zno-cao-p2o5 y mgo-zno-cao-p2o5 - uam
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FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Química Inorgánica
Los diagramas de equilibrio de fases
ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
y su aplicación al diseño y obtención de biomateriales
basados en fosfato tricálcico
Leticia Mercedes Carbajal Galán
Memoria para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas
Directores:
Dr. Ángel Caballero Cuesta
Dra. María Antonia Sainz Trigo
Instituto de Cerámica y Vidrio
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Madrid 2013
Los autores de este trabajo agradecen al Ministerio de Economía y Competitividad por la
financiación del proyecto de investigación CICYT MAT2007-65857.
Al Consejo Superior de Investigaciones Científicas, CSIC, y a la dirección del Instituto de
Cerámica y Vidrio, por permitir la realización de la presente Tesis Doctoral.
Leticia Mercedes Carbajal Galán quiere expresar su agradecimiento al Ministerio de
Economía y Competitividad por la concesión de la beca de formación de personal
investigador, FPI, BES-2008-004317, destinada a realizar esta Tesis Doctoral.
Resumen
La línea de investigación seguida en la presente memoria de Tesis doctoral se
enmarca dentro del proyecto de investigación, MAT2007-65857:
“Diagramas de equilibrio de fases para el diseño y desarrollo de materiales cerámicos de
interés tecnológico. Sistema P2O5-CaO-ZnO-MgO-SiO2”
El propósito de la presente Tesis Doctoral ha sido establecer mediante estudios
experimentales las compatibilidades en estado sólido y las relaciones de fusión del fosfato
tricálcico en los sistemas ternario ZnO-CaO-P2O5 y cuaternario ZnO-MgO-CaO-P2O5 y
específicamente las regiones ricas en fosfato tricálcico en ambos sistemas y en óxido de
cinc y fosfato tricálcico en el sistema ternario. Paralelamente se han revisado y establecido
nuevas zona de los diagramas de equilibrio siguientes:
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2,
Ca3(PO4)2-ZnO
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
Estos estudios han permitido establecer los campos de estabilidad de α, β y α+β
fosfato tricálcico dopado con cinc y magnesio en función de la temperatura y la
composición así como los rangos de solución sólida de cinc y magnesio en fosfato
tricálcico en función de la temperatura.
En segundo lugar y teniendo en cuenta la información obtenida en los estudios de
los correspondientes diagramas de equilibrio de fases se diseñaron, formularon y
obtuvieron biomateriales de α, β y α+β fosfato tricálcico modificados con óxido de cinc y
con óxido de cinc/óxido de magnesio. Se estableció la influencia de estos elementos en
estructura, transiciones de fase, sinterización, mineralogía y la microestructura de los
materiales.
Posteriormente en muestras seleccionadas se realizó un estudio del comportamiento
bioactivo “in vitro” en suero fisiológico artificial (SFA) y estudios de la citotoxicidad y
biocompatibilidad en cultivos primarios de osteoblastos humanos.
Resumen
Finalmente se ha llevado a cabo un estudio preliminar para la obtención de
materiales densos, con un escaso crecimiento cristalino, de fosfato tricálcico dopados con
cinc y cinc/magnesio mediante la técnica de Spark Plasma Sintering (SPS)
El estudio persigue un objetivo de relevancia social que es la mejora de los patrones
de salud y calidad de vida de las personas mediante la investigación y el desarrollo de
materiales basados en fosfato tricálcico modificados con óxido de cinc y
con óxido de cinc/óxido de magnesio de mineralogía y microestructura controlada con
aplicación en biomedicina como sustituto y regenerador óseo.
i
Índice
Capítulo I. Introducción ............................................................................................... 1
I.1. CONCEPTO DE BIOMATERIAL. .................................................... 3
I.2. BIOMATERIALES EMPLEADOS EN LA REPARACIÓN Y REGENERACIÓN DEL TEJIDO ÓSEO. ..................................................... 5
I.3. CLASIFICACIÓN DE LOS BIOMATERIALES.................................... 6
I.3.1. Metálicos. ................................................................................................... 6
I.3.2. Poliméricos. ............................................................................................... 7
I.3.3. Cerámicos. ................................................................................................. 8
I.3.3.1. Cerámicas bioinertes. .......................................................................... 9
I.3.3.2. Cerámicas bioactivas. ........................................................................ 10
I.3.3.3. Cerámicas reabsorbibles. .................................................................. 10
I.3.4. Materiales Compuestos. ..................................................................... 11
I.4. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL TEJIDO ÓSEO .............. 12
I.4.1. Composición. .......................................................................................... 13
I.4.1.1. Componente inorgánico. ................................................................... 13
I.4.1.1. Componente orgánico. ...................................................................... 13
I.4.2. Estructura del tejido óseo. ................................................................. 14
I.4.2.1. Hueso compacto o cortical. ............................................................... 14
I.4.2.2. Hueso esponjoso o trabecular. .......................................................... 14
I.4.3. Propiedades mecánicas del tejido óseo. ........................................ 15
I.4.4. Remodelación ósea. .............................................................................. 16
I.5. BIOCERAMICAS BASADAS EN FOSFATOS CÁLCICOS ........... 17
I.5.1. Hidroxiapatita (HAp). ......................................................................... 21
I.5.2. Fosfato Tricálcico (TCP). ................................................................... 23
ii
I.5.3. Modificación del fosfato tricálcico (TCP). ................................... 29
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 32
Capítulo II. Propósito de la Presente Memoria ................................................ 45
CapítuloIII. Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización ....................................................................................................... 51
III.1. MATERIALES DE PARTIDA. ........................................................ 53
III.1.1. Carbonato cálcico (CaCO3). ............................................................. 53
III.1.2. Fosfato monobásico de amonio (NH4H2PO4). ............................. 54
III.1.3. Óxido de cinc (ZnO). ........................................................................... 55
III.1.4. Óxido de magnesio (MgO). ............................................................... 56
III.2. CONSIDERACIONES GENERALES. ............................................ 58
III.3. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL SEGUIDA PARA EL ESTUDIO DE LOS DIAGRAMAS DE EQUILIBRIO DE FASES. .......... 58
III.3.1. Diseño de composiciones. ................................................................... 58
III.3.2. Síntesis, conformado y sinterización de las composiciones. .. 58
III.3.3. Caracterización de las muestras sometidas al método de congelación del equilibrio “quenching”. ....................................................... 59
III.4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL SEGUIDA PARA LA OBTENCIÓN DE BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2
MODIFICADOS CON ZnO Y ZnO/MgO. ................................................. 60
III.4.1. Diseño de composiciones. ................................................................... 60
III.4.2. Preparación de los biomateriales. ................................................... 61
III.4.2.1. Síntesis de composiciones basadas en fosfato tricálcico por mezcla de óxidos . ............................................................................................................ 61
III.4.2.2. Conformado y sinterización de los biomateriales cerámicos. ....... 63
iii
III.4.2.2.1. Sinterización convencional......................................................... 64
III.4.2.2.2. Sinterización mediante corriente eléctrica pulsada (Spark Plasma Sintering). ................................................................................................... 64
III.4.3. Caracterización de los biomateriales. ............................................ 65
III.4.3.1. Caracterización química, física, estructural, microestructural y mecánica de los biomateriales. .............................................................................. 65
III.4.3.2. Estudios “in vitro” de los biomateriales. ......................................... 66
III.4.3.2.1. Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA). ...................................................................................................... 66
III.4.3.2.2. Ensayos de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” en un cultivo celular. ......................................................................................................... 68
III.4.3.2.2.1. Experimentos de inhibición de crecimiento celular empleando disoluciones concentradas de iones Zn2+ y Mg2+. ............................. 69
III.4.3.2.2.2. Experimentos de interacción directa material-célula....... 70
III.4.3.2.2.3. Experimentos de interacción indirecta material-célula. .. 71
III.5. TÉCNICAS EXPERIMETALES. ..................................................... 72
III.5.1. Análisis químico. ................................................................................... 72
III.5.1.1. Fluorescencia de Rayos X (FRX). .................................................... 72
III.5.1.2. Espectroscopía de Emisión Atómica con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-OES). .................................................................... 73
III.5.2. Densidad. ................................................................................................. 73
III.5.2.1. Picnometría de gas (He/Aire)............................................................ 73
III.5.2.2. Densidad aparente. ............................................................................ 74
III.5.2.3. Densidad real y densificación. .......................................................... 74
III.5.3. Tamaño de partícula. .......................................................................... 75
III.5.4. Superficie específica (Se). ................................................................... 75
III.5.5. Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG) ………… ................................................................................................................... 76
III.5.6. Dilatometría de Alta Temperatura (DAT). ................................. 77
III.5.7. Microscopía Óptica de Calefacción. ............................................... 78
iv
III.5.8. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR)... .................................................................................................................... 78
III.5.9. Difracción de Rayos X (DRX). ......................................................... 79
III.5.10. Espectroscopía Raman. ...................................................................... 82
III.5.11. Propiedades Mecánicas: Dureza (HV) y Módulo Elástico (E)…….. .................................................................................................................... 83
III.5.12. Perfilómetro. .......................................................................................... 84
III.5.13. Microscopía Óptica de Luz Reflejada (MOLR) y Transmitida (MOLT). ......................................................................................... 84
III.5.14. Microscopía Electrónica de Barrido con Emisión de Campo y microanálisis puntual por Dispersión de Energía de rayos X (MEB-EC y EDX). ................................................................................................ 85
III.5.15. Análisis de Imagen. .............................................................................. 86
III.5.16. Microscopía Confocal de Barrido Láser (MCBL). ................. 86
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 87
Capítulo IV. Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5 ........................................................................ 89
IV.1. INTRODUCCIÓN. ............................................................................ 91
IV.2. REVISION BIBLIOGRÁFICA. ....................................................... 91
IV.2.1. Sistema CaO-P2O5. ............................................................................... 92
IV.2.2. Sistema ZnO-P2O5. ............................................................................... 94
IV.2.3. Sistema MgO-P2O5. .............................................................................. 96
IV.2.4. Sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2. .......................................................... 97
IV.2.5. Sistema Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2. ......................................................... 98
IV.2.6. Sistema CaO-MgO-P2O5. ................................................................. 100
IV.2.7. Sistemas Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y MgO-ZnO-P2O5. ................ 101
IV.3. ESTUDIO DEL SISTEMA ZnO-CaO-P2O5. .................................. 103
v
IV.3.1. Relaciones de compatibilidad en estado sólido en el sistema ZnO-CaO-P2O5. .................................................................................................... 107
IV.3.1.1. Estudio de la zona rica en ZnO. ..................................................... 108
IV.3.1.2. Estudio de la zona rica en Ca3(PO4)2. ............................................ 110
IV.3.2. Revisión de los rangos de solución sólida en Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2. ............................................................................................................... 112
IV.3.2.1. Estudio de las soluciones sólidas en Zn3(PO4)2. ............................ 112
IV.3.2.2. Estudio de la soluciones sólidas en Ca3(PO4)2. .............................. 115
IV.4. ESTUDIO DEL SISTEMA MgO-ZnO-CaO-P2O5. ........................ 120
IV.4.1. Relaciones de compatibilidad en estado sólido en el sistema MgO-ZnO-CaO-P2O5. ........................................................................................ 120
IV.4.2. Rangos de estabilidad en estado sólido en función de la temperatura y de la composición de los polimorfos α y α+β del fosfato tricálcico en la zona rica en Ca3(PO4)2 del subsistema: Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2. ......................................................................................... 131
IV.4.2.1. Revisión del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2. ................................... 132
IV.4.2.2. Sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2. ..................................... 138
IV.4.2.3. Estudio de la incorporación de Zn2+ y Mg2+ en la fase β-Ca3(PO4)2 mediante espectroscopía Raman. ........................................................................ 144
IV.5. CONCLUSIONES PARCIALES. ................................................... 152
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 154
Capítulo V. Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO ..................................................................................................... 157
V.1. INTRODUCCIÓN. .......................................................................... 159
V.2. SÍNTESIS, SINTERIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO.. .......................................................................................................... 160
V.2.1. Síntesis de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO. .......................................................... 160
vi
V.2.1.1. Caracterización de los compuestos cerámicos en verde. ............. 160
V.2.1.1.1. Distribución de tamaño de partícula y superficie específica. 160
V.2.1.1.2. Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG),,,,,,,,,,,,,. ........................................................................................................... 161
V.2.1.2. Caracterización de los compuestos cerámicos sintetizados. ........ 164
V.2.1.2.1. Espectroscopía de Infrarrojo mediante transformada de Fourier (IR-TF). ................................................................................................... 164
V.2.1.2.2. Difracción de rayos X (DRX). ................................................. 165
V.2.1.2.3. Distribución de tamaño de partícula y superficie específica. 166
V.2.1.2.4. Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG)……….. ........................................................................................................... 167
V.2.2. Sinterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO. .......................................................... 169
V.2.3. Caracterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO. .......................................................... 169
V.2.3.1. Caracterización mineralógica. ....................................................... 170
V.2.3.1.1. Difracción de rayos X (DRX). ................................................. 170
V.2.3.2. Análisis de las transiciones de fase, densificación y microestructura. ................................................................................................... 173
V.2.3.2.1. Proceso de densificación y microestructura. .......................... 173
V.2.3.2.2. Transiciones de fase y su estudio mediante la distribución microestructural. .................................................................................................. 179
V.2.4. Estudios “in vitro” de los compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO en disoluciones acelulares. 180
V.2.4.1. Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA),,,,,,,,,,. ........................................................................................................... 180
V.2.4.1.1. Perfiles de liberación iónica. .................................................... 181
V.2.4.1.2. Caracterización de precipitados superficiales de Ca y P. ..... 186
V.2.4.1.2.1. Caracterización microestructural. .................................... 186
V.2.4.1.2.2. Espectroscopía Raman. ...................................................... 187
V.3. CONCLUSIONES PARCIALES DE LOS BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO... ........................ 190
vii
V.4. SÍNTESIS, SINTERIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO/MgO. .................................................................................................. 191
V.4.1. Síntesis de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO/MgO. ................................................ 191
V.4.1.1. Caracterización de los compuestos cerámicos en verde. .............. 192
V.4.1.2. Caracterización de los compuestos cerámicos calcinados............ 192
V.4.2. Sinterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO/MgO. ................................................ 195
V.4.3. Caracterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO/MgO. ................................................ 195
V.4.3.1. Caracterización mineralógica. ........................................................ 195
V.4.3.1.1. Difracción de rayos X (DRX). .................................................. 195
V.4.3.2. Densificación y caracterización microestructural. ....................... 197
V.4.4. Estudios “in vitro” de los compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO/MgO en disoluciones acelulares. ............................................................................................... 200
V.4.4.1. Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA)……... ........................................................................................................... 200
V.4.4.1.1. Perfiles de liberación iónica. .................................................... 200
V.4.4.1.2. Caracterización de precipitados superficiales de Ca y P. ..... 202
V.4.4.1.2.1. Caracterización microestructural. .................................... 202
V.5. CONCLUSIONES PARCIALES DE LOS BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO/MgO. ................ 204
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 205
viii
Capítulo VI. Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos ......................... 207
VI.1. INTRODUCCIÓN. .......................................................................... 209
VI.2. EXPERIMENTOS DE INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO CELULAR EMPLEANDO DISOLUCIONES CONCENTRADAS DE ZnCl2 Y MgCl2. .......................................................................................... 210
VI.3. EXPERIMENTOS DE INTERACCIÓN DIRECTA MATERIAL-CÉLULA. ................................................................................................... 215
VI.3.1. Compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO. ........................................................................... 217
VI.3.1.1. Análisis cualitativo de la adhesión, morfología y distribución celular,,,,,,,,,. .......................................................................................................... 217
VI.3.1.2. Análisis cuantitativo de la viabilidad celular. ............................... 218
VI.3.2. Compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO/MgO. ................................................................. 220
VI.3.2.1. Análisis cualitativo de la adhesión, morfología y distribución celular,,,,,,,,,. .......................................................................................................... 220
VI.3.2.2. Análisis cuantitativo de la viabilidad y proliferación. ................. 222
VI.4. EXPERIMENTOS DE INTERACCIÓN INDIRECTA MATERIAL-CÉLULA. ................................................................................................... 223
VI.5. CONCLUSIONES PARCIALES. ................................................... 227
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 228
Capítulo VII. Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering ............................................ 231
VII.1. INTRODUCCIÓN. .......................................................................... 233
VII.2. SINTERIZACIÓN MEDIANTE CORRIENTE ELÉCTRICA PULSADA “SPARK PLASMA SINTERING”. ....................................... 234
VII.2.1. Montaje experimental. ........................................................... 234
VII.2.2. Procedimiento experimental. ................................................. 235
ix
VII.2.3. Estudio de los procesos de sinterización. .............................. 237
VII.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS BIOMATERIALES OBTENIDOS MEDIANTE “SPARK PLASMA SINTERING”. ..................................... 239
VII.3.1. Caracterización Mineralógica y Microestructural. ............. 239
VII.4.1. Caracterización Mecánica. .................................................... 241
VII.4.1.1. Fundamento teórico. ........................................................................ 241
VII.4.1.2. Módulo de Elasticidad y Dureza Vickers. ..................................... 242
VII.4. CONCLUSIONES PARCIALES. ................................................... 243
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 244
Capítulo VIII. Conclusiones Generales ............................................... 245
Abreviaturas
Abreviaturas
Con el objeto de simplificar la escritura y la representación de las fórmulas
químicas y de los compuestos, en la presente memoria se ha empleado indistintamente
tanto en el texto como en las figuras, tablas y diagramas de equilibrio de fases, la
nomenclatura extendida y la reducida, que consiste en representar cada óxido por la letra,
cuando forma parte de un compuesto. Así, por ejemplo:
CaO=C, P2O5=P, ZnO=Z, MgO=M
Escribiendo los compuestos de la forma siguiente:
Ca3(PO4)2=3CaO P2O5=C3P
Zn3(PO4)2=3ZnO P2O5=Z3P
Mg3(PO4)2=3MgO P2O5=M3P
Cuando alguno de los compuestos presenta soluciones sólidas se indica en el texto
de la siguiente forma:
Ca3(PO4)2ss=3CaO P2O5 (solución sólida)=C3Pss
Zn3(PO4)2ss=3ZnO P2O5 (solución sólida)=Z3Pss
Mg3(PO4)2ss=3MgO P2O5 (solución sólida)=M3Pss
La fase vítrea o líquido a la temperatura de ensayo, se ha representado en el texto
como L=Líq o Líquido.
Igualmente, se han empleado en ocasiones acrónimos para designar a algunas
técnicas de experimentales de caracterización, sustituyendo el nombre completo por sus
iniciales en castellano, a modo de ejemplo:
Difracción de rayos X=DRX
Microscopia electrónica de Barrido de emisión de campo=MEB-EC
Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG)
Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR)
Capítulo I
Introducción
3
Introducción
I. Introducción
I.1 CONCEPTO DE BIOMATERIAL
En la primera Conferencia de la Sociedad Europea de Biomateriales (ESB)
celebrada en Chester en 1987, se definió por consenso un biomaterial como [1]:
“Un material no vivo empleado en un dispositivo médico y concebido para interaccionar
con sistemas biológicos.”
Los biomateriales según esa definición, eran esencialmente materiales industriales
seleccionados con el criterio de que fueran capaces de cumplir ciertos requisitos de
aceptabilidad biológica [2].
Sin embargo, fue en el año 1991 cuando se propone la definición vigente de la
ESB [3]:
"Un material diseñado para actuar interfacialmente con sistemas biológicos con el fin de
evaluar, tratar, mejorar o reemplazar algún tejido, órgano o función del cuerpo".
Actualmente son muchos los biomateriales que dependiendo de la función a realizar
o del tejido que se deba reemplazar son diseñados, sintetizados, procesados y preparados
con el único fin de poseer esa aplicación específica en el campo de la medicina. En este
sentido su principal diferencia respecto a otros tipos de materiales, es su capacidad para
permanecer en un entorno biológico sin perjudicarlo y sin sufrir un deterioro nocivo
durante su uso.
La definición más reciente de biomaterial propuesta por Williams [4] en 2009,
refleja este hecho al proponer la siguiente definición:
"Un Biomaterial es aquella sustancia que se ha diseñado, para adquirir una forma, que
por sí misma o como parte de un sistema complejo, es empleada para dirigir, mediante el
control de las interacciones con los componentes de los sistemas vivos, el curso de
cualquier procedimiento diagnóstico o terapéutico, en medicina o en veterinaria.”
4
Capítulo I
La obtención y disponibilidad de materiales avanzados de diferente naturaleza es
una de las causas del notable impulso experimentado por la Ciencia de Biomateriales en las
últimas décadas [5]. La continua evolución y el desarrollo de nuevas generaciones de
implantes ha permitido reemplazar tanto tejidos duros como blandos, ampliando el campo
de aplicación a procedimientos terapéuticos y de diagnóstico, tanto en medicina como en
veterinaria.
El enorme abanico de posibilidades que ofrece el campo de los biomateriales a día
de hoy se refleja en su capacidad de cumplir satisfactoriamente los requerimientos de sus
potenciales aplicaciones [6]. En esta dirección todo biomaterial debe ser biocompatible
tanto química como mecánica y medicamente, no producir toxicidad, ni reacciones
alérgicas o efectos adversos, una vez implantado en el organismo [2].
Por todo esto, la obtención de un biomaterial adecuado para su implante no debe
contemplar únicamente una composición apropiada de partida, sino también considerar los
posibles elementos liberados por el mismo, como consecuencia de su interacción con el
biosistema. Como la toxicidad de cualquier sustancia en el organismo humano es función
de la concentración en la que se encuentre, la composición del biomaterial debe considerar
y no obviar todos los elementos que puedan alterar la bioquímica del ser humano.
La vida útil de un biomaterial es un factor decisivo a la hora de su evaluación, ya
que debe permanecer en contacto con los tejidos vivos, manteniendo sus prestaciones en el
tiempo. Este tiempo será diferente según sea la función a la que esté destinado, por lo que
las características que ha de satisfacer un biomaterial dependen de si su utilización es
provisional o definitiva. Finalmente, debe añadirse que su procesamiento sea sencillo, su
fabricación reproducible y su coste competitivo, para conseguir su producción y uso a gran
escala.
La evolución de los biomateriales ha estado marcada por todos estos
requerimientos, así entre 1960 y 1980 se demandaron fundamentalmente materiales inertes,
con propiedades físicas similares al tejido receptor con el fin de reemplazar la parte o pieza
dañada, y con una mínima o nula reacción sobre el tejido huésped. Estos materiales
basados fundamentalmente en alúmina y circona constituyeron la primera generación de
biomateriales. Durante la década de los 80 se optó por utilizar materiales capaces de
provocar una reacción tisular controlada. Tal era el caso de los vidrios de base fósforo y
5
Introducción
silicio, la hidroxiapatita y los fosfatos cálcicos, denominados materiales bioactivos y
bioreabsorbibles porque inducen la regeneración ósea. Estos materiales constituyen la
segunda generación de biomateriales. Hoy en día podemos hablar de biomateriales de
tercera generación, diseñados con la finalidad de promover una interacción específica con
el tejido a nivel celular y molecular, combinando el diseño estructural y morfológico con
sus propiedades, fundamentalmente biodegradación y bioactividad. Los materiales basados
en fosfato tricálcico son los materiales de referencia en este tipo de comportamiento.
I.2 BIOMATERIALES EMPLEADOS EN LA REPARACIÓN Y
REGENERACIÓN DEL TEJIDO ÓSEO
El empleo de los biomateriales como sustitutivos óseos, a fin de mantener y mejorar
la calidad de vida en una sociedad cada vez más longeva, donde el crecimiento anual de la
población de edad superior a 65 años crece a una tasa anual del 2-3%, puede considerarse
un éxito de las políticas de salud pública y del desarrollo socioeconómico [7]. Sin
embargo, el deterioro paulatino de las propiedades de los tejidos y sus funciones asociadas,
relacionadas o no con el envejecimiento, hace necesario el desarrollo y diseño de
materiales especiales destinados a reparar o reemplazar dichos tejidos.
