fosforescencia y fluorescencia
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Diapositiva 2 (principio físico)
Desde el primer cuarto del siglo XX se han establecido muchas teorías con respecto
a la radiación y su interacción con la materia. Hoy en día se sabe que una vez que la
radiación electromagnética entra en contacto con la materia pueden ocurrir diferentes
fenómenos entre ellos están la transmitancia, difracción, reflexión y absorbancia;
siendo esta última el principio físico de variadas técnicas de espectroscopia.
Cuando la luz es absorbida como respuesta se da la luminiscencia que es el proceso
de emisión de la luz y que principalmente ocurre en dos formas: fluorescencia y
fosforescencia, también llamados fenómenos de fotoluminiscencia.
Diapositiva 3 (continua principio físico)
Para entender los diferentes procesos de emisión la figura 1 representa el diagrama
de energía del proceso de absorción-emisión mejor conocido como diagrama de
Jablonski.
Figura 1. Diagrama de jablonski.
Descripción:
La línea base color negro sólido, identificada como S0 representa el estado
fundamental de menor energía donde la molécula permanece estable. Cuando la
molécula entra en contacto con la radiación electromagnética ocurre el fenómeno de
absorción (A) donde la molécula puede entrar en un estado de vibración (Ev, lo que
implica vibración/rotación de la molécula). Sin embargo, recordemos que la energía
esta cuantizada y para que la molécula logre alcanzar un nivel permitido (S1) pueden
ocurrir dos fenómenos:
1. Conversión interna (IC) para pasar del estado excitado a uno de menor energía
toda la energía de emisión se convierte en calor y no hay presencia de fotones
liberados, no está del todo claro cómo es que se dispersa el calor liberado.
2. Relajación Vibracional (Nr). Se da cuando ocurren colisiones entre el soluto y
el solvente, donde este último transfiere térmicamente la energía necesaria
para regresar al estado basal. Este proceso es tan eficiente que, no solo uno o
dos cuantos de energía vibracional se pierden, sino todo el exceso de energía
vibracional del estado excitado, en un tiempo de 10-13 a 10-11 s. Esto significa
que antes de que una molécula excitada en solución pueda emitir un fotón
sufrirá una relajación vibracional. Tanto Ic como Nr son procesos no radiativos
y son formas de emisión.
Por otro lado la fluorescencia (F) es un proceso “radiativo” de relajación que puede
observarse cuando la emisión es producida debido a la relajación de la molécula
excitada a cualquiera de los estados vibracionales del estado electrónico
fundamental. En otras palabras si hay emisión de un fotón como producto de la
relajación es posible medir por equipo especializado.
En el diagrama se ve representado el entrecruzamiento de sistema (Isc) y para
entenderlo es necesario recordar la naturaleza del spin dentro de una molécula. En la
figura 2 se observa primeramente la molécula en el estado fundamental (S0) cuando
la molécula es irradiada pasa a un estado excitado S1 y como se puede observar el
spin del electrón excitado se mantiene con respecto a la posición inicial, se dice que
está en singulete. Cuando ocurre el ISC se presenta una Ic donde el electrón sufre
una inversión de spin de + a – o viceversa, lo cual resulta en un estado de menor
energía conocido como triplete (T1). La probabilidad de que el Isc ocurra es muy
baja (cuánticamente es prohibida).
Figura 2. Entrecruzamiento de sistemas para dar lugar a la fosforescencia.
Finalmente el último proceso de emisión posible es desde el estado triplete o mejor
conocido como fosforescencia denotado como P en la figura 1. Las velocidades de
emisión en este caso son lentas (103 – 100 s-1), tal que la vida media de la
fosforescencia es típicamente de milisegundos a segundos.
Si una molécula presenta emisión radiactiva el camino de emisión más probable
hacia el estado fundamental será aquel que minimiza el tiempo de vida media del
estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es rápida con
respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión. Por otro lado, si un
camino sin radiación tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no
tiene lugar o es menos intensa.
Diapositiva 4 Descripción del equipo
En general la instrumentación para medir fosforescencia y fluorescencia son
similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros de
ultravioleta/ visible y se les conoce como fluorómetros. Casi todos los instrumentos
de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz (el de muestreo y uno de referencia) tal
como se muestra en la figura 3. El haz de la fuente pasa primero a través de un filtro
o un monocromador de excitación, que transmite la radiación es aquí cuando una
parte de la luz incidente es absorbida por la muestra y algunas de las moléculas de la
muestra producirán fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las
direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador de emisión y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra
a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz
incidente reflejada o transmitida llegue al detector.
