Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren unas tcnicas especficas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones aspticas: el material e instrumental que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen.

El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles. Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estn manipulando. Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.

MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USOInstrumentos Para Siembra de Microorganismos

A.- Asa de Siembre.B.- Hilo de Siembra.C.- Pipeta de Pasteur.D.- Cayado.

PIPETAS

A.- Pipeta automtica de 0,2 - 1ml.B.- Pipeta automtica de 0,02 - 0,2ml.C-- Pipeta de vidrio de 10m.D.- Pipeta de vidrio de 1ml.

MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIN

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL

En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidaslas endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad.

El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que seconserve sin contaminar una vez esterilizado:

El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc., se cierran conalgodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de losmicroorganismos. Adems, cuando se usa algodn, a de cubrirse ste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando lacontaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y queste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur.El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para suuso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plsticoselladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones.Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces otubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave.

TCNICAS

El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismoses el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calorhmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura tridimensional de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o medianteestufas de aire caliente.

Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas,esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles.CALOR SECO

Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamenteprotegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160 - 180C durante cerca de 2 horas).ESTERILIZACIN POR AIRE CALIENTE

Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica, y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar cambios en la concentracin de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida.

El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rpidamente,al igual que las membranas celulares. Adems, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al interior de la clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin:CALOR HMEDO

Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.

EBULLICIN:

Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizarmedios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares,suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos. Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o tindalizacin.VAPOR FLUENTE

Clula VegetativaClula EsporulandoEsporaGerminacin de la EsporaCrecimientoClula

Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin delagua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos losmicroorganismos (salvo los termfilos extremos) en un tiempo de 15 a 20minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de lasendosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y quepueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vaporde agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas,coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.VAPOR SATURADO A PRESIN

Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, comoalgunos medios de cultivo, soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc. o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la esterilizacin por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtracin los retira de una forma mecnica, en lugar de destruirlos.

La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener bacterias. La accin combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza qumica del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan a travs de la membrana con la ayuda del vaco generado, por ejemplo, con una bomba de vaco. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros mtodos, generalmente el autoclave.Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.LA FILTRACIN

MATERIALES QUE SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPORMaterial textil Material de vidrio Material de goma Instrumental Quirrgico de acero inoxidable Soluciones acuosas Todo aquel material cuyo fabricante certifique pueda ser esterilizado por vaporMATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPORSustancias oleosas Sustancias grasas Polvos Instrumental Quirrgico cromado o niquelado Artculos elctricos sin cobertura especial Todo material que no tolera la exposicin al calor y a la humedad

MATERIALES QUE PUEDEN ESTERILIZARSE POR CALOR SECOInstrumental Quirrgico cromado Materiales de vidrio, aluminio o porcelana Aceites, parafina, sustancias grasas, vaselina Polvos (talco)MATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR POR CALOR SECOMaterial textil (algodn, sedas, lino, etc.) Gomas Materiales sintticos Todo material que se altere a la temperatura de trabajoNOTA: cuando el material a esterilizar sea mal conductor trmico (talco), deber disponerse en capa delgada.

Una accin mecnica: como frotar, cepillar, lavar con agua bajo presin o uso de aire comprimido.

Una accin qumica: detergente, detergente enzimtico y agua que son usados para inhibir y eliminar a los microbios, residuo orgnico y el polvo.

El calor (agua caliente) mejora las propiedades de disolucin del agua, el detergente y enzimas.

LA LIMPIEZA GENERALMENTE COMPRENDE: