1534887501.fluorescencia para 2011
TRANSCRIPT
1
La espectroscopía de fluorescencia en el análisis estructural
de proteínas y de agregados amiloides
Introducción
La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo
denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la
fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorción y emisión de la luz es del orden
de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho más lento y toma
alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. Así, la fluorescencia dura únicamente mientras dura el
estímulo, es un fenómeno virtualmente instantáneo, mientras que la fosforescencia puede durar
hasta minutos luego de desaparecido el estímulo.
La espectroscopía de fluorescencia es un método muy utilizado en mediciones analíticas
y en la investigación científica, especialmente en bioquímica y biomedicina. Las dos razones
principales por las que se masificó el uso de esta técnica espectroscópica son: 1) su gran
sensibilidad y 2) el alto nivel de evolución alcanzado tanto por los instrumentos requeridos,
como por los fluoróforos diseñados para aplicaciones específicas. Aún cuando una de las
aplicaciones más utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromoléculas (como una
alternativa al marcaje con isótopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar
estudios de dinámica molecular, análisis estructural de proteínas, cuantificación de iones en
compartimentos celulares, microscopía, análisis de potencial de membrana, interacciones entre
macromoléculas, etc.
Comparada con los métodos de absorción, la sensibilidad de los métodos basados en
fluorescencia es 10 a 10.000 veces mayor, esto significa que se pueden analizar nanogramos a
picogramos de diversos analitos con muy buenos resultados. Otra ventaja de la fluorescencia es
su especificidad, que permite identificar moléculas específicas en matrices complejas. Como
desventaja se puede distinguir que tiene menos aplicaciones que la espectroscopía de absorción,
ya que es relativamente limitada la cantidad de sistemas químicos que exhiben fluorescencia. Sin
embargo, aún cuando el analito no exhiba fluorescencia natural, se pueden usar sondas
fluorescentes que se unen a grupos funcionales específicos en la molécula en estudio.
Fluoróforos
La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas
moléculas llamadas fluoróforos. Dichas moléculas son generalmente orgánicas poliaromáticas o
heterociclos. Los átomos son generalmente no fluorescentes, pero una notable excepción son los
La Fluorescencia es un fenómeno físico mediante el cual ciertas sustancias absorben
energía en forma de radiación electromagnética emitiéndola en una longitud de onda
mayor en un período de tiempo muy corto.
2
lantánidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnición electrónica
entre orbitales ƒ.
Los fluoróforos se pueden dividir en dos clases generales: extrínsecos e intrínsecos. Se
denomina fluoróforo intrínseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el
grupo indol del triptofano en las proteínas. Fluoróforo extrínseco es aquel que se agrega a una
muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se
utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.
Fundamento
Cuando el fluoróforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de
mayor energía) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energía se libera en
forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energía) a la de excitación. Este
proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).
Figura 1. Diagrama de Perrin-Jablonski
Un fluoróforo absorbe energía electromagnética pasando de un estado electrónico “basal”
(S0) a un estado electrónico “excitado” (S1) luego de absorber un fotón (es decir, luz) de energía:
E = h .νex
donde E es la energía, h es la constante de Planck y νex es la frecuencia de excitación. Esta
energía es suministrada por una fuente de luz externa. La absorción de luz produce una transición
electrónica en el fluoróforo: un electrón es promovido desde el orbital molecular ocupado más
externo al orbital molecular desocupado más cercano al mismo (Figura 1). Este proceso está
dirigido por distintas reglas de selección y la probabilidad de que la transición se produzca está
reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, ε (M-1. cm-1) que está determinado por la ley
de Lambert y Beer para cada longitud de onda:
Decaimiento
vibracional
Decaimiento
vibracionalActivación
térmica
Fosforescencia
Fluorescencia
Excitación
Cruce
intersistema
Decaimiento
vibracional
Decaimiento
vibracionalActivación
térmica
Fosforescencia
Fluorescencia
Excitación
Cruce
intersistema
S0 + hνexc → S1 Excitación
S1 → S0 + hνem Fluorescencia
S1 → T1 Cruce intersistema
T1→ S0 + hνem´ Fosforescencia
3
A = ε . l. c
donde A es la absorbancia, l es el paso óptico y c la concentración del fluoróforo.
