espectroscopia de fluorescencia

MODULO

INTRODUCCIN A LA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

RECOPILADO POR:

Jorge Enrique Castillo Ayala

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

ANALISIS INSTRUMENTAL

JECA 1

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FLUORESCENCIAEs el fenmeno a travs del cual algunas molculas despus de absorber radiacin electromagntica, son capaces de emitir luz, sin que se de cambio en la multiplicidad.

E0

E1Absorcin

UVEmisin

VIS

v1v2v3v4

v1v2v3v4

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E0

E1

S0 S1 T1

Singulete

Singulete Triplete

Estado fundamental en su estado de mnima energa

Transicin sin cambio de multiplicidad. El

modo vibracional no es el de mnima energa

Cambio de multiplicidad. El modo vibracional no es el de

mnima energa

FLUORESCENCIA

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Una vez el electrn se encuentra en el estado excitado, este tiende a pasar al estado fundamental; este retorno se puede llevar a cabo de mltiples formas, las cuales compiten entre s.

La transicin desde un modo vibracional vi del estado excitado hasta el estado fundamental se conoce como desexcitacin.

La desexcitacin puede ocurrir de una forma no radiativa (sin emitir radiacin electromagntica) o radiativa (emitiendo un fotn).

Las sustancias que emiten radiacin electromagntica, se les conoce como luminiscentes.

Las formas ms importantes de desexcitacin se pueden clasificar en transiciones verticales y horizontales.

Las verticales se dan entre estados vibracionales de distinta energa; las horizontales implican transiciones entre modos vibracionales isoenergticos.

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S0

S1

S2

T

Conversin interna y

externaAbsorcin Fluorescenci

a Fosforescencia

Cruce entre sistemas

Relajacin vibracional

Conversin interna

Relajacin vibracional

Estado triplete excitado

Estados singuletes excitados

Diagrama de Jablonski

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PROCESOS DE DESACTIVACIN

1. Relajacin vibracionalColisiones moleculares conducentes al estado fundamental vibracional.

2. Conversin internaPaso a un nivel electrnico inferior sin emitir radiacin. Solapamiento de niveles vibracionales.

3. Conversin externaTransferencia de energa desde la molcula excitada hacia el disolvente.

4. PredisociacinExcitacin a nivel electrnico que por conversin interna conduce a nivelelectrnico inferior en el que se disocia.

5. DisociacinExcitacin a nivel electrnico en el que la molcula se disocia.

6. Cruzamiento de sistemasTransicin entre dos estados electrnicos de diferente multiplicidad de espn.Ms probables cuando se solapan los niveles vibracionales.


DESEXCITACIONES NO RADIATIVAS

Desexcitaciones no radiativas se dan por procesos de relajacin vibracional y rotaciona, (R).

Mediante dicho proceso la molcula va pasando a modos vibracionales de menor energa dentro del estado excitado (vi vi-1 v0) hasta alcanzar el de mnima energa compatible con dicho estado.

Este tipo de transicin es, por lo tanto, vertical.

En molculas en disolucin, dicho proceso se debe a los choques estadsticos entre esas molculas, o entre stas y las de disolvente.

La energa liberada en esta desexcitacin se convierte en energa cintica de las molculas, y en ltimo trmino se disipa en forma de calor.

Esta es, la cusa por la que se calienta un medio como consecuencia de su exposicin a la luz. Estos procesos de relajacin son muy rpidos en los lquidos (10-12 s) y compiten con otras formas de desexcitacin.JECA 7


S0

S1v1v2v3v4

v1v2v3v4

v0

v0

RELAJACION VIBRACIONAL O ROTACIONAL

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DESEXCITACIONES NO RADIATIVAS

En el camino hacia modos vibracionales de menor energa dentro del estado S1, puede suceder que alguno de ellos, vj, sea de igual energa que un modo vibracional del estado fundamental, vj.

En ese caso pude acontecer una transicin isoenergtica, por tanto horizontal, no radiativa, que se conoce con el nombre de conversin interna (CI):

En este caso la molcula pasa a un modo vibracional de elevada energa de los del estado singulete fundamental.