Hoy en día, las enfermedades relacionadas con el sistema músculo esquelético
representan una de las causas más comunes de incapacidad física afectando a cientos de
millones de personas en el mundo. La actuación en este campo, reviste de una gran
demanda, debido al elevado número de traumatismos ósteoarticulares y fracturas óseas,
que se producen por accidentes, en la práctica deportiva o por diferentes tipos de
patologías óseas, que afectan a la desmineralización del hueso como la osteoporosis y los
tumores óseos.
La naturaleza multidisciplinar de esta biotecnología, que obliga a complementar los
conocimientos provenientes de áreas muy diferentes como la ciencia e ingeniería de
materiales, la biología y la medicina, ha permitido la obtención de nuevos biomateriales,
partiendo de la identificación de la necesidad de un determinado material hasta su
desarrollo, fabricación, implementación o remoción en la etapa de investigación clínica [8].
6
Capítulo I
Finalmente reseñar que los implantes óseos con un coste de 15 billones de dólares,
representaron aproximadamente unas 408.000 intervenciones en Europa, 605.000 en USA
y 617.000 en el Reino Unido [9,10] y que aproximadamente un 10% fueron implantes de
cadera. El aumento de la demanda de biomateriales con aplicaciones ortopédicas
asociados al incremento de la vida media de la población y de sus expectativas de mayor
calidad de vida está siendo acompañada de los notables avances que ha experimentado el
desarrollo de los biomateriales y las técnicas quirúrgicas, como la cirugía mínimamente
invasiva, lo que está permitiendo nuevos desarrollos y aplicaciones.
I.3 CLASIFICACIÓN DE LOS BIOMATERIALES
En función de sus características físico-químicas, los biomateriales sintéticos que se
pueden emplear como sustitutivos óseos son: metálicos, poliméricos, cerámicos y
compuestos.
La importancia relativa de cada uno de los materiales puede ser analizada a la luz
de los trabajos presentados en el 9th World Biomaterials Congress celebrado en China en
Junio del 2012. Entre ellos los trabajos que centraron su estudio en el diseño, síntesis y
obtención de los biomateriales fueron aproximadamente el 53 %. De estos, los materiales
poliméricos representaron casi la mitad, destacando los dedicados a los hidrogeles y
polímeros bioreabsorbibles. Los trabajos sobre metales y aleaciones, sector maduro y con
el desarrollo de sus aplicaciones en estado muy avanzado, representaron el 15 %. El resto
de los trabajos (alrededor del 30%) correspondió a estudios de cerámicas y vidrios,
centrados fundamentalmente en fosfatos cálcicos, biovidrios y otras cerámicas bioactivas o
inertes.
I.3.1 Metálicos
Los biomateriales metálicos son los más adecuados para aplicaciones estructurales,
donde se deben soportar elevadas cargas, puesto que poseen unas excelentes propiedades
mecánicas, destacando su elevada resistencia y tenacidad.
El principal requisito que tiene que cumplir un biometal implantable es que sea
tolerado por el organismo. También es imprescindible que presente una elevada resistencia
a la corrosión, en especial en un medio tan hostil como es el fisiológico. Por este motivo,
7
Introducción
muchos de los metales empleados se inducen o se recubren con una capa fina y delgada de
óxido biocompatible, denominada capa de pasivación, que al adherirse firmemente al
sustrato metálico, evita su posible oxidación y por tanto el debilitamiento del implante.
El efecto de la fricción entre la superficie del material y el tejido óseo, es otro factor
a tener en consideración, pues provoca el desgaste paulatino del implante. Por ello, la
acción sinérgica corrosión-desgaste-carga, puede conllevar al desprendimiento de la capa
de pasivación y posterior liberación de los consiguientes productos de corrosión al medio,
ocasionando efectos muy diversos, en la mayoría de los casos adversos.
Otro problema, de índole mecánico, que afecta a la superficie articulante del
implante, es la diferencia entre el modulo de Young del implante metálico y el hueso. La
modificación superficial del implante con otro biomaterial mecánicamente más compatible
con el hueso, es un recurso muy empleado a día de hoy, ya que la elevada rigidez del
biometal puede ocasionar el movimiento relativo entre el implante y el hueso con el
ulterior aflojamiento del mismo.
En la actualidad se emplean como implantes metálicos, en diferentes aplicaciones,
aceros inoxidables, aleaciones de cobalto y el titanio puro o en aleación, siendo las
aplicaciones más relevantes las prótesis articulares, las placas de osteosíntesis, tornillos/
clavos de fijación e implantes dentales [2,5,11,12].
I.3.2 Poliméricos
El empleo de componentes poliméricos en dispositivos médicos, abarcan
prácticamente todas las áreas de aplicación del cuerpo humano y deben su éxito a la amplia
gama de formulaciones posibles así como a la versatilidad de su diseño, dada la sencillez
de procesamiento y conformado. Se pueden emplear polímeros naturales como;
polisacáridos, polipéptidos y proteínas, y polímeros sintéticos como; teflón, polietileno,
polipropileno, entre otros.
Asimismo, en función de la acción a desempeñar y el tiempo de vida útil, existen
dos grandes grupos de biopolímeros: los polímeros bioestables, si en última instancia lo
que se pretende es sustituir parcial o totalmente la zona dañada y los polímeros
biodegradables, en el caso de que deban permanecer únicamente un tiempo específico en el
8
Capítulo I
organismo. El campo de aplicación de los biopolímeros, al igual que en el caso de
cualquier otro tipo de biomaterial, estará condicionado fundamentalmente por sus
propiedades mecánicas, térmicas y químicas y aunque presentan algunos inconvenientes, el
empleo de los biomateriales poliméricos como cementos en cirugía ortopédica y
odontológica, implantes biodegradables, andamiajes, membranas y barreras temporales en
ingeniería tisular y en sistemas de liberación controlada de fármacos, es hoy en día
prácticamente insustituible [13–16].
I.3.3 Cerámicos
Los problemas detectados en los implantes de tipo metálico y polimérico, hizo que
a finales de los años sesenta se planteara el uso de los materiales cerámicos en aplicaciones
biomédicas, con el objetivo de mejorar la biocompatibilidad y la osteointegración de los
mismos.
Las biocerámicas empleadas para la reparación y regeneración del tejido óseo,
constituidas por compuestos inorgánicos no metálicos y obtenidas o consolidadas a través
de tratamientos térmicos a alta temperatura, pueden ser cristalinas, amorfas (vidrios) y
amorfas con núcleos de cristalización (vitrocerámicas). El empleo de las biocerámicas en
aplicaciones estructurales que deban soportar elevadas cargas, está limitado por su
fragilidad y su limitada resistencia mecánica. Por este motivo, su uso se encuentra
restringido a aquellas zonas del organismo que no requieran de elevadas prestaciones
mecánicas. Tal es el caso de su aplicación en cirugía del oído medio, en el relleno de
defectos óseos en cirugía bucal u ortopédica y como recubrimiento en implantes dentales y
prótesis metálicas. Finalmente, una de las razones fundamentales por las cuales se emplean
las biocerámicas es por la ausencia de toxicidad.
La continua evolución en este campo de investigación ha permitido el desarrollo de
biocerámicas avanzadas con propiedades muy mejoradas, con una excelente resistencia
química, alta resistencia mecánica a compresión y al desgaste [17,18], lo que ha permitido
extender considerablemente las expectativas de aplicación y su éxito clínico.
Las primeras biocerámicas seleccionadas fueron aquellas que permitían reemplazar
partes del esqueleto deterioradas y la razón fundamental de su utilización fue su baja
reactividad. El aspecto fundamental a considerar en este punto es seleccionar un
9
Introducción
biomaterial cerámico con mínima o nula reactividad que evite reacciones tóxicas que
induzcan muerte celular en el entorno del implante como consecuencia de la migración a
los fluidos corporales de productos de degradación liberados por el material.
Posteriormente este planteamiento fue ampliándose pasando a seleccionar
cerámicas, vidrios y vitrocerámicas capaces de inducir una cierta actividad química en el
organismo, de forma que no solo sustituyeran la zona dañada sino que a su vez estimularan
la regeneración de la misma.
Los materiales cerámicos disponibles se pueden clasificar según sus características
de comportamiento en: bioinertes, bioactivos y reabsorbibles.
I.3.3.1 Cerámicas bioinertes
Las primeras biocerámicas biológicamente inactivas, prácticamente inertes, que no
reaccionan apreciablemente con el medio una vez implantadas, fueron la alúmina (Al2O3) y
la circona (ZrO2). En presencia de un implante de este tipo, los tejidos reaccionan dando
lugar a la formación de una membrana fibrosa muy fina del orden de micras, que rodea y
aísla el implante. Esta es quizás la respuesta más frecuente que presentan la mayor parte de
los biomateriales implantables, no sólo cerámicos, sino también metálicos y poliméricos.
Se trata de un mecanismo de protección que con el tiempo podría dar lugar a la completa
encapsulación del implante en el seno de este tejido.
La fuerte unión física que se produce entre el implante y el tejido, junto con el
desacuerdo a nivel mecánico cerámica-hueso, provoca un fuerte desajuste elástico en la
interfase con el hueso. Esto genera un distribución asimétrica de cargas entre ambos, donde
el implante soporta la mayor parte de los esfuerzos. Este hecho impide que el hueso
desarrolle su función mecánica habitual llevando a su debilitamiento y atrofia causando en
última, instancia su fractura. Los implantes cerámicos empleados habitualmente como
componentes en prótesis de unión total y en implantes dentales, están basados en
materiales monofásicos de alúmina o circona. Para mejorar la fiabilidad de estos implantes
cerámicos y adaptar sus propiedades a las del biosistema, las investigaciones se están
dirigiendo hacia el empleo de materiales cerámicos compuestos (polifásicos), de
composición y microestructura controlada [5,19].
10
Capítulo I
I.3.3.2 Cerámicas bioactivas
Son aquellas que una vez implantadas en el medio fisiológico, son capaces de
generar una interacción química a modo de unión, entre la superficie del implante y el
tejido vivo circundante. La capacidad que poseen este tipo de biocerámicas de estimular
reacciones químicas en la interfase tejido-implante, permite la formación de una capa de
nuevo material, que sella la interfase e impide el movimiento interfacial que se ocasiona al
emplear cerámicas bioinertes.
Las biocerámicas que presentan este tipo de comportamiento osteoinductivo,
uniéndose al hueso directamente o a través de la formación de una capa de
carbohidroxiapatita (CHA) sobre su superficie, se denominan cerámicas bioactivas. La
hidroxiapatita (HAp), los biovidrios como el Bioglass® del sistema Na2O-CaO-P2O5-SiO2
y sus derivados con adiciones de B2O3 y CaF2 [20–22] y las vitrocerámicas basadas en
apatita-wollastonita (A-W) [23], son los ejemplos más típicos.
La fijación bioactiva que proporcionan este tipo de implantes amplía el campo de
aplicación a la ortopedia, la odontología y la cirugía reconstructiva, con formas y
características muy variadas, tales como implantes densos, porosos, sistemas particulados y
recubrimientos, entre otros. El requerimiento esencial exigible a las cerámicas bioactivas
es un control riguroso de su reactividad química en el sistema fisiológico, puesto que la
interfase bioactiva se modifica con el tiempo.
I.3.3.3 Cerámicas reabsorbibles
Las cerámicas reabsorbibles son aquellas en las que la evolución con el tiempo de
la interfase bioactiva permite de forma suficientemente rápida, que el material se disuelva
o reabsorba, siendo reemplazado gradualmente por nuevo tejido óseo. Este es el caso de las
cerámicas biodegradables o reabsorbibles, destacando fundamentalmente el fosfato
tricálcico, Ca3(PO4)2 (C3P o TCP). Así, las cerámicas reabsorbibles deben poseer una
composición química que pueda ser degradada o metabolizada fácilmente por los fluidos
corporales y las células óseas, interactuando activamente con el biosistema durante el
proceso de reabsorción. Las cerámicas reabsorbibles basadas en TCP presentan una serie
de problemas asociados fundamentalmente a la dificultad de ajustar las velocidades de
reabsorción con las de sustitución por el nuevo tejido formado [24]. Sin embargo, pese a
11
Introducción
este inconveniente se pueden considerar hoy en día como las más cercanas a las “ideales”,
ya que permanecerían en el organismo únicamente el tiempo necesario y requerido para
cumplir su función, desapareciendo gradualmente a medida que se va regenerando el
nuevo tejido. Este es el principal motivo por lo que en este trabajo nos centraremos en el
diseño de este tipo de biocerámicas capaces de interactuar con el tejido de acogida.
I.3.4 Materiales Compuestos
Todos los biomateriales previamente mencionados se pueden emplear a su vez de
manera combinada, obteniendo implantes con propiedades mejoradas respecto de los
materiales individuales de partida. La fijación bioactiva que proporcionan los
recubrimientos cerámicos en implantes metálicos, aporta una mayor biocompatibilidad e
osteointegración a la vez que se mantienen las altas prestaciones mecánicas inherentes a
los materiales metálicos. Este es el ejemplo actual más extendido y aplicado de biomaterial
compuesto [25–34].
En otra dirección, la asociación de partículas cerámicas dispersadas en matrices
poliméricas y la elaboración de materiales compuestos cerámica-polímero, se están
desarrollando en un intento de reproducir las propiedades físico-químicas del hueso
humano. Este tipo de materiales compuestos proporcionan la estabilidad y el refuerzo
estructural necesario, dotando al mismo tiempo al componente implantable de una mejor
respuesta bioactiva en el entorno fisiológico, incrementando su biocompatibilidad y
osteoconductividad [35–42]. Algunos ejemplos de biomateriales compuestos bioactivos
incluyen vitrocerámicos de Apatita-Wollastonita, y de Apatita-Wollastonita reforzada con
circona, Bioglass® reforzado con fibras de acero inoxidable o titanio, polietileno reforzado
con partículas de fosfato cálcico, y cementos óseos reforzados con fibras y partículas de
fosfato cálcico. Dentro de la categoría de biomateriales compuestos bioreabsorbibles cabe
destacar los polímeros basados en acido poliláctico reforzado con fibras de fosfato cálcico
[43].
12
Capítulo I
I.4 CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL TEJIDO ÓSEO
Antes de profundizar en el estudio de los biomateriales basados en fosfatos cálcicos
para su aplicación en la regeneración y reparación del tejido óseo, se considera conveniente
exponer las principales características de este tipo de tejido.
El componente primario del hueso es el tejido óseo. Se trata de un tejido conjuntivo
especializado, compuesto por células, tejido cartilaginoso y sustancia intercelular
mineralizada. Sirve de soporte de las partes blandas protegiendo a los órganos vitales.
Asimismo, proporciona apoyo a los músculos del esqueleto transformando sus
contracciones en movimientos útiles.
El tejido óseo presenta como propiedades físicas, una alta resistencia a la tracción y
compresión, cierta elasticidad y flexibilidad, además de bajo peso. Aunque está
fundamentalmente compuesto por una matriz acelular, es uno de los sistemas más
dinámicos del organismo. Por un lado está encargado del crecimiento y mantenimiento de
la integridad de los huesos durante todas las etapas del desarrollo del cuerpo humano,
salvaguardando su forma y consistencia, posibilitando su regeneración en caso de fractura
[44]. Por otro lado, contribuye al almacenamiento de los elementos esenciales
constituyentes del mismo como son el calcio y el fósforo.
Los dientes, por otro lado, presentan características similares al hueso excepto en su
capa superficial externa, denominada esmalte. El esmalte dental tiene un contenido
inorgánico mucho mayor que el del hueso, hasta un 90 %, y está formado por cristales
prismáticos, de mayores dimensiones, muy orientados. Las diferencias en cristalinidad y
composición entre el hueso y la dentina, tejido intermedio que protege al esmalte, quedan
patentes, justificando su distinto comportamiento mecánico. El esmalte se considera el
material más duro y resistente del mundo biológico. Sin embargo, a diferencia del hueso, el
esmalte dental de un individuo adulto no contiene células por lo que no es capaz de
regenerarse y cualquier deterioro que sufra resulta irreversible [44].
13
Introducción
I.4.1 Composición
El hueso está compuesto por una matriz ósea que es la responsable de las
propiedades biomecánicas del tejido óseo. La matriz ósea está constituida
fundamentalmente por un componente inorgánico (alrededor del 70 % en peso), un
componente orgánico (25 % en peso) y agua.
I.4.1.1 Componente inorgánico
Está compuesto fundamentalmente por fosfato cálcico de baja cristalinidad, en
forma de pequeños cristales similares a la hidroxiapatita mineral, de 1.5-5 nm de espesor,
20 nm de anchura y 40-60 nm de longitud [45]. Los cristales de hidroxiapatita, orientados
paralelamente a las fibras de colágeno, actúan reforzando la matriz ósea, ya que son
nucleados en cavidades regularmente espaciadas entre estas moléculas, a través de un
proceso de biomineralización en el que están involucradas más de 200 proteínas [44]. La
hidroxiapatita de los huesos, o apatita carbonatada, no es estequiométrica, ya que contiene
una serie de impurezas como iones carbonato (CO32-), y silicato SiO4
2- sustituyendo a los
grupos fosfato y a los iones fluoruro (F-), cloruro (Cl-), sustituyendo a los grupos hidroxilo.
A nivel minoritario y de trazas presenta sustituciones de los iones Ca2+ por iones Na+, K+,
Mg2+ y Zn2+, Sr2+, Pb2+, Ba2+, respectivamente, alterando en cierta medida las propiedades
físico-químicas de los cristales, en particular su solubilidad dependiente de la relación
Ca/P.
I.4.1.2 Componente orgánico
En su mayor parte está conformado por colágeno de tipo I. Estas moléculas
proteicas forman fibras de ~20-40 nm de diámetro y 300 µm de longitud. Las moléculas de
colágeno se encuentran enlazadas, formando cadenas lineales dispuestas en fibras,
íntimamente entremezcladas con la fase mineral, y rodeadas por la sustancia fundamental,
que sirve como soporte para distintas funciones celulares. El componente orgánico aporta
flexibilidad y tenacidad al hueso.
14
Capítulo I
I.4.2 Estructura del tejido óseo
Los huesos se pueden clasificar según su forma en cortos, largos, planos e
irregulares. Además, el tejido óseo se clasifica según el grado de madurez en fibrilar y
laminar. El hueso fibrilar se considera hueso inmaduro y se encuentra en los recién nacidos
y en los cayos que se forman durante el período de soldadura tras una fractura. El hueso
laminar se encuentra en el tejido óseo ya maduro. De acuerdo con su organización a nivel
macroscópico se reconocen asimismo zonas estructurales con diferente densidad y
disposición de tejido óseo, el compacto o cortical y el esponjoso o trabecular, figura I.1.
I.4.2.1 Hueso compacto o cortical
Rodea el perímetro del hueso constituyendo ~80 % del volumen total. Las unidades
funcionales estructurales del hueso compacto son las osteonas. Cada osteona se compone
de capas concéntricas, o láminas de tejido óseo mineralizado, en cuyo interior se ubican las
lagunas con los osteocitos. Desde cada una, se irradian canalículos ramificados que las
comunican y permiten la nutrición de los osteocitos. Todo este entramado se encuentra
dispuesto alrededor de un canal central, el canal de Havers que contiene los nervios del
hueso y los vasos sanguíneos que se disponen paralelos al eje longitudinal del hueso. Los
conductos de Volkmann, aunque dispuestos de forma transversal, tienen el mismo
diámetro que los canales de Harvers, y permiten la circulación sanguínea en sentido radial.
I.4.2.2 Hueso esponjoso o trabecular
El hueso esponjoso es menos denso que el hueso compacto, con una porosidad
interconectada entre un 50-90 %, lo que representa alrededor del 20 % en volumen total del
hueso y no contiene osteonas. En este caso las láminas de tejido óseo mineralizado están
dispuestas de manera irregular formando placas denominadas trabéculas, orientadas de
manera paralela a las líneas de fuerza. Estas placas forman una estructura esponjosa
formando cavidades irregulares en cuyo interior se encuentran los osteocitos y la médula
ósea. En este caso los canalículos se encargan de conectar las cavidades adyacentes, en
lugar de los canales de Harvers, por lo que los vasos sanguíneos penetran directamente en
el hueso esponjoso y permiten el intercambio de nutrientes con los osteocitos.
15
Introducción
Figura I.1 Anatomía y fisiología del hueso humano.
I.4.3 Propiedades mecánicas del tejido óseo
El sistema esquelético confiere al cuerpo humano una estructura que por un lado es
rígida, lo que le permite mantener su forma, y por otro está articulada, facilitando los
movimientos. Asimismo sirve de anclaje al sistema muscular permitiendo que este realice
su función. Las propiedades mecánicas del tejido óseo son poco usuales, pues es capaz de
soportar su propio peso y resistir fuerzas puntualmente elevadas. La rigidez, resistencia y
dureza están relacionadas con su contenido mineral y están principalmente condicionadas
por su porosidad, que dependerá en el caso del hueso compacto de los canales de Harvers y
Volkman, mientras que en el hueso esponjoso, de los espacios intertrabeculares.
Mientras que el hueso compacto debe soportar fuerzas de compresión, tracción y
cizalladura, el hueso esponjoso trabaja fundamentalmente a compresión [46]. Teniendo en
cuenta la fuerte anisotropía de la microestructura del hueso compacto, tanto la resistencia
mecánica como el modulo elástico, dependerán de la dirección de aplicación de la carga.
Canal de HaversOsteocito
Osteóna
Osteona
Periostio
Canal de HaversVasos Sanguíneos Canal de Volkman
Cavidades Vasculares
Trabéculas
HUESO ESPONJOSO
HUESO COMPACTO
16
Capítulo I
En este sentido, presentan mejores propiedades mecánicas a lo largo de su eje longitudinal
que a lo largo del transversal. En el caso del hueso esponjoso las propiedades mecánicas
dependerán por un lado de su densidad aparente. La densidad del hueso compacto es de
~1.8 g/cm3 frente a la del hueso poroso que oscila entre 0.1-1.0 g/cm3, mientras que las
trabéculas del hueso esponjoso tienen una densidad que varía en torno a 1.6-1.9 g/cm3. Las
propiedades del hueso esponjoso también dependerán de otros factores como la disposición
de las trabéculas individuales, la edad del individuo y la aplicación de la carga, entre otros.
En este sentido únicamente se podrán aportar valores medios de su resistencia mecánica y
del módulo elástico.
El modulo de Young, la resistencia a la tracción y a la compresión tanto en la
dirección longitudinal como transversal del hueso compacto, así como los valores medios
de la resistencia mecánica y el módulo elástico del hueso esponjoso, se resumen en la tabla
I.1.
Tabla I.1 Propiedades mecánicas del hueso compacto y esponjoso [47–51].
Características mecánicas Hueso Compacto Hueso Esponjoso
Longitudinal Transversal Promedio
Resistencia a tracción (MPa) 79-151 51-66 -
Resistencia a compresión (MPa) 131-224 106-131 -
Módulo de elasticidad (GPa) 17-20 6-13 0.05-0.1
Resistencia mecánica (MPa) - - 5-10
I.4.4 Remodelación ósea
El proceso de formación del hueso se inicia por la acción de los osteoblastos,
células especiales que sintetizan y segregan la matriz de colágeno en forma de una
sustancia gelatinosa, osteoide, que posteriormente se mineraliza por precipitación
controlada de fosfato cálcico. Los osteoblastos quedan atrapados en el interior de la fase
mineral evolucionando a osteocitos, que mantienen de forma constante la acción formadora
de hueso. Por otra parte, otro tipo de células los osteoclastos, catabolizan el hueso
17
Introducción
destruyéndolo. Este proceso dinámico de formación y destrucción del hueso permite su
crecimiento durante la época de desarrollo del organismo, manteniendo su forma y
consistencia regenerándolo cuando se produce una fractura [44]. Asimismo, este
mecanismo contribuye al almacenamiento y trasporte de elementos esenciales, como son el
calcio y el fosforo, constituyentes fundamentales del hueso humano.