En fosforescencia el electrón excitado sufre una transición a un estado más estable (T1), y
la emisión con energía hνem´ resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el
estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el
fluoróforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a múltiples interacciones con el medio
ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a
la energía que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotón de energía emitido
hνem, es de menor energía que el fotón que el fluoróforo absorbió previamente, por lo tanto la
longitud de onda de emisión es mayor que la de excitación; 2) no todas las moléculas que se
excitaron inicialmente por absorción retornan al estado basal de energía por emisión de
fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: “quenching” colisional, transferencia de
energía de fluorescencia por resonancia (RET), conversión interna o desactivación no radiativa y
formación de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de moléculas en el estado excitado y
por lo tanto disminuyen el rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 2).
El rendimiento cuántico de fluorescencia, ΦF es la razón entre la cantidad de fotones
emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molécula:
ΦF = cantidad de fotones emitidos / cantidad total de fotones absorbidos
Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipación de energía
Espectro de fluorescencia
En espectroscopía de fluorescencia se registran espectros de excitación y de emisión. El
espectro de excitación se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una
representación de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en función de la longitud
de onda en nm. Para registrar el espectro de emisión se fija una longitud de onda de excitación y
para el de excitación se fija una longitud de onda de emisión. Una característica llamativa de los
10-8 segundos
Quenching o transferencia de energía de fluorescencia por resonancia
Estado
basal
Estado
excitado*
4
espectros de excitación y emisión de fluorescencia es que para algunas moléculas estos son
imágenes especulares uno del otro, a esto se llama “regla del espejo” (Figura 3). Alteraciones de
esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas,
a una banda “Raman” que es la banda de vibración del agua. Además existen muchas sustancias
que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geométricos del
núcleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.
Figura 3. Imágenes especulares de los espectros de excitación y emisión de fluorescencia del
isotiosianato de fluoresceína (FITC)
Figura 4. Espectros de excitación y emisión de fluorescencia del p-terfenilo
Otra característica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisión es
independiente de la longitud de onda de excitación (λλλλexc), debido a la disipación parcial de
energía de excitación que ocurre durante la duración del estado excitado (Figura 5).
Intensidad de flu
orescencia
Intensidad de fluorescencia
Intensidad de flu
orescencia
Intensidad de fluorescencia
5
El espectro de emisión de fluorescencia varía marcadamente con la estructura química
del fluoróforo y del solvente en el que esta disuelto.
Intensidad de fluorescencia
Intensidad de fluorescencia
Figura 5. Independencia del pico de máxima emisión y la longitud de onda de excitación.
Espectro de excitación de un compuesto y sus diversos espectros de emisión excitando a las longitudes
de onda EX1, EX2 y EX3.
Procesos de disipación de energía
Quenching
El “quenching” o atenuación de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso
que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluoróforo sin cambiar el
espectro de emisión. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras
moléculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formación de complejos del
estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminución de la
fluorescencia debida a la alta concentración del fluoróforo, el cual al disminuir su concentración
aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea
para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluoróforo se ha
incorporado en el interior de vesículas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna
razón, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.
Transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET)
La transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la
transferencia de energía entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante
fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10
nm). La excitación de moléculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energía de
las moléculas donor excitadas y ésta se manifiesta como una reducción en la intensidad de
emisión de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de
emisión del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluoróforo donante excitado presenta
fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximación estrecha de un segundo fluoróforo
con una banda de absorción que se superpone con la banda de emisión del donante, conduce a la
excitación del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.