Figura 3. Representación esquemática de un fluorimetro.
Mientras tanto el haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su
potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (de la muestra). Las
señales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen
a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro.
Los componentes de los espectrofluorímetros constan generalmente de:
- Fuentes: Se requieren fuentes más intensas que las lámparas de wolframio ya que
como puede verse en la siguiente ecuación la eficiacia de la medición depende en
gran medida de la potencia de la lámpara.
F=K ' (P0−P)
Donde F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación, P0 es la
potencia del haz que incide sobre la muestra y P es su potencia después de
atravesar una longitud b de la muestra. La constante K’ depende de la eficacia del
proceso de fluorescencia.
Como fuentes se utilizan tanto lámparas como laseres. Las lámparas más comunes
para los espectrofluorímetros son las lámparas de arco de xenón de alta presión y
logran generan un análisis en el espectro desde aproximadamente 300 a 1.300 nm.
Por otro lado, los láseres los más comunes utilizan como sistemas de bombeo un
láser de nitrógeno pulsante o un láser de Nd: YAG.
- Filtros o monocromador: Sirven para la selección de radiaciones de una
determinada longitud de onda: normalmente se utilizan los filtros, prismas y redes de
difracción.
- Cubetas porta muestras: Son utilizadas para contener la muestra, suelen ser de
cuarzo para permitir el paso de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm
de espesor, como las utilizadas para medidas de absorción, excepto que todas las
caras son transparentes a la radiación (están pulidas), ya que generalmente las
medidas de fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la radiación
incidente; a otros ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la
cubeta puede originar mayor ruido de fondo.
- Detectores: se usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para detectar la
radiación de fluorescencia. Este aprovecha el efecto de emisión secundaria de
electrones para responder a niveles muy bajos de iluminación, manteniendo un nivel
de ruido aceptable.
Para medir fosforescencia únicamente se requiere acoplar un componente adicional.
Se trata de un dispositivo que irradia alternativamente la muestra y, después de un
retraso en el tiempo adecuado, mide la intensidad de fosforescencia.
Diapositiva 5; esquema real de un espectroscopio de fluorescencia (marca
nanolog de la compañía Horiba)
Diapositiva 6 y 7; Información proporcionada
La luz emitida por una molécula a partir de su estado excitado singlet en su nivel
vibracional más bajo, S1, corresponde a la diferencia de energía de éste con un nivel
vibracional de S0 (Figura 1). Habrá un espectro de energía de los fotones que
fluorescen, y este espectro (Figura 4) es el que se optiene en el espectrofluorímetro.
Los datos del espectro de fluorescencia se presentan generalmente en un espectro
de emisión de fluorescencia, un PLOT de las intensidades de fluorescencia versus
longitudes de onda (nanómetros) o número de onda (cm-1).
Figura 4. Espectro generado por espectroscopia de fluorescencia
Generalmente en el equipo para obtener el espectro de fluorescencia primero se
obtiene el espectro de excitación (E) del cual se obtiene la longitud de onda máxima
(ʎmax) a la que absorbe el material. Con este dato se programa el monocromador de
excitación para obtener el espectro ya sea de fluorescencia o fosforescencia (Figura
5).
Figura 5. Como obtener el espectro de fotoluminiscencia.
Diapositiva 8. Tipos de muestras/ preparación de la muestra
Sabemos que no todas las moléculas absorben en la región del visible y aquellas que
si lo hacen se conocen como cromóforos pues bien, no todas las moléculas
presentan fotoluminiscencia. Aquellas que si lo hacen se conocen como fluoróforo.
Para poder identificar un fluoróforo es importante recordar los tipos de enlaces que
presenta una molécula.
Recordando
Enlace sencillo (compuesto de dos electrones) = enlace sigma (σ)
Enlace doble = 1 enlace sigma y 1 enlace pi (σ + π)
Enlace triple = 1 enlace sigma y 2 enlace pi (σ + 2π)
A los pares de electrones libres se le representa por la letra n
La figura 6 da un ejemplo de una molécula donde se identifican los enlaces σ, π y n.
