54 biol molecular 2de3(dp19-37) pcr
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APUNTES LABORATORIO DIAGNOSTICO CLINICOTRANSCRIPT
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LibroFundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos y CitológicosEd. Paraninfo: Pág. 473
IES Miguel de Cervantes. MurciaCiclo Laboratorio de Diagnóstico ClínicoFundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos
José Ángel Pina Alburquerque
54 – Técnicas de Biología Molecular2ª parte de tres
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Amplificación de ácidos nucleicos in vitro.Amplificación de ácidos nucleicos in vitro.
Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa• PCRPCR:
Polymerase Chain Reaction.• Técnica de biología
molecular desarrollada en 1985 por Kary Mullis.
• Su objetivo es obtener in vitro un gran número de copias (millones) de un fragmento de ADN concreto, partiendo de una muestra mínima (ADN molde).
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Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa
•En 1993, Mullis ganó el premio Nobel de Química por su trabajo sobre la PCR.
•http://www.dnalc.org/view/15138-Naming-PCR.html•http://www.dnalc.org/view/15139-Finding-DNA-to-copy-Kary-Mullis.html
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• Utilidad: Tras la amplificación (y a veces en combinación con técnicas de secuenciación) se utiliza para:– Identificar virus o bacterias
patógenos.– Identificar enfermedades genéti
cas.– Medicina forense (Identificar
personas o cadáveres).– Pruebas de paternidad– Investigación científica.
Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa
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RecuerdaRecuerda::Replicación del ADNReplicación del ADN•En sentido 5' → 3'
•Hebra adelantada (leading strand )
•Hebra retrasada (lagging strand ) y formación de los fragmentos de OkazaKi (≈ 2 Kb)
•http://es.wikipedia.org/wiki/Sintesis_de_ADN
•http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYdQEHQ
3’3’5’5’5’5’ 3’3’
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PCR: ReactivosPCR: Reactivos• ADN molde (diana o
template):• Desoxinucleótidos
(dNTP).• Oligonucleótidos
(Cebadores o primers).• ADN Polimerasa.• Tampón: Con MgCl2 y
pH 8,4.
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PCR: ReactivosPCR: Reactivos
ADN molde ADN molde (diana):(diana):
• DNA bicatenario: Se necesita su extracción previa a partir de la muestra biológica.
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PCR: ReactivosPCR: ReactivosDesoxinucleótidos (dNTP):• dATP, dTTP, dCTP, dGTP
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PCR: ReactivosPCR: Reactivos
• Son cadenas breves de nucleótidos (20 - 30) capaces de reconocer una secuencia complementaria del ADN diana y unirse ella por hibridación.
• Se necesitan dos cebadores por PCR: Uno para cada cadena del ADN.
• Delimitan los extremos del fragmento a replicar.• Tienen una Tm (Melting Temperature) característica.
Oligonucleótidos (cebadores o primers):Oligonucleótidos (cebadores o primers):
•Tm es la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN están en forma de doble cadena y la otra mitad como simple cadena.
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PCR: ReactivosPCR: ReactivosOligonucleótidos (cebadores o primers):Oligonucleótidos (cebadores o primers):
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PCR: ReactivosPCR: Reactivos ADN PolimerasaADN Polimerasa• Enzima que elonga un cebador (primer) fijado en el
extremo 3’ de una cadena molde ADN.• Añade desoxinucleótidos al extremo 3’ del cebador y en
dirección 5’ del ADN molde.(DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi(DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi
5’ 3’5’3’
3’ 5’5’ 3’
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PCR: ReactivosPCR: Reactivos ADN PolimerasaADN Polimerasa
• Thermus aquaticus (Taq polimerasa)
• Pyrococcus furiosus (Pfu)• Thermococcus litoralis
(Vent)• Thermus termophilus (Tth)
•Se utilizan ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas.
•A veces se emplean mezclas de polimerasas rápidas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
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PCRPCR• La reacción es muy
sencilla:– Necesita cantidades de
ADN muy pequeñas como diana.
– Un tubo de ensayo (tubo eppendorf)
– Los reactivos mencionados (dNTPs, polimerasa)
– Pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores (primers).
– Una fuente de calor: El termociclador
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Proceso de la PCR:Proceso de la PCR:Consiste en una serie de cambios de temperaturaConsiste en una serie de cambios de temperatura• La molécula de ADN que va a copiarse se calienta a 94ºC para que
se desnaturalice y se separen las dos hebras.• Después se someten a cambios de temperatura que se repiten 25 -
40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas:
1. DESNATURALIZACIÓN → A 94°C: Permite la separación de las dos cadenas de ácidos nucleicos formados en el ciclo anterior.
2. ALINEAMIENTO (annealing) → A 50-60 °C: Permite la hibridación de los cebadores al ADN molde (la temperatura depende de la Tm de los oligos).
3. POLIMERIZACIÓN → A 68 - 72 °C : La Taq-polimerasa trabaja a 72ºC, con una velocidad de 1000 bases por minuto).
• Vuelve al punto 1 (unos 25 a 40 ciclos).
• Tras una polimerización final, el ADN formado se mantiene en frío (4ºC)
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Ejemplo de programa de PCREjemplo de programa de PCR
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PCR• http://www.dnalc.org/view/15924-Making-many-copies-of-DNA.html
• http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html
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Detección del ADN amplificado (amplicones)Detección del ADN amplificado (amplicones)
• Electroforesis en gel:– Gel de agarosa– Gel de poliacrilamida
• Hibridación con sondas.• Secuenciación.
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PCR cuantitativaPCR cuantitativa(o PCR en tiempo real)(o PCR en tiempo real)
• qPCR, Q-PCR (quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (real time PCR)
• Variante de la PCR utilizada para amplificar y simultáneamente simultáneamente cuantificarcuantificar de forma absoluta el ADN en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.
Ver en: http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t12.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1360278/pdf/0060-04.pdf
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PCR cuantitativaPCR cuantitativa(o PCR en tiempo real)(o PCR en tiempo real)
• Se incorporan fluorocromos:– La emisión de fluorescencia
producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
• Se usa un termociclador con sensores:– Miden la fluorescencia
después de cada ciclo de amplificación, tras excitar el fluorocromo a la longitud de onda apropiada.
• Dos tipos de fluorocromos:– Agentes intercalantes.– Sondas específicas marcadas
con fluorocromos.Ciclo umbral (Ct, de threshold cycle):Ciclo en el que se empieza a detectar un aumento de fluorescencia significativo respecto a la señal base.
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Una variante de la PCR:Una variante de la PCR:PCR tras transcripción inversa (PCR tras transcripción inversa (RT-PCR)RT-PCR)
• RT-PCR: Reverse Transcriptase PCR
• Una hebra de ARN es retrotranscrita en cADN usando una transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.
• (RT-PCR no debe ser confundido con la PCR en tiempo real)
•También existe RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real o RT-Q-PCR): Permite cuantificar carga viral en virus ARN.
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PCR MultiplexPCR Multiplex • PCR en la cual se
amplifica más de una secuencia en una misma reacción.
• Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar al mismo tiempo múltiples segmentos de ADN
• Permite detectar microsatélites y SNPs
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Técnicas de Biología MolecularFin de la 2ª parte de tres
Continúa en:
Técnicas de Biología Molecular: 3ª parte de tres