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Tema 10. Biodegradación de Compuestos Xenobióticos
• Biodegradación de compuestos cloroaromáticos- Biodegradación de dioxinas y dibenzofuranos clorados- Biodegradación de policlorobifenilos (PCBs)
- Biodegradación de pentaclorofenol
• Biodegradación de compuestos nitroaromáticos- Rutas aeróbicas oxidativas: monooxigenasas y dioxigenasas- Rutas aeróbicas reductivas: nitrorreductasas y transferasas de hidruro
- Rutas anaeróbicas: cometabolismo del 2,4-dinitrofenol en Rhodobacter - Biodegradación del 2,4,6-trinitrotolueno (TNT)- Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos
• Biotecnologías asociadas a los compuestos nitroaromáticos- Biorremediación de nitroaromáticos- Biotecnologías terapéuticas antibacterianas y antitumorales
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Entre los compuestos xenobióticos, los más importantes cuantitativamente son los
derivados aromáticos clorados y nitrados producidos en las industrias de fabricación deexplosivos, colorantes, herbicidas y plaguicidas, disolventes, aislantes y otros productosde interés industrial. Existen algunos compuestos clorados y nitrados de origen natural(antibióticos como el cloramfenicol), por lo que algunos microorganismos poseen rutasbiodegradativas para este tipo de compuestos xenobióticos, que son altamente tóxicos(desacoplantes, cancerígenos, interferidores hormonales, etc.)
Biodegradación de Compuestos Xenobióticos
Cl Cl
OH
OH
OH
OH
O
O
Cl
Cl Cl
Cl
4,4'-diclorobifenilo
Estradiol
2,3,7,8-tetraclorodioxina
Testosterona
O
I
I
OH
I
I
Ala
Tiroxina (T4)
ClCl
Cl Cl
Cl
DDT
Fig. 15.1. Semejanza estructural de algunas hormonas con compuestos xenobióticos clorados
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Biodegradación de Compuestos Cloroaromáticos
Cl
O
O
Cl
Cl
O
Cl
Cl
Cl
COOH
OH
Cl
PCBs
Cl
Cl
OH
OH
COOH
Clorodibenzo-dioxinas Clorodibenzofuranos
Clorosalicilatos Clorobenzoatos
Clorocatecoles
Figura 15.2. Convergencia en clorocatecoles de las rutas de degradación dedioxinas cloradas, clorodibenzofuranos y policlorobifenilos (PCB). La posición delos cloros es arbitraria.
Las rutas biodegradativas aeróbicas de los cloroaromáticos (dioxinas, dibenzofuranos y
bifenilos policlorados) forman un “embudo metabólico” que converge en los clorocatecoles(el catecol es el o -dihidroxibenzeno)
Las dioxinas (sin cloros)apenas se encuentran en lanaturaleza, aunque eldibenzofurano y el bifeniloson compuestos naturales.Sus derivados clorados
son xenobióticos muyrecalcitrantes, y entreellos, los PCBs son losmás abundantes
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Biodegradación de Dioxinas y Dibenzofuranos Clorados
Dioxinas cloradas: compuestos con dos grupos clorofenilo unidos por dos enlaces -O-
Clorodibenzofuranos: compuestos con dos grupos clorofenilo unidos por un grupo furano
Cl
O
O
Cl
Cl
O
Cl
Clorodibenzo-dioxinas Clorodibenzofuranos
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Origen Dioxinas:
NATURAL ANTROPOGÉNICO
Volcanes Incineración comp. organicos clorados
incendios forestales Blanqueado pulpa papel con cloro
Síntesis química de herbicidas (2,4,5-T,
2,4,5-triclorofenoxiacético, exfolianteVietnan (gas naranja)
La primera bacteria descrita capaz de usar dioxinas y dibenzofuranos como fuentede carbono (Sphingomonas sp. RW1) se aisló en 1992, lo que es indicativo de la
recalcitrancia de estas moléculas.
La toxicidad de las dioxinas depende de la posición de los cloros:
2,3,7,8-tetraclorodioxina es la molécula más tóxica de la biosfera
En Seveso (Italia), en 1976, se produjo el mayor vertido de dioxinas cloradas por
un accidente en una fábrica del herbicida 2,4,5-T.