6
Fuente luminosa
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Fuente luminosa
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Figura 6. Transferencia de energía de fluorescencia por resonancia
Análisis estructural de las proteínas
Hay sólo tres aminoácidos aromáticos que absorben luz en la región del ultravioleta
cercano (λ > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). El espectro de
emisión de fluorescencia de las proteínas está determinado por la presencia en la cadena proteica
de dichos aminoácidos. Además existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que
también presentan fluorescencia cuando están presentes en las proteínas. Los cambios de la
fluorescencia intrínseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la proteína.
Los tres aminoácidos aromáticos tienen distinta absorción y emisión de fluorescencia,
como se resume en la tabla 1.
λλλλex (nm) λλλλem (nm) ΦΦΦΦF
Trp 295 353 0,20
Tyr 275 304 0,14
Phe 260 282 0,02
Tabla 1. Características de fluorescencia de los aminoácidos aromáticos
La fluorescencia de una proteína es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos
residuos aromáticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la
fluorescencia del triptófano. Generalmente, se mide la emisión de fluorescencia del triptófano
por su mayor rendimiento cuántico y su vida media más prolongada. Además, la proximidad de
estos tres aminoácidos en la estructura de una proteína permite que ocurra transferencia de
energía por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp
la única que no se transfiere. Las proteínas usualmente tienen un número limitado de Trp y éste
está generalmente en el sitio activo de las proteínas.
La tirosina, como el triptófano, tiene una fuerte banda de absorción a 280 nm. Es un
emisor más débil que el triptófano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de
7
la proteeína, ya que normalmente está en un número mayor. La fluorescencia de la tirosina puede
ser fácilmente transferida si se encuentra cerca del triptófano.
La fenilalanina, con sólo un anillo bencénico y un grupo de metileno es débilmente
fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuántico y absortividad
molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa
sólo en ausencia de tirosina y triptófano.
Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuántico son generalmente más
dependientes del medio ambiente que los espectros de absorción y los coeficientes de extinción
molar. En las proteínas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del
núcleo hidrofóbico de las mismas y por lo tanto está en regiones donde las moléculas de agua
tienen poco acceso, el espectro de emisión del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento
hacia el azul) con el máximo de emisión generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energía
emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde
parte de la energía absorbida es transferida a las moléculas de agua y por lo tanto la longitud de
onda del máximo de emisión es mayor (340-350). Esto también sucede cuando una proteína se
desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al péptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones
crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de
la fluorescencia (Figura 7).
Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.
Los rendimientos quánticos de los tres aminoácidos aromáticos decaen cuando se
incorporan a una proteína. En la Tabla 2 se comparan las características de la fluorescencia de
los aminoácidos libres e insertos en una proteína. También contiene datos que muestran la
sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.
100 %
80 %
20 %
40 %
0 %
351 nm 333 nm
8
Aminoácido) Proteína
Solvente λλλλem (nm ΦΦΦΦF λλλλem (nm) ΦΦΦΦF
H2O 340 0,12 333 0,02 Trp
DMSO 340 0,81 333 0,67
H2O 303 0,21 --- --- Tyr
DMSO 306 0,27 309 0,06
Phe DMSO 282 0,02 284 0,006
Tabla 2. Características de la fluorescencia de los aminoácidos libres e insertos en una proteína.
DMSO = dimetil sulfóxido, un solvente orgánico.
La fluorescencia de los residuos aromáticos varía en forma un tanto impredecible entre
las diversas proteínas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento
quántico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en sí
misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de
perturbación del estado plegado. La longitud de onda de emisión es un mejor indicador del
medio ambiente del fluoróforo.
Por otro lado la fluorescencia del triptófano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos
disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.
Proceso patológico de formación de Amiloides
Se conoce como amiloidosis a una serie de patologías que se caracterizan por la
formación irreversible de agregados insolubles, denominados fibras amiloides. Como ejemplos
de estas patologías podemos mencionar: la amiloidosis sistémica, la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la Encefalopatía Espongiforme,
Amiloidosis familiar, Tumor de células C de la Tiroides, las enfermedades priónicas y en algunas
Diabetes tipo II.