La evolucin hacia el modo vibracional de menor energa ocurre mediante procesos de relajacin idnticos a los descritos para el estado singulete excitado.

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v9

v5

S0

S1

S0

Absorcin

Conversin interna

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

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v9

v5

S0

S2

S1

Absorcin

Conversin interna

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

Fluorescencia v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

S0JECA 11PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

DESEXCITACIONES NO RADIATIVASLas transiciones desde un estado singulete a un estado triplete, y viceversa, estn altamente impedidas, ya que implican un cambio de multiplicidad.

Sin embargo, en algunas molculas, dichos estados tripletes poseen modos vibracionales isoenergticos con determinados modos vibracionales de estados singuletes excitados. As, la transicin entre dichos estados puede suceder con bastante probabilidad. Esta transicin, que es horizontal, se conoce con el nombre de cruce entre sistemas, (CES):

El modo vibracional de menor energa de T1 normalmente est a un nivel energtico inferior que el correspondiente del estado S1. Esto hace que los estados tripletes se comporten como autnticas trampas para los electrones excitados. La transicin al estado singulete fundamental implica un cambio de multiplicidad, la molcula permanecer mucho tiempo en ese estado triplete antes de abandonarlo.

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v9

v5

S0

S1

T1

Absorcin

Cruce entre sistemas

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

v9

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

Fosforescencia

S0

v5

v1v2v3v4

v0

v6v7v8

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RENDIMIENTO CUANTICO

El rendimiento cuntico es la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto al nmero total de molculas excitadas.

Para molculas altamente fluorescentes como la fluoresceina, la eficiencia cuntica, bajo determinadas condiciones, es aproximadamente uno.

El rendimiento cuntico para un compuesto se puede calcular a partir de las constantes de velocidad relativas kx de los procesos por los que el estado singulete excitado ms bajo se desactiva. Fluorescencia (kf), cruce entre sistemas (kces), conversin externa (kce), conversin interna (kci), predisociacin (kpd), disociacin (kd). kf, kpd, kd , dependen de la estructura y kces, kce, kci , dependen del entorno.

dpdcicecesf

f

kkkkkkk

+++++=f

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TRANSICIONES EN MOLCULAS FLUORESCENTES

La fluorescencia rara vez se presenta por absorcin de radiacin de longitud de onda inferior a 250 nm, debido a que esta radiacin es suficientemente energtica para producir desactivacin de los estados excitados por predisociacin o disociacin.

Rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones s* s, en cambio, est asociada a procesos menos energticos p* p y p* n.

La fluorescencia surge, generalmente, de una transicin desde el nivel vibracional ms bajo del primer estado electrnico excitado a uno de los niveles vibracionales del estado electrnico fundamental.

Para la mayora de los compuestos fluorescentes, la radiacin se produce por una transicin p* p y p* n, dependiendo de cul de ellas sea la menos energtica.

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EFICIENCIA CUNTICA Y TIPO DE TRANSICIN

La fluorescencia se encuentra con ms frecuencia en los compuestos en los que la transicin de ms baja energa es del tipo p p*, que en aquellos compuestos en los que la transicin de menor energa es del tipo n p*.

La mayor eficiencia cuntica asociada a la transicin p p* se puede explicar de dos formas:

1. La absortividad molar de una transicin p p* es normalmente de 100 a 1000 veces superior que la de un proceso n p* que representa una medida de la probabilidad de la transicin en ambas direcciones; el tiempo de la transicin p p* es de 1 X 10-9 a 1 X 10-7 s y el de la transicin n p* es de 1 X 10-7 a 1 X 10-5 s; siendo kf mayor para la transicin p p*.

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EFICIENCIA CUNTICA Y TIPO DE TRANSICIN

2. Consideraciones termodinmicas sugieren que la constante de velocidad del cruce entre sistemas kces es menor para el estado excitado p p*, ya que la diferencia de energa entre los estados singulete/triplete es grande , es decir, se requiere ms energa para desaparear los electrones del estado excitado p*.