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Biodegradación de Dioxinasy Dibenzofuranos
1. Dioxigenasa
2. Dioxigenasa (meta)
3. Hidrolasa
Ruta metabólica poco evolucionada(moléculas relativamente recientesen la biosfera)
Figura 15.3. Conversión de dioxina y dibenzofurano enderivados dihidroxilados por Sphingomonas sp. RW1
O2
2
1O2 + NADH
HOOC
COOH
+
OH
OH
OH
OH
COOHHO
OH
OH
H2O
3
COOH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
OO
O
O
HO
OH
OH
OH
COOH
COOHCOOH
1
2
3
+
4
O2
2
1O2 + NADH
HOOC
COOH
+
OH
OH
OH
OH
COOHHO
OH
OH
H2O
3
COOH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
OO
O
O
HO
OH
OH
OH
COOH
COOHCOOH
1
2
3
+
4
O2
2
O2
2
1O2 + NADH
1O2 + NADH
HOOC
COOH
+
OH
OH
OH
OH
COOHHO
OH
OH
H2O
3
COOH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
OO
O
O
HO
OH
OH
OH
COOH
COOHCOOH
1
2
3
+
4
5C
6C
DioxinaDibenzofurano
salicilato
gentisato catecol
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La presencia de cloros en las dioxinas y dibenzofuranos hace más recalcitrante a
estas moléculas, que no se degradan en aerobiosis. Existen algunas bacterias
que pueden eliminar los átomos de cloro en anaerobiosis en un proceso
respiratorio denominado deshalorrespiración
Las moléculas poco cloradas pueden ser atacadas por la dioxigenasa,
generándose clorocatecoles y clorosalicilatos, pero para la biodegradación de
dioxinas muy cloradas se precisaría un primer paso anaeróbico previo a la
degradación aeróbica.
Biodegradación de Dioxinas y Dibenzofuranos Clorados
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Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)1 2
3
45
1'2'
3'
4' 5'
Cl
Cl
Figura 15.4. Estructura general de los PCB
Hay 5 posiciones para el Cl en cada anillo aromático (209 posibles PCBs). Se utilizan
desde 1929 en la fabricación de cosméticos, barnices, material ignífugo, y sobre todo
como lubricantes en transformadores eléctricos debido a su estabilidad a altatemperatura y a su capacidad dieléctrica. Se comercializaron como mezclas (Aroclor,
Clophen, Fenclor o Kanechlor). Principales problemas debidos a su recalcitrancia, su
toxicidad y su bioacumulación. Son poco solubles en agua pero muy liposolubles,
por lo que se van acumulando en la cadena trófica. En la CE está prohibida su
fabricación y los PCBs existentes deben eliminarse antes del 2010.
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Los PCBs de los transformadores eléctricos en desuso pueden eliminarse por
incineración, en instalaciones especiales a 1200 ºC, pero es un proceso costoso. En
España no existen instalaciones autorizadas.
Para la contaminación del suelo, la incineración es inviable y hay que recurrir a la
biodegradación. Se han descrito microorganismos (bacterias y hongos) capaces de
transformar o degradar PCBs, pero ninguno es capaz de mineralizar todos los PCBs,
ya que existen pasos limitantes. Las bacterias que degradan PCBs se han aisladomediante enriquecimiento a partir de suelos contaminados usando bifenilo, un
análogo natural no tóxico, como única fuente de carbono y energía.
Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)
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El bifenilo es un compuesto natural degradable por diversas bacterias en
aerobiosis:1) Oxidación de bifenilo y rotura en meta para formar benzoato y un derivado de
5 C que se transforma en acetaldehído y piruvato (ruta superior)
2) Oxidación del benzoato hasta piruvato y acetaldehído (ruta inferior delplásmido TOL)
Ambas rutas se suelen encontrar en unidades transcripcionales diferentes
Los PCBs se degradan por las mismas enzimas de la ruta del bifenilo, pero
existen pasos limitantes. Ejemplo: grado de cloración; nº Cl ataque del O2
La solución, como en el caso de las dioxinas policloradas, es la descloración de
los PCBs mediante tratamiento microbiológico anaeróbico, eficaz pero muy
lento, o realizar un pretratamiento químico reductivo. Una vez reducido elcontenido en cloro, el residuo puede tratarse con las bacterias aeróbicas
adecuadas para su completa destrucción
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Biodegradación de PCBsO
2
NAD(P)H
O O
HH
NAD(P)+BphA1A2A3A4
HH
NAD(P)H
NAD(P)+
BphB
HHO O
O2
O
HOOC OH
BphC
BphDOH2
COOH
HOOC
OH
OH2
HOOC
O
OH
OH2
BphH
CH3
HOOC
O
+CH3
H
O
BphI
CoA +NAD+
CH3
SCoA
O
BphJ
Figura15.5. Ruta degradativa de bifenilo por bacterias.
Benzoato 5 C
Acetil-CoA
Piruvato
Bifenilo
Acetaldehído
TOL
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Biodegradación de PCBs
La degradación bacteriana de los PCBspoco clorados produce clorobenzoatosy derivados de 5C.
La mayoría de las bacterias quedegradan PCB no degradanclorobenzoatos.
En la ruta superior puede producirsedescloración. Sin embargo, lo habituales el ataque del O2 al anillo no clorado omenos clorado, con la consiguienteformación y acumulación declorobenzoatos
Cl
Cl
OH OH
Cl
H Cl
HOOC Cl
OH
COOH
CAT
BphA
Reacciónespontánea
ClHOH OH
Cl
O2 + 2H
+
BphD
BphC
Figura 15.7. Degradación de PCB por bacterias, conacumulación de clorobenzoatos. CAT (Ciclo de Krebs).