I.5 BIOCERAMICAS BASADAS EN FOSFATOS CÁLCICOS
Las biocerámicas basadas en fosfatos cálcicos se empezaron a emplear en el campo
de la medicina ya en 1890 con la intención de estimular la restauración ósea. Sin embargo,
no fue hasta 1920 cuando Albee et al. [52] obtuvieron resultados favorables en los que se
demostraba la capacidad osteoconductiva de un fosfato cálcico en particular, el fosfato
tricálcico (C3P o TCP). Aun así, el verdadero impulso de los materiales basados en fosfatos
cálcicos tuvo lugar más adelante, en los años setenta y ochenta, cuando se descubrió la
capacidad de guiar la formación de nuevo hueso a partir de la unión superficial directa
material-hueso, en uno de los fosfatos cálcicos por excelencia, la hidroxiapatita y en un
vidrio que contiene Ca y P en su composición, al que se denominó Bioglass® [53–58].
Las biocerámicas basadas en fosfatos cálcicos con aplicaciones clínicas
constituyeron desde ese momento, un campo muy interesante de investigación para el
desarrollo y producción de implantes biocerámicos, empleándose en la actualidad en
prácticamente todas las áreas del sistema esquelético como la fusión espinal,
reconstrucción maxilofacial, tratamiento de defectos y fracturas en el hueso, prótesis de
cadera y en cirugía de revisión [59]. Sin embargo, de todos los fosfatos cálcicos
englobados en el sistema ternario CaO-P2O5-H2O [60], figura I.2, sólo algunos pueden ser
empleados como materiales de sustitución ósea, siendo los factores limitantes la
solubilidad y acidez en los fluidos corporales.
18
Capítulo I
Figura I.2 Diagrama de equilibrio de fases del sistema CaO-P2O5-H2O en condiciones de
presión parcial de vapor de agua 500 mm Hg (~66 kPa) según Riboud [60].
Existe una familia de fosfatos cálcicos cuya composición y características físico-
químicas dependen de la proporción de iones Ca y P en su estructura y que generalmente
son candidatos para su uso como biomateriales. Estos son los ortofosfatos de calcio, es
decir, aquellos compuestos que contienen grupos PO43-. En la tabla I.2, se recogen las
principales formulaciones de ortofosfatos de calcio. Dependiendo del método de
preparación estos compuestos se pueden clasificar en fosfatos cálcicos de baja temperatura,
obtenidos por vía química mediante solución-precipitación y en fosfatos cálcicos de alta
temperatura, preparados a partir de tratamientos térmicos a temperaturas elevadas
temperaturas. Todos ellos son potencialmente aplicables, por presentar una elevada
biocompatibilidad, que se debe fundamentalmente a que su composición es muy similar a
la del componente mineral del hueso. Presentan además propiedades biológicas adaptadas
a su aplicación cuando se requiere el empleo de un material bioactivo o bioreabsorbible
[61].
19
Introducción
Tabla I.2 Principales formulaciones de ortofosfatos de calcio obtenidos por vía química
mediante solución-precipitación (o de baja temperatura) y por tratamientos térmicos a
elevadas temperaturas (o de alta temperatura) [62].
Nombre Abreviatura Fórmula Química Ca/P Obtención
Fosfato Tetracálcico
TTCP Ca4O(PO4)2 2.00 Alta T
Hidroxiapatita HAp Ca10(PO4)6(OH)2 1.67 Alta/Baja T
Hidroxiapatita deficiente en calcio
CDHA Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x 1.5-1.67 Baja T
Fosfato de calcio amorfo
ACP Ca3(PO4)2·nH2O 1.2-2.2 Baja T
α-Fosfato tricálcico α-TCP α-Ca3(PO4)2 1.50 Alta T
β-Fosfato tricálcico β-TCP β-Ca3(PO4)2 1.50 Alta T
Fosfato octacálcico OCP Ca8(HPO4)2(PO4)4·5H2O 1.33 Baja T
Fosfato dicálcico anhidro (Monetita)
DCPA CaHPO4 1.00 Baja T
Fosfato dicálcico dihidratado (Monetita)
DCPD CaHPO4·2H2O 1.00 Baja T
Fosfato monocálcico
anhidro MCPA Ca(H2PO4)2 0.50 Baja T
Fosfato monocálcico
monohidratado MCPM Ca(H2PO4)2·H2O 0.50 Baja T
Como ya se ha mencionado, una característica de los ortofosfatos cálcicos que
condiciona y limita su comportamiento “in vivo”, es la mayor o menor solubilidad y acidez
que presentan en el ámbito de los fluidos corporales. Sin embargo, es posible predecir este
comportamiento, atendiendo a la estrecha dependencia que existe entre la composición
química (relación Ca/P) y la acidez y solubilidad en medio acuoso. Por ello, la selección de
20
Capítulo I
una adecuada formulación con aplicaciones biomédicas, vendrá determinada en primera
instancia por esta relación. En este sentido, todos aquellos compuestos con relación
Ca/P<1, presentan una elevada solubilidad y acidez en medio acuoso, impidiendo su
aplicación como biomaterial de manera aislada, sí bien pueden ser utilizados en
combinación con otros compuestos que puedan contrarrestar estos efectos [63]. Por tanto,
los ortofosfatos cálcicos susceptibles de aplicación estarán confinados hacia relaciones
Ca/P>1, ya que su solubilidad disminuye considerablemente con el aumento de la relación
Ca/P hasta alcanzar el valor de 1.67, coincidente con el valor de la HAp estequiométrica
[62].
Parece por tanto lógico que, entre todas estas formulaciones, el ortofosfato de calcio
empleado como biomaterial, y con mayor éxito clínico, sea la hidroxiapatita
Ca10(PO4)6(OH)2 (HAp). Esto se debe a que no solo es uno de los compuestos más estables
en medio fisiológico, sino también porque su composición química y su estructura son las
más similares al componente inorgánico del hueso.
El fosfato tricálcico Ca3(PO4)2 (C3P o TCP), objeto también de numerosas
investigaciones [64], se puede considerar como un candidato idóneo y por tanto una
alternativa a la hidroxiapatita, a la hora de desarrollar un biomaterial “ideal”. El TCP
presentaría una cinética de reabsorción capaz de adaptarse al proceso de remodelación
ósea, proporcionando el armazón necesario que guía los fenómenos óseos reparativos.
Durante su degradación el TCP interactuaría con el tejido de acogida, el tiempo necesario
para ser reemplazado por el tejido óseo neoformado.
Adicionalmente, existe un creciente interés por el desarrollo de biomateriales
basados en formulaciones bifásicas derivadas de mezclas variables de estos dos
compuestos, HAp+TCP, en el sentido de ejercer un mayor control de la cinética del
proceso de bioreabsorción a partir de la modulación de la relación HAp/TCP [65,66].
Los métodos de preparación comúnmente empleados para la obtención de los
fosfatos cálcicos (reacción en estado sólido, síntesis hidrotermal, precipitación, hidrólisis y
sol-gel) influyen en las propiedades finales de los materiales implantables. La versatilidad
que existe a la hora de seleccionar las condiciones de procesado y conformado, derivará en
macroestructuras y microestructuras controladas que definirán las características físico-
químicas del producto final. En este sentido se obtendrán materiales con diferente
21
Introducción
composición, estructura, cristalinidad, tamaño de partícula/grano, porosidad, morfología y
forma física, condicionando fuertemente su reactividad tanto “in vitro” como “in vivo”. En
definitiva será posible definir y obtener las características físico-químicas que deben
poseer los biomateriales en función de su aplicación.
I.5.1 Hidroxiapatita (HAp)
En este apartado y en el siguiente se expondrán las principales características,
ventajas e inconvenientes del empleo de la HAp y del TCP como materiales implantables.
Asimismo se valoraran las posibles soluciones de cara a su optimización y desarrollo en el
campo de los biomateriales como sustitutivos óseos.
A mediados de los años setenta, varios grupos de investigación, Jarcho et al.
[67,68], K. de Groot et al. [69,70], Denissen et al. [71] y Akoi et al. [72,73], dirigieron sus
estudios hacia la obtención y comercialización de la HAp sintética como material para la
reparación y sustitución del tejido óseo, por ser el compuesto más parecido a la fase
mineral del hueso y en definitiva la base de las formulaciones mas empleadas en
biomateriales.
El término apatita, se emplea para describir una familia de compuestos de fórmula
A10(BO4)6C2, que tienen idéntica estructura cristalina pero no necesariamente la misma
composición. Dentro de esta familia, la hidroxiapatita Ca10(PO4)6(OH)2 (HAp), es la
cerámica bioactiva por excelencia.
La HAp con una relación estequiométrica Ca/P=1.67, posee una composición y una
estructura bien definida [74–76], cristalizando en el sistema hexagonal con grupo espacial
de simetría P63/m. Este grupo espacial está caracterizado por 6 ejes-c perpendiculares a 3
ejes-a equivalentes (a1, a2, a3), separados estos últimos por ángulos de 120 º. La celda
unidad contiene la representación completa de un cristal de hidroxiapatita constituida por
10 átomos de Ca, 6 grupos PO43- y 2 grupos OH-, estrechamente empaquetados, según la
disposición mostrada en la figura I.3, siendo sus parámetros de red: a=b=9.418 Å, c=6.884
Å, α=β=90 º y γ=120 º.
22
Capítulo I
Figura I.3 Proyección en el plano (001) de la estructura de la hidroxiapatita. Los dos
triángulos de Ca2+ están localizados en z=1/4 y z=3/4. Los iones OH- se encuentran
localizados ligeramente por encima/debajo de los triángulos [77] .
Los 10 átomos de Ca pertenecen a los subgrupos de Ca (I) o de Ca(II) dependiendo
del entorno. Cuatro de los átomos de Ca, ocupan las posiciones Ca(I): dos de ellos al nivel
z=0 y los otros dos a z=0.5. Los 6 átomos de Ca restantes, ocupan las posiciones Ca(II);
organizados en dos grupos de tres átomos de Ca cada uno, en dos triángulos, uno de ellos
situado en z=1/4 y el otro en z=3/4, rodeados por grupos OH localizados en las esquinas de
la celda unidad en z=1/4 y z=3/4, respectivamente. Los 6 tetraedros de fosfato PO43-
presentan por otro lado una disposición helicoidal desde los niveles z=1/4 hasta z=3/4,
confiriendo a la estructura de un armazón adecuado capaz de proporcionar a la apatita su
estabilidad [78].
La HAp es capaz de alojar numerosos iones en su estructura, siendo los más
destacados, las substituciones que pueden tener lugar en las posiciones de los iones calcio
(Ca2+), como es el caso de Sr y Mg, en los grupos ortofosfato PO43-, como es el caso del
CO32- o en los grupos hidroxilo (OH-), como en el caso del F-, Cl- y del CO3
2-, sin alterar
significativamente su simetría hexagonal. Todas estas sustituciones producen cambios
significativos en las propiedades finales de la HAp, afectando a los parámetros de red, la
cristalinidad, la morfología y la solubilidad, induciendo alteraciones en su estabilidad tanto
química como térmica, en función de la cantidad y tamaño del ión sustituto. Cuando dichas
23
Introducción
sustituciones tienen lugar de forma simultánea, pueden afectar de manera sinérgica o
antagónica a la solubilidad y a la cristalinidad del material, lo que permite modular las
propiedades finales de la HAp en función de las especificaciones de destino.
La HAp presenta extraordinarias similitudes con las apatitas biológicas no-
estequiométricas, principales constituyentes de los huesos y del esmalte y dentina de los
dientes. Respecto a éstas, difieren en estequiometría, composición y cristalinidad. La HAp
presenta una unión directa y fuerte con el tejido óseo, aunque su alta estabilidad
termodinámica en medio fisiológico condiciona su bioreabsorbilidad, permaneciendo
durante largos periodos de tiempo en el cuerpo una vez implantado.
Las propiedades mecánicas de la HAp son similares a las de los componentes más
resistentes del hueso humano, ya que su módulo de elasticidad oscila entre 40 y 100 GPa,
frente a los 74 GPa del esmalte dental, 21 GPa de la dentina y 12-18 GPa del hueso
compacto. Sin embargo, su resistencia mecánica en forma de material denso es ~100 GPa
frente a los 300 GPa del hueso humano, valor que disminuye drásticamente cuando se
utiliza en forma de implante poroso [5]. Todo esto limita su campo de aplicación a zonas
donde no haya que soportar cargas muy elevadas [79]. Se aplica en forma de implante
poroso, como material de relleno para reparar pequeños defectos óseos o como
recubrimiento para prótesis metálicas e incluso en polvo.
I.5.2 Fosfato Tricálcico (TCP)
Los fosfatos tricálcicos Ca3(PO4)2 (TCP), con una relación Ca/P=1.50 o cercana,
(cerámicas reabsorbibles), son los candidatos idóneos para su utilización como implantes.
El fosfato tricálcico presenta tres formas polimórficas β, α y α´ dependiendo de la
temperatura. La fase de baja temperatura, β-TCP es estable hasta 1125 ºC, temperatura a
partir de la cual transforma en α-TCP. Se trata de una transformación reconstructiva y
cinéticamente lenta que conlleva rotura y formación de nuevos enlaces con un consiguiente
incremento de volumen. La fase α-TCP es metaestable a temperatura ambiente y estable en
el rango de temperaturas 1125-1430 ºC. La transformación de α a β-TCP está impedida, en
el enfriamiento, a velocidades rápidas e incluso moderadas. Esta fase, por otro lado,
transforma rápida y reversiblemente a α´-TCP a temperaturas superiores a 1430 ºC. La fase
24
Capítulo I
α´-TCP es inestable temperatura ambiente y por tanto no tiene ningún interés como
biomaterial.
Desde el punto de vista estructural el polimorfo β-TCP es una fase estable anhidra
del fosfato tricálcico. Dickens et al. [80,81] fueron los primeros autores que determinaron
la estructura del β fosfato tricálcico. El β-TCP cristaliza en el sistema romboédrico en el
grupo espacial R3c y contiene Z=21 unidades de fórmula Ca3(PO4)2 por cada celda unidad
hexagonal. Posteriormente Yashima et al. [82] determinaron por difracción de neutrones
con una alta precisión los parámetros de red de la celda unidad en configuración
hexagonal. Las características cristalográficas de este compuesto se recogen en la tabla I.3.
La estructura del β-TCP presenta cinco posiciones de Ca con distinto nivel de ocupación.
Estos autores, confirmaron que el sitio de Ca(4) con coordenadas [0, 0, -0.0851](6), era
muy diferente al resto de los sitios ocupados por los restantes átomos de calcio. El calcio
que ocupa la posición Ca(4) presenta coordinación trigonal planar con los átomos de
oxígeno, bajo factor de ocupación, 0.43(4) y alto parámetro de agitación térmica isotrópica.
Por otro lado, el resto de posiciones Ca(1), Ca(2), Ca(3) y Ca(5) se encuentran totalmente
ocupadas por un átomo de calcio y están coordinadas con 7, 8, 8 y 6 átomos de oxígeno
respectivamente. Los átomos de fósforo se encuentran localizados en tres posiciones
cristalográficas diferentes denotadas P(1), P(2) y P(3) con nivel de ocupación 1:3:3,
respectivamente.
La estructura del β-TCP, presenta una faceta muy interesante, pues se puede
describir como una serie de columnas A y B dispuestas paralelamente al eje c de la celda
unidad, figura I.4.
25
Introducción
Figura I.4 a) Proyección de la estructura cristalina del β-TCP en el plano (001), mostrando
las columnas A y B. El rombo en a) indica la celdilla unidad hexagonal del β-TCP, b) y c)
muestran las columnas A y B, así como las configuraciones de los grupos CaOn y PO4 en
las columnas A y B, respectivamente, a lo largo del eje c de la celda hexagonal (n = 3, 6, 7,
y 8), adaptado de Yashima et al. [82].
El polimorfo α-TCP es una fase metaestable a temperatura ambiente anhidra del
fosfato tricálcico. Cristaliza en sistema monoclínico, con grupo espacial P21/2a. La celda
unidad está compuesta por Z=24 unidades con fórmula Ca3(PO4)2 [83]. Las características
cristalográficas de este compuesto se recogen asimismo en la tabla I.3. Al igual que en el
caso del β-TCP, la estructura de α-TCP, figura I.5, se puede describir como una sucesión
de columnas dispuestas de forma paralela al eje c [84,85]. Los grupos CaOn y PO4 están
empaquetados en dos tipos de columnas a lo largo de la dirección [0,0,1]. Una de ellas
contiene únicamente cationes, catión-catión (C-C), mientras que la otra contiene cationes y
aniones, catión-anión (C-A). Cada columna C-C está rodeada por seis columnas C-A y
cada columna C-A por columnas alternadas C-C, C-A. La disposición de estas columnas es
pseudohexagonal.
b) Columna A c) Columna B
a)
26
Capítulo I
Figura I.5 Proyección de la estructura cristalina de. α-TCP a) en el plano (a,b) y b) en el
plano (b,c).
La existencia de la fase polimórfica α´-TCP, fue descubierta por Nurse et al. [86] en
1959. Como no presenta ni estabilidad ni metaestabilidad a temperatura ambiente, no fue
hasta 44 años más tarde cuando se pudieron determinar sus características estructurales.
Yashima et al. [85] reportaron en 2003, a través de un estudio por difracción de neutrones
de alta temperatura, que el grupo espacial al que pertenece este polimorfo es el P3m. Las
principales características estructurales de esta fase se recogen también en la tabla I.3.
Columna Ca-PO4
Columna Ca
Columna Ca-PO4
Columna Ca
a
b
a
b
a) b)
27
Introducción
Tabla I.3 Características cristalográficas de los polimorfos del fosfato tricálcico.
La densidad de las fases polimórficas del TCP varía en el siguiente orden: β-TCP >
α-TCP > α´-TCP. Los dos polimorfos β y α-TCP presentan coeficientes de dilatación
fuertemente anisótropos, lo que sumado a los mencionados cambios de volumen (7 % en
volumen) asociados a las transformaciones polimórficas [88], explicarían las limitadas
propiedades estructurales de los materiales basados en ambos polimorfos del TCP, lo que
podría condicionar su potencial aplicación. Finalmente indicar que la solubilidad es otro
los factores que influye en el comportamiento de éstos materiales una vez implantados en
el biosistema. La solubilidad de las fases cristalinas de TCP, apatitas e HAp, en
condiciones fisiológicas de pH=7 y temperatura 37 ºC, decrece en el orden siguiente;
α-TCP > β-TCP > apatitas deficientes en calcio > HAp [89].
Dependiendo del método de preparación empleado, se pueden clasificar en fosfatos
tricálcicos de baja temperatura como son el fosfato tricálcico amorfo (am-TCP) y el fosfato
tricálcico apatítico (ap-TCP), que son sintetizados por vía química mediante solución-
precipitación y los fosfatos tricálcicos de alta temperatura tales como el fosfato tricálcico
beta (β-TCP), el fosfato tricálcico alfa (-TCP) y el fosfato tricálcico alfa prima (α´-TCP),
sintetizados generalmente por reacción en estado sólido.
Los dos polimorfos del fosfato tricálcico de mayor interés a los fines del presente
trabajo, β y α-TCP, no se pueden obtener a partir de métodos de precipitación directa en
β-TCP [87] α-TCP [85] α´-TCP [85]
Simetría Romboédrica Monoclínica Trigonal
Grupo Espacial R3c P21/2a P3m
Parámetros Celda Unidad
(configuración hexagonal) a=b=10.4352(2) Å
c=37.4029(5) Å α=β=90º γ=120 º Z=21
a=12.859(2) Å b=27.354(2) Å c=15.222(3) Å
α=90º β=126.35(1)º
γ=90º Z=24
a=5.3507(8) Å b=5.3507(8) Å c=7.684(1) Å α=β=90º γ=120º
Z=1
Densidad Teórica 3.066 g/cm3 2.866 g/cm3 2.702 g/cm3
Volumen celda unidad 3527.2(2) Å3 4310(60) Å3 190.52(8) Å3
28
Capítulo I
medio acuoso, a diferencia de los fosfatos tricálcicos amorfos y apatíticos. Los polimorfos
β y α-TCP se obtienen generalmente a través de distintas técnicas de procesamiento que
han de culminar en tratamientos térmicos a elevadas temperaturas, dando lugar a fases bien
cristalizadas de los mismos. El polimorfo β-TCP también se puede obtener con alta
pureza, a partir de am-TCP y ap-TCP, sintetizados por vía solución-precipitación seguido
de tratamientos térmicos a temperaturas superiores a 900 ºC durante varias horas.
Asimismo, α-TCP también se puede obtener a partir de am-TCP calentando en el rango de
temperaturas 630-850 ºC [90]. No obstante, resaltar que es complicado sintetizar con
elevada densidad el polimorfo de baja temperatura β-TCP, debido a la baja temperatura
(T~1125 ºC) de la transformación β→α-TCP.
Aunque los métodos anteriormente descritos son eficaces, generalmente ambas
formas polimórficas del fosfato tricálcico, suelen ser sintetizadas por reacción en estado
sólido a partir de mezclas estequiométricas de sales y óxidos con contenido de Ca y P y
una relación Ca/P=1.5. Como la relación Ca/P no presenta variación con la temperatura,
los productos obtenidos seguidamente se someten a tratamientos térmicos de consolidación
en los rangos de estabilidad térmica de cada una de las fases, por debajo de 1125 ºC en el
caso de β-TCP y en el rango 1125-1430 ºC en el caso de α-TCP, [64].
La adecuada selección y control de parámetros como; la composición química,
proporción de fases presentes, cristalinidad, microestructura y distribución geométrica de
las fases en la misma, tamaño de partícula o grano, forma física y acabado superficial,
serán de vital importancia a la hora de obtener las propiedades deseadas.
Estos fosfatos se emplean en la actualidad como sustitutos óseos, recubrimientos de
prótesis metálicas, cementos o formando parte de materiales compuestos entre otras
aplicaciones. Los productos comerciales basados en fosfatos tricálcicos, con aplicaciones
clínicas, actualmente son comercializados por un gran número de empresas en todo el
mundo. Estas compañías han desarrollado productos muy diversos basados en β-TCP y/o
α-TCP, o combinados con HAp [91].
29
Introducción
I.5.3 Modificación del fosfato tricálcico (TCP)
Los polimorfos α y β-TCP presentan una serie de limitaciones asociadas
fundamentalmente a la dificultad para ajustar las velocidades de reabsorción con las de
sustitución por nuevo tejido [24]. La elevada solubilidad de los fosfatos cálcicos,
condiciona la integridad física del material durante el periodo de reabsorción, y por tanto
su estabilidad interfacial.
La modificación química de la estructura del TCP, a través de la incorporación de
iones monovalentes y divalentes, permite solventar estas limitaciones y por consiguiente,
a día de hoy, es una de las líneas de trabajo en I+D más importantes, que permite el diseño
y desarrollo de biomateriales a medida. Esta estrategia permite ejercer un mayor control
sobre su reactividad en el ámbito de los fluidos corporales y en definitiva optimizar las
propiedades estructurales/microestructurales y biológicas del material [92–98].
Adicionalmente también se consigue optimizar la síntesis e incrementar la densidad de los
materiales, lo que permite mejorar sus prestaciones mecánicas y su aplicación en zonas del
sistema esquelético que demanden soportar cargas mecánicas moderadas.
Los aditivos utilizados están limitados única y exclusivamente a elementos
presentes en el hueso, que satisfagan el requisito mínimo de biocompatibilidad. Establecer
el efecto que ejercen aditivos como el CO32-, SiO4
4-, Mg2+, Zn2+, F-, Cl-, Na+ y el K+ en el
comportamiento de estos materiales es uno de los objetivos principales de recientes
investigaciones [99–105].
