE SE AISLO Rhizobium legu bia(mphusmIi
Para el análisis de correlación se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson y se tomó
para su interpretación una sigdicancia del 5%. (tabla No. 13)
En eta tabla (tabla No. 13), se aprecia que existió una alta correlación entre el contenido de
nitrógeno y el contenido de materia orgánica (0.01%), que prácticamente es una
correlación perfecta (coeficiente de correlación =1, significancia =0.00%).
En los resultados que se obtuvieron del contenido de materia orgánica (tabla 12), se
observó que el contenido de materia orgánica estaba de moderado a alto, y por estar
correlacionado directamente con el contenido de nitrógeno en el suelo, era de esperarse un
contenido del elemento de moderado a alto, por lo que el contenido de materia orgánica es
un índice que permite estimar aproximadamente las reservas de nitrógeno y de fósforo en el
suelo y su comportamiento en la dinámica de nutrimentos.
También existió una alta correlación entre el elemento calcio y los elemento hierro, fósforo,
nitrógeno, cinc y el contenido de materia orgánica y potencial de hidrógeno. Sin embargo,
la correlación de calcio con hierro es una correlación inversa es decir, que al ir aumentando
el hierro la disponibilidad de calcio en el suelo es menor.
Así mismo, se obtuvo alta correlación del pH con el contenido de calcio, potasio, hierro, y
fósforo; siendo la correlación entre pH y contenido de hierro inversamente proporcional, es
decir que conforme aumenta el pH en el suelo, la actividad del hierro disminuye.
En b ase a 1 os resultados o btenidos ( pH 5.5 - 5.9), e 1 p H del suelo es a propiado p ara 1 a
mayoría de los cultivos porque aquí las interferencias para la absorción de los nutrimentos
esenciales es mínimo, tal y como se muestra en la correlación del pH con el contenido de
calcio, potasio y fósforo.
Dentro de este análisis también se obtuvo que el hierro y el manganeso están
correlacionado significativamente (4.3%).
7. CONCLUSIONES
Se logró colectar un total de 1 1 1 muestras de nódulos y de suelos en 25 municipios
de las dos zonas en estudio.
En los municipios de Jutiapa y Chimaltenango, se encontraron 21 cepas de
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, pues fueron capaces de infectar a
plantas de fiijol común en condiciones controladas de laboratorio.
La fertilización nitrogenada química adicionada al cultivo de frijol (Phaseolus
vulgaris) de donde se recolectaron los nódulos, no afectó la formación de los
mismos.
En el departamento Jutiapa en donde existió mayor porcentaje de cepas
identificadas fueron los municipios de Santa Catarina Mita (6 cepas) y el municipio
de Jutiapa (6 cepas).
Entre los posibles factores responsables del 34 % de aislamientos negativos se
pueden mencionar: el tamaño nodular, la conservación de nódulos, el efecto del
hipoclorito de calcio y el número de análisis efectuados por muestra.
Las cinco cepas (43, 41, 46, 23 y 3 1) que presentaron alta infectividad pertenecen a
los municipios de Santa Catarina Mita, Jutiapa, Quezada y el Progreso del
departamento de Jutiapa.
Trece cepas presentaron alta contaminación por hongos por lo que no existió
respuesta a la infección, lo que limitó el avance del proyecto.
Se efectuaron 11 1 determinaciones para cada uno de los macro y micronutrimentos,
contenido de pH, contenido de materia orgánica y clase textual, obteniéndose que
la mayoría de las muestras mostraron una fertilidad de moderada a alta.
Las clase texturales predominantes en el departamento de Jutiapa fueron: arcilloso y
franco arcillo arenoso; mientras que en departamento de Chimaltenango fueron:
franco arenosos y franco arcillo arenosos.
Basándonos en los análisis realizados de pH, se estableció que existían condiciones
apropiadas para el desarrollo de Rhizobium (pH mayores de 5).
El aislamiento de bacterias no estuvo correlacionado con el estado nutricional del
suelo donde fueron colectados los nódulos, sin embargo, si existió correlación entre
el contenido nutricional del suelo, contenido de materia orgánica y potencial de
hidrógeno de las muestras de suelo de donde se logró el aislamiento de Rhizobium.