5 C
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OH
OH
Catecol
HOOCO
O
Muconolactona
HOOCO
O
HOOC
HOOC
O
Enol lactona del 3-oxoadipato
3-Oxoadipato(ß-cetoadipato)
OH
OH
ClOH
OH
Cl
Cis,cis -muconato
HOOC
HOOC
Cl
HOOC
HOOCCl
HOOC
HOOC
HOOC
O
O
COOH
O
O
2-cloro-cis,cis -muconato
HOOC
HOOC
O
3-clorocatecol 4-clorocatecol
3-cloro-cis,cis -muconato
Cis -dienlactonatrans -dienlactona
Maleil-acetato
Catecol-1,2-dioxigenasa(Tipo I)
Cloroatecol-1,2-dioxigenasa(Tipo II)
Muconato
cicloisomerasa
Cloromuconato
cicloisomerasa
Muconolactonaisomerasa
HCl
Dienlactonahidrolasa
Maleilacetatoreductasa
TCA
Figura 15.8. Comparación de las rutas para la degradación de
catecol y clorocatecoles y convergencia en 3-oxoadipato.
Existen bacterias que degradanclorobenzoatos por una benzoatodioxigenasa que transforma elclorobenzoato en clorocatecol
Estas enzimas difieren en laespecificidad de sustrato aunque hayalgunas bacterias con benzoato
dioxigenasas de amplia especifidad,pero incapaces de degradar loscorrespondientes clorocatecoles
Sería posible complementar
bacterias con benzoato dioxigenasade amplia especificidad con otrasbacterias que degradenclorocatecoles
Biodegradación de PCBs
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Cl
HOOC
Cl
OH
OHCl
Bacteria degradadora de PCBs
Bacteria transformadora
de clorobazoatos
Bacteria degradadora de clorocatecoles
CO2
+ H2O + HCl
Figura 15.9. Biodegradación de PCB mediante la co-inoculación de tres tipos de bacterias.
Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)
INCONVENIENTES CO-INOCULACIÓN
- 4-Cl SUBSTITUIDOS:un metabolito tóxico a partir del 4-clorobenzoato que “envenena” todo elsistema. Este metabolito es laprotoanemonina, un antibiótico que se
produce en reacciones catalizadas porenzimas de la ruta del 3-oxoadipato.Este es un ejemplo claro de que lasrutas metabólicas son algo más que lasuma de las reacciones.
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OHOH
Cl
O
O
4-clorocatecol
Protoanemonina
H +
CO2
HOOC
HOOC
Cl
HOOC
Cl
OO
Cl
OO
O
O
H+
H+
Catecol-1,2- dioxigenasa (Tipo I)
Muconato cicloisomerasa Cl
Figura 15.10. Formación de protoanemonina a partir de 4-clorocatecol, mediante enzimas de la ruta del 3-oxoadipato. Entrecorchetes se ilustra el posible mecanismo de la reacción.
La formación de metabolitostóxicos a partir de xenobióticoses habitual, por lo que la
formación de protoanemonina noes el único ejemplo.
Biodegradación de PCBs
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Principal incompatibilidad degradación PCB y clorocatecoles EN GENERAL:
Bifenilo, y el benzoato derivado de su metabolismo, se degradan por una ruta meta ,clorocatecoles sólo lo hacen por una ruta orto .La rotura en meta de los clorocatecoles genera sustratos suicidas haluro de acilo.
La rotura en orto de metilcatecoles produce metil-muconolactonas que no pueden serdegradadas por las enzimas de ruta del 3-oxoadipato.
OH
OHCl
3-Clorocatecol
Catecol 2,3-dioxigenasa
HOOCCOCl
OH
Haluro de ácido
OH
OH
Catecol
HOOC OHCHO
Semialdehido
-COOH
COOH
Cis,cis- muconato
OH
OH
CH3
4-metilcatecol
CH3
COOHCOOH
3-metil-cis,cis- muconato
Catecol 1,2-dioxigenasa
Incompatibilidad para la degradación de cloro- y metil-catecoles simultáneamente
meta (TOL)
Orto (3-0A)
meta orto
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Pseudomonas sp. B13 Pseudomonas sp. BN10
Pseudomonas sp. BN210
Figura 15.12. Selección de bacterias que degradan
nuevos congéneres de PCB.
Degrada 3-clorobenzoato Degrada policlorobifenilos(PCB)
Degrada 3-clorobenzoato y PCB
Para degradar PCBs se requieren 3 pasos:1.- Enzimas para degradar PCB hastabenzoatos (genes de microorganismosaislados de suelos contaminados con PCB).2.- Enzimas para transformar clorobenzoatosen clorocatecoles (genes de bacterias quedegradan clorobenzoatos o del plásmido TOL,que codifica una dioxigenasa de amplia
especificidad).3.- Enzimas que catalicen la degradación
completa de clorocatecoles (genes debacterias que degradan clorocatecoles).