El cinc, aunque es un elemento traza en el cuerpo humano, el papel que juega en el
crecimiento y en el bienestar de la persona es muy importante incluso antes del nacimiento
[106–109]. El cuerpo humano contiene en torno a 2-3 g de zinc, de los cuales un 90 % del
Zn está contenido en los huesos (60 % en peso) y en los músculos (30 % en peso). El
contenido de cinc en el hueso varía entre 0.0126-0.0217 % en peso, valor que es
ligeramente mayor que el promedio en los tejidos de una persona adulta (0.003 % en peso)
y el contenido en el plasma humano (12-17 µM Zn) [110–116]. El cinc es también esencial
en el crecimiento de hueso [117,118] y su influencia ha sido ampliamente demostrada en
diversas condiciones [118,119]. La adición de cinc a la dieta produce una estimulación del
crecimiento del hueso y de la mineralización del mismo [120], mientras que el crecimiento
de hueso se retarda en animales con un dieta deficiente en este elemento [118]. La
30
Capítulo I
deficiencia de cinc también ha sido asociada con la pérdida de masa ósea en la
premenopausia y con osteoporosis en la postmenopausia [121–123]. Asimismo, se ha
puesto en evidencia que el cinc inhibe la reabsorción ósea osteoclástica “in vitro”. [127]
Sin embargo, el cinc debe ser reabsorbido lentamente desde el implante ya que a elevadas
concentraciones puede generar reacciones adversas [124,125].
El magnesio es el cuarto catión más abundante en el cuerpo humano y el segundo
en el ámbito intracelular. Aproximadamente un 50-65 % del contenido total de magnesio
se encuentra en los tejidos óseos y únicamente un 1 % se halla en los fluidos extracelulares
[126–129]. Desde el punto de vista fisiológico el magnesio es esencial en una gran
cantidad de reacciones enzimáticas [130]. El Mg estimula directamente la proliferación de
los osteoblastos, mientras que su deficiencia inhibe el crecimiento celular [131,132]. El Mg
se une superficialmente a los cristales de apatita inhibiendo su formación y crecimiento
[133,134], y asimismo, su carencia en la dieta diaria y su bajo contenido en el tejido óseo y
alta cristalinidad se consideran factores de riesgo asociados con la osteoporosis a partir de
una determinada edad [135,136]. Todos estos efectos adversos asociados a la deficiencia
de magnesio, de manera conjunta, pueden afectar al crecimiento del hueso y a su
mineralización, disminuyendo su calidad, su fortaleza y su densidad, induciendo la
fragilidad del mismo [137,138].
El fosfato tricálcico, es posiblemente uno de los portadores más adecuados de cinc
y de magnesio [100,139–141], ya que posee en su estructura cristalina una posición
atómica de Ca (radio iónico = 0.099 nm), conocida como posición de Mg, capaz de
incorporar cationes divalentes con un radio iónico comprendido entre 0.060 y 0.080 nm.
Este sería el caso del Zn2+ y del Mg2+, cuyos radios iónicos en coordinación trigonal
planar y octaédrica, estarían incluidos en este rango.
Los estudios estructurales llevados a cabo en TCP modificado con Zn2+ y/o Mg2+,
demostraron que efectivamente el Zn y el Mg reemplazan al ion Ca2+ en la estructura del β-
TCP. Asimismo, cabe destacar que la temperatura de transformación polimórfica β→α es
altamente sensible a la presencia de estos dos cationes [100,139,141], estabilizando la fase
β-TCP hacia temperaturas más altas.
31
Introducción
La presencia de cinc y de magnesio en solución sólida en la estructura del TCP
reduce su solubilidad y en consecuencia su reactividad en el medio fisiológico. Este hecho
permite una mejor adaptación al proceso dinámico de formación y reabsorción que se
produce en los tejidos óseos. Por otro lado, la liberación controlada de cinc y magnesio
abastecerá a nivel local el entorno fisiológico combinando los beneficios de ambos
dopantes indicados previamente. [142]
Durante los últimos años, se han realizado varias publicaciones sobre la síntesis,
obtención, solubilidad y comportamiento biológico tanto “in vitro” como “in vivo” de
cerámicos de fosfato tricálcico con contenidos variables de cinc [119,129,147,154]. Estos
autores, observaron que el TCP dopado con Zn2+ y/o Mg2+ mantiene su biocompatibilidad
como material, mejorando su bioactividad.
Ninguno de los estudios mencionados considera en sus discusiones la información
disponible en los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5, y MgO-ZnO-CaO-
P2O5, debido probablemente a que la información sobre estos sistemas multicomponentes
es muy limitada o prácticamente inexistente. Estos estudios permitirán entender el efecto
del óxido de cinc y/o del óxido de magnesio, en la estabilidad, transiciones de fase,
evolución microestructural y bioactividad “in vitro” del fosfato tricálcico, cuando estos
dopantes se localizan de forma individual o de forma simultáneamente en su estructura,
situación que se acerca más a la realidad del hueso humano.
32
Capítulo I
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36
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38
Capítulo I
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Introducción
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41
Introducción
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42
Capítulo I
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[147] Y. Sogo, A. Ito, M. Kamo, T. Sakurai, K. Onuma, N. Ichinose, M. Otsuka & R.Z. LeGeros "Hydrolysis and cytocompatibility of zinc-containing α-tricalcium phosphate powder." Materials Science and Engineering: C, [24] 6-8 709-715 2004
[148] M. Otsuka, Y. Ohshita, S. Marunaka, Y. Matsuda, A. Ito, N. Ichinose, K. Otsuka & W.I. Higuchi "Effect of controlled zinc release on bone mineral density from injectable Zn-containing β-tricalcium phosphate suspension in zinc-deficient diseased rats." Journal of Biomedical Materials Research Part A, [69] 3 552-560 2004
43
Introducción
[149] A. Ito, M. Otsuka, H. Kawamura, M. Ikeuchi, H. Ohgushi, Y. Sogo & N. Ichinose "Zinc-containing tricalcium phosphate and related materials for promoting bone formation." Current Applied Physics, [5] 5 402-406 2005
[150] A. Ito, H. Kawamura, S. Miyakawa, P. Layrolle, N. Kanzaki, G. Treboux, K. Onuma & S. Tsutsumi "Resorbability and solubility of zinc-containing tricalcium phosphate." Journal of Biomedical Materials Research, [60] 2 224-231 2002
Capítulo II
Propósito de la Presente Memoria
47
Propósito de la Presente Memoria
II. Propósito de la Presente Memoria
El objetivo de la moderna ciencia de los materiales es diseñar materiales específicos
para un determinado uso y por tanto obtener durante su investigación y desarrollo el
adecuado conjunto de propiedades necesarias a dicha aplicación. Las propiedades de los
materiales en general dependen de las fases presentes, lo que involucra su estructura a
todos los niveles, y su proporción y composición, así como la forma en que dichas fases
están geométricamente distribuidas en la microestructura.
El inicio, hace más de 60 años, de la investigación, desarrollo y aplicación de
biomateriales, obligó a conjugar los conceptos y conocimientos de la ciencia y tecnología
de los materiales con los de otras áreas como la biología y la medicina. La importancia que
ha obtenido en estos últimos años este campo de investigación de naturaleza
multidisciplinar, ha conseguido que los biomateriales encuentren numerosas aplicaciones,
de las que la restauración, sustitución y regeneración ósea del sistema esquelético, afectado
por traumas derivados de patologías relacionadas o no con el envejecimiento, o por
traumatismos osteoarticulares, muy comunes en los tiempos actuales, sean unas de las más
importantes.
En esta dirección, los biomateriales cerámicos debido a su biocompatibilidad y
osteointegración fueron considerados materiales ideales por su capacidad para sustituir,
restaurar, inicialmente, o procurar posteriormente un andamiaje temporal, o indefinido que
induzca la reparación de defectos y promover estímulos celulares y moleculares de manera
controlada que faciliten ese proceso. Los biomateriales cerámicos ampliamente utilizados,
por poseer una composición muy similar a la del componente mineral del hueso humano,
son la Hidroxiapatita (HAp) y el Fosfato Tricálcico (TCP).
Del conjunto de propiedades exigibles a estos materiales, una de las más
importantes desde el punto de vista de su comportamiento “in vivo”, y la que, por tanto,
limita su posible aplicación, es la solubilidad en medio acuoso y en consecuencia en los
fluidos corporales. Actualmente es posible predecir este comportamiento puesto que existe
una estrecha dependencia entre la relación Ca/P y la solubilidad en medio acuoso, de tal
forma que relaciones Ca/P > 1.5 generan una muy baja solubilidad mientras que relaciones
48
Capítulo II
Ca/P < 1 son muy solubles. La relación Ca/P igual o cercana a 1.5 es la que actualmente se
considera idónea para la formulación de estos materiales
La HAp (Ca/P = 1.67) es extremadamente insoluble en medio acuoso y en los
fluidos corporales, mientras que el TCP (Ca/P = 1,5) presenta una solubilidad intermedia
en relación a este compuesto y los fosfatos mas solubles (Ca/P < 1.0). Este hecho da lugar
a que, hoy en día, el TCP sea considerado la alternativa más cercana al biomaterial “ideal”,
ya que como se ha indicado anteriormente, además de poseer una composición muy similar
a la del componente mineral del hueso humano, su solubilidad es adecuada y su cinética de
reabsorción puede ser adaptada al proceso de remodelación ósea, proporcionando además
el armazón necesario capaz de guiar los procesos óseos reparativos y, al mismo tiempo,
interactuar durante su reabsorción con el tejido de acogida.
Sin embargo, todavía quedan aspectos relevantes a resolver, así ajustar la velocidad
de reabsorción y evitar el desfase de tiempo en el proceso de reemplazamiento por el tejido
óseo neoformado es una tarea que no está definitivamente conseguida y establecida.
El fosfato tricálcico presenta tres formas polimórficas de las cuales β y α-TCP
tienen un mayor interés como biomaterial. El α-fosfato tricálcico en presencia de agua se
puede transformar en una pasta plástica y deformable con una velocidad elevada de
reabsorción, o puede derivar a una forma monolítica de HAp con una velocidad demasiado
lenta de reabsorción. Asimismo, este material debe alcanzar una densidad óptima durante
el proceso de sinterización que garantice un umbral mínimo de prestaciones mecánicas con
el objetivo no solo de mantener su integridad estructural sino también su estabilidad
interfacial durante el proceso de reabsorción. Estas limitaciones conducen a que, hoy en
día, el empleo de materiales basados en fosfato tricálcico se dirija al diseño de cementos
óseos, materiales para relleno de cavidades e implantes en zonas donde no se requieran
esfuerzos mecánicos elevados.
Las limitaciones mencionadas se pueden abordar modificando el fosfato tricálcico,
dopándolo con elementos que están presentes en el hueso humano, y que no alteren su
biocompatibilidad, manteniendo su estructura cristalina. El cinc y el magnesio cumplen
estas condiciones puesto no rompen la biocompatibilidad del TCP y se incorporan en la
estructura cristalina en solución sólida, sin modificarla, ya que los iones Zn2+ y Mg2+
ocupan las posiciones de Ca2+. Al mismo tiempo su presencia permite optimizar la síntesis
49
Propósito de la Presente Memoria
y sinterización del TCP y controlar la proporción de fases y la microestructura, lo que
permite indirectamente modular su solubilidad y optimizar sus propiedades.
En el estudio de sistemas de multicomponentes, generalmente complejos, para la
formulación y el diseño de materiales es extremadamente útil disponer de una descripción
teórica y/o experimental de las relaciones entre las fases en función de la composición,
presión y temperatura. En este sentido, los diagramas de equilibrio de fases son una
herramienta poderosa y fundamental para estudiar y establecer dichas relaciones. Los
estudios en los sistemas ZnO-CaO-P2O5 y ZnO-MgO-CaO-P2O5 permitirán entender el
efecto del cinc y/o del magnesio, adicionados en forma de óxidos, sobre la estructura, las
transiciones de fases y los rangos de estabilidad de las fases en función de la temperatura y
composición. A partir de esta información suministrada por los diagramas de equilibrio se
diseñarán y prepararán materiales basados en fosfato tricálcico modificados con óxido de
cinc y óxido de cinc/ óxido de magnesio en los que se establecerá la influencia de estos
dopantes sobre la síntesis, sinterización, mineralogía y desarrollo microestructural de los
materiales. Mediante estudios “in vitro”, se establecerá el comportamiento bioactivo de los
materiales, a partir de muestras previamente seleccionadas, en suero fisiológico artificial
(SFA), y se evaluará, la citotoxicidad de los iones Zn2+ y Mg2+ y la biocompatibilidad en
las mismas muestras, en un cultivo primario de osteoblastos humanos.
Por último se llevará a cabo un estudio preliminar de la sinterización del fosfato
tricálcico, mediante Spark Plasma Sintering (SPS), técnica novedosa en el campo de los
biomateriales, que permite reducir los tiempos y temperaturas de tratamiento necesarios
para alcanzar el equilibrio termodinámico. Asimismo permite obtener materiales más
densos con un menor crecimiento cristalino. Mediante esta técnica será posible obtener
biomateriales de mejores prestaciones mecánicas, extendiendo su campo de aplicación a
otras zonas del sistema esquelético.
50
Capítulo II
Bajo estas consideraciones, los objetivos de la presente Tesis Doctoral fueron los
siguientes:
Establecimiento experimental de las compatibilidades en estado sólido del fosfato
tricálcico y del óxido de cinc en el sistema ternario ZnO-CaO-P2O5, y del fosfato
tricálcico en el sistema cuaternario MgO-ZnO-CaO-P2O5.
Determinación experimental del sistema pseudo-binario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y
establecimiento de los rangos de solución sólida de Zn2+ y/o Mg2+ en Ca3(PO4)2 en
los subsistemas Ca3(PO4)2-ZnO y Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2. Establecimiento experimental de los campos de estabilidad de α, y
α+β fosfato tricálcico dopado con cinc y/o magnesio en función de la temperatura y
la composición.
Diseño de composiciones, optimización de la síntesis, variables de procesado y
sinterización mediante métodos convencionales de materiales de fosfato tricálcico
monofásicos (α o β), y bifásicos (α + β), modificados con óxido de cinc y óxido de
cinc/óxido de magnesio. Caracterización mineralógica, estructural y
microestructural de los materiales obtenidos.
Estudios de bioactividad “in vitro” en suero fisiológico artificial (SFA) de
materiales previamente seleccionados. Análisis de los procesos de
solución/precipitación en la interfase de reacción en función del tiempo de
inmersión. Estudios de citoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante cultivo
primario de osteoblastos humanos. Análisis de la citotoxicidad mediante la
inhibición del crecimiento celular. Análisis de la biocompatibilidad a través de la
interacción directa e indirecta material-célula.
Estudio preliminar comparativo de la sinterización de fosfato tricálcico modificado
con óxido de cinc y óxido de cinc/óxido de magnesio, mediante técnicas
convencionales y Spark Plasma Sintering (SPS). Análisis comparativo de las
características microestructurales y mecánicas.
Capítulo III
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
53
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
III. Materiales de Partida, Metodología Experimental y
Técnicas de Caracterización
III.1 MATERIALES DE PARTIDA
Los compuestos cerámicos desarrollados en esta memoria de tesis, se sintetizaron a
partir de materias primas sintéticas comerciales. Puesto que la pureza de los materiales con
aplicaciones biomédicas es un factor crítico, es obligatorio y esencial la realización de un
riguroso control químico desde las etapas iniciales del procesamiento. En este sentido, los
reactivos empleados se seleccionaron atendiendo principalmente a su pureza, en base al
análisis químico proporcionado por el fabricante. En algunos casos se realizó una nueva
caracterización química de los mismos mediante diversas técnicas de análisis como
fluorescencia de rayos X y Espectroscopía de Emisión Atómica con fuente de Plasma de
Acoplamiento Inductivo (ICP-OES). Adicionalmente se realizó una caracterización física y
mineralógica mediante Difracción de Rayos X (DRX), picnometría de He, tamaño de
partícula y superficie especifica (Se). Estas técnicas de caracterización se describirán más
en detalle en el apartado III.4.
III.1.1 Carbonato cálcico (CaCO3)
Como fuente de calcio se empleó CaCO3 de pureza analítica 99.0 % en peso de la
casa comercial Panreac. En la tabla III.1 se muestra el análisis químico del CaCO3
proporcionado por el fabricante. En la figura III.1, se muestra el difractograma de RX
obtenido en polvo de este reactivo donde únicamente se observan picos de difracción
asociados a la fase mineral calcita, según la ficha nº 721651 de la base de datos JCPDS.
54
Capítulo III
Figura III.1 DRX correspondiente al CaCO3 de Panreac.
El CaCO3 presenta una densidad de 2.6 g/cm3 y una superficie específica de 1.1
m2/g. Asimismo exhibe una distribución de tamaño de partícula bimodal con dos máximos
en 20.0 μm y 0.2 μm y un tamaño medio de partícula d50=16.7 μm.
III.1.2 Fosfato monobásico de amonio (NH4H2PO4)
El fosfato monobásico de amonio con una pureza ≥99.0 % en peso, de Fluka Sigma
Aldrich, se ha empleado como fuente de P2O5. En la tabla III.1 se muestra el análisis
químico del NH4H2PO4 proporcionado por el fabricante. Asimismo en la figura III.2, se
muestra el difractograma de Rayos X obtenido a partir de polvo de este reactivo donde
únicamente se observan picos de difracción asociados a la fase NH4H2PO4, según la ficha
nº 850815 de la base de datos JCPDS.
Figura III.2 DRX correspondiente al NH4H2PO4 de Fluka.
20 30 40 50 60
CaCO3 Panreac
Inte
nsi
da
d (
u.a
)
2
20 30 40 50 60
NH4H
2PO
4 Fluka
Inte
nsid
ad
(u.a
)
2
55
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
El polvo de NH4H2PO4 presenta una densidad de 1.8 g/cm3, una superficie
específica de 0.1 m2/g y un tamaño medio de partícula d50=427.5 μm.
III.1.3 Óxido de cinc (ZnO)
El ZnO empleado presenta una pureza de 99.9 % en peso y fue suministrado por la
casa comercial Oxizinc-Algasa. En la tabla III.1 se muestra el análisis químico del ZnO
determinado mediante fluorescencia de rayos X y Espectroscopía de Emisión Atómica con
fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-OES). En la figura III.3, se muestra el
difractograma de Rayos X obtenido donde se observan picos de difracción asociados
únicamente al ZnO, según la ficha nº 361451 de la base de datos JCPDS.
Figura III.3 DRX correspondiente al ZnO de Oxizinc-Agalsa.
El ZnO presenta una densidad de 5.49 g/cm3, una superficie específica de 6.5 m2/g
y un tamaño medio de partícula d50=1.0 μm.
20 30 40 50 60
ZnO Oxizinc
Inte
nsi
dad
(u.a
)
2
56
Capítulo III
III.1.4 Óxido de magnesio (MgO)
Como fuente de magnesio se empleo MgO de pureza analítica 97.0 % en peso de la
casa comercial Merck. En la tabla III.1 se muestra el análisis químico del MgO
proporcionado por el fabricante. El difractograma de rayos X obtenido en este caso se
muestra en la figura III.4. Se observó como todos los picos de difracción correspondían
con la fase mineral periclasa según la ficha nº 741225 de la base de datos JCPDS.
Figura III.4 DRX correspondiente al MgO de Merck.
El MgO presenta una densidad de 3.6 g/cm3, una superficie específica de 26.0 m2/g
y un tamaño medio de partícula d50=13.0 μm.
En la tabla III.1 se muestran los análisis químicos suministrados por las casas
comerciales correspondientes, excepto para el ZnO, en el que se proporciona el realizado
por las técnicas de análisis previamente mencionadas en el apartado III.1. Se puede
observar la elevada pureza de los materiales empleados para la preparación de
composiciones y biomateriales.
20 30 40 50 60
MgO Merck
Inte
nsi
dad
(u.a
)
2
57
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Tabla III.1 Análisis químicos de los reactivos empleados en la síntesis de composiciones.
% CaCO3 NH4H2PO4 ZnO MgO
Pureza ≥99.0 ≥99.0 ≥99.9 ≥97.0
Sol. en H2O - - - ≤0.5
Insol. en Acético ≤0.2 - - ≤0.10
Insol. en HCl ≤0.005 - - - Carbonato como CO2
- - - ≤1.5
Cloruro (Cl) ≤0.005 ≤0.0005 - ≤0.01
Nitrato (NO3) ≤0.02 ≤0.001 - -
Sulfato (SO4) - ≤0.01 - ≤0.02 Metales pesados
(como Pb) ≤0.002 - - -
Nitrógeno total (N) ≤0.001 ≤0.00005 ≤0.002
Al ≤0.005 - - -
As ≤0.0004 ≤0.00005 - -
Ba ≤0.005 - 0.0034 -
Ca - ≤0.001 0.025 ≤0.10
Cd - ≤0.0005 0.0009 -
Co - ≤0.0005 - -
Cr - ≤0.0005 - -
Cu ≤0.0005 ≤0.0005 0.0079 ≤0.001
Fe ≤0.001 ≤0.0005 0.0017 ≤0.005
K ≤0.01 ≤0.005 - ≤0.005
Mg ≤0.05 ≤0.0005 0.00054 -
Mn - ≤0.0005 - -
Na ≤0.02 ≤0.005 0.0376 ≤0.030
Ni - ≤0.0005 - -
Pb ≤0.0005 ≤0.0005 0.006 ≤0.001
Sr ≤0.1 - - -
Zn - ≤0.0005 - ≤0.0005
Ba y Sr (como Ba) - - - ≤0.005 Pérdida
por calcinación ≤0.1 - >0.08 ≤3.0
58
Capítulo III
III.2 CONSIDERACIONES GENERALES
Las composiciones preparadas y sintetizadas, tanto para el estudio de los
diagramas de equilibrio de fases como en el diseño de los biomateriales cerámicos de la
presente memoria, se han llevado a cabo mediante reacción en estado sólido. La
elección de este método de síntesis tiene su justificación tanto en la sencillez del
procesamiento y reproducibilidad como por su fácil implantación y bajo coste de
obtención.
III.3 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL SEGUIDA PARA EL
ESTUDIO DE LOS DIAGRAMAS DE EQUILIBRIO DE FASES
III.3.1 Diseño de composiciones
Para la realización del estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-
P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5, se prepararon y sintetizaron composiciones con diferente
estequiometria y relación Ca/P, (Zn+Ca/P), (Mg+Ca/P) y (Mg+Zn+Ca/P), empleando los
materiales de partida previamente mencionados. Las composiciones químicas estudiadas
en función de los correspondientes óxidos y su ubicación en cada uno de los sistemas, se
detallan en el capítulo IV.
III.3.2 Síntesis, conformado y sinterización de las composiciones
Las mezclas de las correspondientes composiciones, según las formulaciones
mostradas en el capítulo IV, se pesaron en una balanza de cuatro cifras significativas y se
mezclaron y homogeneizaron en mortero de ágata empleado como medio líquido alcohol
etílico. Una vez evaporado el disolvente se volvió a añadir alcohol etílico en el mortero y
se procedió a la segunda homogeneización. Este procedimiento se repitió hasta completar
un total de tres homogeneizaciones. Seguidamente, la mezcla obtenida se secó en estufa a
60 ºC durante 24 h y se tamizó por una malla de nylon con una ventana de luz de 63 μm.
Las composiciones homogeneizadas se trataron térmicamente en crisoles de platino
a 900 ºC durante 4 h a una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min y enfriamiento
siguiendo la inercia del horno utilizado.
59
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Las muestras obtenidas se molturaron nuevamente en un mortero de ágata y se
tamizaron nuevamente por una malla de nylon con una ventana de luz de 63 μm. .
Seguidamente las muestras se conformaron, mediante prensado uniaxial, en forma
de cilindros de ~6 mm de diámetro y ~10 mm de altura que se introdujeron en crisoles de
platino. Dichas muestras fueron finalmente sinterizadas empleando un horno eléctrico de
ascensor en atmósfera de aire a temperaturas comprendidas entre 900 y 1400 ºC, durante
12 h, con velocidades de calentamiento de 3 ºC/min y posterior enfriamiento brusco a
temperatura ambiente empleando el método para congelar el equilibrio (congelación del
equilibrio).