8. RECOMENDACIONES
Realizar estudios de caracterización a las 21 cepas identificadas como Rhizobium
leguminosarum biovar phaseoli, y poder así contar con una fuente orgánica que
sirva como una alternativa para disminuir el uso de fórmulas químicas nitrogenadas
en el cultivo de hjol .
Que para las muestras donde no se obtuvo respuesta a la infección de plantas por
Rhizobium, se trabaje en lugares que cumplan con las condiciones de asepsia con el
propósito de evitar contaminación por hongos.
Evaluar las cepas aisladas de bacterias del género Rhizobium leguminosarum,
biovarphaseoli en suelos arcillosos y de baja fertilidad, a efecto de observar su
potencial para fijar nitrógeno atmosférico a nivel de invernadero y ensayos de
campo.
Las c epas a isladas deberán c onservarse e n ampollas 1 eofilizadas p ara a segurar S u
preservación por períodos mayores de 3 meses.
Repetir los muestreos de sitios en los cuales no se logró el aislamiento de cepas.
Seguir muestreando las diferentes zonas frijoleras del país.
9. BIBLIOGRAFIA
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tres variedades de frijol negro en Guatemala. Guatemala: Universidad de San
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10. ANEXOS
ANEXO 1
Clasificación por grupos de Rhizobium
Grupo 1 : Rhizobium de crecimiento rápido, productores de ácido con 2-6 flagelos peritricales. Las colonias miden 2-4 mm. a los 3-5 días de incubación en agar manitol-
levadura. Aislados de leguminosas de regiones templadas.
ESPECIE HUESPED
R. leguminosarum Phaseolus vulgaris
R. trifolii Medicago, Meliloti, Tregonella
R. phaseoli Trifolium
Grupo 11: Rhizobium de crecimiento lento, productoras alcalinas, con flagelos, las colonias son menores de 1 mm de diámetro a los 5-7 días en placas de agar Manitol-levadura.
Nodulan leguminosas tropicales.
ESPECIE HUESPED
R. japonicum Lupinus, Ornithopus
R. Iipini Vigna, Desmodium, Archis, Centrocema, Stylosanthes, etc
Fuente: referencia No. 1
ANEXO 2
Morfología de Rhizobium obtenido directamente de nódulos
FORMA
CONTORNO
BORDES
TAMAÑO (ancho: LARGO)
AGRUPACIONES
REACCION GRAM
OTROS
Recto
Redondeados
parejas, cadenas y en racimo
negativo
3-5 gránulos púrpuras redondeados dentro de la bacteria.
ANEXO 3
Morfología colonial de Rhizobium
Morfología de las colonias de Rhizobium en agar manitol-levadura incubados a 30 grados por tres días
Tamaño
- - -
2-4 mm de diámetro
Forma colonia circular
Pigmentación blancas opacas ó leñosas translúcidas
Elevación Elevadas o planas
Borde
Superficie
Estructura
liso
lisa
amor fa
Consistencia viscosa
Fuente: referencia No. 1
ANEXO 4
GUIA PARA LA INTERPRETACION DE ANALISIS DE SUELOS
MEDIO ALTO 4-20 >20
CmoYKg. =
m e q 1 1 0 0 g suelo
Mglkg. = ppm
RANGO
1 % Materia 1 0.6-2.0 2.1-4.5 >4.5
1 1 l Fuente: Kass, D. Fertilidad de Suelos
pH ácido 5.6-6.5
neutro 6.6-7.3
alcalino 7.4-8.3
ANEXO 5
AISLAMIENTO DE Rhizobium
Los nódulos desecados se deben rehidratar antes de esterilizarlos. Colocar los
nódulos en vasos de precipitar pequeños con agua estéril fna y dejar en el
refrigerador toda la noche para que la absorban.
Sumergir los nódulos intactos y sin daño 5-10 segundos en etanol al 95 %.
Transferirlos a una solución de hipoclorito de calcio al 3 % y dejar por 4-6 minutos.
Lavar en 5 recipientes estériles con agua estéril ( se pueden utilizar cajas de petri
plásticas).
Romper 1 os n ódulos e n una gota d e agua e stéril e n una caja d e p etri. S embrar 1 a
suspensión nodular en agar Manitol-levadura más azul de bromotimol. Flamear
entre cada estiada.