Como consecuencia, el solapamiento de los niveles vibracionales del triplete con los del estado singulete es menor y la probabilidad de que ocurra un cruce entre sistemas es menor.

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FLUOROFOROSPara que una molcula pueda llegar a emitir fluorescencia, es necesario que previamente sea capaz de absorber radiacin electromagntica; es decir, dicha molcula debe pasar de su estado fundamental S0, en el modo vibracional de menor energa, a algn modo vibracional vi de un estado excitado (S1 o S2), es necesario que dicha molcula tenga un crofomforo, es decir, enlaces o conjuntos de enlaces responsables de dicha absorcin.

El hecho de que una molcula posea un grupo cromforo no implica necesariamente que pueda emitir fluorescencia; sin embargo, si ese grupo fluorece, se le denomina fluorforo.

Cuando una molcula posee de modo natural un fluorforo, a ste se le califica como intrnseco. En otros casos es conveniente unir a una molcula, covalentemente o no, un fluorforo ajeno a ella. El fin de esta manipulacin es dotarla de fluorescencia si no la tiene o de una fluorescencia diferentea la que tiene de modo natural. A este tipo de fluorforos se les denomina extrinsecos.

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FLUORESCENCIA Y ESTRUCTURA

La fluorescencia ms intensa y ms til es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromticos con transiciones p p* de baja energa.

Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas y alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados tambin pueden presentar fluorescencia, pero el nmero de estos compuestos es pequeo comparado con el nmero de sistemas aromticos.

OH

VITAMINA AJECA 19



La mayora de hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin, la eficiencia cuntica normalmente aumenta con el nmero de anillos y con su grado de condensacin.

BENCENO NAFTALENO ANTRACENO FENANTRENO PIRENO

FLUORENO FLUORANTENO

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Los heterocclicos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol, no presentan fluorescencia.

Las estructuras condensadas con los anteriores si presentan fluorescencia.

N

PIRIDINA

O

FURANO

S N

H

TIOFENO PIRROL

N

QUINOLINA

N

ISOQUINOLINA

N

H

INDOL

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En los heterocclicos con nitrgeno, se cree que la transicin electrnica de ms baja energa implica a un sistema n p* que rpidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.

La condensacin de anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos, da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorcin. En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as, se observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indol.

La sustitucin en el anillo bencnico provoca desplazamientos en la longitud de onda de los mximos de absorcin y los correspondientes cambios en los picos de fluorescencia.

La sustitucin afecta a la eficacia de la fluorescencia: algunos de estos efectos se ilustran con los datos de los derivados bencnicos. (tabla)

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Efecto de los sustituyentes en la fluorescencia del benceno Compuesto Formula Longitud de onda de

fluorescencia, nm Intensidad de

fluorescencia relativa Benceno C6H6 270 - 310 10 Tolueno C6H5CH3 270 - 320 17 Propilbenceno C6H5C3H7 270 - 320 17 Fluorobenceno C6H5F 270 -320 10 Clorobenceno C6H5Cl 275 - 345 7 Bromobenceno C6H5Br 290 - 380 5 Yodobenceno C6H5I - 0 Fenol C6H5OH 285 - 365 18 Ion fenolato C6H5O- 310 - 400 10 Anisol C6H5OCH3 285 - 345 20 Anilina C6H5NH2 310 - 405 20 Ion anilinio C6H5NH3+ - 0 cido benzoico C6H5COOH 310 - 390 3 Benzonitrilo C6H5CN 280 - 360 20 Nitrobenceno C6H5NO2 - 0

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FLUORESCENCIA Y ESTRUCTURALos halgenos ejercen influencia en la fluorescencia, se cree que el descenso en la fluorescencia al aumentar el nmero atmico del halgeno es debido, en parte, al efecto del tomo pesado (el cruce entre sistemas es ms comn en molculas que contienen tomos pesados, como son el yodo o el bromo; los acoplamientos espn/orbital se hacen grandes en presencia de tales tomos y, de ese modo, se favorece en cambio en el espn), que aumenta la probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el estado triplete.