Para asegurar que las composiciones tratadas térmicamente habían alcanzado las
condiciones de equilibrio termodinámico, muestras seleccionadas fueron tratadas
nuevamente durante un tiempo más prolongado (48 h), no observándose cambio alguno en
su mineralogía y microestructura.
Método de congelación del equilibrio “quenching”
La determinación de las fases en equilibrio que permitan establecer los
correspondientes diagramas de fases, se han realizado en muestras sometidas al método de
congelación del equilibrio (congelación del equilibrio por enfriamiento brusco de las
mismas). Este método se denomina comúnmente “quenching”, palabra anglosajona que
significa enfriamiento brusco. Este método consiste en preparar adecuadamente una serie
de muestras, llevarlas a la temperatura deseada durante el tiempo suficiente para que
alcancen el equilibrio y enfriarlas bruscamente para conservar, a temperatura ambiente, las
fases y la microestructura presentes a alta temperatura.
III.3.3 Caracterización de las muestras sometidas al método de
congelación del equilibrio “quenching”
Las muestras obtenidas se caracterizaron mediante Difracción de Rayos X (DRX) y
Microscopía Electrónica de Barrido de Emisión de Campo (MEB-EC). Adicionalmente se
realizaron microanálisis puntual por Dispersión de Energía de Rayos X (EDX), para
60
Capítulo III
identificar los elementos presentes y complementar la información obtenida por DRX, en
aquellos casos considerados de interés a los fines del presente trabajo.
III.4 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL SEGUIDA PARA LA
OBTENCIÓN DE BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2
MODIFICADOS CON ZnO Y ZnO/MgO
III.4.1 Diseño de composiciones
Para la obtención de biomateriales basados en Ca3(PO4)2 (TCP), se han preparado y
sintetizado nueve composiciones basadas en Ca3(PO4)2, con contenidos variables en ZnO y
ZnO/MgO y relación Ca/P, (Zn+Ca)/P y (Mg+Zn+Ca)/P constante e igual a 1.5, a partir de
la siguiente reacción:
XZnO + YMgO + (3-X-Y)CaCO3 + 2NH4H2PO4 → [ZnXMgYCa(3-X-Y)](PO4)2 + ↑3H2O + ↑2NH3
+↑(3-X-Y)CO2
(Ecuación III.1)
La elección de las composiciones, con el objetivo de estudiar su viabilidad como
biomateriales, se realizó en base a la investigación que se describe en el capítulo IV. En ese
capítulo se estudian en profundidad los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y
MgO-ZnO-CaO-P2O5. Se establecieron las regiones de solución sólida del Zn2+, Mg2+ y de
la combinación Zn2+/Mg2+ en el TCP, así como los campos de estabilidad de los
polimorfos β y α del fosfato tricálcico [1] para contenidos variables de estos dos dopantes.
En la tabla III.2, se muestra la composición química nominal de los materiales preparados
así como los acrónimos con los que se designarán los materiales de aquí en adelante.
61
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Tabla III.2 Composiciones nominales de los materiales basados en TCP preparados en
función de los correspondientes óxidos.
III.4.2 Preparación de los biomateriales
III.4.2.1 Síntesis de composiciones basadas en fosfato tricálcico por mezcla de óxidos
Las diferentes etapas seguidas en la síntesis por reacción en estado sólido de las
composiciones basadas en fosfato tricálcico destinadas a la preparación de los
biomateriales se esquematizan en la figura III.5.
Figura III.5 Esquema de la síntesis de composiciones por mezcla de óxidos.
% en peso
Composición MgO ZnO CaO P2O5 (Mg+Zn+Ca)/P
ratio molar
TCP - - 54.235 45.765 1.50±0.01
0.125 Z - 0.125 54.128 45.747 1.50±0.01
0.25 Z - 0.250 54.021 45.729 1.50±0.01
0.5 Z - 0.500 53.806 45.694 1.50±0.01
1.0 Z - 1.000 53.378 45.622 1.50±0.01
1.0 Z 0.125 M 0.125 1.000 53.230 45.645 1.50±0.01
1.0 Z 0.25 M 0.250 1.000 53.083 45.667 1.50±0.01
1.0 Z 0.5 M 0.500 1.000 52.788 45.712 1.50±0.01
1.0 Z 1.0 M 1.000 1.000 52.198 45.802 1.50±0.01
Homogenización del tamaño de partícula
de las materias primas
Mezcla y Homogenización
Calcinación
T
t
Molienda
62
Capítulo III
Inicialmente, y debido al elevado tamaño medio de partícula (d50) del NH4H2PO4 en
comparación con el resto de materias primas de partida, apartado III.1, se llevó a cabo una
reducción del tamaño de partícula de este reactivo. Para ello, el NH4H2PO4 se molturó
independientemente durante 4 h en un molino de atrición con bolas de ZrO2 estabilizada
con Y2O3 de Ø=1.2 mm, empleando como medio líquido alcohol isopropílico. Tras la
molienda, este reactivo se secó en estufa a 60 ºC durante 24 h y se tamizó por una malla de
nylon con una ventana de luz de 63 μm. Este proceso permitió reducir el tamaño de
partícula del NH4H2PO4 a d50=28.4 μm, tamaño medio similar al del otro constituyente
fundamental en las composiciones (CaCO3). Esta primera etapa se realizó con el fin de
minimizar posibles fuentes de heterogeneidad que pudieran perturbar etapas posteriores del
procesamiento de los materiales.
A continuación, se procedió al mezclado y homogeneización de cada una de las
composiciones. Cantidades adecuadas de los correspondientes reactivos, según las
formulaciones previamente mencionadas, se pesaron en una balanza de cuatro cifras
significativas y se molturaron en medio alcohólico (isopropílico) durante 2 h en un molino
de atrición con bolas de ZrO2 estabilizada con Y2O3 de Ø=1.2 mm. Las composiciones
homogeneizadas se secaron en estufa a 60 ºC durante 24 h y se tamizaron por una malla de
nylon de 63 μm. Se evaluó el tamaño de partícula y la superficie específica (Se) de las
composiciones preparadas y su comportamiento térmico mediante Análisis Térmico
Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG).
Posteriormente, las composiciones homogeneizadas fueron calcinadas sobre una
lámina de platino en crisoles de alúmina a 900 ºC durante 2 h a una velocidad de
calentamiento de 3 ºC/min y enfriamiento siguiendo la inercia del horno. A continuación,
las muestras fueron molturadas mediante molienda de atrición empleando bolas de ZrO2
estabilizada con Y2O3 de Ø=1.2 mm, durante 2 h en isopropílico. Finalmente, los polvos
obtenidos se secaron en estufa a 60 ºC y se tamizaron por una malla de nylon con una
ventana de luz de 63 μm.
Los composiciones calcinadas se analizaron empleando las siguientes técnicas de
caracterización: Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG),
Dilatometría de alta temperatura (DAT), superficie específica (Se), tamaño de partícula,
Espectroscopía Infrarroja mediante transformada de Fourier (IR-TF) y Difracción de rayos
63
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
X (DRX). Asimismo, se determinó la relación Ca/P (Zn+Ca)/P y (Mg+Zn+Ca)/P por
Espectroscopía de Emisión Atómica con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo
(ICP-OES), obteniendo una relación Ca/P, (Ca+Zn)/P y (Ca+Zn+Mg)/P de 1.5±0.1 en
todas las composiciones.
III.4.2.2 Conformado y sinterización de los biomateriales cerámicos
Las diferentes etapas seguidas en el conformado y sinterización de los
biomateriales cerámicos se esquematizan en la figura III.6:
Figura III.6 Esquema de las etapas de conformado y sinterización de los materiales
cerámicos de partida.
Las composiciones tratadas térmicamente se conformaron en forma de cilindros de
10 mm de diámetro y 40 mm de altura, mediante prensado isostático a una presión de 200
MPa. A continuación, los cilindros en verde se cortaron con un disco de Al2O3 cilindros de
10 mm de diámetro y 2 mm de espesor.
La densificación de las muestras se llevó a cabo mediante dos métodos de
sinterización: convencional sin presión y asistida por un campo eléctrico con presión
mecánica. En ambos casos el seguimiento de la densificación durante los tratamientos
térmicos de sinterización, se realizó mediante Dilatometría de alta temperatura (DAT).
Conformado T
tSinterización
Convencional(Sin presión)
T
t
Asistida por una corriente eléctrica
pulsada(Con presión)
Composiciones calcinadas (900 ºC 2 h)
64
Capítulo III
III.4.2.2.1 Sinterización convencional
Las muestras cerámicas compactados se depositaron en una lámina de platino sobre
una superficie de alúmina para evitar posibles reacciones del material con la misma y se
sinterizaron empleando un horno eléctrico en atmósfera de aire, a temperaturas
comprendidas entre 1000-1350 ºC, durante 12 h, con velocidades de calentamiento y
enfriamiento de 3 ºC/min, figura III.7.
Figura III.7 Esquema del ciclo térmico empleado en el proceso de sinterización
convencional.
III.4.2.2.2 Sinterización mediante corriente eléctrica pulsada (Spark Plasma
Sintering)
Los ensayos de sinterización no convencional se llevaron a cabo sobre muestras
previamente seleccionadas empleando un equipo de Spark Plasma Sintering (SPS), que
utiliza una corriente pulsada al tiempo que aplica una presión mecánica uniaxial durante el
ciclo térmico, figura III.8.
0
900950
1000105011001150120012501300135014001450
3 ºC/min
T
em
pera
tura
(ºC
)
Tiempo (h)
12 h
65
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Figura III.8 Esquema del ciclo térmico y de presión empleados en el proceso de
sinterización por SPS.
III.4.3 Caracterización de los biomateriales
III.4.3.1 Caracterización química, física, estructural, microestructural y mecánica de
los biomateriales
Una vez sinterizados los materiales cerámicos, las primeras propiedades que se
evaluaron fueron la densidad y la pérdida de peso. En primera instancia, la pérdida de peso
se determinó por diferencia de pesada entre el compacto en verde y el material sinterizado.
Posteriormente, para obtener un dato mucho más fiable se realizaron ensayos de
Termogravimetría. La densidad aparente se evaluó mediante el procedimiento de
Arquímedes por inmersión en agua desionizada.
Las muestras sinterizadas se caracterizaron mineralógicamente mediante Difracción
de Rayos X (DRX) en un equipo Bruker D8 Advance dotado con detector rápido “ojo de
lince”, usando CuKα como radiación y silicio policristalino como patrón interno. Las
estructuras cristalinas de las fases presentes en las cerámicas sinterizadas fueron refinadas
y cuantificadas mediante un programa de ajuste por mínimos cuadrados.
Para evaluar la microestructura de los materiales cerámicos, las muestras se
pulieron y posteriormente se atacaron químicamente con acido acético diluido al 5 % con
el fin de revelar las fases presentes en las mismas. La superficie pulida de cada muestra se
0
100
700
800
900
1000
1100
1200
50
25 ºC/min
50 ºC/min
Te
mp
erat
ura
(ºC
)
Tiempo (min)
5 min
Pre
sión
(M
Pa)
1
66
Capítulo III
observaró mediante Microscopía Óptica de Luz Reflejada (MOLR) y Microscopía
Electrónica de Barrido de Emisión de Campo (MEB-EC), realizándose sobre las imágenes
obtenidas medidas estadísticas de la distribución del tamaño de grano, porosidad y
proporción de fases presentes utilizando un equipo de Análisis de Imagen. En muestras
seleccionadas, asimismo se realizó microanálisis puntual por Dispersión de Energía de
Rayos X (EDX) para identificar los elementos presentes y complementar la información
obtenida por DRX.
Las propiedades mecánicas, en particular la Dureza Vickers y el Módulo Elástico,
se determinaron empleando un equipo Zwick/Roell, Zhu 2.5. El estudio se realizó en todas
las muestras sinterizadas sobre superficie pulida perfectamente plano-paralela.
III.4.3.2 Estudios “in vitro” de los biomateriales
Para la caracterización “in vitro” de los biomateriales, las muestras sinterizadas por
el método convencional fueron previamente mecanizadas en forma de discos plano-
paralelos de ~10 mm de diámetro y ~2 mm de espesor y posteriormente pulidas según el
proceso descrito previamente. La rugosidad superficial se evaluó mediante un perfilómetro
Perthometer Mahr M1.
III.4.3.2.1 Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA)
Como se ha descrito ampliamente en el capítulo I, algunos materiales son capaces
de presentar una unión directa con el tejido óseo a través de la formación de una capa de
apatita en su superficie. Esta capa de apatita se puede reproducir en un medio fisiológico
específico, acelular y libre de proteínas, con una concentración iónica muy cercana a la del
plasma sanguíneo, denominado suero fisiológico artificial (SFA). Esta apatita, a nivel
composicional y estructural es muy similar a la del componente mineral del hueso. Sin
embargo, aunque este ensayo no es concluyente, permite predecir la bioactividad “in vivo”
de un material implantable como sustitutivo óseo, previa a la experimentación animal,
reduciendo considerablemente el número de ensayos de este tipo.
Para formular el SFA, se eligió la propuesta de Kokubo et al. [2], por ser la de
mayor grado de aceptación y uso para este tipo de ensayos, además de estar su
67
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
procedimiento de preparación regulado por la norma ISO-23317:2007. La concentración
iónica de la formulación del SFA empleada, junto con la del plasma humano, se recogen en
la tabla III.3.
Tabla III.3 Concentración iónica del SFA y del plasma sanguíneo.
Los biomateriales sinterizados por el método convencional, en forma de discos
plano-paralelos y pulidos de ~10 mm de diámetro y ~2 mm de espesor, se introdujeron en
tubos de polietileno de 100 ml con fondo cónico, como se muestra en la figura III.10, de tal
manera que la muestra estuviera plenamente inmersa en el SFA.
Figura III.10 Diseño experimental empleado en los ensayos de Bioactividad en SFA.
Ion Concentración iónica (mM)
Plasma Sanguíneo SFA
Na+ 142.0 142.0
K+ 5.0 5.0
Mg2+ 1.5 1.5
Ca2+ 2.5 2.5
Cl- 103.0 147.8
HCO3- 27.0 4.2
HPO42- 1.0 1.0
SO42- 0.5 0.5
pH 7.2-7.4 7.4
68
Capítulo III
El volumen de SFA introducido en cada recipiente se calculó a partir de la
expresión:
(Ecuación III.2)
donde VSFA es el volumen de SFA en ml y Sa es el área superficial aparente en mm2.
Las muestras fueron sometidas a tiempos de exposición comprendidos entre 1 y 4
semanas a la temperatura de 37 ºC y pH=7.4. Una vez finalizados los ensayos, los discos se
lavaron en agua desionizada y se secaron y almacenaron en un desecador hasta el momento
de su análisis. La evaluación de la reactividad de los materiales en dicho medio se realizó
analizando la composición del suero fisiológico artificial mediante Espectroscopía de
Emisión Atómica con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-OES),
determinando la variación de la concentración de iones Ca, P, Zn y Mg en el medio, a los
diferentes períodos de exposición.
Las superficies de las muestras se analizaron empleando Microscopía Electrónica
de Barrido de Emisión de Campo (MEB-EC), realizando adicionalmente microanálisis
puntual por Dispersión de Energía de Rayos X (EDX) en los casos considerados de interés
a los fines del presente trabajo. En las composiciones en las que se observó precipitación
superficial de agregados de Ca y P, se evaluó la estructura de los mismos mediante
Espectroscopía Raman a temperatura ambiente.
III.4.3.2.2 Ensayos de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” en un cultivo
primario de osteoblastos humanos
Las células empleadas en los estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in
vitro” fueron células provenientes de línea MG-63, constituida por células de osteosarcoma
humano de tipo osteoblástico.
Estas células, una vez descongeladas, se cultivaron en frascos de 75 cm2 de
superficie conteniendo 12 ml de medio de cultivo (DMEM, Dulbecco´s Modified Eagle
Medium, Gibco), suplementado previamente con 10 % suero fetal bovino (Gibco), 1 % v/v
Penicilina/Glutamina (Gibco). Las células se incubaron a 37 ºC en una atmósfera
10a
SFA
SV
69
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
humidificada al 5 % de CO2 en aire. El medio se renovó cada 2-3 días hasta que las células
alcanzaron la confluencia, momento en el que se procedió a su subcultivo con el fin de
prevenir la muerte celular.
Para proceder a su sub-cultivo, la monocapa celular se limpió en primer lugar con
una solución salina tampón (PBS) y se incubó con tripsina/EDTA durante 5 min con el fin
de despegar las células adheridas a la superficie del frasco de cultivo. El efecto de la
tripsina se inhibió adicionando medio de cultivo a temperatura ambiente.
Las células empleadas para realizar los experimentos de biocompatibilidad se
utilizaron tras la quinta subdivisión “quinto paso”. Todos los ensayos realizados se
llevaron a cabo empleando una densidad de 105 células/ml por pozo.
Cada una de las condiciones ensayadas se repitió un total de cinco veces. Los
resultados se representaron en función de la media aritmética ± desviación estándar del
total de los cinco ensayos. La significación estadística de las diferencias de los valores
medios obtenidos en los diferentes ensayos, fueron evaluadas mediante el método One-way
ANOVA (Análisis de la varianza en una dirección) empleando el software Origin 8.0. Se
han considerado que las diferencias entre los valores medios obtenidos respecto al control
o referencias elegidas eran estadísticamente significativas, cuando al aplicar el test de
comparaciones múltiples de Tukey, p< 0.05.
III.4.3.2.2.1 Experimentos de inhibición de crecimiento celular empleando
disoluciones concentradas de iones Zn2+ y Mg2+
Para evaluar el grado de toxicidad de iones Zn2+ y Mg2+ en contacto con células
humanas MG-63 de tipo osteoblasto, se realizaron experimentos de inhibición de
crecimiento celular empleando disoluciones concentradas de iones Zn2+ y Mg2+. En esta
dirección se prepararon disoluciones con distintas concentraciones de ZnCl2 y MgCl2 en
medio de cultivo abarcando rangos comprendidos entre 0-600 μM y 0-200 mM
respectivamente. A continuación se procedió a la incubación de estas disoluciones
concentradas, en placas de extracción de 24 pozos “24 well-plates” (área superficial ~1.5
cm2), en contacto directo con un cultivo previamente incubado durante 48 h.
70
Capítulo III
Una vez trascurrido un periodo de exposición de 48 h, se evaluó cualitativamente la
distribución y morfología de las células adheridas a la superficie de los materiales
mediante Microscopia Óptica de Luz Transmitida (MOLT).
El estudio de las alteraciones vitales de las células debido a la incorporación en el
medio de cultivo de estos iones, se dirigió fundamentalmente al estudio de la viabilidad y
proliferación celular en cada caso, determinando a su vez la máxima concentración iónica
no tóxica a partir de la cual se producía una muerte celular del 50 % (dosis letal-LD50).
Para la cuantificación de viabilidad celular, se empleó un Kit de uso comercial
denominado Cell Countong Kit 8 CCK-8 (protocolo WST-8), mientras que la proliferación
celular se determinó a través de la medida de la actividad de la Lactato Deshidrogenasa
(protocolo LDH).
III.4.3.2.2.2 Experimentos de interacción directa material-célula
Para evaluar la citotoxicidad de los materiales diseñados, se realizaron estudios de
la interacción directa material-célula. Antes de realizar este tipo de experimentos, los
materiales a caracterizar se esterilizaron en autoclave a 121 ºC durante 1 h y se
introdujeron en placas de extracción de 24 pozos.
Las células desadheridas en el paso anterior se contaron y se introdujeron en pozos
vacíos (referencias) y en pozos que contenían las distintas muestras de TCP puro y TCP
dopado con cinc y/o magnesio a analizar. Se empleó una densidad de 1x105 células/ml en
cada pozo y se incubaron durante 48 h.
Una vez transcurrido el tiempo de exposición, se evaluó cualitativamente la
distribución y morfología de las células adheridas a la superficie de los materiales
mediante Microscopia Electrónica de Emisión de Campo (FE-SEM) y Microscopía Láser
Confocal de Barrido (MCBL).
Seguidamente, se procedió a la cuantificación de la viabilidad celular (protocolo
WST-8) y proliferación (protocolo LDH) de las células MG- 63 en contacto con los
distintos materiales.
71
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
III.4.3.2.2.3 Experimentos de interacción indirecta material-célula
Para estos ensayos, los diferentes materiales a caracterizar se incubaron en medio
de cultivo, a 37 ºC en una atmósfera humidificada al 5 % de CO2 en aire, en ausencia de
células, durante periodos de tiempo comprendidos entre 1-3 semanas.
Una vez transcurridos los correspondientes tiempos de incubación, los productos
lixiviados de los diferentes materiales liberados en el medio de cultivo (sobrenadante) se
extrajeron y se testaron en contacto directo con un cultivo celular, previamente incubado,
durante 48 h.
Las alteraciones vitales de las células debidas a la incorporación en el medio de
cultivo de las especies iónicas liberadas, durante 48 h, se evaluaron una vez más mediante
Microscopio Óptico de Luz Transmitida (MOLT), cuantificando su viabilidad (protocolo
WST-8) y proliferación celular (protocolo LDH) después de 48 h.
Protocolo WST-8
Para evaluar cuantitativamente la viabilidad celular se empleó un Kit de uso
comercial denominado Cell Countong Kit 8 (CCK-8). Este tipo de kits, a través de ensayos
colorimétricos extremadamente sensibles, permiten obtener el número de células viables en
los ensayos de viabilidad celular. El reactivo empleado, WST-8, es una sal de tetrazolio
[sal monosódica del 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-
tetrazolio], que al reaccionar con el sistema mitocondrial de las células viables se reduce
por la deshidrogenasa celular, dando como resultado cristales de formazan. El formazan es
un compuesto de color amarillento cuya absorbancia a 450 nm puede ser medida
colorimétricamente a través de un espectrofotómetro. Esta reducción únicamente tiene
lugar cuando las enzimas reductasas de las mitocondrias están activas. Por tanto, los
valores de aborbancia obtenidos son directamente proporcionales la cantidad de células
vivas.
Protocolo LDH
Para evaluar cuantitativamente la proliferación celular, se midió la liberación de la
LDH (lactato deshidrogenasa) por las células muertas, mediante una reacción enzimática
72
Capítulo III
acoplada que se traduce en la reducción de la sal de tetrazolio en formazan de color rojo.
La actividad LDH se determina luego como una función de la oxidación del NADH o de la
reducción del tetrazolio durante un periodo de tiempo definido. La cantidad de la forma
reducida del colorante es proporcional al número de células lisadas. La producción de la
forma reducida del colorante se medió colorimétricamente determinando la absorbancia a
490 y 690 nm.
III.5 TÉCNICAS EXPERIMETALES
III.5.1 Análisis químico
III.5.1.1 Fluorescencia de Rayos X (FRX)
La Fluorescencia de Rayos X permite la identificación cualitativa y cuantitativa de
elementos químicos que poseen un número atómico superior al del boro. Esta técnica se
basa en la irradiación de la muestra con un haz de rayos X, produciendo la excitación de
los átomos como consecuencia de la absorción del haz primario. El retorno por parte del
átomo, hasta su estado fundamental, hace que emita su radiación característica (emisión
secundaria o fluorescencia de radiación X).
Los análisis presentados en esta memoria se han llevado a cabo empleando un
espectrofotómetro MagiX PW 2424 (Philips, Holanda) con un tubo de rayos X de Rodio.
Las muestras analizadas se prepararon en forma de perla fundiendo una mezcla homogénea
de 0.3 g de muestra en polvo y 5.5 g de Li2B4O7 en un crisol de Pt-Au. El espectrómetro
está equipado con el software analítico IQ+ que permite el análisis cualitativo y
cuantitativo de las muestras. Esta aplicación incluye los parámetros necesarios para los
cálculos correspondientes a la corrección inter-elemental. Los valores obtenidos se han
corregido con las correspondientes curvas de calibrado obtenidas a partir de patrones
certificados de materiales de fosfatos.