Incubar a 25-30 grados centígrados en oscuridad, 4 a 10 días. Buscar colonias
aisladas típicas de Rhizobium.
Aislar cada colonia diferente en agar levadura manitol más azul bromotimol.
Incubar y observar diariamente la aparición de colonias típicas de Rhizobium.
o Azul de bromotimol: un color amarillo debido a la producción de ácido
de Rhizobium de crecimiento rápido.
Se deben leer 3-5 días después para los de crecimiento rápido.
Realizar gram y montajes en fresco para observar movilidad.
Transferir a tubos de cultivo con caldo manitol levadura.
Incubar a 25 grados centígrados por 3-5 días.
IDENTIFICACIÓN DE Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli
La identificación se realizará por medio de la infección de Phaseolus vulgaris por las
cepas aisladas.
Se utilizarán bolsas de crecimiento hechas de propileno aproximadamente de 16" 18
cm, con una hoja de papel adsorbente en el interior y un canal hecho del mismo
papel en el borde superior.
Colocar en el interior de la bolsa 50 m1 de solución nutriente para planta.
Esterilizar la superficie las semillas:
o Seleccionar semillas de viabilidad buena, libres de daño; si se ha usado
pesticida, estas deben ser lavadas con agua y secadas con papel absorbente.
o Colocar las semillas en erlenmeyer autoclaveado y cubrirlo con una caja de
petri estéril.
o Lavar las semillas en alcohol al 95% por 10 segundos, quitar alcohol.
o Agregar hipoclorito de calcio al 3% en volumen suficiente para cubrir todas
las semillas, mezclar y dejar 5 minutos. Descartar la solución.
o Lavar con agua estéril, 6 veces.
o Agregar suficiente agua y c olocar las semillas e n el r efrigerador para que
absorban el agua por 4 horas.
Trasladar asépticamente las semillas a una caja de petri que contenga dos láminas de
papel filtro esterilizado ( 20 semillas por caja de petri ).
Dejar las semillas 24 a 48 horas hasta que germinen
Seleccionar las semillas germinadas y de radículas de 1 - 1.5 cm. de largo.
Colocar las semillas esterilizadas y pregerminadas en un en la bolsa de crecimiento,
con la raíz en el interior de la bolsa.
Se dejan 5-7 días las plantas
PREPARACIÓN DEL INÓCULO: La técnica utilizada para esto es la sugerida por
Vincent y Somasegaran
o Suspensión inicial: A partir del cultivo puro obtenido de las cepas aisladas
sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, tomar 10 asadas
de las colonias y colocarlas en 5 ml. de caldo manitol-levadura (ML).
o A partir de la suspensión inicial se realizarán seis diluciones 1 5 , seriadas,
con cuatro repeticiones para cada dilución, de la manera siguiente:
Dilución 1: lrnl de suspensión inicial para cada bolsa de
crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 5 : 1 m1 d el anterior + 4 m1 d e caldo M L. 1 m1 p ara
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 25: lml del anterior + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 125: lrnl del anterior + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 625: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. Iml para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 3 125: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dejar 3 semanas con luz permanente las bolsas y observar la presencia de nódulos.
Se utilizaran como control positivo: una bolsa de crecimiento con nitrógeno
inorgánico. Y como control negativo: bolsa de crecimiento sin inocular.
Las cepas se conservarán en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral en la
superficie
11. FOTOGRAFIAS
FOTO 1. CONSERVACION DE NODULOS COLECTADOS
FOTO 2. AISLAMIENTO DE CEPAS DE RHIZOBIUM
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i FOTO 3. DESINFESTACIQN DE LA SEMILLA DE W O L ;f-$!:;/. q c .+-2.,.-, ...y - ~~, . , - -. ...~."p~~G.*~,p";~~:?.'-': ,'. 7
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FOTO 5. PREGERMINADO DE SEMILLAS
FOTO 6. BOLSAS DE CRECIMIENTO PARA COMPROBACION DE Rhizobium leguminmarum biovar phasmli
FOTO 7. NODULOS DE Rhizobiurn leguminmararm biovarphaseoli
FOTO 8. NODULOS DE RIrizobUrm kguminmamm b i o v a r p h d i
2 FOTO 9. CONSERVACION DE CEPAS
FOTO 10. INGRESO Y CODIFICACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE SUELOS.