Se cree que la predisociacin juega un papel importante tanto en el yodobenceno como en los nitroderivados; estos compuestos tienen enlaces de fcil ruptura que pueden absorber la energa de excitacin seguida de una conversin interna.

La adicin de un cido carboxlico o de un grupo carbonilo en un anillo aromtico generalmente inhibe la fluorescencia. En estos compuestos, la energa de la transicin n p* es menor que la de la transicin p p*; el rendimiento de la fluorescencia es normalmente menor para el sistema del primer tipo.

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EFECTO DE LA RIGIDEZ ESTRUCTURAL

H2C

FLUORENO BIFENILO

La fluorescencia se ve favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas.

La eficiencia cuntica para el fluoreno y el bifenilo son prximas a 1,0 y 0,2, respectivamente, bajo condiciones de medida similares.

La falte de rigidez de una molcula probablemente provoca un aumento de la velocidad de conversin interna y el correspondiente aumento en la probabilidad de desactivacin no radiante.

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EFECTO DE LA RIGIDEZ ESTRUCTURAL

Se ha recurrido a la influencia de la rigidez estructural para explicar el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando estn formando un complejo con un ion metlico.

La intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es mucho menor que la de su complejo con zinc.

N

OZn

2

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EFECTO DE LA TEMPERATURA

La eficiencia cuntica de fluorescencia disminuye en la mayora de las molculas al aumentar la temperatura.

Al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es elevada, aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin externa.


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EFECTO DEL DISOLVENTE

Una disminucin en la viscosidad del disolvente aumenta la probabilidad de la conversin externa, disminuyendo la eficiencia cuntica de fluorescencia.

La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de disolventes que contienen tomos pesados o de solutos con dichos tomos en su estructura; como por ejemplo: tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.

El efecto es similar al observado cuando se introducen, por sustitucin, tomos pesados en compuestos fluorescentes: las interacciones spin-orbital desembocan en un aumento en la velocidad de formacin del triplete y en la correspondiente disminucin de la fluorescencia.

Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a los disolventes compuestos que contienen tomos pesados.


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EFECTO DEL pH

La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos depende normalmente del pH.

Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son, probablemente, diferentes para las formas ionizadas y no ionizadas del compuesto.

Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo surgen del distinto nmero de especies resonantes asociadas con las formas cidas y bsicas de las molculas.


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EFECTO DEL pH

N N N N

HH HH HH HHH

FORMAS RESONANTES DE LA ANILINA ION ANILINIO

La anilina tiene varias formas resonantes, mientras que el ion anilinio solo una. Esto es, cuanto mayor es el nmero de formas resonantes, mayor es la estabilidad del primer estado excitado, la consecuencia es una fluorescencia en la regin ultravioleta.

La influencia del pH en la fluorescencia de ciertos compuestos se ha utilizado para la deteccin de puntos finales en valoraciones acido/base.


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EFECTO DEL OXGENO DISUELTO

La presencia de oxgeno disuelto suele reducir la intensidad de fluorescencia de una disolucin.

Este efecto puede ser el resultado de una oxidacin de las especies fluorescentes inducida fotoqumicamenre. Sin embargo, con ms frecuencia la amortiguacin tiene lugar como consecuencia de las propiedades paramagnticas del oxgeno molecular, que favorecen el cruce entre sistemas y la conversin de las molculas excitadas al estado triplete.

Otras especies paramagnticas tambin tienden a amortiguar la fluorescencia.


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EFECTO DE LA CONCENTRACIN EN LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA

La potencia de la emisin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitacin absorbido por el sistema. Esto es

F = K(Po P) (1)

Donde Po = potencia del haz que incide sobre la disolucin.P = potencia despus de atravesar una longitud b del medio.K = constante que depende de la eficiencia cuntica de la

fluorescencia

Con el objeto de relacionar F con la concentracin c de la especie fluorescente, se escribe la ley de Beer de la forma

(2)

bc

oPP e 10-=


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Donde e es la absortividad molar de las molculas fluorescentes y ebc es la ansorbancia, A. Sustituyendo la ecuacin (2) en la ecuacin (1)se obtiene

F = KPo(1 10 - ebc) (3)

El trmino exponencial de la ecuacin (3) puede desarrollarse como una serie de Maclaurin

(4)( )

+-= ...