Esto ha permitido la construcción de bacteriasmodificadas genéticamente capaces demineralizar una amplia gama de PCBs, lo quepodría ser una solución definitiva delproblema de la contaminación con este tipode residuos industriales.
Biodegradación de PCBs
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CO2 + H2O
2 Cl -DOX OH
CHOCOO -
ClCl
O2
OH
ClCl
ClCl
Cl
PCP
MOX
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OHO2
TCHQ
DHL
OH
Cl Cl
OH2 GSH
DCHQ
Cl - Cl- Cl-
CO2 + H2O
2 Cl -DOX OH
CHOCOO -
ClCl
O2
OH
ClCl
ClCl
Cl
PCP
MOX
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OHO2
TCHQ
DHL
OH
Cl Cl
OH2 GSH
DCHQ
CO2 + H2O
2 Cl -
CO2 + H2OCO2 + H2O
2 Cl -DOX OH
CHOCOO -
ClCl
O2
DOX OH
CHOCOO -
ClCl
O2
OH
CHOCOO -
ClCl
OH
CHOCOO -
ClCl
O2
OH
ClCl
ClCl
Cl
PCP
OH
ClCl
ClCl
Cl
OH
ClCl
ClCl
Cl
OH
ClCl
ClCl
Cl
PCP
MOX
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OHO2
TCHQ
MOX
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OHO2
TCHQ
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OH
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OH
Cl
OH
Cl
Cl Cl
OH
OH
Cl
Cl Cl
OHO2
TCHQ
DHL
OH
Cl Cl
OH2 GSH
DCHQ
DHL
OH
Cl Cl
OH2 GSH
DCHQ
OH
Cl Cl
OH2 GSH
DCHQ
Cl - Cl- Cl-Cl -Cl - Cl-Cl- Cl-Cl-
Figura 15.14. Ruta degradativa del pentaclorofenol (PCP). MOX (monooxigenasa); DHL(deshalogenasa); DOX (dioxigenasa); TCHQ (triclorohidroquinona); DCHQ (diclorohidroquinona).
Ruta inespecífica de Shingomonas chlorophenolica que está construida reclutando una
enzima preexistente de una ruta ajena y alterando la especificidad de enzimasdegradantes de clorofenoles naturales. La ruta elimina los cloros combinando un proceso
oxidativo con la deshalogenación reductiva. La flavoenzima MOX es una monooxigenasa
común en bacterias del suelo que degradan clorofenoles naturales. Es muy inespecífica y
reemplaza -H, -NO2, -NH2, -CN y -Cl por grupos -OH. La deshalogenasa que cataliza la
descloración reductiva ha evolucionado a partir de una isomerasa del catabolismo de la
fenilalanina, un aminoácido aromático. La dioxigenasa que cataliza la rotura del anillo
pertenece a rutas degradativas de diclorofenoles producidos por hongos e insectos.
Biodegradación de Pentaclorofenol
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Los compuestos nitroaromáticos suelen tener origen humano, en industrias de
explosivos (TNT, ácido pícrico), colorantes, plaguicidas (paration) y herbicidas
(dinoseb), disolventes y fármacos. Son compuestos muy estables y persistentes en el
medio ambiente, donde pueden permanecer inalterados durante siglos. Se pueden
adsorber a la superficie de las fases inorgánica y orgánica (humus) del suelo tanto por
enlaces débiles como covalentes.
El consumo humano de estos compuestos puede resultar muy peligroso por su altatoxicidad (el 2,4-dinitrofenol es un desacoplante y los nitrotoluenos causan anemia y
hepatitis) y la mutagenicidad de sus derivados aminoaromáticos (el 2-nitro-4-
aminofenol y la 5-nitro-o -toluidina son carcinogénicos). Algunos compuestos
nitroaromáticos no son tóxicos per se , sino sus productos de biotransformación
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
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Figura 16.1. Formas resonantes del nitrato (izquierda). Estructura del anillo aromático del nitrobenceno,C6H5-NO2 (centro) y de las formas resonantes del grupo nitroaromático (derecha). La carga (+) en el anillo(Ar+) estaría localizada en los C 2-6 ó 4.
N
-O O
O
N
O
O
-O
N
O O
-O
NO2
26
4
-O O
Ar
N+
Ar
N+
-OO
Ar+
N+
O--O
N
-O O
O
NN
-O O
O
-O O
O
N
O
O
-O
NN
O
O
-O
N
O O
-O
NN
O O
-O
NO2
26
4
NO2NO2
26
4
-O O
Ar
N+
Ar
N+
-OO
Ar+
N+
O--O-O O
Ar
N+
-O O
Ar
N+N+
Ar
N+
-OO
Ar
N+N+
-OO
Ar+
N+
O--O
Ar+
N+N+
O--O
La carga positiva sobre el N del grupo –NO2 extrae carga electrónica del anilloaromático, que resulta cargado positivamente, tanto más cuanto mayor sea el
número de grupos nitro.
