metodos de estudio y control de los microorg

MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL

DE LOS

MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL

DE LOS

MICROORGANISMOS

Dra. M. E. Arias FernándezDpto. Microbiología y Parasitología

E-mail: enriqueta.arias@uah.es

• Métodos de observación de los microorganismos� El microscopio. Tipos de microscopios. Preparación y examen

de muestras. Tipos de tinciones.

• Métodos de aislamiento de los microorganismos

• Crecimiento de los microorganismos:� Nutrición microbiana: requerimientos nutritivos� Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo� Crecimiento microbiano: curva de crecimiento� Determinación del crecimiento.� Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento� Microorganismos extremófilos

• Control de poblaciones microbianas:� Métodos físicos: Esterilización y otros métodos� Métodos químicos: desinfectantes, antisépticos y

esterilizantes� Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos de

síntesis

PROGRAMAPROGRAMA

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS

MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS

MICROORGANISMOS

MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS

PROTOZOOS

ALGAS

HONGOS VIRUS

BACTERIAS

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

MICROSCOPIO ÓPTICO

RANGO DE TAMAÑO DE LOS MICROORGANISMOS

VIRUS BACTERIAS

SUBVIRICAS

EUCARIOTAS

1 nm 10 102 103 104 105 106

1 µm 1 mm

TIPOS DE MICROSCOPIOSTIPOS DE MICROSCOPIOS

• Microscopio óptico:� Microscopio de campo claro� Microscopio de campo oscuro� Microscopio de contraste de fases� Microscopio de fluorescencia� Microscopio de láser confocal

• Microscopio electrónico:� De barrido� De transmisión

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)

EL MICROSCOPIO ÓPTICOEL MICROSCOPIO ÓPTICO

CAMPO OSCURO CONTRASTE DE FASES

CAMPO CLARO FLUORESCENCIA CONFOCAL

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICOEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM)

Haz de electrones que atraviesa cortes ultrafinos de una muestra

Haz de electrones que “barre” la superficie de un objeto sólido

Resolución: < 7nm

Resolución: 5 Å

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)

Microscopio de efecto túnelMicroscopio de fuerza atómica

Manipulandoátomos...

Obtiene imágenes con resolución de menos de 1 nm

Observación de una espora de Aspergillus oryzae atrapada en un poro con microscopio de fuerza atómica

TIPOS DE TINCIONESTIPOS DE TINCIONES

TINCIÓN SIMPLETINCIÓN SIMPLE

TINCIÓN DIFERENCIALTINCIÓN DIFERENCIALTINCIÓN DE GRAM TINCIÓN DE Ziehl-Neelsen

TINCIONES ESPECÍFICASTINCIONES ESPECÍFICAS

TINCIÓN DE CÁPSULA TINCIÓN DE FLAGELOS TINCIÓN DE ESPORAS

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE

LOS MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE

LOS MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

• Siembra por estría en placa Petri• Vertido en placa• Extensión en placa:

- Diluciones seriadas- Asa de Digralsky

SIEMBRA POR ESTRÍA EN PLACA DE PETRI

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

DILUCIONES SERIADAS

Extensión en placa Vertido en placa

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

� Medios definidos

� Medios complejos

� Medios selectivos

� Medios diferenciales

� Medios selectivos y diferenciales

� Medios de enriquecimiento

COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DEFINIDO Y UN MEDIO COMPLEJO

• Medio definido

� Glucosa…………. 10 g� (NH4)2SO4…………. 2 g� CaCl2 ……….......0,01 g� FeSO4.7H2O…..0,005 g� MgSO4.7H2O…..0,02 g� Agua destilada…… 1 L� Agar……………… 15 g

• Medio complejo: caldo nutritivo

�Peptona…………… 5 g

�Extracto de carne.. 3 g

�NaCl…………………8 g

�Agua destilada…….1 L

MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

Medios selectivos y diferenciales

Medios de enriquecimiento

Agar Entéricode Hektoen

Agar Baird-Parker

Agar Levine(EMB) Agar Wilson-Blair

Caldo Giolitti-CantoniCaldo Müller-Kauffmann

(Enterobacterias patógenas) (Estafilococos) (Coliformes) (Salmonella)

