"ANALISIS ELECTROFORTICO DEL ADN

I.INTRODUCCION:

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.

El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao (peso molecular), forma y carga neta (a mayor carga neta, la molcula migrar ms rpido; a mayor friccin, la movilidad ser menor). La movilidad de las partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molcula y de forma inversamente proporcional a la friccin de la molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma.

Generalmente, se usan dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se emplea para separar fragmentos de ADN con tamaos de 100 pares de bases hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares de bases.

Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas.Las bandas del ADN o fragmentos de un determinado tamao pueden observarse en estos geles al intercalar molculas de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloracin naranja cuando se coloca en un transiluminador con luz ultravioleta.

Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros.

II.OBJETIVOS:

Establecer los procedimientos bsicos de la tcnica de electroforesis.Realizar la electroforesis del ADN en cmara horizontal.Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de agarosa.

III.FUNDAMENTO TEORICO:

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.

El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao (peso molecular), forma y carga neta (a mayor carga neta, la molcula migrar ms rpido; a mayor friccin, la movilidad ser menor). La movilidad de las partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molcula y de forma inversamente proporcional a la friccin de la molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma.

Generalmente, se usan dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se emplea para separar fragmentos de ADN con tamaos de 100 pares de bases hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares de bases.

Fig.1.-Preparacin del gel de acrilamida.

Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas.Las bandas del ADN o fragmentos de un determinado tamao pueden observarse en estos geles al intercalar molculas de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloracin naranja cuando se coloca en un transiluminador con luz ultravioleta.

Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros.

Electroforesis de cidos nucleicos:

No slo las protenas presentan carga y son solubles, tambin los cidos nucleicos tienen la capacidad de migrar en un campo elctrico y, por tanto, son susceptibles de ser separados por electroforesis, aunque con algunas variaciones con respecto de las protenas:

Son molculas de mayor tamao:Lo que implica que el tamao de poro que nos da la acrilamida puede ser demasiado pequeo.

Presenta gran cantidad de conformaciones y de tamaos:Lo que supone una gran variabilidad a la hora de disear los experimentos, ya que no es lo mismo separar cromosomas que simples nucletidos.En principio, es anloga a la electroforesis de protenas en condiciones desnaturalizantes, salvo que aqu no hace falta el SDS para conferir la misma relacin carga/masa es todas las molculas (aunque se utiliza en el tampn de carga), ya que en los cidos nucleicos la parte que confiere la carga es el grupofosfato, y est presente de forma regular en la estructura.En estas condiciones, y al contrario que las protenas, si realizramos una electroforesis libre, observaramos como todas las molculas migraran hacia el polo positivo con la misma velocidad al tenerigual. Esta propiedad no nos sirve de mucho, pero hay que decir que en un soporte en gel, como los que vamos a utilizar, las molculas de cido nucleico se separan en funcin de su tamao.

Soportes

Como ya he avanzado, la acrilamida se queda pequea en la mayora de las electroforesis de cido nucleico, y es por lo que se utiliza otro tipo de soporte.

Agarosa:

polmero que funde a 80 - 90 C (aunque hay agarosas de muy diverso tipo, entre las que se encuentran las de bajo punto de fusin), y forman gel a unos 30 C. El rango de concentracin oscila entre el 0,3 %, que puede separar molculas del orden de 5 a 60 Kb, y el 2% que puede separar cidos nucleicos de 0,1 a 0,2 Kb.

Poliacrilamida:

de la que ya hemos hablado y que para cidos nucleicos ronda unas concentraciones del orden del 3,5%, con una capacidad separadora de 1.000 a 2.000 bases y del 20%, que puede diferenciar molculas de 6 a 50 bases. Permite separar molculas que slo difieren en un solo nucletido, que implica la utilizacin de geles de poliacrilamida en secuenciacin.La agarosa es, por tanto, el soporte ms utilizado, y supone la aparicin de nuevos aparatos, al ser ms frgil que la acrilamida y no poder intercambiarse los moldes. sta fragilidad hace que, adems de tener que ser geles ms gruesos, se hagan y se utilicen de forma horizontal, ya que si no se resquebrajaran.

Fig.2.-Preparacinde el gel de acrilamida.