La carga positiva del anillo nitroaromático está influenciada por sustituyentes
que puede aumentar aún más (-Cl, -NO2, -C≡≡≡≡N, -SO3H, -COOH), o disminuirla (-
CH3, -NH2 , -O-).
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OH
OH
N = 0 N = 2
OH
OH
O2N
H
O2N
NH 2
O2N
N = 3
OH
O2N
O2NCH3
X
O2N
Ataqueoxidativo
Ataquereductivo
N = 1
OH
OH
O2N
OH
O2N
O2N
Y
OH
OH
N = 0
OH
OH
OH
OH
OH
OH
N = 0 N = 2
OH
OH
O2N
H
O2N
NH 2
O2N
N = 2
OH
OH
O2NOH
OH
O2NOH
OH
OH
OH
O2NO2N
H
O2N
H
O2N
H
O2N
NH 2
O2N
NH 2
O2NO2N
N = 3
OH
O2N
O2NCH3
X
O2N
N = 3
OH
O2N
OH
O2N
OH
O2N
O2NCH3
O2NCH3
O2NO2NCH3
X
O2N
X
O2N
X
O2N
AtaqueoxidativoAtaque
oxidativoAtaque
reductivoAtaque
reductivo
N = 1
OH
OH
O2N
OH
O2N
O2N
Y
N = 1
OH
OH
O2NOH
OH
O2NOH
OH
OH
OH
O2NO2N
OH
O2N
OH
O2N
OH
O2N
O2N
Y
O2N
YYY
Fig.16.2. La susceptibilidad al ataque reductivo aumenta con el nº de gruposnitro (N), dependiendo del resto de sustituyentes. Cuando N = 3, el ataque essiempre reductivo (Y: -NHOH, -CH3, -COO; X: cualquier sustituyente-).
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
La presencia de grupos nitro estabiliza a los compuestos nitroaromáticos con relación al
ataque electrofílico del O2, el principal agente activo en la degradación de compuestosaromáticos naturales o xenobióticos. Por ello, los seres vivos han desarrollado estrategiasde ataque reductivo, bien sobre el propio anillo (derivados Meisenheimer) o sobre losgrupos –NO2 (derivados aminoaromáticos).
Los microorganismos
llevan a cabo el ataqueoxidativo medianteoxigenasas, queinsertan átomos deoxígeno en el anillo. El
ataque reductivo serealiza por reductasasque transfieren ioneshidruros (H-) bien alanillo nitroaromático oa los grupos nitro. Elataque oxidativosiempre se lleva acabo en aerobiosis,mientras que elreductivo puede tener
lugar en aerobiosis oen anaerobiosis.
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Rutas aeróbicas oxidativas del anillo aromático: monooxigenasas y dioxigenasas
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
N O 2
O H 2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O
O H
O H
N O 2
O H
N O 2
O H 2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O
O H
O H
O H
O H
Figura 16.3. Oxidación del o -nitrofenol a catecol.
O H
N O 2
N A D (P )H + O2
O H
N O 2
O H N O 2-
C O 2 + H 2O
O H
N O 2
O H
N O 2
N A D (P )H + O2
N A D (P )H + O2
O H
N O 2
O H
O H
N O 2
O H
N O 2
O H
N O 2
O H N O 2-
N O 2-
C O 2 + H 2O
Figura 16.4. Oxidación del p -nitrofenol a nitrocatecol y posterior oxidación de éste.
Las monooxigenasas liberan el grupo nitrofenólico como nitrito, o insertan un grupo –OHpreviamente. Las dioxigenasas producen nitrito a partir de nitrotoluenos. El catecol semineraliza a CO2 y H2O mediante ruptura orto o meta y el nitrito se utiliza como fuente denitrógeno mediante su reducción a amonio por la nitrito reductasa asimiladora.
N O 2
C H 3 N A D (P )H + O 2 N O 2-
O H
C H 3
O H
N O 2
C H 3
N O 2
C H 3 N A D (P )H + O 2 N O 2-N A D (P )H + O 2 N O 2-
O H
C H 3
O H
O H
C H 3
O H
C H 3
O H
C H 3
O H
Figura 16.5. Oxidación del o -nitrotolueno a metilcatecol.
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Rutas aeróbicas reductivas: nitrorreductasas y transferasas de hidruros
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
Los sustratos de estas rutas reductivas son normalmente polinitroaromáticos, estables
frente al ataque del O2, pero susceptibles de ataques nucleofílicos por parte de iones H-
tanto al grupo –NO2 como al anillo aromático.
Reducción del grupo nitro: nitrorreductasasEnzimas ampliamente distribuidas (bacterias y eucariotas), que utilizan NAD(P)H como
reductor de un amplio número de compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos.