Cada enlace tiene un orbital de anti-enlace con base en la teoría de orbitales
moleculares. Esto quiere decir que cada tipo de enlace es un posible sitio donde
puede absorberse la radiación electromagnética y ocurrir una transición desde un
estado fundamental sigma (σ) a uno sigma de anti – enlace (σ*) por ejemplo. Los de
mayor energía son las transiciones que corresponden a los dobles y triples enlaces
por ello los mejores fluoróforos se componen por enlaces carbono-carbono, sistemas
aromáticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un
átomo con pares libres). Es importante mantener en mente este tema de las
tranciones y tipos de enlaces ya que son la base para la interpretación de datos.
Por otro lado la espectroscopia de fluorescencia es una técnica no destructiva y que
se aplica a sólidos. También hay fluorescencia en gases sin embargo el principio de
emisión y la instrumentación implementada varían por ello se omite su descripción
para efectos de esta presentación.
Para la preparación de la muestra no se requiere tratamiento y solo es necesaria la
preparación de una solución de la muestra con una concentración conocida. Se toma
una alícuota de la muestra y se coloca en el portamuestra de cuarzo para su
correspondiente medición.
Para que esto ocurra la molécula debe presentar grupos cromóforos que son los
grupos funcionales de la molécula responsable de la absorción. Principalmente son:
dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromáticos, grupo carbonilo,
imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un átomo con pares libres).
Normalmente son fluorescentes las siguientes sustancias:
– Moléculas que contienen anillos aromáticos (benceno, tolueno y derivados,
fluoreno, bifenilos,..).
– Algunos compuestos carbonílicos.
– Compuestos orgánicos con dobles enlaces conjugados.
– Compuestos orgánicos con heterociclos( piridina, furano, tiofeno, pirrol,..)
Diapositiva 9 (Costo mantenimiento, Calibración del equipo)
Previo a utilizar el equipo se hace un ajuste de blancos o calibración del equipo para
ello se mide la fluorescencia del blanco (el blanco es el solvente) esta medición se
guarda en el equipo como espectro y después, en el software ese archivo se utiliza
para eliminar los efectos asociados al ruido y al solvente.
El resto de la información esta explicada en la lámina.
Diapositiva 10; Ubicación del equipo y donde hay otros
En el IPICYT dentro del laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y
Ambiental (LANBAMA) se encuentra un equipo capaz de medir fluorescencia de la
marca BioRad modelo Gel Doc XR Plus. Además de fluorescencia hace mediciones
de colorimetría/densitometría y documentación de geles de los cuales también se
puede obtener imagen. Por otro lado, en el CIACYT se encuentra otro equipo de
espectroscopia fluorescente de la marca Acton modelo 2500 y que está a cargo del
Dr. Ángel Gabriel Rodríguez.
Diapositiva 11; variaciones de la técnica otras versiones avanzadas
En cromatografía liquida de alta eficacia las medidas de fotoluminiscencia
proporcionan un importante método para la detección y determinación de los
componentes de una muestra que eluyen de las columnas cromatografías. También
se pueden hacer análisis acoplados a fluorescencia por rayos X. Inclusive con la
finalidad de mejorar el método se ha acoplado instrumentación para la medición de
los tiempos de vida de fluorescencia.
Diapositiva 12. Interpretación de datos
En un espectro de fluorescencia cada pico (dicho apropiadamente es una señal)
representa una transición electrónica llamese σ, π o n. La interpretación de los datos
se hace a partir del espectro de absorción usando como argumento la regla del
espejo que establece que los espectros de excitación y emisión de fluorescencia son
imágenes especulares uno del otro, tal como en la figura 7.
Otra característica de los espectros de fluorescencia, representada en la figura 8, es
que el espectro de emisión es independiente de la longitud de onda de excitación
(λexc), recordemos que la energía esta cuantizada y si una molécula emite a una
determinada λemision lo seguirá haciendo la clave es irradiar a la λ adecuada (por eso
regularmente se selecciona la longitud de onda máxima del espectro de absorción).
Sin embargo la intensidad si depende de la concentración de la muestra por la
relación indirecta con la ley de Lambert beer.
Diapositiva 13
La interpretación de los espectros de fluorescencia es muy específica depende de la
molécula y del proceso que se desee analizar. Sin embargo hay algunas reglas
generales para lograr asociar cada señal que se presenta en el espectro con
respecto a la molécula analizada:
1. Las transiciones electrónicas tienen una región bien definida en el espectro
(Tabla 1.)