Para los geles de agarosa hay moldes rectangulares que estn abiertos por los dos extremos, de modo que antes de echar la agarosa fundida en el molde hay que sellar esos dos extremos, funcin que realiza una cinta adhesiva que se coloca segn la figura. Una vez sellado el molde por los cuatro costados se deposita la agarosa fundida con cuidado de no formar burbujas. Una vez lleno a una altura prudencial, y con la agarosa todava lquida se procede a colocar el peine, normalmente a cualquiera de los extremos del molde, teniendo siempre cuidado de que el peine no toque el fondo del molde. Las formas de sujetar el peine una vez colocado son muy diversas y suelen depender de la pasta que tenga el laboratorio, desde peines dobles con tuercas reguladoras (como el que nos ense el profesor en clase), hasta sujetar el peine con dos pinzas para papel pasando por soportes de metacrilato al que se adhiere el peine. En general es conveniente que se haga el ajuste de altura antes de echar la agarosa en el molde.Como se observa tambin en la figura, una vez polimerizado el gel (proceso que requiere enfriamiento de la agarosa, no reacciones qumicas como en la acrilamida), se le retiran las cintas adhesivas, de modo, que la agarosa queda libre en los dos extremos del gel, lo que se aprovecha para colocarlo en una cubeta en forma de puente con los pocillos en la cubeta con el electrodo negativo. El gel se encuentra sumergido en un electrolito tamponado con Tris-Borato (no glicina), para garantizar que los cido nucleico estn cargados negativamente; por esto a la tcnica se le denominaelectroforesis de inmersin. Las molculas migrarn hacia el polo positivo, de modo que viajarn en esa direccin por el gel, separndose por tamao (n de nuletidos).

Al igual que con las protenas, en estas condiciones se debe aadir un compuesto que aumente la densidad de la muestra y no difunda, o pase a otros pocillos a la hora de cargar la muestra, y unos marcadores de frente que nos permitan detener la electroforesis en el momento que lo creamos oportuno.Para visualizar las bandas, hay que teir el gel o marcar radiactivamente las molculas. El mtodo ms utilizado en geles de agarosa es el delBrEt(bromuro de etidio), del que ya hemos hablado. Se comporta como un agente intercalante, de modo que, adems de disminuir la densidad de la molcula, tiene la capacidad de emitir luz cuando se le excita con luz ultravioleta. Hay que tener cuidado con este compuesto ya que es altamente cancergeno. En un principio, una vez corrido el gel se retiraba y se pona a incubar durante un tiempo (30 minutos), a continuacin se miraba la posicin de las bandas con la lmpara de U.V. Ahora, y para evitar la difusin que se produca durante la incubacin, se aade el BrEt tanto en la agarosa como en el electrolito, de modo que, puedes parar la electroforesis y visualizar las bandas en la lmpara, y si es necesario continuar corriendo el gel sin ningn problema.

Fig.3.- Mapa conceptual de los componentes.

Hay varios tipos de visores para este tipo de geles, uno que proyecta la luz U.V por arriba, que implica que tienes que ponerte unas gafas o una careta, adems de los guantes para protegerte del BrEt, y que lleva incorporado una cmara, que saca las fotos en negativo. La foto es muy importante ya que permite trabajar con algo imperecedero, no como el gel, que poco a poco va difundiendo y perdiendo el BrEt. El otro tipo, sin embargo, presenta la fuente de luz abajo, y con una pantalla enzima del gel que nos protege de la radiacin.

Fig.4.- Grficas referidas a las bandas electroforeticas.

Siguiendo con el soporte de agarosa, nos interesa saber como varacon respecto del tamao del poro, o lo que es lo mismo de la concentracin de agarosa. Si digerimos una muestra de DNA con una enzima de restriccin y representamos los valores dede cada fragmento en diferentes concentraciones de agarosa, obtendramos una grfica como la de la figura, donde se observa como aparecen lneas de la misma pendiente, que indican cmo vara la movilidad con respecto de la concentracin, haciendo que aumenteal aumentar la concentracin.

Fenmenos que alteran:

Uno de los fenmenos que ms se producen es el denominado deinversin de banda, debido a la tendencia de los fragmentos de tamao medio de DNA a formar horquillas, lo que hace que queden retenidos en los poros el gel ms tiempo del necesario, siendo por tanto, adelantados por fragmentos de mayor tamao. Los de mayor y menor tamao no presentan esta tendencia, con lo que migran sin problemas.

Fig.5.- Grficas referidas a las bandas electroforeticas.

Esta variacin dedel DNA debida a la estructura nos permite separar fragmentos de igual tamao y con diferente conformacin, como en el caso del superenrollamiento. Un fragmento circular de DNA se puede encontrar en formas relajadas o superenrolladas (supercoiled).Si introducimos molculas de igual tamao y con estructura ms o menos enrolladas veremos como se nos separan, quedando las ms enrolladas con una movilidad mayor que las relajadas. De este modo, tambin podemos diferenciar formas O.C. de C.C; de DNAs s.s. y d.s.; de formas enrolladas y relajadas. Todas, aunque de igual tamao presentan diferentes movilidades electroforticas. Esta propiedad es muy til a la hora de identificar elementos extracromosomales (plsmidos).

IV.MATERIALES Y METODOS:

Cmara de electroforesis horizontal y accesorios.Fuente de poderGuantes de latexGradillas para tubos eppendorfMicropipetas y puntas de 20uLTransluminador

Soluciones y reactivosAgarosa de grado molecular al 1%Buffer TBE 10X (Tris base, cido brico, 0.5M EDTA pH 8.0)Buffer TBE 1XBuffer de carga 10X (0,25% w/v Azul de bromofenol, 0,25% w/v Xilene cianol, 40% w/v Sucrosa)Bromuro de etidioMarcador de peso Molecular

Nota: Para la preparacin del gel es importante tener completamente ensamblada la cmara de electroforesis ubicndola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algn tipo de declive.