Las nitrorreductasas bacterianas son de dos tipos:
a) Nitrorreductasas de tipo I, insensibles al O2, que reducen el grupo -NO2 en tres etapas
sucesivas de pares de electrones, formándose los intermediarios nitroso e hidroxilamino.
b) Nitrorreductasas de tipo II, sensibles al O2, que catalizan la transferencia de 1 e- al grupo
nitro con producción de un radical libre aniónico, que puede reaccionar con el oxígenoregenerando el Ar-NO2 y formando el radical anión superóxido (O2
.-).
Figura 16.6. Reducción secuencial del grupo –NO2. Ar (Anillo aromático).
Ar-NO2 → Ar-N = O → Ar-HNOH → Ar-NH2
2 e- 2 e- 2 e-
Ar-NO2 → Ar-N = O → Ar-HNOH → Ar-NH2
2 e- 2 e- 2 e-
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Reducción del anillo: hidruro transferasas
El anillo aromático polinitrado (TNT, TNP o ácido pícrico, dinitrofenol) puede
degradarse reductivamente por transferencia de iones hidruro (H-) a regiones del
anillo con densidad de carga positiva, especialmente en posiciones orto (2) y para
(4), debido a la capacidad de éste para retirar los e - ππππ del anillo. Por ello, el 2-
nitrofenol y el 4-nitrofenol son más ácidos que el 3-nitrofenol. Rhodococcus (bacteria Gram positiva) mineraliza polinitrofenoles (TNT, ácido pícrico, 2,4-
dinitrofenol) por transferasas de hidruro que forman como intermediarios
derivados no aromáticos reducidos (complejos Meisenheimer).
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Rutas aeróbicas reductivas: transferasas de hidruros
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
En Rhodococcus sp. RB1, la ruta degradativa del 2,4-dinitrofenol tiene dos fases:1.- Transferencia de hidruros y formación de derivados hidruro-Meisenheimer: el grupo –OHno atrae e- del anillo aromático, pero sí los grupos –NO2 y aparecen cargas δδδδ+ en meta (m) 2.- Liberación de NO2
- y degradación del anillo formando 3-nitroadipato como intermediario
Figura 16.11. Transferencia de 2 H- al 2,4-dinitrofenol por parte de NAD(P)H-reductasas y formación de dos derivados HM consecutivos.
OHNO2
NO2H -
OHNO2
NO2H - -O2N
NO2-
OH
H
OHNO2
NO2H -
OHNO2
NO2
OHNO2
NO2H -H -
OHNO2
NO2H -
OHNO2
NO2
OHNO2
NO2H -H - -O2N
NO2-
OH
H-O2N
NO2-
OH
H-O2N
NO2-
OH
NO2-
OH
NO2-
OH
H
HMm
COO-
COO-
O2-N HO2
-N
NO2-
OH
H
COO-
COO-
O
NO2-
O2
NO2-
O2
CO2 + H2O
COO-
COO-
O2-N H
COO-
COO-
O2-N HO2
-N
NO2-
OH
HO2-N
NO2-
OH
O2-N
NO2-
OH
O2-N
NO2-
OH
NO2-
OH
H
COO-
COO-
O
COO-
COO-
COO-
COO-
O
NO2-
O2
NO2-NO2-
O2O2
NO2-
O2
NO2-NO2-
O2O2
CO2 + H2OCO2 + H2O
Figura 16.12. Ataque del O2 y oxidación del 3-nitroadipato (centro). Una posibilidad
alternativa es la producción de dinitrohexanoato -OOC-CH2-CH2-CHNO2-CH2-CH2NO2
como intermediario.
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Rutas anaeróbicas: cometabolismo del 2,4-dinitrofenol en Rhodobacter Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
En anaerobiosis, las bacterias metabolizan los nitroaromáticos reduciendo los grupos nitro
a amino mediante nitrorreductasas. Rhodobacter capsulatus es una bacteria fototrófica quefija N2 en luz-anaerobiosis, proceso que consume mucha energía y es muy sensible adesacoplantes como el 2,4-dinitrofenol (DNP). En presencia de DNP, R. capsulatus induceuna nitrorreductasa que reduce el grupo 2-nitro a 2-amino formando 2-amino-4-nitrofenol(ANP), que no es desacoplante pero sí genotóxico. Para evitar daños al DNA, la bacteria
bombea al medio el ANP, y cuando la mayor parte del DNP se ha reducido a ANP reanuda elcrecimiento por fijación del N2. La nitrorreductasa de R capsulatus puede utilizar diferentessustratos, como el ácido pícrico (2,4,6-trinitrofenol), al que reduce a ácido picrámico (2-amino-4,6-dinitrofenol), que posteriormente se degrada con liberación de nitrito
O -
N O2
N O 2
O -
N H2
N O 2
N P R
M P
m e d io
3 N A D P H
O -
N O2
N O 2
O -
N H2
N O 2
N P R
M P
m e d io
3 N A D P H
O -
N O2
N O 2
O -
N H2
N O 2
N P R
M P
m e d io
O -
N O2
N O 2
O -
N O2
N O 2
O -
N H2
N O 2
N P R
O -
N H2
N O 2
O -
N H2
N O 2
N P RN P R
M P
m e d io
M P
m e d io
3 N A D P H
Fig.16.13. Fotorreducción del 2,4-dintrofenol. NPR (nitrorreductasa).