3! 2,303

!2 303,2 303,2'

2 bcbcbcPKF oe

e


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Siempre que 2,303 ebc = A < 0,05, los trminos posteriores del corchete son despreciables respecto al primero; en estas condiciones, el error relativo mximo cometido al despreciar todos los trminos excepto el primero es de 0,13 por 100. Por ello se puede escribir

F = 2,3 K ebc Po (5)

o cuando Po es constante,

F = Kc (6)

c

F


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ESPECTROS DE EMISION Y DE EXCITACIN

Tres espectros del fenantreno, E corresponde al espectro de excitacin, este se obtiene midiendo la intensidad luminiscente a una longitud de onda fija mientras se vara la longitud de onda de excitacin.

Los espectros de fluorescencia F y fosforescencia P suponen la excitacin a una longitud de onda fija mientras se registra la intensidad de emisin como funcin de la longitud de onda.

La fotoluminiscencia tiene lugar a longitudes de onda ms largas que las longitudes de onda de excitacin. Las bandas fosforescentes se encuentran a longitudes de onda ms largas que las bandas de fluorescencia, ya que el estado triplete excitado tiene menor energa que el correspondiente estado singulete.


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INSTRUMENTACIN EN FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Los componentes de los instrumentos usados en las medidas de luminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotmetros o espectrofotmetros UV/Vis.

La figura muestra los componentes de los fluormetros o espectrofluormetros.

Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan pticas de doble haz para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.


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1. Lmparas: Arco de Mercurio a baja presin (254, 302, 313, 546, 578, 691, 773 nm) tiles en Fluormetros de filtros.

Lmpara de arco de Xenon Emite espectro de radiacin continua desde 300 a 1300 nm tiles en espectrofluormetros.

Lseres sintonizables de nitrgeno pulsante o de Nd:YAG trabajan a una sola longitud de onda.

2. Filtros y Monocromadores:Se han usado tanto filtros de absorcin como filtros de interferencia en los fluormetros para seleccionar la longitud de onda de excitacin y de emisin. En los espectrofluormetros se utilizan monocromadores de red.


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3. DetectoresSe utilizan tubos fotomultiplicadores, detectores de diodos y en el caso particular de algunos espectrofluormetros se usan detectores de diodos en lnea; tiles en HPLC y Electroforesis capilar.

4. CubetasSe utilizan cubetas cilndricas o rectangulares, fabricadas en slice o en vidrio que se utilizan segn el caso.

En fluorescencia es importante evitar dejar huellas dactilares en las cubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia fluorece.


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Los espectrofluormetros son instrumentos especializados equipados con dos monocromadores .

Uno de los monocromadores permite variar la longitud de onda de excitacin y el otro permite obtener un espectro de emisin.

La figura muestra un espectro de excitacin del antraceno que es similar al espectro de absorcin; tambin se muestra el espectro de emisin de fluorescencia del antraceno; la longitud de onda de excitacin se mantuvo constante mientras se hace un barrido de las longitudes de onda de emisin.


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Estos espectros son como una imagen especular uno del otro, ya que las diferencias de energa vibracional para los dos estados electrnicos fundamental y excitado son ms o menos las mismas.


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FLUORMETRO

Son instrumentos diseados para anlisis cuantitativo; para seleccionar la longitud de onda de excitacin y de emisin utilizan filtros. Utilizan lmpara de mercurio a baja presin y un par de tubos fotomultiplicadores.


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ESPECTROFLUORMETRO

Instrumentos diseados para hacer barrido espectral en la regin UV y Visible para obtener los espectros de excitacin y de emisin de las molculas que fluorecen. Utilizan monocromadores de red y lmpara de arco de Xenn; se utilizan tanto para anlisis cualitativo como para anlisis cuantitativo.


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