Tabla 1. Descripción del espectro de absorción/ emisión según el tipo de transición.
Figura7. Imagen especular
Transición Región del espectro electromagnético (nm)
σ σ*U.V. de vacío
(<95)
n σ*U.V. lejano
(100-200)
π π*U.V. cercano
(210-380)
n π*Visible
(400-780)
Es muy complicado con la tecnología que tenemos ver las primeras dos variantes de
la tabla, por ello las moléculas con este tipo de transiciones son usados como
solventes (se evita interferencias en las medidas). Algunos ejemplos son:
CH3OH max: 177 (hexano)
(CH3)3N
CH3Cl max: 173 (hexano)
Diapositiva 14
2. Las bandas de emisión más intensas representan transiciones de mayor
probabilidad (Bandas π π *) mientras que las de baja intensidad
corresponden a transiciones n π *. (menos probables). Figura 8.
Figura 8. Espectro de emisión de un azobenceno presentado bandas de
emisión características, correspondientes a las transiciones electrónicas π a
π*y na π*.
Diapositiva 15
3. Los compuestos aromáticos y compuestos insaturados que tienen sistemas de
electrones π extendidos son FLUORESCENTES. Sin embargo, la rigidez
estructural aumenta la FLUORESCENCIA y provoca un corrimiento hacia
mayores longitudes de onda
4. La presencia de átomos con alto número atómico, disminuye la
FLUORESCENCIA. (Efecto del átomo pesado). Hay perturbación del spin
electrónico y aumenta el ISC. Las especies paramagnéticas también alteran el
spin electrónico afectando la FLUORESCENCIA.
5. Las características espectrales de los metales de transición en disolución se
deben a transiciones electrónicas entre estos orbitales d. Los iones y complejos
de los metales de transición están coloreados en todos sus estados de oxidación.
Las bandas son generalmente anchas y están muy influenciadas por el tipo de
ligando unido al ión central.
Diapositiva 16 Factores que pueden afectar la fluorescencia/ medición
Hay muchos otros efectos según el sistema que se analice pero para efectos de
generalidad se enlistan los siguientes
-temperatura y naturaleza del solvente: el efecto de un aumento en la temperatura
incrementa el número de choques moleculares, por lo que la desactivación tiende a
efectuarse a través de procesos no radiativos y por lo tanto se inhibe la
fluorescencia.
- efecto del ph: debido a las diferentes formas químicas que son posibles de existir a
diferentes condiciones de ph, la intensidad de fluorescencia también es afectado por
este factor. Ejemplo: el fenol y el ión fenolato tienen diferentes propiedades
fluorescentes, por lo que si las condiciones son de ph básico la especie estará en el
equilibrio químico en la forma del fenol y/o ion fenolato, afectando así la intensidad
de fluorescencia.
- sustituyentes. Las moléculas conocidas como auxocromos son grupos funcionales
de sustitución que poseen electrones de valencia no-enlazantes, n, que no absorben
a ʎ > 220nm, pero muestran absorción intensa de radiación en el uv lejano (180-200
nm), debido a transiciones n a σ*.
ej. -OH; -NH2; -Cl, etc. estos sustituyentes pueden tener un efecto batocrómico o
hipsocrómico.
Si un grupo auxocromo se asocia a la cadena de un cromóforo, la banda de
absorción del cromóforo se desplaza a ʎ más largas (efecto batocrómico o
desplazamiento hacia el rojo) a la vez que aumenta su intensidad (efecto
hipercrómico).
si se desplaza la ʎ del máximo de absorción de un cromóforo a ʎ más cortas (ej. al
cambiar a un disolvente más polar) se ha produceun efecto hipsocrómico o
desviación hacia el azul
-solvente: hay dos características del solvente seleccionado para la medición que se
deben cuidar el primero es la viscosidad ya que a mayor viscosidad menor número
de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia. el otro aspecto es la
polaridad del solvente puede tener influencia en la fluorescencia, debido al efecto
hipsocrómico y batocrómico que el solvente ejerce sobre el compuesto.
este efecto es debido a que el estado π* es más polar que el estado π y por tanto las
interacciones dipolo-dipolo con los disolventes polares disminuyen la energía del
estado excitado más que del fundamental, la transición ocurrirá por tanto a ʎ más
largas al aumentar la polaridad del disolvente.