(Estafilococos)(Salmonella)

CRECIMIENTO Y CONTROL DE

LOS MICROORGANISMOS

CRECIMIENTO Y CONTROL DE

LOS MICROORGANISMOS

NUTRICIÓN MICROBIANA: REQUERIMIENTOS NUTRITIVOSNUTRICIÓN MICROBIANA: REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS�Fuente de carbono:

- CO2: Autótrofos

- Compuestos orgánicos: heterótrofos

�Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor

- Luz: fototrofos

- Compuestos químicos: quimiotrofos

- compuestos orgánicos: quimioorganotrofos

- compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos

�Tipos nutricionales de los microorganismos:

� Fotoautótrofos

� Fotoheterótrofos

� Quimiolitotrofos autótrofos

� Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos

� Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)

CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS

1- ENTRADA DE NUTRIENTES

CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS

2- REACCIONES CATABÓLICAS

CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS

3- BIOSÍNTESIS

CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS

4- POLIMERIZACIÓN

CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS

5- ENSAMBLAJE

FUENTE DE NITRÓGENO

� Inorgánica:

- NH4+

- NO3-

- N2

� Compuestos orgánicos nitrogenados:- aminoácidos- bases nitrogenadas, etc.

(Bacillus, Pseudomonas)

(Nitrosomonas, Nitrobacter)

(Azotobacter, Cianobacterias)

(Clostridium, fototrofas rojas y verdes)

OTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALESOTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

� Fósforo: Fosfato

� Azufre:

- SO4 2-

- SH2

- Compuestos

orgánicos azufrados

� K, Mg, Na, Ca, Fe, etc.

� Micronutrientes: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, etc.

� Factores de crecimiento: vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc.

(Thiobacillus, Beggiatoa,Foto-trofos erobios)

(B. Fototróficasrojas y verdes)

(Desulfovibrio, Desulfobacter)

(Desulfuromonas,

Archaea term.)

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• División celular en procariotas

Fisión binaria

El tiempo para completar el ciclo depende de factores

nutricionales y genéticos

1. Contraste de fases

2. Tinción de nucleoide

3. Tinción del anillo FtsZ

4. Tinción de nucleoide y anillo

1

2

3

4

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• Crecimiento de poblaciones- Velocidad de crecimiento

- Tiempo de generación

- Expresión del crecimiento

Datos de una población que se

duplica cada 30 minutos

Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano que se inicia con una sola célula y que tiene un tiempo de generación de 30 min:

Datos representados

en distintas escalas

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• Curva de crecimiento: sus fases

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTODETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO

RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO

TURBIDIMETRÍA

RECUENTO DE VIABLESDETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTODETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO

EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO

• Temperatura

Desnaturalización de Proteínas;

Colapso de la membrana; citoplasmática; lisis térmica

Gelificación de membrana; proceso de transporte demasiado lento para soportar el crecimiento

Tasa d

e C

recim

iento

Reacciones enzimáticas a la máxima velocidad posible

Reacciones enzimáticas incrementando sus velocidades de reacción

Temperatura mínima y óptima

EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO

• TemperaturaTipos de microorganismos según su temperatura óptima

Mesófilos

Termófilos

Psicrófilos

Hipertermófilos Hipertermófilos

EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO

Salinidad

�Halófilo: discretos (1-6 %) y moderados (6-15 %) de NaCl

� Halotolerante: crecen en amplio rango de actividad de agua

�Halófilos extremos: 17-36 % NaCl

Aer

ob

ios

An

aero

bio

s

Fac

ult

ativ

os

Mic

roae

rófi

los

An

aero

bio

s ae

roto

lera

nte

sTipos de microorganismos en relación

con el oxígeno

Medio con tioglicolato y

resazurina

Medio con tioglicolatoy resazurina

CULTIVO DE ANAEROBIOS

Catalizador (Pd)

H2

2H2+O2 2H2O

Radicales tóxicos del oxígeno

Enzimas que destruyen radicales tóxicos del O2

Pyrococcus furiosus

MÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍAMÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍA

� Esterilización: destrucción total de formas vivas/material inerte

� Desinfección: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en material inerte desinfectantes

� Antisepsia: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en la superficie de tejidos vivos antisépticos

� Saneamiento: reducción población microbiana en material inerte o tejidos vivos hasta niveles seguros limpieza mecánica/productos

� Quimioterapia: control crecimiento microbiano dentro de un hospedador agentes quimioterapéuticos antimicrobianos

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos físicos: esterilización por calor

� Calor seco

� Horno Pasteur (170°C/ 1-2h)

� Flameado (incineración)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

� Vapor de agua a presión: el autoclave (121°C/ 20min)

� Hervido (100°C)

� Calor húmedo

� Tindalización (100°C)

� Esterilización a temperatura ultraelevada (UHT)

• Métodos físicos: esterilización por calor

� Pasteurización: Reducción de

población microbiana y alargamiento vida útil

HTST: 71-72°Cdurante 15 seg.

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Métodos físicos: esterilización por filtración

� Filtración de soluciones termosensibles

� Filtración del aire:� Algodones en los tubos de vidrio, mascarillas� Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)

� Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar� Habitaciones especiales de hospitales (inmunosuprimidos)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Métodos físicos: esterilización por radiación

� Depende de la energía (λ), intensidad y duración

� Radiaciones utilizadas: � IONIZANTES (λ < 200nm)

� Rayos γ (60Co y 137Cs)� Rayos de electrones� Rayos X

� NO IONIZANTES (λ > 200nm)� Luz UV (λ = 260nm)� Microondas

Suministros quirúrgicos, medicamentos, materiales de

laboratorio, industria alimentos, productos cárnicos

Desinfección de superficies, aire, etc.

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

� Control por bajas temperaturas� Congelación� Refrigeración (0-5°C)

Métodos físicos: otros métodos

� Desecación� Evaporación (Industria alimentaria)

� Liofilización (conservar cultivos, hemoderivados, etc)

� Soluciones hipertónicas (salazón, miel, mermeladas, etc)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicosPropiedades de los agentes químicos:

1. Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales2. Amplio espectro3. Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica4. Soluble en agua5. Estable, inodoro y económico

Tipos de agentes químicos:

� Antisépticos� Desinfectantes� Esterilizantes

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicosPrincipales grupos de antisépticos:

AGENTE APLICACIÓN

� Alcohol (60-85% etanol) Piel

� Fenoles (hexaclorofeno, triclosan, clorhexidina)

Jabones, lociones, cosméticosy desodorantes

� Detergentes catiónicos(cloruro de benzalconio)

Jabones y lociones

� Peróxido de hidrógeno al 3% Piel

� Compuestos de yodo (Betadine) Piel

� Nitrato de Plata Ojos neonatos

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicosPrincipales grupos de desinfectantes y esterilizantes

AGENTE APLICACIÓN

� Alcohol (60-85% etanol) Instrumental médico

� Detergentes catiónicos(amonio cuaternario)

� Formaldehído (3-8%) Superficies

� Compuestos Clorados

� Sulfato de cobre Algicida

Instrumental médico, alimentos yequipos de industria lácteas

Suministro de agua

Industria alimentaria (equipos)

� Gas Cloro

� Óxido de etileno (gas) Esterilizante de material termosensible

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicosAgentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos

de síntesis

Alexander Fleming

Howard Florey y Ernst Chain

Antibiogramas

Penicilinas

Sulfanilamida

Gerhardt Domagk

Bactericida

Bacteriolítico

Bacteriostático

Tipos de agentes antimicrobianos

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Antibióticos: microorganismos productores

� Bacterias� Actinomicetos (4600)� Bacillus (950)

� Hongos (1600)

� Plantas

� Animales5-

Metoxihidrocarpaina

PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA

�Aumento de resistencias:

� Abuso y mal uso de los antibióticos

� Enfermedades crónicas

�Soluciones:

� Uso restringido de los antibióticos

� Búsqueda de nuevos antimicrobianos

� Mejora de los ya existentes