Mediante esta técnica se han realizado los análisis químicos de las materias primas
de partida empleadas en la preparación de los materiales y se han determinando las
relaciones Ca/P, (Zn+Ca/P), (Mg+Ca/P) y (Mg+Zn+Ca/P) de los polvos calcinados.
73
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
III.5.1.2 Espectroscopía de Emisión Atómica con fuente de Plasma de Acoplamiento
Inductivo (ICP-OES)
Esta técnica de análisis se basa en la vaporización, disociación y excitación de los
diferentes elementos químicos de una muestra en el interior de un plasma. Durante el
proceso de desexcitación, los átomos neutros e iones inmersos en el plasma emiten
radiación electromagnética, en la zona del UV-visible, característica de cada elemento. El
análisis de las muestras en disolución se ha realizado empleando un espectrómetro IRIS
ADVANTAGE (Thermo Jarrel Ash, USA) con sistema de visualización dual, una fuente
de radiofrecuencia de 40, 68 MHz, red de difracción tipo “Echelle” y detector de estado
sólido de transferencia de carga (CID).
Esta técnica se empleó para determinar la variación en la concentración iónica de
calcio, fósforo, cinc y magnesio en el Suero Fisiológico Artificial (SFA), una vez
finalizados los ensayos descritos en el apartado III.4.3.2.1.
III.5.2 Densidad
III.5.2.1 Picnometría de gas (He/Aire)
La densidad de los materiales de partida se determinó empleando picnometría de
gas (He/Aire), empleando un picnómetro Monosorb Multipycnometer de Quantachrome
Corporation (EEUU). La picnometría de gas permite determinar el volumen de un polvo,
mediante la diferencia de presión ejercida por una cantidad de Helio en una célula de
referencia (P1) de volumen conocido (VR) y la presión de gas en una célula problema (P2)
de volumen (VC), donde se encuentra la muestra en polvo a determinar. El volumen del
polvo (VP) se obtiene aplicando la ley de los gases ideales:
1)(
2
1
P
PVVV RCP (Ecuación III.3)
Una vez determinado el volumen del polvo VP, conocida la masa del polvo introducido mP,
se puede calcular su densidad.
74
Capítulo III
III.5.2.2 Densidad aparente
La densidad aparente y la porosidad abierta de las muestras sinterizadas se
calcularon mediante el método de inmersión. Este método, que utiliza el Principio de
Arquímedes, se basa en la medida del empuje que sufre un cuerpo sumergirlo en un
líquido, agua desionizada en este caso. El cálculo se realiza mediante las siguientes
relaciones:
OHaparente mm
m2
21
1
(Ecuación III.4)
OHabierta mm
mmP
2
23
13
(Ecuación III.5)
Donde m1 es el peso de la muestra seca, m2 el peso de la muestra sumergida, m3 el peso de
la muestra húmeda y H2O la densidad del H2O a la temperatura de medida.
III.5.2.3 Densidad real y densificación
La densidad real y la densificación de los materiales desarrollados se calcularon a
partir de las densidades aparentes de las muestras obtenidas, teniendo en cuenta las
densidades teóricas de las fases cristalinas presentes en los materiales y la cuantificación
obtenida por Difracción de Rayos X (DRX) de las mismas, mediante las siguientes
expresiones:
100
) * pesoen (%+) * pesoen (% teórica (Ecuación III.6)
100
(%) teórica
aparenteiónDensificac
(Ecuación III.7)
Donde ρα=2.86 g/cm3, ρβ=3.07 g/cm3 son las densidades teóricas de los polimorfos α-TCP
y β-TCP respectivamente y (%) el tanto por ciento en peso de la fase α y/o β.
ρreal
ρreal
75
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
III.5.3 Tamaño de partícula
El tamaño medio de partícula (d50) y la distribución del tamaño de partícula de los
materiales de partida y de las composiciones homogeneizadas y pre-sinterizadas tras la
molturación se obtuvieron empleando un analizador de pulso láser de Malvern, modelo
Mastersizer S (Reino Unido). Este equipo evalúa tamaños medios de partícula
comprendidos entre 0.20–880 μm, basándose en la teoría de la dispersión de luz láser de
bajo ángulo (LALLS). La fuente de luz es un láser de He–Ne con una longitud de onda
λ=632.8 nm. El haz del láser interacciona con las partículas de sólido en suspensión,
dispersándose a determinados ángulos en función del tamaño de las partículas.
El tratamiento de los datos se puede llevar a cabo empleando la teoría de
Fraunhofer, según la cual las características de la dispersión de la luz no dependen de las
propiedades ópticas de la muestra. Dicha teoría se aplica únicamente a polvos que están
constituidos por varios compuestos y a muestras de tamaño micrométrico elevado, ya que
introduce serios errores de medida en partículas submicrónicas. Para caracterizar las
partículas submicrónicas es necesario emplear la teoría de Mie, que describe la dispersión
de la luz para esferas ópticamente homogéneas, siendo necesaria la introducción del índice
de refracción de la fase sólida dispersa y del medio de dispersión. Este ha sido el método
utilizado en la presente memoria.
Las muestras se dispersaron en etanol en un baño de ultrasonidos durante 15
minutos añadiendo como defloculante Dolapix CE64.
III.5.4 Superficie específica (Se)
La cuantificación de la superficie específica de los compuestos en polvos se ha
realizado mediante el método dinámico en un equipo Monosorb Surface Area Analyser
MS-13 (Quantachrome Corporation, USA).
Su funcionamiento se basa en la determinación de la cantidad de N2
adsorbido/desorbido de la superficie de un sólido, mediante la integración de la señal
diferencial de dos detectores de conductividad térmica situados antes y después de la
muestra.
76
Capítulo III
El área superficial de los sólidos se puede calcular mediante la ecuación III.8:
(Ecuación III.8)
donde S0 es la superficie ocupada por un mol de adsorbato, w es el peso de la muestra y Nm
la capacidad de la monocapa, el cual se calcula aplicando la ecuación de Brunauer, Emmet
y Teller [3]:
(Ecuación III.9)
donde P es la presión del adsorbato en equilibrio con la cantidad de N de sustancia
adsorbida, P0 es la presión de saturación del adsorbato puro a la temperatura de adsorción y
C es un parámetro relacionado con la entalpía molar de adsorción. El valor C puede
considerarse constante para el intervalo de fracción molar de 0.05 a 0.35. Representando
⁄ frente a ⁄ se pueden obtener los valores de Nm y C.
En este trabajo se empleó el método de un solo punto, que consiste en la
determinación de de un punto a valor de presión parcial de nitrógeno suficientemente baja
(0.3) para considerar un comportamiento lineal de la isoterma definida por la ecuación.
Uniendo este punto con el origen de coordenadas se pueden determinar los parámetros de
la ecuación y, por tanto, el valor de la capacidad de la monocapa de gas adsorbido.
III.5.5 Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG)
El Análisis Térmico Diferencial (ATD) se basa en el registro de los cambios de
temperatura, que con respecto a una sustancia de referencia térmicamente inerte, tienen
lugar en una muestra cuando es calentada o enfriada a una velocidad constante en
atmósfera controlada. La Termogravimetría (TG) detecta variaciones de peso que se
producen en la muestra, al someterla a un tratamiento térmico, referido al mismo patrón.
Estos análisis permiten obtener información acerca de la estabilidad térmica de las
composiciones bajo estudio. La variación de la masa con la temperatura puede ser debida a
distintos procesos tales como: descomposición, sublimación, reducción, desorción,
adsorción y vaporización [4–7].
77
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Las curvas ATD-TG se registraron en un equipo Netzsch modelo STA-409 que
incorpora un controlador de temperatura TASC 414/2 Netzsch para el horno. Para realizar
los ensayos se utilizaron entre 80 y 100 mg de masa de muestra que se depositaron sobre
crisoles de platino, empleándose alúmina (α-Al2O3) calcinada como material de referencia.
Los análisis se realizaron en un intervalo de temperatura entre 30 y 1500 ºC, bajo un flujo
de aire de 0.04 l/min, con una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min, con el fin de
simular las condiciones de la etapa de sinterización.
III.5.6 Dilatometría de Alta Temperatura (DAT)
La dilatometría de alta temperatura permite conocer la variación dimensional de
una muestra en función de la temperatura. El cambio dimensional experimentado por una
muestra compactada durante su tratamiento térmico se utiliza como método para estudiar
su sinterabilidad. Aunque dichos cambios dimensionales son en general anisótropos,
midiendo la contracción o expansión del material a lo largo de una dirección, se puede
obtener información sobre los procesos que ocurren durante este tratamiento. Formalmente
el cambio dimensional se define como dL/L0, cantidad que refleja el cambio en la longitud
inicial del compacto, L0, al alcanzar una longitud final, LS, durante la sinterización. Si
LS<L0 entonces dL/L0<0 indicando que la muestra ha contraído y que su densidad, si no se
ha producido variación en la masa del compacto, ha aumentado. En el caso contrario, el
material se habría expandido y su densidad habría disminuido. Para procesos de
calentamiento a velocidad constante se puede registrar además la velocidad de contracción
en función de la temperatura, d(ΔL/L0)/dT.
Los ensayos dilatométricos se efectuaron en un dilatómetro Netzch 407/E. Las
condiciones de trabajo fueron similares a aquellas empleadas durante la sinterización, con
una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min. Las muestras se compactaron por prensado
uniaxial en forma de cilindros plano-paralelos de 5 mm de altura. Durante el tratamiento de
los datos se restaron las dilataciones/contracciones del soporte y el palpador, determinadas
durante el proceso de calibración previa del equipo.
78
Capítulo III
III.5.7 Microscopía Óptica de Calefacción
La Microscopía de Calefacción o de alta temperatura, a veces denominada también
dilatometría óptica, permite a través de una cámara acoplada a un horno tubular y un
programa de análisis de imagen, seguir la evolución con la temperatura de diferentes
parámetros de muestras sólidas en verde obtenidas a partir de polvo prensado o piezas de
forma geométrica sencilla–como pequeños cilindros o cubos. Durante el ensayo se registra
la variación del área de la muestra, los ángulos de contacto de ésta con el sustrato, los
ángulos formados por las esquinas superiores de la muestra, la anchura y la altura de la
muestra y la variación de un factor de forma calculado en base a algunos de los anteriores
parámetros. Todo ello permite determinar una serie de temperaturas características de los
materiales que definen la temperatura de deformación, la temperatura de comienzo y
evolución de la sinterización, y en caso de fusión, las temperaturas de formación de esfera
y/o de semiesfera y de fluencia, de acuerdo a la normas UNE establecidas.
Las muestras se caracterizaron en el intervalo de temperaturas de 25-1300 ºC con
una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min para simular las condiciones de la etapa de
sinterización. Se ha empleado un horno HR18 de Hesse Instruments con resistencias de Pt-
Rd, que posibilitan alcanzar una temperatura máxima de trabajo de 1650 ºC. El horno está
acoplado a un sistema óptico y de Leica-Microsystems y Análisis de Imagen EMI.
III.5.8 Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR)
La espectroscopía infrarroja es una técnica analítica instrumental que permite
conocer los principales grupos funcionales de la estructura molecular de un compuesto, al
estudiar la interacción entre la materia y la radiación infrarroja. Esta información se
obtiene a partir del espectro de absorción de dicho compuesto al someterlo a la radiación
infrarroja en el espectrofotómetro considerado. Se utiliza para obtener información de los
cambios que experimenta el material, estudiando las frecuencias de vibración de la red. Se
puede considerar que la energía total de una molécula es la suma de cuatro contribuciones
energéticas: electrónica, vibracional, rotacional y traslacional.
El espectro de infrarrojo se origina por una absorción de fotones de energía
correspondiente a la región del infrarrojo, generando una transición entre niveles de
79
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
energía vibracionales en una molécula. Se utiliza la interferencia entre dos haces de
radiación, lo que ha dado lugar a la espectroscopia de infrarroja de transformada de Fourier
(FTIR) [8–11].
En muestras presinterizadas, previamente seleccionadas, se realizaron espectros en
absorción, que fueron registrados en un espectrofotómetro Perkin-Elmer (USA) modelo
FTIR 1720X con una resolución de 2 cm-1 en el intervalo de frecuencias 4000–400 cm−1.
Para la realización de las medidas se prepararon pastillas en las que se mezclaron 5 mg de
muestra con 250 mg de KBr.
III.5.9 Difracción de Rayos X (DRX)
La identificación de las distintas fases cristalinas presentes en las muestras, se
realizó mediante Difracción de Rayos X (DRX), a temperatura ambiente.
La Difracción de Rayos X constituye una herramienta muy poderosa para el estudio
de la composición mineralógica de una muestra cristalina. La DRX se basa en la reflexión
de las ondas electromagnéticas incidentes por planos sucesivos de átomos en un cristal. Al
incidir un haz de rayos X según un ángulo θ, parte de la radiación se refleja y parte se
transmite. Esta situación se repite en los sucesivos planos. Todas las ondas reflejadas en un
plano cristalino estarán en concordancia de fase y sólo en ciertas condiciones también se
produce la reflexión en concordancia de fase de dos planos sucesivos. Para ello, es
necesario que la diferencia de recorridos entre las ondas difractadas por dos planos
sucesivos sea un número entero de longitudes de onda (n). Así, para dos ondas reflejadas
en un punto P, la diferencia de recorridos entre los dos planos será =AB+BC. Por simetría
AB=BC y =2AB, resultando =2sen(), siendo d, la separación entre dos planos
consecutivos (espaciado reticular). La condición de reflexión establecida por W. Bragg y
W. L. Bragg indica que la diferencia de caminos recorridos es un múltiplo entero de la
longitud de onda [12]:
dsenn 2 (Ecuación III.10)
Donde es la longitud de onda de la radiación, d es el espaciado entre planos atómicos y θ
es el ángulo del haz incidente.
80
Capítulo III
Las distancias entre los planos que definen la red cristalina determinan el valor del
ángulo de Bragg, cuya posición se considera como una “huella dactilar” del sólido
ordenado. De esta manera, los patrones de difracción suministran información inequívoca
de la estructura cristalina. La posición angular de los máximos de difracción se relaciona
con los parámetros de la celda unidad, mientras que las intensidades reflejan la simetría de
la red y la densidad electrónica dentro de la celda unidad [13]. Cada sustancia cristalina
produce un difractograma único. En una mezcla de componentes, cada sustancia presenta
un difractograma independientemente de las otras, y por ello, esta técnica se emplea para la
identificación de mezclas y componentes.
El difractómetro empleado ha sido un difractómetro de polvo Bruker D8 Advance
con radiación Kα de Cu y con detector rápido “ojo de lince” (Bruker, Germany) con
radiación y condiciones de 40 kV de voltaje y 40 mA de intensidad. El programa de
barrido empleado fue: intervalo angular de 2θ entre 10 y 90 º y tiempo de adquisición por
paso de 0.017 s. Los difractogramas se han comparado con los estándar de la base de datos
de Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) usando el programa EVA
6.0 Diffrac plus (Bruker AXS, Alemania).
Cálculo del tamaño de cristalito mediante DRX
El ensanchamiento de los máximos de Bragg puede originarse principalmente por
dos fenómenos: (1) ensanchamiento asociado al instrumento de medida, debido a la falta
de monocromaticidad de la radiación y a la divergencia del haz incidente. (2)
ensanchamiento debido a la naturaleza del material, fundamentalmente debido a que posee
un tamaño de cristalito/dominio de coherencia inferior a 1000 Å.
(1) El ensanchamiento del máximo de difracción debido al equipo utilizado se
puede estimar a partir de la anchura a la mitad de la altura del máximo de difracción,
2(∆θ), de una muestra patrón, que debe ser de la misma composición que la estudiada pero
con un tamaño de cristal superior a 1000 Å y libre de tensiones internas. El diagrama de
difracción de una muestra es la deconvolución de la contribución de la estructura de la
muestra y la debida al instrumento. Restando el ensanchamiento en la muestra patrón del
ensanchamiento experimental obtenido para una muestra, podemos obtener de manera
81
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
bastante aproximada el ensanchamiento debido a las deformaciones y el tamaño de grano
de la muestra:
patrónmuestra )(2)(2)(2 exp (Ecuación III.11)
(2) Cuando un haz incide sobre un cristal infinito con un ángulo muy próximo al
correspondiente ángulo de Bragg, los haces difractados por los distintos planos sufren una
interferencia destructiva. Esto quiere decir que para todo haz difractado existe siempre otro
plano del cristal que difracta un haz opuesto en fase con el anterior. Sin embargo, debido al
tamaño finito del cristal, para un haz que incide sobre una familia de planos de un cristal
con un ángulo muy próximo al correspondiente ángulo de Bragg, la radiación reflejada a
posiciones angulares vecinas a la posición exacta no se anula, sino que se suma; entonces,
en lugar de tener una línea de difracción tenemos un máximo de difracción. La anchura a
mitad de altura del máximo de difracción puede relacionarse con el tamaño del dominio de
coherencia (o tamaño del cristalito). Esta expresión, conocida como fórmula de Scherrer
[14], viene dada por:
cos)(2
9.0
D
(Ecuación III.12)
Donde 2(∆θ) es la anchura a mitad de altura del máximo de difracción.
Para la determinación de la anchura a mitad de altura del máximo de difracción, el
espectro de difracción se deconvolucionó como la suma de funciones PseudoVoigt
asignando a cada una de ellas los máximos de difracción correspondientes a la estructura
de cada uno de los polimorfos del fosfato tricálcico. La anchura del pico a media altura
(FWH), el área y la posición de los picos fueron extrapolados del ajuste.
82
Capítulo III
Refinamiento Rietveld
En el presente trabajo se empleó el método de Rietveld para el refinamiento de
estructuras cristalinas y análisis cuantitativo de las fases cristalinas presentes en las
muestras después del tratamiento térmico de sinterización.
El refinamiento de una estructura cristalina por el método Rietveld consiste en
minimizar la diferencia entre un difractograma experimental y uno calculado utilizando un
modelo estructural aproximado y unos parámetros que permitan distribuir las intensidades
de las diferentes reflexiones en el difractograma. Durante el refinamiento, los parámetros
atómicos y globales se optimizan en un procedimiento de ajuste por mínimos cuadrados.
El programa informático utilizado para el estudio de los difractogramas obtenidos
fue el Fullprof 2k [15,16]. Los parámetros refinados fueron: el desplazamiento de cero, el
fondo, los parámetros de la celda y los de la forma de los picos, la orientación preferente y
la fracción de las fases presentes.
III.5.10 Espectroscopía Raman
Cuando una muestra se irradia con fotones se excita y posteriormente puede
relajarse de dos maneras: volviendo al estado energético en el que se encontraba o pasando
a un estado energético diferente. En la mayoría de los casos, retorna al estado inicial
liberando una energía igual a la absorbida, denominada dispersión elástica o de Rayleigh.
Pero se dan ocasiones “normalmente una entre un millón o diez millones” en las que no
vuelve a su estado inicial dando lugar a la dispersión inelástica que caracteriza el fenómeno
Raman. Cuando el nivel energético final es más elevado que el inicial, esta dispersión
Raman se denomina Stokes, mientras que cuando el nivel energético final posee una
energía menor que el inicial, la dispersión Raman se denomina anti-Stokes. Las
transiciones tipo Stokes son más probables que las anti-Stokes a temperaturas moderadas,
motivo por el cual los estudios Raman suelen realizarse en la zona Stokes. La separación
que presentan las bandas Stokes y anti-Stokes con respecto a la dispersión Rayleigh es
idéntica, ya que corresponde al cambio entre dos niveles energéticos en un sentido o en el
contrario [17].
83
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
Estas transiciones entre niveles energéticos corresponden a transiciones entre
estados vibracionales. Para obtener un espectro Raman la muestra se irradia con un haz
láser y se estudia la luz dispersada. De esta manera, en la Espectroscopía Raman se miden
frecuencias vibracionales como un desplazamiento entre la energía del haz incidente y el
dispersado. Como esto no depende de la longitud de onda del haz incidente, siempre se
obtiene el mismo valor de desplazamiento Raman en las bandas observadas,
independientemente de la luz con que se irradia la muestra.
El equipo empleado para la caracterización de las muestras es un Raman confocal
de la casa comercial WITec (Alemania) modelo alpha-300R acoplado a un Microscopio de
Fuerzas Atómicas. En este caso los espectros se realizaron con un láser de longitud de onda
de excitación 532 nm y una fibra de 25 µm de diámetro sobre puntos y áreas de distintas
dimensiones y tiempos de integración. Se empleo una potencia del laser incidente de 0.5
mW. La resolución óptica del microscopio confocal está limitada lateralmente a ~200 nm y
verticalmente a 500 nm. La resolución de los espectros Raman del sistema es de 0.02 cm-1.
Los espectros adquiridos una vez finalizados los ensayos se analizaron y procesaron a
través del programa WiTec Project 2.02 (Alemania).
III.5.11 Propiedades Mecánicas: Dureza (HV) y Módulo Elástico (E)
La caracterización mecánica de los biomateriales obtenidos en la presente memoria
se realizó determinando su módulo de elasticidad y su microdureza Vickers.
El modulo elástico y la dureza de los materiales se determinaron mediante un
equipo de micro-indentación instrumentalizado ZHU 2.5, (Zwick GmbH & Co. KG,
Alemania) utilizando una punta de diamante tipo Vickers. Se midieron tres muestras por
composición y temperatura, realizándose entre 10 y 15 indentaciones por muestra. La carga
aplicada fue de 9.8 N, la velocidad de aplicación de la misma de 0.5 mm/min y el tiempo
de residencia de 15 s. El software asociado registra simultáneamente la carga y
desplazamiento de la punta. A partir de la curva resultante el software calcula
automáticamente el módulo elástico a partir de la pendiente de la curva (desplazamiento-
carga), en el intervalo de 95 a 60%, durante el ciclo de descarga. La dureza se calcula
midiendo las diagonales de la huella y aplicando la ecuación 3.12:
84
Capítulo III
(Ecuación III.13)
Donde F se expresa en Newton y la diagonal de la huella d, en milímetros.
III.5.12 Perfilómetro
La rugosidad de los materiales, previamente pulidos, se caracterizó empleando un
perfilómetro lineal, Perthometer M1, (Mahr GmbH, Alemania). Este equipo dispone de
tres tamaños de recorrido de análisis (1.75 mm, 5.6 mm, 17.5mm). El recorrido lineal
empleado en los ensayos fue 5.6 mm. Al final del recorrido el equipo integra los valores
medidos y proporciona la rugosidad media de la línea (Ra), la profundidad media de la
rugosidad (Rz) y la profundidad máxima (Rmax).
III.5.13 Microscopía Óptica de Luz Reflejada (MOLR) y Transmitida
(MOLT)
La microscopía óptica de luz reflejada se ha empleado para observar los materiales
previamente pulidos, a fin de analizar tanto su microestructura como los defectos e
imperfecciones presentes en los mismos. También se empleó para caracterizar las huellas
de indentación obtenidas en los ensayos mecánicos. Se utilizó un microscopio óptico de luz
polarizada Zeiss Axiophot (Alemania) con una cámara digital adaptada AxioCam MRc5
para la adquisición de micrografías.
En configuración de luz transmitida se observaron las células adheridas
superficialmente en placas de extracción de 24 pozos en los ensayos de biocompatibilidad
“in vitro”, caracterizando cualitativamente, a través de las imágenes adquiridas, su
distribución y morfología.