V.RESULTADOS:

Aplicacin de la muestra

La aplicacion de la muestra para la corrida electroforeticadespuesde la preparacion de la agarosa,cada muestra se debe colocar teniendo en cuenta cual es su contenido,plasmido el DNA extraido de la sangre.

Corrida de la electroforesis

Los fragmentos de DNA corren en cuanto a su peso y a la afinidad de cada colorante como el xilenxianol y el azul de bromofenol.

Visualizacin del gel

La visualizacion en el caso de utilizar el bromuro de etidio es necesario hacerla en la oscuridad con una lampara de UV.

En el caso de haber utilizado un marcador se observan las bandas y se comparan con las del marcador,ademas con esto tambien se pueden observer si el dna esta puro,en el caso de formacion de smirs podemos decir que existen dna asas o en otros caso tambien se puede decir que el DNA esta contaminado.

VI.DISCUSIONES:

Es importante realizar un analisis electroforetico de las muestras ya que con este se puede saber si existen RNA asas o si nuestra extraccion de and se ha realizado con existe y no hay presencia de contaminantes.

Tambien es importante para saber cual es el peso de los fragmentos,en el caso de que se haya utilizado un marcador.

Las tecnicas del analisis electroforetico del DNA,son utilizadas en la cuantificacion segun el peso de las bandas

VII.CONCLUSIONES:

El analisis elctroforetico del DNA,es muy importante en la biologia molecular y biotecnologiamedica, para la produccion de vacunas recombinantes y la realizacion de diagnostico, reconociendo las bandas de dna o segmentos los cuales son insertados en el plasmido y luego realizar las experimentaciones y pasos subsiguientes de mejoramiento de las tecnicas. TBE:Disolucin tampnformada porTris,boratoyEDTA, de uso frecuente enelectroforesis, en especial en gel deagarosapara separar cidos nucleicos. ElTrises la molcula responsable deltamponamiento(regulacin del pH). Elboratocontribuye a ajustar el pH deseado e igualmente a mantenerlo. ElEDTAes unquelantede cationes divalentes cuya funcin es secuestrar el Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden los cidos nucleicos de la muestra (la mayora de lasnucleasasrequieren Mg2+comocoenzima). Tampn TBE ( Tris - Borato - EDTA) proporciona una solucin inica que permite que la corriente pase a travs del agua. El Tris ( y el hecho de que el tampn es bsico ) parte es til para mantener el ADN en solucin y desprotonado . TBE ( Tris borato EDTA) acta como un electrolito para llevar corriente a travs del gel , proporcionando la fuerza motriz . Tris y borato son sales tampn, para la estabilizacin del pH. EDTA a proteger el ADN contra DNasas , es un quelante de cationes divalentes ( Mg2 + ... ) que son cofateurs de DNasas .

Tampn de restriccin mantiene el pH en un rango adecuado para la actividad enzimtica , as como el suministro de sal cofactores requeridos para la catlisis . Desde diferentes enzimas de restriccin requieren condiciones de sal y pH variable, una sola memoria intermedia de compromiso puede ser utilizada que establece un equilibrio entre las condiciones preferidas por las diversas enzimas de restriccin . ( Spec . Tampn de restriccin de compromiso)

En la biologa molecular , TBE y TAE tampones se utilizan a menudo en procedimientos que implican cidos nucleicos, la electroforesis ser ms comn . Soluciones de Tris - cido son tampones efectivos para condiciones ligeramente bsicas , que mantienen ADN desprotonado y soluble en agua. EDTA es un quelante de cationes divalentes , en particular de magnesio ( Mg2 +) . Como estos iones son co- factores necesarios para muchas enzimas , incluidas las nucleasas contaminantes , el papel del EDTA es proteger los cidos nucleicos contra la degradacin enzimtica. Pero como Mg2 + es tambin un co-factor para muchas enzimas de ADN modificadores tiles tales como enzimas de restriccin y ADN polimerasas , su concentracin en TBE o TAE tampones generalmente se mantiene baja ( tpicamente a alrededor de 1 mM). AMs recientemente descubrieron sustitutos de TBE y TAE tampones para electroforesis estn disponibles . [ 1 ] Receta (1 litro de solucin madre 5X ) [ editar] 54 g de base Tris ( CAS # 77-86-1 ) 27,5 g de cido brico ( CAS # 10043-35-3 ) 20 ml de 0,5 M EDTA ( CAS # 60-00-4 ) (pH 8,0 ) TBE puede ser diluido a 1X antes del uso en electroforesis, 0.5x es aceptable tambin.