-efecto del oxígeno disuelto: debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno,
esta tiende a desactivar cualesquier estado activado por oxidación fotoquímica de la
especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las
moléculas excitadas al estado triplete .por lo que es deseable que el oxígeno no se
encuentra presente en solución o su concentración sea mínima
Diapositiva 17 (ventajas desventjas)
Diapositiva 18 y 19 Cálculos
Para el análisis cuantitativo el dato más importante que se puede obtener de
fluorescencia es el rendimiento cuántico y no menos importante es el tiempo de vida
de fluorescencia, esto en caso de que se desee analizar cinetica de alguna reacción.
El rendimiento cuántico () de un proceso de fluorescencia es una manera de
interpretar la eficacia del mecanismo. Se define como la proporción entre el número
de fotones emitidos y el de fotones absorbidos. Ecuación en la diapositiva
El método más confiable para determinar el rendimiento cuántico es el método
comparativo, el cual involucra el uso de muestras standard.
Procedimiento para encontrar el rendimiento cuantico.
1. Se preparara un numero de soluciones de distintas concentraciones de la
muestra de interés (analito) y del blanco o muestra estándar.
2. Primero se obtiene el espectro de UV-visible del blanco y de las soluciones de
analito preparadas, se registra la absorción máxima.
3. Con los datos obtenidos se genera una curva de área integrada vs absorbancia
4. se obtiene la ecuación de la recta y la pendiente de la recta nos da el gradiente
tanto del estándar como del analito. (representados por
Grad en la ecuación).
El valor representado por øst es el rendimiento cuantico del estándar. En la
diapositiva se presenta un cuadro con los estándares mas utilizados.
Diapositiva 19
Otra via para obtener datos de los espectros de fluorescencia es por los abatimientos
debido a los auxocrmos. Es lo que se conoce como quenching. Para de deducir
estas interacciones se usa la ecuación de stern volmer.
Mediante algunas consideraciones matemáticas se llega a la ecuación:
Así una gráfica de IF0/IF versus [Q] (gráfica de Stern-Volmer) debería ser lineal, e
interceptar en la unidad al eje IF0/IF. La pendiente de dicha gráfica se denomina
constante de Stern-Volmer (KSV), y es igual a kq / kF = tF0 kq. En esta última
expresión tF0 es el parámetro tF definido en el Capítulo anterior. Sin embargo, en los
experimentos de quenching se le suele agregar el superíndice 0 para diferenciarlo de
los tiempos de vida en presencia de quencher
El análisis de las gráficas de Stern-Volmer permite obtener valiosa información. Por
ejemplo, el determinar el coeficiente de Stern-Volmer da un método indirecto para
obtener el tiempo de vida de fluorescencia
Diapositiva 20 Ejemplo
Durante un tiempo y no hace muchos años, la espectroscopia de fluorescencia molecularestuvo restringida en sus aplicaciones cuantitativas a unos cuantos químicos raros.Hoy día la fluorescencia es de primordial importancia en la química analítica. Una de susmás espectaculares aplicaciones ha sido en la detección y cuantificación de substanciasque son separadas a través del uso de la cromatografía de líquidos.
En el ejemplo presentado se realiza la síntesis de puntos cuánticos recubiertos de cisteína y se analizó la influencia que tienen distintos metales (Cu, Pb, Hg
y Cd) al aumentar su concentración en la solución de puntos cuánticos de CdTe-cisteina.
Analizando los resultados obtenidos en la interferencia del Pb se puede observar que al ir
agregando más concentración de Pb la fluorescencia disminuye poco a poco, lo cual nos dice
que no es muy selectivo hacia este; cuando se utiliza Cd la fluorescencia se abate casi
completamente y al utilizar Hg y Cu la fluorescencia queda completamente abatida, lo cual
nos indica que el sensor tiene mayor afinidad hacia estos dos metales. A partir de la grafica
de stern volver se puede obtener tiempos de vida y también se puede deducir si el
abatimiento es dinamico puede representarse como una transferencia de energía entre una
especie excitada (M*) y una especie quencher, o estático que se produce, generalmente,
como consecuencia de la formación de un complejo no fluorescente entre la molécula
emisora y la molécula quencher tienen la siguiente forma