O H
N O 2
N O 2
O 2 N
O H
N H 2
N O 2
O 2 N
N P R
3 N A D P H
O H
N O 2
N O 2
O 2 N
O H
N O 2
N O 2
O 2 N
O H
N H 2
N O 2
O 2 N
O H
N H 2
N O 2
O 2 N
N P R
3 N A D P H
N P RN P R
3 N A D P H3 N A D P H
Fig.16.15. Fotorreducción de ácido pícrico a ácido picrámico. NPR (2-nitrorreductasa).
ó á
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Biodegradación del 2,4,6-trinitrotolueno (TNT)
Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
La biodegradación de TNT y otros explosivos como el ácido pícrico puede utilizarse para eldiseño de tecnologías de biorremediación in situ (para paliar la contaminación ambiental) yex situ (para eliminar los excedentes mediante biorreactores).El TNT sólo puede ser objetode ataques reductivos, abióticos o biológicos tanto aeróbicos como anaeróbicos.
Catabolismo aeróbico: Es similar a la mineralización de ácido pícrico y del 2-cloro-4,6-
dinitrofenol en Rhodococcus OHNO2
NO2
O2N
OHO2N
NO2
Cl
H -
NO2-
OH
NO2
O2N
NO2
OHO2N Cl
CO2 + H2O
2 H - 2 NO2-
OHNO2
NO2
Cl-
NO2-
OHNO2
NO2
O2NOH
NO2
NO2
O2N
OHO2N
NO2
Cl
H -
OHO2N
NO2
ClOH
O2N
NO2
Cl
H -H -
NO2-
OH
NO2
O2N NO2-
OH
NO2
O2N NO2-
OH
NO2
O2N
NO2
OHO2N Cl
NO2
OHO2N Cl
NO2
OHO2N Cl
CO2 + H2O
2 H - 2 NO2-
CO2 + H2O
2 H -2 H -2 H - 2 NO2-2 NO2-2 NO2-
OHNO2
NO2
Cl-
NO2-
OHNO2
NO2
OHNO2
NO2
Cl-Cl-Cl-
NO2-NO2-NO2-
Figura 16.16 Mineralización de ácido pícrico y 2-Cl-dinitrofenol vía 2,4-dinitrofenol.
Catabolismo anaeróbico: Nitrorreductasas que producen derivados parcial o totalmentereducidos (triaminotolueno) capaces de sufrir una oxidación posterior con liberación de NH3y ruptura del anillo. Los grupos –NO2 del TNT difieren por su capacidad atrayente deelectrones y la reducción del primer grupo (normalmente en la posición 4) tiene lugar conmucha más facilidad que la del grupo 2-nitro y la del 6-nitro; el primer grupo –NH
2formado
disminuye la densidad de carga positiva del anillo al dejar de atraer ya a los electrones ππππ.
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Bi d d ió d C t Nit áti
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N O 2
1 - N i t r o n a f t a l e n o
N O 2
1 - N i t r o p i r e n o
N O 2
7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n o
N O 2
2 - N i t r o f l u o r e n o
N O 2
9 - N i t r o a n t r a c e n o
N O 2
6 - N i t r o c r i s e n o
3 - N i t r o b e n z o ( a ) p i r e n o
N O 2
N O 2
1 - N i t r o n a f t a l e n o
N O 2N O 2N O 2
1 - N i t r o n a f t a l e n o
N O 2
1 - N i t r o p i r e n o
N O 2N O 2N O 2
1 - N i t r o p i r e n o
N O 2
7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n oN O 2N O 2N O 2
7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n o
N O 2
2 - N i t r o f l u o r e n o
N O 2N O 2N O 2
2 - N i t r o f l u o r e n o
N O 2
9 - N i t r o a n t r a c e n o
N O 2N O 2N O 2
9 - N i t r o a n t r a c e n o
N O 2
6 - N i t r o c r i s e n o
N O 2N O 2N O 2
6 - N i t r o c r i s e n o
3 - N i t r o b e n z o ( a ) p i r e n o
N O 2
3 - N i t r o b e n z o ( a ) p i r e n o
N O 2N O 2N O 2
Figura 16.23. Hidrocarburos aromáticos policíclicos nitrados.
Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH)Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos nitrados (Nitro-PAHs) se producen al reaccionarlos hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) con óxidos de nitrógeno y por combustiónparcial de combustibles fósiles
La biodegradación de Nitro-PAH es similar a la de los nitroaromáticos monocíclicos:reducción por nitrorreductasas y oxidación por monooxigenasas, que producen óxidos de
nitroareno y derivados fenólicos, y dioxigenasas, que producen dihidrodioles.Cit P-450
O2
O2N-Ar OO2N-Ar O2N-Ar OH
SO42-
G, GU
Cit P-450
O2
Cit P-450
O2
O2N-ArO2N-ArO2N-Ar OO2N-Ar OO2N-ArO2N-Ar O2N-Ar OHO2N-ArO2N-ArO2N-Ar OHOH
SO42-SO42-
G, GUG, GU
Figura 16.24. Degradación de Nitro-PAH por el hongo Cunninghamella elegans. Ar (anilloaromático); Cit P-450 (citocromo P-450); G (glucosa); GU (glucuronato)
Biotecnologías Asociadas a los Compuestos Nitroaromáticos
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Biotecnologías Asociadas a los Compuestos NitroaromáticosBiorremediación de nitroaromáticos
Tratamientos in situ (biodegradación de TNT en suelos) y ex situ (biorreactores paraeliminar TNT y ácido pícrico de aguas de fábricas de explosivos y aguas subterráneas deterrenos contaminados por prácticas militares). La incineración es la forma de eliminar losexcedentes de TNT, pero existen tratamientos biológicos basados en el compostaje, labiodegradación aeróbica (rutas ligninolíticas de hongos, muy limitadas por el límite detoxicidad, < 100 µµµµM) y tecnologías de fangos activados. La biomineralización del TNT sepuede plantear mediante lavado del suelo y tratamiento secuencial anaerobio/aerobio, biensobre TNT eliminado del suelo por lavado o sobre una suspensión de suelo contaminado.Estas tecnologías no evitan dos problemas: la formación aerobia de derivados azoxi y lafijación del triaminotolueno (TAT) a la fase orgánica del suelo.
a) Biorreactores anaerobios: Pseudomonas putida JLR11 elimina anaeróbicamenteTNT con glucosa como cosustrato (elimina el 99% del TNT en 20 días). También se hanutilizado consorcios de bacterias anaeróbicas para eliminar TNT y otros compuestosnitroaromáticos como el dinoseb (2-sec -butil-4,6-dinitrofenol).
TN T TAT Tolueno + 3 N H 3 o Trihidroxitolueno + 3 N H 3TN T TAT Tolueno + 3 N H 3 o Trihidroxitolueno + 3 N H 3
Figura 16.26. Biodegradación anaerobia de TNT.
b) Biorreactores aerobios: hongos ligninolíticos que utilizan las mismas enzimasextracelulares para degradar contaminantes aromáticos que para la lignina (idóneos paramezclas complejas de xenobióticos). La toxicidad del TNT para los hongos se evitaaumentando la masa micelial del biorreactor, que degrada TNT mediante un proceso
bifásico, rápido al principio (minutos) y lento después (horas). La eliminación de grandescantidades de TNT (hasta 1 g kg-1) requiere de 1 a 3 meses.
Biotecnologías Asociadas a los Compuestos Nitroaromáticos
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Biotecnologías Asociadas a los Compuestos NitroaromáticosBiotecnologías terapéuticas antibacterianas y antitumorales
I. Terapias antibacterianas.
La reducción de los grupos nitroaromáticos mediante nitrorreductasas produce derivadoshidroxilamino-aromáticos citotóxicos y mutagénicos. La actividad nitrorreductasa de lasbacterias es 500 veces mayor que la de células eucarióticas, por lo que los nitroderivadosson mucho más tóxicos para las primeras y tienen un alto potencial para el tratamiento deinfecciones parasitarias (nitrofuranos).II. Terapias anticancerosas.En eucariotas, los derivados formados por las nitrorreductasas de la flora intestinal soncancerígenos (acumulación de mutaciones en tejidos susceptibles, como epitelio del colon).Sin embargo, las nitrorreductasas bacterianas se utilizan en terapias antitumorales, como latecnología ADEPT (Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy). La nitrorreductasa se unecovalentemente a un anticuerpo (Ac-TUM) que reconoce un antígeno específico del tumor
(Ag-TUM) y se suministra un nitroaromático inocuo (prodroga) que se sólo forma elderivado hidroxilamino citotóxico en las células tumorales que poseen la nitrorreductasabacteriana. También se puede expresar el gen de la NR en los tumores (GDEPT y VDEPT).
NR
Ac-TUMNR-Ac-TUM
Ag TUM
TUM OR
TUM OR
Ar-NO 2
Ar-NH 2 Tum or destruído
NR
Ac-TUMNR-Ac-TUM
Ag TUM
TUM OR
TUM OR
Ar-NO 2
Ar-NH 2 Tum or destruído
NR
Ac-TUMNR-Ac-TUM
NR
Ac-TUMNR-Ac-TUMNR-Ac-TUM
Ag TUM
TUM OR
Ag TUM
TUM ORTUM OR
TUM OR
Ar-NO 2
Ar-NH 2
TUM ORTUM OR
Ar-NO 2
Ar-NH 2
Ar-NO 2
Ar-NH 2 Tum or destruídoTum or destruído
Figura 16.25. Destrucción selectiva de un tumor mediante tecnología ADEPT.
Prodroga
Derivadocitotóxico