Los agregados se pueden forman a partir de péptidos no estructurados o de proteínas
globulares y se caracterizan por ser irreversibles, presentar estructura tipo “cross β” y estructura
fibrilar, cuando se los observa al microscopio electrónico.
El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un diámetro entre 75-80 Ǻ y se
encuentra formada por protofibras de 25-35 Ǻ (Figura 8). En esta estructura la cadena peptídica
forma hojas β cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje
fibrilar.
Figura 8. Modelo de una fibra amiloide.
9
La formación de fibras amiloides pueden también ser inducidas “in vitro” bajo
condiciones fisicoquímicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan
el proceso. Se sabe que ciertas proteínas solubles a pH ácido y en un entorno hidrofóbico pueden
formar rápidamente estos agregados. También pueden ser formados en presencia de fosfolípidos
ácidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios
realizados “in vitro” demostraron que proteínas como albúmina, lisozima, insulina,
gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c,
histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides.
La inhibición o reversión de la formación de fibrillas amiloides se insinúa como un
posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos
orgánicos pequeños han demostrado capacidad de inhibición del proceso “in vitro”.
Figura 9. Cinética de formación de la fibra amiloide.
Los mecanismos moleculares relacionados con la formación de los agregados amiloides
no han sido aún dilucidados, pero se acepta la existencia de un mecanismo general de formación.
La fibrilogenesis es dependiente de un proceso de nucleación, ya que por diversos estudios se
puso de manifiesto que generalmente presenta una cinética de tipo sigmoidal (Figura 9). La
proteína en estado monomérico establece un equilibrio lento con estructuras oligoméricas
(tiempo de inducción), las cuáles, una vez formadas, dan lugar rápidamente a fibras amiloides, ya
sea mediante asociación de unidades de monómeros o bien por fusión de oligómeros. Además, el
agregado de fibras preformadas provoca una disminución del tiempo de inducción.
La capacidad de la albúmina de suero bovino (BSA) de formar fibrillas amiloides bajo
ciertas condiciones experimentales, ha sido recientemente demostrada. Este proceso de
fibrilación ocurre minutos luego de la incubación de la proteína a pH fisiológico y a temperaturas
mayores de 60°C. La cinética de formación de agregados por la BSA sigue un patrón de tipo
hiperbólico en lugar de sigmoidal.
10
Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia
Los elementos esenciales en los sistemas de detección de fluorescencia son cuatro: 1) una
fuente de excitación (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3)
monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisión de los fotones de
excitación y 4) un detector para registrar la emisión de los fotones, el cual produce una señal
generalmente eléctrica. Para mejorar la visualización de los resultados generalmente está
acoplado al equipo un amplificador de la señal.
Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos básicos de la fluorescencia,
entre ellos:
Espectrofluorómetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la
fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los µL a mL).
Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una función de las
coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscópicos (por debajo
de ~ 0,1 mm de diámetro).
Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en función de coordenadas en dos
dimensiones de objetos macroscópicos como ser geles de electroforesis, blotting y
cromatografías.
Citometría de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la
fluorescencia de células, en un flujo a través de un capilar. Permite identificar y
cuantificar subpoblaciones de células en una muestra compleja.
Otros tipos de instrumentos que usan la detección por fluorescencia son los sistemas de
electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciación de DNA.
Espectrofluorómetro
Un espectrofluorómetro (Figura 10) consta de una lámpara de arco de Xenón la cual emite
luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta
el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de
excitación (M1) el cual selecciona la longitud de onda (λex) que va a incidir sobre la muestra y es
determinada por el espectro de absorción de cada fluoróforo. El rayo de luz con la longitud de
onda λex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las
cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda
en la cual leamos. La emisión de fluorescencia generalmente es detectada a 90° del rayo de luz
de excitación. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a través de un Monocromador
secundario o de emisión (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de
11
excitación, con una longitud de onda determinada (λem). La luz incide en un fotodetector que
convierte los fotones de fluorescencia en una señal eléctrica.
Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una
señal electrónica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el
espectrofluorómetro se pueden colocar filtros en los trayectos ópticos que impiden el paso de la
luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medición.
Figura 10. Representación esquemática de un espectrofluorómetro.
Lámpara de arco
de Xenón
Monocromador
primario de excitación
Monocromador secundario
de excitación
Cubeta de
muestra
λ ex
λ em
Detector /
amplificadorFotomultiplicador
Lámpara de arco
de Xenón
Monocromador
primario de excitación
Monocromador secundario
de excitación
Cubeta de
muestra
λ ex
λ em
Detector /
amplificadorFotomultiplicador
de emisión
12
Parte experimental
Objetivo del Trabajo Práctico:
*Determinar la fluorescencia intrínseca de distintas proteínas y como dicha fluorescencia
varía según el medio en que se encuentran.
*Estudiar in vitro la capacidad de formación de fibras amiloides de la albúmina.
Determinación de la fluorescencia intrínseca de proteínas
1) Determinación del espectro de excitación y de emisión de albúmina,
gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM
pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir
de soluciones madres de la proteína (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los
distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a
temperatura ambiente.
2) Determinación de RET entre tirosina y triptófano. A partir de una solución madre
de 2mg/ml de TYR se realiza una dilución 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia
cuando se la excita a 280 nm y fijando la longitud de onda de emisión en: a) 300 nm y b)
350 nm. Luego se le agregan 50 µl de TRP (2mg/ml) y se repiten las lecturas de
intensidad de fluorescencia.
3) Quenching de la fluorescencia intrínseca del triptófano de la albúmina con el
agregado de KI y hormonas tirodeas (T4). La albúmina es la proteína más abundante del
plasma sanguíneo, y es un transportador inespecífico de una gran cantidad de sustancias,
por ejemplo: hormonas. La albúmina tiene un solo triptófano, el cual se encuentra en su
sitio de unión a la hormona. Cuando ésta se une a la BSA se quenchea la fluorescencia
del triptófano. A partir de una solución madre de 2mg/ml de albumina se realiza una
dilución 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se excita a 300 nm y emite a
350 nm. Luego se le agregan 50 µl de T4 (4mg/ml) y se repite la lectura de intensidad de
fluorescencia.
Estudio in vitro de la capacidad de formación de fibras amiloides de la albúmina.
La albúmina forma fibrillas amiloides cuando se la incuba a temperaturas mayores de
60°C y a pH fisiológico. La formación de estos agregados se pondrá en evidencia con la sonda
fluorescente Thioflavina T.
La Thioflavina T (ThT) (Figura 11), es un fluoróforo que cuando se encuentra libre se
caracteriza por presentar una λexc 415 nm y de λem 482 nm. Sin embargo, al unirse a las fibras
amiloides, su espectro de excitación se modifica apareciendo un pico a λexc 450 nm, sin
modificar la longitud de onda de emisión.
Figura 11. Thioflavina T
13
Determinación: Se inducirá la formación de fibras amiloides de la albúmina por calentamiento a 65ºC. Se estudiará la cinética de formación de agregados de la albúmina (2mg/ml) en buffer Tris-HCl 20 mM pH 7,4. Se tomarán alícuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para detener la agregación se pondrán los tubos en baño de hielo. Para la lectura se diluye las proteínas a una concentración final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentración final de 25 µM.
14
1) Proteína: λ exc λ em Dioxano 100% Urea 8M Guanidina 6M
200
220
240
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
260 280 300 320 340 360 380 400
2) RET: Tyr – Trp y 3) Quenching
λexc 275
λem 300 λem 350 KI
Tyr -----
Tyr-Trp
4)
Fluorescencia (UA)
0
10
30
60
90
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 20 40 60 80 100