2
1891.0
d
FH
85
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
III.5.14 Microscopía Electrónica de Barrido con Emisión de Campo y
microanálisis puntual por Dispersión de Energía de rayos X (MEB-EC y
EDX)
La Microscopía Electrónica de Barrido permite analizar la microestructura y
determinar de una manera directa el tamaño de los cristales. En esta microscopía un haz de
electrones se enfoca sobre la muestra y barre una pequeña área rectangular. Los electrones
que conforman el haz interactúan con la muestra produciendo electrones secundarios,
corrientes internas, emisión de fotones, etc., que son apropiadamente detectados y
utilizados para generar una imagen. Los electrones retrodispersados y los secundarios son
los que constituyen las señales de más interés en esta técnica, ya que dependiendo de las
diferencias topográficas de la superficie, el haz de electrones que incide sobre las muestras
dará lugar a distintas intensidades de los mismos.
Las materiales a caracterizar se colocaron sobre un portamuestras y se sometieron a
un proceso de metalización para hacer su superficie conductora. Este proceso se lleva a
cabo mediante evaporación y deposición en vacío de una capa de plata o carbono de
aproximadamente 10 nm sobre la superficie pulida. Este espesor de recubrimiento metálico
es suficiente para eliminar los efectos de carga y la degradación térmica durante la
observación. Además del análisis microestructural de los materiales, se realizaron análisis
cualitativos y semicuantitativos simultáneos mediante microanálisis puntual por Dispersión
de Energía de rayos X (EDX). Estos espectros se analizan con un programa de corrección
ZAF que tiene en cuenta la influencia del número atómico (Z), la absorción del detector
(A), y la fluorescencia de rayos X inducida en la muestra (F).
En este trabajo se ha utilizado un Microscopio Electrónico de Barrido de Emisión
de Campo Hitachi S-4700 (MEB-EC) con una resolución de 1.5 nm a 15 kV, que permite
una variación en el voltaje de aceleración de 0.5 a 30 kV. El voltaje de trabajo empleado
para las muestras se encuentra en el rango 20-25 kV. El equipo incorpora una microsonda
EDS Noran provista de software de adquisición de datos System Six.
86
Capítulo III
III.5.15 Análisis de Imagen
En el análisis de las imágenes se realizó empleando un método semiautomático
para la adquisición, tratamiento y medida de la relación de aspecto (longitud/espesor),
número de cristales/granos y desviación estándar. El método parte de una imagen
digitalizada previamente obtenida por microscopía que se transforma en una imagen
binaria que define y delimita el objeto a medir. Estas mediciones se llevaron a cabo con un
procesador de imágenes provisto de un programa de Análisis Leica Qwin de Leica
Microsystems. Dicho analizador mide el área de cada grano y transforma su superficie
irregular en un círculo de diámetro equivalente. Para que este método sea fiable es
necesario realizar el conteo sobre el mayor número posible de partículas o granos. En el
análisis, más de 300 granos fueron medidos en cada muestra. El error en el tamaño de
grano se estima a partir de la desviación en el valor medio, obtenido del análisis de
diferentes micrografías correspondientes a la misma muestra.
III.5.16 Microscopía Confocal de Barrido Láser (MCBL)
La evaluación de las características morfológicas de las células adheridas en
contacto directo con los materiales desarrollados, se realizó empleando fundamentalmente
un Microscopio Láser Confocal de Barrido (CLSM Leica SPS).
Para ello, una vez finalizadas los ensayos descritos en el apartado III.4.3.2.2.2, las
muestras cultivadas, una vez desechado el medio de cultivo, se prepararon para su
observación. En primer lugar se limpiaron con PBS. A continuación añadió en cada pozo
de cultivo 250 l de una disolución que contenía 2 l de Calceina 1 mM y 0.75 l de
Ioduro de Propídio 1.5 mM en PBS. Esta preparación se mantuvo durante 5 min para
colorear las células vivas y las muertas en cada caso. Finalmente, las muestras se
extrajeron de los pozos de cultivo y se introdujeron en crisoles. Éstas se cubrieron con PBS
y se mantuvieron en la oscuridad durante su caracterización microscópica. Las imágenes
adquiridas una vez concluidos los ensayos se procesaron empleando un programa de
análisis de imagen de la firma Leica.
87
Materiales de Partida, Metodología Experimental y Técnicas de Caracterización
BIBLIOGRAFÍA
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88
Capítulo III
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[17] M. Faraldos & C. Goberna "Técnicas de Análisis y Caracterización de Materiales." Ed. Biblioteca de Ciencias (CSIC), 2002
Capítulo IV
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases
ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
91
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
IV. Estudio de los diagramas de equilibrio de fases
ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
IV.1 INTRODUCCIÓN
Las propiedades de un material cerámico consolidado a alta temperatura dependen
de las fases presentes, de su composición y proporción y de cómo están geométricamente
distribuidas en la microestructura a escala, macro, micro, nano e incluso a nivel atómico.
En este sentido, el conocimiento y comprensión de las relaciones de equilibrio de fases,
establecidas a partir del estudio de las condiciones termodinámicas de equilibrio,
representadas gráficamente mediante los correspondientes diagramas de equilibrio de
fases, constituye una herramienta muy poderosa y de vital importancia en el campo de la
ciencia de materiales a la hora de diseñar materiales a medida, donde las propiedades son
optimizadas en función de su composición química, mineralógica y su microestructura.
La necesidad de abordar el estudio de los sistemas ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-
CaO-P2O5, con el objetivo de controlar los parámetros de diseño y el procesado y
consolidación a alta temperatura, de los biomateriales descritos en esta memoria, radica en
la escasez de datos presentes en la literatura. Por tanto, establecer estos diagramas de
equilibrio se puede considerar como el primer paso a la hora de predecir las fases formadas
y su proporción, en los procesos de reacción y sinterización que tienen lugar durante el
tratamiento térmico de los biomateriales a estudio. La obtención de una información
detallada de los rangos de temperatura y composición en los que las diferentes fases son
estables, así como sus transformaciones y/o transiciones de fases y sus estados de
equilibrio/no equilibrio o equilibrio metaestable es absolutamente indispensable para su
desarrollo. Estos datos permitirán establecer previsiones sobre las propiedades finales de
los materiales y en definitiva adecuarlas a los requerimientos demandados en sus
potenciales aplicaciones.
IV.2 REVISION BIBLIOGRÁFICA
Antes de abordar el estudio experimental de los sistemas ternario ZnO-CaO-P2O5 y
cuaternario MgO-ZnO-CaO-P2O5, se procedió a efectuar una exhaustiva revisión
92
Capítulo V
bibliográfica de los siguientes sistemas binarios, pseudo-binarios y ternarios: CaO-P2O5,
ZnO-P2O5, MgO-P2O5, Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2, Mg3(PO4)2-Zn3(PO4)2, CaO-MgO-P2O5 y
MgO-ZnO-P2O5.
IV.2.1 Sistema CaO-P2O5
Los primeros diagramas de equilibrio de fases propuestos en la literatura en el
sistema binario CaO-P2O5 [1–4] incluían los campos de estabilidad y las relaciones de
fusión de los compuestos: Ca4(PO4)2O ó (C4P), Ca3(PO4)2 ó (C3P o TCP), Ca2P2O7 ó (C2P),
Ca(PO3)2 ó (CP), Ca2P6O17 ó (C2P3) y CaP4O11 ó (CP2), así como las temperaturas de
transición α/β de los polimorfos correspondientes a los compuestos Ca3(PO4)2 y Ca2P2O7.
Hill et al. [2] añadieron las fases α/β-Ca2P2O7 y Ca(PO3)2 en la región del sistema que
estudiaron, considerando el compuesto Ca7P10O32 ó (C7P5) y sus correspondientes
relaciones de fusión. Éstos autores pusieron en duda la existencia de los rangos de solución
sólida en las fases Ca(PO3)2 y β-Ca2P2O7 que habían sido establecidos en los trabajos
anteriormente mencionados. En posteriores estudios [5,6], se incorporó el polimorfo α´-
Ca3(PO4)2 al sistema, y se incidió nuevamente en la presencia de amplios rangos de
solución sólida de P2O5 en los polimorfos del Ca3(PO4)2.
La versión más completa del diagrama de equilibrio CaO-P2O5 fue publicada en
1967 por Kreidler y Hummel [7], figura IV.1, construido a partir de datos experimentales
obtenidos en la zona de subsólidus y las relaciones de fusión y transformación recogidas de
la literatura. La presencia de soluciones sólidas en los polimorfos del fosfato tricálcico
reportada por Welch et al. [5] fue descartada y se demostró la estabilidad del compuesto
Ca7P10O32 hasta la temperatura de 800 ºC. Finalmente los estudios sobre la ubicación del
punto eutéctico del sistema fosfato tricálcico-fosfato dicálcico [8], la temperatura de
transición polimórfica α-Ca3(PO4)2 → α´-Ca3(PO4)2 [9] y la reciente descripción de la fase
líquida de este sistema, mediante modelización termodinámica empleando la metodología
CALPHAD (CALculation of PHAse Diagram) [10], ha permitido establecer una buena
concordancia de estas investigaciones con los datos previamente publicados en la
literatura.
93
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.1 Diagrama de equilibrio de fases del sistema CaO-P2O5 según Kreidler y
Hummel [7].
94
Capítulo V
En la revisión de este sistema, es importante reseñar el estudio realizado por
P.V. Riboud et al. [11] sobre el diagrama CaO-P2O5-H2O, figura IV.2. Estos autores
establecieron las temperaturas de descomposición y las variaciones en los rangos de
estabilidad de la hidroxiapatita Ca10(PO4)6(OH)2 (HAp) y del Ca4(PO4)2 (C4P) a una
presión parcial de vapor de agua p(H2O)=0 mm Hg y p(H2O)=500 mm Hg y PT=1 atm.
Asimismo, pusieron de manifiesto la estabilidad de la fase HAp frente al Ca4(PO4)2O a
temperaturas inferiores a 1360 ºC, a una presión parcial de vapor de agua de 500 mm de
Hg (~66 kPa).
Figura IV.2 Diagrama de equilibrio de fases del sistema CaO-P2O5 a PT=1 atm:
a) p(H2O)=0 mm Hg y b) p(H2O)=500 mm Hg (~66 kPa) según Riboud [11].
IV.2.2 Sistema ZnO-P2O5
Katnack y Hummel [12] establecieron las relaciones de equilibrio de fase en el
sistema ZnO-P2O5, elaborando el primero y el más completo diagrama de equilibrio, figura
IV.3, de este sistema. Partieron de la información publicada en un trabajo previo [13], en el
que se proclamaba la existencia de tres formas polimórficas del ortofosfato de cinc,
a) b)
95
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Zn3(PO4)2. Asimismo, delimitaron los campos de estabilidad de los compuestos: Zn3(PO4)2
ó (Z3P), Zn2P2O7 ó (Z2P) y Zn(PO3)2 ó (ZP) y determinaron sus temperaturas de transición
polimórfica y relaciones de fusión.
El Zn3(PO4)2 presenta una transformación polimórfica α→β lenta y reversible a
942 ºC y fusión congruente a 1060±8 ºC. En el Zn2P2O7 dicha inversión α→β es rápida y
reversible y tiene lugar a 132 ºC, fundiendo congruentemente a 1017 ºC. Finalmente el
Zn(PO3)2, presenta una transformación polimórfica, en este caso irreversible, α→β, en el
rango de temperaturas, 600-700 ºC.
Figura IV.3 Diagrama de equilibrio de fases del sistema ZnO-P2O5 según Katnack
y Hummel [12].
Recientemente se ha abordado el cálculo termodinámico de este sistema empleando
la metodología CALPHAD, con el objetivo fundamental de proponer modelos
termodinámicos que permitan describir las distintas fases del sistema, a partir del cálculo
de sus correspondientes funciones de energía de Gibbs. Se ha demostrado que los
resultados calculados reproducen adecuadamente las propiedades termodinámicas
experimentales del sistema ZnO-P2O5 recopiladas de la bibliografía, reforzando al mismo
tiempo la validez de los modelos empleados. La modelización propuesta para la fase
a) b)
96
Capítulo V
líquida, ha permitido simular su constitución y sus propiedades a diferentes temperaturas
[14].
IV.2.3 Sistema MgO-P2O5
Los estudios de J. Berak [15] en este sistema, figura IV.4, pusieron de manifiesto la
existencia de tres compuestos intermedios: Mg3(PO4)2 ó (M3P), Mg2P2O7 ó (M2P) y
Mg(PO3)2 ó (MP) con sus correspondientes puntos de fusión, 1357 ºC, 1382 ºC y 1165 ºC.
Este autor también estableció las proporciones y temperaturas de las tres composiciones
eutécticas que presentaba el sistema: 52 % en peso de P2O5 (1325 ºC), 57.5 % en peso de
P2O5 (1282 ºC) y 76 % en peso de P2O5 (1150 ºC). También observó que la transformación
del Mg3(PO4)2 a 1055 ºC está acompañada por un incremento de volumen, siendo la fase
de alta temperatura inestable a temperatura ambiente. Estableció que la solubilidad del
Mg2P2O7 en el Mg3(PO4)2 era baja y que la temperatura de transformación α/β- Mg3(PO4)2
disminuye por la adición de Mg2P2O7 desde 1055 ºC hasta 940 ºC.
Figura IV.4 Diagrama de equilibrio de fases del sistema MgO-P2O5 según Berak [15].
97
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Posteriormente Sarver et al. [16] estudiaron las posibles transformaciones de fase y
la naturaleza de la fusión del Mg(PO3)2. No detectaron ninguna inversión en este
compuesto que funde congruentemente a 1165 ºC.
IV.2.4 Sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2
La única publicación existente de este sistema, que es una sección del sistema
ternario ZnO-CaO-P2O5, data de 1967 en la que Kreidler y Hummel [17], realizaron el
estudio de las relaciones de fase en el sistema pseudo-binario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2, figura
IV.5. Estos autores concluyeron que el Ca3(PO4)2 admite ~10 % mol de Zn3(PO4)2 en
solución sólida, dando lugar a un aumento significativo de la temperatura de
transformación polimórfica β→α del Ca3(PO4)2. Obtuvieron un nuevo compuesto ternario,
el CaZn2(PO4)2 ó (Z2CP), que fundía congruentemente a 1048 ºC y que presenta tres
formas polimórficas α, β y δ, de las cuales, las fases α y δ eran estable y metaestable
respectivamente a temperatura ambiente. Finalmente establecieron los rangos de solución
sólida del δ-CaZn2(PO4)2 en Zn3(PO4)2, del Ca3(PO4)2 en β y δ-CaZn2(PO4)2 y del
Ca3(PO4)2 en β-Zn3(PO4)2 (sustitución de Zn2+ por Ca2+ en todos los casos).
Figura IV.5 Diagrama de equilibrio de fases del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 según
Kreidler y Hummel [17].
b) a)
98
Capítulo V
IV.2.5 Sistema Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2
Este sistema pseudo-binario de tipo peritéctico fue estudiado experimentalmente
por primera vez por J. Ando [18], figura IV.6. Este autor puso de manifiesto la existencia
de un nuevo compuesto ternario, el Ca3Mg3(PO4)4 ó (C3M3P2) que fundía
incongruentemente a 1175 ºC, e indicó las regiones de solución sólida del Ca3Mg3(PO4)4 y
del Ca3(PO4)2 y Mg3(PO4)2. Además, determinó que la temperatura del solidus entre el
Ca3(PO4)2ss y el Ca3Mg3(PO4)4ss se encontraba a 1175 ºC y la equivalente del
Ca3Mg3(PO4)4ss y el Mg3(PO4)2ss a 1120 ºC. Finalmente, en la región rica en Ca3(PO4)2,
señaló la existencia de solución sólida de Mg2+, donde el Mg2+ sustituía al Ca2+. La
solubilidad máxima de Mg2+ en Ca3(PO4)2 es del 13.2 % atómico; dicha incorporación
aparecía acompañada de un aumento de la temperatura de transformación β→α-Ca3(PO4)2,
con la subsiguiente estabilización de la fase β, desde 1180 ºC en el caso del Ca3(PO4)2
puro, hasta 1485 ºC en el caso de Ca3(PO4)2 para un 4.1 % atómico de sustitución.
Sin embargo, el diagrama propuesto por J. Ando [18], incumplía la regla de las
fases pues no describía correctamente las transiciones de fases que en función de la
temperatura se producen en el Ca3(PO4)2ss (círculo en el diagrama).
Figura IV.6 Diagrama de equilibrio de fases del sistema Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2 según
Ando [18].
% en peso
Ca3Mg3(PO4)4
99
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Posteriormente, K. Slawski [19], ratificó dichas regiones de solución sólida y
reveló la existencia de dos transformaciones polimórficas en el Ca3Mg3(PO4)4, γ↔β y
β↔α, con sus respectivas temperaturas de transformación a 1006 ºC y 1104 ºC. R.A.
McCauley et al. [20], como parte de sus estudios en el sistema ternario CaO-MgO-P2O5,
manifestaron su desacuerdo respecto de los datos disponibles en la bibliografía [18,19], en
relación a los rangos de extensión de las soluciones solidas en los alrededores del
compuesto Ca3Mg3(PO4)4,. Dichos autores, realizaron un estudio exhaustivo concluyendo
que dichos rangos de solución sólida en realidad se extendían aproximadamente el doble
en la dirección del Mg3(PO4)2 que en la del Ca3(PO4)2.
Recientemente algunos autores han revisado el efecto de la incorporación de Mg2+
en la temperatura de transformación polimórfica β/α del Ca3(PO4)2, figura IV.7,
redibujando el diagrama de equilibrio en la zona rica en fosfato tricálcico. Este es el caso
de Enderle et al. [21], figura IV.7, quienes determinaron además el límite máximo de
sustitución del Mg2+ (14 % mol) en las posiciones Ca2+ en la estructura del β-Ca3(PO4)2 a
1025 ºC. Nuevamente este diagrama incumplía la regla de las fases en lo referente a las
transformaciones polimórficas del Ca3(PO4)2 ss (círculo en el diagrama).
Figura IV.7 Correcciones realizadas en el diagrama de equilibrio de fases del sistema
Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2, en la zona rica en Ca3(PO4)2 según Enderle [21].
100
Capítulo V
Finalmente, la tentativa más completa de este diagrama, fue realizada por R.G.
Carrodeguas et al. en 2008 [22], quienes delimitaron los campos que definen la estabilidad
y las transformaciones polimórficas del Ca3(PO4)2 ss, figura IV.8, y redibujaron el
diagrama acorde con la regla de las fases
Figura IV.8 Modificaciones propuestas en el diagrama de equilibrio de fases del sistema
Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2, en la zona rica en Ca3(PO4)2 según Carrodeguas [22].
IV.2.6 Sistema CaO-MgO-P2O5
R.A. McCauley et al. [20], determinaron experimentalmente las compatibilidades
en estado sólido y los rangos de solución sólida en la región del sistema que presentaba un
contenido <50 % mol P2O5, figura IV.9. En la línea de compatibilidad Ca3(PO4)2-
Mg3(PO4)2 delimitaron los rangos de solución sólida, previamente mencionados en el
apartado IV.2.5, confirmando la transformación polimórfica β↔α del Ca3Mg3(PO4)4 a
1104 ºC pero no la γ↔β a 1006 ºC, previamente reportada por Slawski [19]. En la línea de
compatibilidad Ca2P2O7-Mg2P2O7 confirmaron la existencia del compuesto CaMgP2O7
[23] que fundía incongruentemente a 1120 ºC y no presentaba soluciones sólidas.
Tem
per
atu
ra (
ºC)
101
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.9 Diagrama de equilibrio de fases del sistema CaO-MgO-P2O5 según McCauley
[20].
Estos autores también determinaron las temperaturas del solidus entre los
compuestos β-Ca2P2O7 y CaMgP2O7 y entre CaMgP2O7 y β-Mg2P2O7 siendo éstas 1115 ºC
y 1120 ºC respectivamente, temperaturas que estaban de acuerdo con los datos previamente
publicados [23]. Los rangos de solución sólida que representaron en el diagrama de los
compuestos, Ca2P2O7 y Mg2P2O7, fueron los establecidos en estos trabajos [23].
Finalmente realizaron un estudio parcial en la línea de compatibilidad Ca(PO4)2-Mg(PO4)2,
indicando la existencia de al menos un compuesto intermedio cuya composición
establecieron, en: 35 % mol CaO, 18 % mol MgO y 47 % mol P2O5.
IV.2.7 Sistemas Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y MgO-ZnO-P2O5
Estos dos sistemas se han englobado en el mismo apartado puesto que los únicos
datos existentes en la literatura, aportados por J.F Sarver et al. [16,24,25], consistían en una
serie de trabajos realizados conjuntamente en ambos sistemas. En el último trabajo de esta
serie [25], figura IV.10, determinaron experimentalmente las relaciones de fase en el
sistema pseudo-binario y las soluciones sólidas en el subsolidus del sistema ternario,
partiendo de datos previamente publicados [12,13,16]. En la primera parte englobaron toda
la caracterización de las soluciones sólidas en la línea Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2, figura
IV.10.a, demostrando que dicho sistema exhibía una región relativamente pequeña de
soluciones sólidas de Mg3(PO4)2 en β-Zn3(PO4)2, una región más pequeña de soluciones
102
Capítulo V
sólidas Mg3(PO4)2 en α-Zn3(PO4)2 y una región muy extensa, en realidad continua, que
abarcaba desde el Mg3(PO4)2 puro hasta un 95 % en mol de Zn3(PO4)2, en solución sólida,
figura IV.10.b. Puesto que este sistema a las temperaturas estudiadas no presenta
formación de líquido, no determinaron las relaciones de fusión construyendo el diagrama a
partir del punto de fusión del Mg3(PO4)2 a 1357 ºC previamente reportado en la literatura
[15].
En la segunda parte del trabajo, donde abordaron el estudio del sistema ternario,
englobaron todos los datos y los de un estudio previo [16], para delimitar los rangos de
solución solida en las líneas de compatibilidad: MgO-ZnO, Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2,
Zn2P2O7-Mg2P2O7 y Zn(PO3)2-Mg(PO3)2, figura IV.10.b.
Figura IV.10 Diagrama de equilibrio de fases del sistema: a) Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y b)
MgO-ZnO-P2O5 según Sarver [25].
a) b)
≈≈
103
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
IV.3 ESTUDIO DEL SISTEMA ZnO-CaO-P2O5
En la presente memoria de tesis doctoral se ha abordado por primera vez el estudio
del diagrama de equilibrio de fases del sistema ternario: ZnO-CaO-P2O5. El objetivo
fundamental ha sido el establecimiento experimental de las compatibilidades en estado
sólido y las relaciones de fusión en dos zonas del diagrama de especial interés: la zona rica
en fosfato tricálcico Ca3(PO4)2, donde estarían enmarcados los biomateriales objeto de
estudio y la zona rica en ZnO, de interés para otro tipo de materiales como son los láseres
de luz UV. Paralelamente, se han revisado los rangos de solución sólida de las fases del
sistema de interés para este estudio. A este fin, se han tenido en cuenta todos los datos de
los sistemas binarios y pseudo-binarios que lo integran, apartado IV.2.
El estudio de las compatibilidades en el estado sólido se realizó a través del estudio
de la sección isotermal a 900 ºC, lo que permitió no sólo establecer dichas
compatibilidades, sino también alcanzar un mayor entendimiento acerca del efecto del ZnO
en la estabilidad y en las transformaciones de fase de los compuestos Ca3(PO4)2, Zn3(PO4)2
y CaZn2(PO4)2. Esta temperatura se eligió con el fin de evitar la presencia de fase líquida,
teniendo en cuenta las temperaturas de fusión de los distintos compuestos: Ca3(PO4)2
(TF=1850 ºC), Zn2P2O7 (TF=1048 ºC), Zn3(PO4)2 (TF=1060 ºC) y Zn2Ca(PO4)2 (TF=1017
ºC). Además, a partir de los datos disponibles en la literatura, especialmente las
temperaturas de los puntos eutécticos de los sistemas binarios y pseudo-binarios
correspondientes, se pudo establecer que todas las reacciones que tuvieran lugar a
temperatura ≤ 900 ºC se llevarían a cabo en estado sólido y sin presencia de fase líquida.
El estudio de las compatibilidades en estado sólido, relaciones de fusión y los
rangos de solución sólida en la sección isotermal a 900 ºC se ha realizado empleando el
método de congelación del equilibrio, “quenching,” ampliamente descrito en el capítulo
III.
Para la realización del estudio se seleccionaron y prepararon un total de 21
composiciones en el rango 0.96-84.00 % mol de ZnO, con el objetivo de cubrir las
regiones de interés. Las composiciones se trataron térmicamente a 900 ºC durante 12 h
después de una etapa previa de calcinación a 900 ºC durante 4 h y subsiguiente molienda
intermedia, ver capítulo III. Para asegurar que las composiciones habían alcanzado el
104
Capítulo V
equilibrio termodinámico, algunas muestras fueron tratadas nuevamente durante un tiempo
más prolongado (48-72 h), no apreciando cambio alguno en las fases finales presentes. Las
muestras fueron caracterizadas mineralógica y microestructuralmente empleando
Difracción de Rayos X (DRX) y Microscopia Electrónica de Barrido de Emisión de
Campo (MEB-EC). Los estudios de microanálisis puntual por Dispersión de Energía de
RX (EDX), se realizaron únicamente en aquellas muestras en las que se consideró
necesario para los fines del presente estudio.
Las composiciones químicas estudiadas y su ubicación en el sistema se detallan en
la figura IV.11 y en la tabla IV.1, para mayor claridad. Las composiciones numeradas del
(1) al (9) se formularon para estudiar la zona rica en ZnO y las numeradas del (10) al (25)
para el estudio de la zona rica en Ca3(PO4)2.
105
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.11 Composiciones seleccionadas para el estudio de las compatibilidades en
estado sólido en el sistema ZnO-CaO-P2O5 a 900 ºC.
Ca2P
6O
17
(22)(22)(20)
(12)
(3)
T=832 ºC
T=972 ºC
(18)
(1)
(2)(4)(5)
(8)
(7)
(14)
(19)
(6)
(15)
(9)
(11)
(21)
(17)
HAp
Zn2Ca(PO
4)2
Zn(PO3)2
Zn2P
2O
7
Zn3(PO
4)2
Ca4P
2O
9Ca
3(PO
4)2
Ca2P
2O
7Ca(PO
3)2
ZnO
CaOP2O
5
CaP4O
11
(10)
T=1005 ºC
(13)
(16)
(23)
(24)(25)
(22)
CaOCa
2P
2O
7
Ca4P
2O
9HApCa
3(PO
4)2
(22)
(20) (19)(21)
(17) (18)
(16) (15)
(13) (14)
(11)
(23)
(24)(25)
e
e
e
Te = Temperatura eutéctica
10
30
20
10
30
20
106
Capítulo V
Tabla IV.1 Composiciones estudiadas en el sistema ZnO-CaO-P2O5.
% mol
Composiciones ZnO CaO P2O5 (Zn+Ca)/P ratio
(1) 84.00 10.00 6.00 7.83
(2) 75.00 - 25.00 1.50
(3) 74.40 0.60 25.00 1.50
(4) 70.00 15.00 15.00 2.83
(5) 67.00 11.00 22.00 1.77
(6) 60.00 18.00 22.00 1.77
(7) 60.00 10.00 30.00 1.17
(8) 50.00 25.00 25.00 1.50
(9) 40.00 40.00 20.00 2.00
(10) 40.00 47.00 13.00 3.35
(11) 30.00 60.00 10.00 4.50
(12) 30.00 52.50 17.50 2.36
(13) 15.00 63.75 21.25 1.85
(14) 15.00 68.00 17.00 2.44
(15) 10.00 68.00 22.00 1.78
(16) 10.00 66.30 23.70 1.61
(17) 7.14 67.86 25.00 1.50
(18) 7.00 69.75 23.25 1.65
(19) 5.00 71.25 23.75 1.60
(20) 5.00 70.00 25.00 1.50
(21) 3.00 72.75 24.25 1.56
(22) 2.00 73.50 24.50 1.54
(23) 0.96 74.04 25.00 1.50
(24) - 75.96 24.04 1.58
(25) - 75.00 25.00 1.50
107
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
IV.3.1 Relaciones de compatibilidad en estado sólido en el sistema ZnO-
CaO-P2O5
Las fases detectadas por DRX en las muestras estudiadas en las dos regiones objeto
de estudio se recogen en la tabla IV.2.
Tabla IV.2 Fases cristalinas detectadas por difracción de rayos X (DRX) en las
composiciones tratadas térmicamente a 900 ºC.
* Las fases cristalinas detectadas por DRX en cada composición se ordenaron en la tabla de sentido creciente-decreciente en relación al
porcentaje de fase obtenido.
Fases Cristalinas Detectadas
(1) ZnO, -Ca3(PO4)2 ss, α-Zn2Ca(PO4)2
(2) α-Zn3(PO4)2
(3) -Zn3(PO4)2 ss
(4) ZnO, α-Zn2Ca(PO4)2, δ-Zn2Ca(PO4)2
(5) -Zn3(PO4)2 ss, δ-Zn2Ca(PO4)2, ZnO
(6) δ-Zn2Ca(PO4)2, ZnO, -Zn3(PO4)2 ss
(7) Muestra fundida
(8) α-Zn2Ca(PO4)2
(9) ZnO, -Ca3(PO4)2 ss, α-Zn2Ca(PO4)2
(10) ZnO, HAp, CaO, Ca(OH)2 (trazas)
(11) ZnO, HAp, CaO, Ca(OH)2 (trazas)
(12) ZnO, -Ca3(PO4)2 ss, HAp
(13) -Ca3(PO4)2 ss, ZnO, HAp
(14) HAp, ZnO, CaO, Ca(OH)2 (trazas)
(15) -Ca3(PO4)2 ss, ZnO, HAp
(16) -Ca3(PO4)2 ss- ZnO
(17) -Ca3(PO4)2 ss
(18) -Ca3(PO4)2 ss, HAp, ZnO
(19) -Ca3(PO4)2 ss, HAp, ZnO
(20) -Ca3(PO4)2 ss
(21) -Ca3(PO4)2 ss, HAp, ZnO (trazas)
(22) -Ca3(PO4)2 ss, HAp
(23) -Ca3(PO4)2 ss
(24) -Ca3(PO4)2, HAp
(25) -Ca3(PO4)2
108
Capítulo V
IV.3.1.1 Estudio de la zona rica en ZnO
Con respecto a esta zona, los difractogramas de RX realizados en las
composiciones (5), figura IV.12, y (6) detectaron la presencia de tres fases: β-Zn3(PO4)2,
δ-Zn2Ca(PO4)2 y ZnO, en diferentes proporciones. Esto significa que estas tres fases son
estables en estado sólido y definen por tanto un triángulo de compatibilidad (ZnO-
Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2). Asimismo en estas composiciones se observó un ligero
desplazamiento de los picos de DRX asociados al β-Zn3(PO4)2 sugiriendo la presencia de
solución sólida. Por otro lado, en el caso de las composiciones (1) y (9) figura IV.13, se
observó una mezcla de ZnO, β-Ca3(PO4)2 y α-Zn2Ca(PO4)2, lo que implica que estas dos
composiciones están situadas en otro triangulo de compatibilidad definido por (ZnO-
Zn2Ca(PO4)2-Ca3(PO4)2). En este caso es importante destacar que las difracciones
asociadas al β-Ca3(PO4)2 están notablemente desplazadas, lo que según algunos autores
[26], podría corresponder a la presencia de una nueva fase Ca19Zn2(PO4)14, indexada de
acuerdo con la ficha nº 481196 de la base de datos JCPDS.
Para estudiar el límite entre estas dos regiones de compatibilidad, se formuló una
nueva composición, (4), en la línea de unión de las fases ZnO y Zn2Ca(PO4)2. Los estudios
de DRX pusieron de manifiesto la única presencia de difracciones asociadas al ZnO y a los
polimorfos α y δ del Zn2Ca(PO4)2, figura IV.14. Este resultado permitió establecer la línea
de compatibilidad de ambas fases, lo que está de acuerdo con los campos de estabilidad
previamente reportados en la literatura en el sistema pseudo-binario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2
[17]. La presencia del polimorfo α-Zn2Ca(PO4)2 es debida a la inversión rápida y reversible
α↔β del Zn2Ca(PO4)2, siendo la fase β inestable a temperatura ambiente. Este último
resultado pone de manifiesto, que la línea que une el ZnO, la composición (4) y el
Zn2Ca(PO4)2 es la línea común a los dos triángulos de compatibilidad previamente
descritos.
109
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.12 Difractograma de RX
correspondiente a la composición (5).
Figura IV.13 Difractograma de RX
correspondiente a la composición (9).
Figura IV.14 Difractograma de RX
correspondiente a la composición (4).
20 25 30 35 40
++
+
++
+
++++
+++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
++In
ten
sid
ad
(u
.a.)
2
+
+ -Zn3(PO
4)2
-Zn2Ca(PO
4)2
ZnO
20 25 30 35 40
ZnO-Ca
3(PO
4)2
-Zn2Ca(PO
4)2
In
ten
sida
d (
u.a.
)
2
20 25 30 35 40
ZnO-Zn
2Ca(PO
4)2
-Zn2Ca(PO
4)2
Inte
nsi
dad
(u.
a.)
2
110
Capítulo V
A continuación se formuló la composición (7), con una relación (Zn+Ca)/P<1.5,
observándose la formación de una cantidad considerable de liquido. Un estudio realizado a
posteriori por microscopía óptica de calefacción, reveló que la fusión de dicha
composición se producía a 884 ºC. Este resultado está de acuerdo con la información
suministrada por los sistemas correspondientes, donde las temperaturas de los puntos
eutécticos de los sistemas binarios: ZnO-Zn3(PO4)2 (T=1005 ºC), Zn3(PO4)2-Zn2P2O7
(T=972 ºC), Zn2P2O7-Zn(PO3)2 (T=832 ºC) y Zn2Ca(PO4)2-Zn3(PO4)2 (T=972 ºC)
previamente reportadas en la literatura [12,17], oscilan entre 832 y 1005 ºC. Este
comportamiento indica, que un descenso en la relación (Zn+Ca)/P, da lugar a la formación
de fase líquida a la temperatura de tratamiento y por consiguiente no es posible obtener
información sobre las compatibilidades en estado sólido en esta región del sistema.
IV.3.1.2 Estudio de la zona rica en Ca3(PO4)2
El resto de las composiciones formuladas, (10)-(25) pertenecen a la región del
sistema ZnO-CaO-P2O5 rica en Ca3(PO4)2. Las muestras (12), (13), (18), (19), (21) y (22)
se formularon en la línea de unión del ZnO-Ca3(PO4)2. Los difractogramas de RX
obtenidos de las composiciones (12), (13), (18), (19) y (21), exhibían una mezcla de ZnO,
β-Ca3(PO4)2 y HAp, siendo dichas fases compatibles, definiendo por consiguiente otro
triángulo de compatibilidad (ZnO-Ca3(PO4)2-HAp). Por otro lado, la composición (22)
presentaba en los difractogramas de RX una combinación de dos fases, β-Ca3(PO4)2 e HAp
definiendo una región de compatibilidad bifásica (Ca3(PO4)2-HAp) que será confirmada y
delimitada en el apartado IV.3.2.2. Una vez más, se detectó un ligero desplazamiento de
los picos asociados al β-Ca3(PO4)2 comparados con la posición de los picos
correspondientes a la composición (25), que coincide con la estequiometria del β-
Ca3(PO4)2 puro, figura IV.15. Por otro lado se observó, que las composiciones (10), (11) y
(14) presentaban una mezcla de HAp, ZnO, CaO y Ca(OH)2, configurando el último
triángulo de compatibilidad en esta región del sistema (ZnO-HAp-CaO), ya que la
presencia de Ca(OH)2 se atribuye a la hidratación del CaO presente en las muestras.
Reseñar que la presencia de HAp en lugar de Ca4(PO4)2O viene determinada por las
condiciones no anhidras del estudio, y que de acuerdo con lo indicado por Riboud et al.
[11] al establecer el sistema CaO-P2O5 a PT=1 atm, dicha fase es estable hasta 1360 ºC y
por tanto a la temperatura del estudio. Finalmente los difractogramas de RX obtenidos al
111
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
analizar las composiciones (24) y (22) revelaron la existencia de una última zona bifásica
de compatibilidad (Ca3(PO4)2-HAp).
Figura IV.15 Difractogramas de RX correspondientes a la composiciones: (18), (19), (21)
y Ca3(PO4)2-TCP.
Los resultados obtenidos en esta sección definen coherentemente las
compatibilidades en estado sólido en las regiones estudiadas del sistema ZnO-CaO-P2O5 a
900 ºC, siendo posible establecer la existencia de cuatro triángulos de compatibilidad:
ZnO-Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2, ZnO-Zn2Ca(PO4)2-Ca3(PO4)2, ZnO-Ca3(PO4)2-HAp, y ZnO-
HAp-CaO y tres campos bifásicos de compatibilidad: Zn3(PO4)2-ZnO, Ca3(PO4)2-HAp, y
Ca3(PO4)2-ZnO. Sin embargo, llegados a este punto aún no es posible proceder a su
representación ya que el ligero desplazamiento observado en los picos de difracción
asociados a algunas de las fases constituyentes del sistema, evidencian la existencia de
rangos de solución solida que deben ser convenientemente delimitados.
30 35 40
31,0 31,5
(18)(19)(21)
ZnO-Ca
3(PO
4)2
HAp
Inte
nsi
dad
(u.
a.)
2
(25)
(21)
(19)
(18)
(25)
112
Capítulo V
IV.3.2 Revisión de los rangos de solución sólida en Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2
Para el establecimiento de los rangos de solución sólida, se han tenido en cuenta los
resultados obtenidos en este trabajo y los datos extraídos de la revisión, apartado IV.2, de
los sistemas binarios y pseudo-binarios que los integran.
IV.3.2.1 Estudio de las soluciones sólidas en Zn3(PO4)2
Se ha estudiado el rango de solución sólida de Ca2+ en Zn3(PO4)2 a 900 ºC, a partir
de las composiciones (5) y (6) formuladas en las regiones de compatibilidad previamente
delimitadas. A este fin, se realizaron estudios de MEB-EC y microanálisis puntuales por
Dispersión de Energía de RX (EDX), para identificar los elementos presentes y completar
la información obtenida por DRX.
En la figura IV.16, se presentan las micrografías obtenidas por MEB-EC y los EDX
correspondientes a la composición (5).
Figura IV.16 Micrografías obtenidas de la composición (5) por MEB-EC, a) superficie
pulida y b) superficie atacada químicamente.
c) y d) EDX de los puntos analizados (círculo en azul) en cada una de las micrografías.
10 μm
ZnO
Composición (5) Pulidaa)
10 μm
Composición (5) Atacadab)
β-Zn3(PO4)2
δ-Zn2Ca(PO4)2
Resina Epoxy
c) d)
113
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
La figura IV.16.a muestra la microestructura de la superficie pulida de dicha
composición, en la que se distingue una fase dispersa entre la matriz, que el estudio por
EDX confirmó que se trataba de ZnO, figura IV.16.c. Por otra parte, la figura IV.16.b
corresponde con la microestructura de la superficie atacada químicamente de la misma
composición. En esta micrografía, se revelaron dos de las fases cristalinas identificadas por
DRX. Nuevamente el estudio por EDX confirmó que dichas fases correspondían a
β-Zn3(PO4)2 y δ-Zn2Ca(PO4)2. Asimismo los EDX realizados en las composiciones (5) y
(6), detectaron la presencia de una pequeña cantidad de Ca2+, (0.6±0.1 % mol CaO), en
solución sólida en la estructura del β-Zn3(PO4)2, figura IV.16.d. Este resultado está de
acuerdo con el pequeño desplazamiento observado en los picos de DRX correspondientes a
la fase β-Zn3(PO4)2 obtenidos en las composiciones (5) y (6), mencionado previamente en
el apartado IV.3.1.
La microestructura observada en la figura IV.16.b, se comparó con las
microestructuras obtenidas de los compuestos estequiométricos puros, expuestos en la
figura IV.17 (Zn3(PO4)2 figura IV.17.a y Zn2Ca(PO4)2 figura IV.17.b. Dicha comparación
permitió resaltar la diferencia de texturas adquiridas por las fases después de la etapa de
ataque químico, lo que hace además posible su inmediata identificación visual figura
IV.16.b.
Figura IV.17 Micrografías obtenidas por MEB-EC de las superficies atacadas de los
compuestos estequiométricos puros, a) Zn3(PO4)2 y b) Zn2Ca(PO4)2.
50 μm
a)Zn3(PO4)2
50 μm
Zn2Ca(PO4)2b)
114
Capítulo V
En relación a la composición (3), situada en la línea de unión Zn3(PO4)2-
Zn2Ca(PO4)2, se puso de manifiesto que la incorporación de un 0.6 % mol de CaO en
solución sólida era la causa del pequeño desplazamiento previamente observado en los
picos de difracción atribuidos a β-Zn3(PO4)2 y de la estabilidad de dicho polimorfo a 900
ºC. La estabilidad del polimorfo β-Zn3(PO4)2 a esta temperatura en presencia de ciertos
iones metálicos divalentes (Ca2+, Cd2+, Mn2+ o Mg2+), ha sido descrito previamente en la
literatura [13,24,25,27], corroborando los resultados obtenidos. Este resultado se verificó
experimentalmente, sintetizando y sinterizando la composición (2), equivalente al
compuesto Zn3(PO4)2 sin dopar, observando por DRX como única fase estable α-
Zn3(PO4)2.
En definitiva, teniendo en cuenta los datos obtenidos en la presente memoria y los
publicados en la literatura [17], podremos establecer que a 900 ºC al menos un 0.6 % mol
de CaO entra en solución sólida en la estructura del Zn3(PO4)2 modificando su temperatura
de transformación polimórfica α→β. Este resultado reveló la existencia de una nueva
región bifásica de compatibilidad (Zn3(PO4)2-ZnO) en el sistema, introduciendo pequeñas
modificaciones en la región de compatibilidad ZnO-Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2 delimitada en
el apartado IV.3.1, figura IV.18.
115
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.18 Regiones de compatibilidad y rango de solución sólida de Ca2+ en Zn3(PO4)2
a 900 ºC en la zona del sistema rica en óxido de cinc. Se muestra la existencia de un
triángulo de compatibilidad (en azul), una región de compatibilidad bifásica (en rojo) y el
rango de solución sólida (en verde).
IV.3.2.2 Estudio de la soluciones sólidas en Ca3(PO4)2
En este apartado se ha estudiado en detalle la solución sólida del Zn2+ en Ca3(PO4)2,
a partir de composiciones formuladas en las líneas que conectan los compuestos:
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2-ZnO respectivamente.
En el caso de las composiciones formuladas en la línea Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2, (20),
(23) y (17), coincidente esta última composición con la estequiometria de la posible fase
Ca19Zn2(PO4)14, se observó que a medida que aumentaba el contenido de ZnO en las
composiciones se producía un notable desplazamiento de los picos de difracción de RX
asociados a la fase β-Ca3(PO4)2. Este hecho pone de manifiesto que la fase Ca19Zn2(PO4)14
no se trata, en realidad, de un compuesto estable, ya que los difractogramas de RX
realizados en las composiciones (20) y (22) presentaban únicamente difracciones asociadas
a la fase β-Ca3(PO4)2, desplazadas en mayor o menor medida, por la incorporación de Zn2+
en su estructura, respecto a las difracciones del β-Ca3(PO4)2 sin dopar. Nunca se detectó la
(4)
(7)
(6)
(5)(3)
ZnO+ Zn3(PO4)2 ss +Zn2Ca(PO4)2
Zn3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
ZnO
Zn3(PO4)2 ss + ZnO
(2)
Zn2P2O7
116
Capítulo V
presencia simultánea en los DRX de las dos fases cristalinas Ca3(PO4)2 y Ca19Zn2(PO4)14,
que deberían estar presentes en el caso de que la fase Ca19Zn2(PO4)14 fuera una nueva fase.
Una vez superado el límite de solución sólida se observa una región de compatibilidad
bifásica constituida por α-Zn2Ca(PO4)2 y Ca3(PO4)2 ss.
Ante la carencia de datos en la literatura y con el fin de corroborar los resultados
obtenidos previamente en la zona rica en fosfato tricálcico, apartado IV.3.1, se ha
realizado, por primera vez, un estudio riguroso de medida de parámetros de red en la línea
de unión de los compuestos Ca3(PO4)2 y ZnO a fin de determinar el límite de incorporación
del Zn2+ en la estructura del β-Ca3(PO4)2. Para ello se procedió al estudio de la evolución
de los parámetros reticulares del β-Ca3(PO4)2 en función del contenido de ZnO en cada
composición, extrayendo y procesando la información estructural derivada de los
difractogramas de RX adquiridos para las composiciones (24), coincidente con el β-
Ca3(PO4)2 y las subsiguientes (18), (19), (21) y (22) formuladas en dicha línea. La
determinación estructural se abordo utilizando el Método Rietveld, ampliamente descrito
en el capítulo III. En la tabla IV.3 y en la figura IV.19, se muestran respectivamente los
valores calculados de los parámetros reticulares del β-Ca3(PO4)2 y su evolución con la
incorporación de ZnO.
Tabla IV.3 Parámetros reticulares calculados para composiciones localizadas en la línea
Ca3(PO4)2-ZnO a 900 ºC.
Composición a(Å) b(Å) c(Å)
(25) β-TCP sin dopar 10.436±0.002 10.436±0.002 37.387±0.006
(22) 2% mol ZnO 10.397±0.002 10.397±0.002 37.317±0.007
(21) 3% mol ZnO 10.401±0.001 10.401±0.001 37.321±0.005
(19) 5% mol ZnO 10.399±0.001 10.399±0.001 37.316±0.004
(18) 7% mol ZnO 10.399±0.001 10.399±0.001 37.313±0.003
117
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Se observa un decrecimiento inicial importante de los parámetros a=b y c desde
10.428±0.002 hasta 10.397±0.002 Å y desde 37.387±0.006 hasta 37.317±0.007 Å
respectivamente, en el caso del β-Ca3(PO4)2 (25) sin dopar y la composición (22),
estabilizándose posteriormente en el resto de composiciones independientemente del
incremento de ZnO, figura IV.19. Los valores obtenidos de los parámetros de red a, b y c
corresponden con un 3.5 % mol de ZnO en solución sólida en β-Ca3(PO4)2, según Kannan
et al. [28], autores que estudiaron exhaustivamente el rango de solución sólida del Zn2+ en
la línea Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2.
Figura IV.19 Variación de los parámetros reticulares del β-Ca3(PO4)2 con el contenido de
ZnO en la composición.
Los estudios realizados por EDX en las composiciones (12), (13) y (18),
permitieron corroborar los resultados previamente obtenidos por DRX en la zona rica en
Ca3(PO4)2, apartado IV.3.1.2, confirmando un contenido máximo de (3.6±0.5 % mol ZnO)
en la estructura del β-Ca3(PO4)2 en la línea de conexión ZnO-Ca3(PO4)2 a 900 ºC.
La incorporación de los rangos de solución sólida estudiados, junto con los
resultados obtenidos en el apartado IV.3.1, nos han permitido definir y delimitar de una
manera muy precisa las áreas de compatibilidad ZnO-Zn2Ca(PO4)2-Ca3(PO4)2, ZnO-
Ca3(PO4)2-HAp y Ca3(PO4)2-HAp anteriormente mencionadas, figura IV.20.
0 1 2 3 4 5 6 7 810.390
10.395
10.400
10.405
10.410
10.415
10.420
10.425
10.430
10.435
10.440
37.290
37.300
37.310
37.320
37.330
37.340
37.350
37.360
37.370
37.380
37.390
37.400
37.410
(15)(16)(18)
(19)
P
arám
etro
s de
red
a, b
(Å
)
% mol ZnO en cada composición
(-Ca3(PO
4)2)
P
arám
etro
de
red
c (Å
)
118
Capítulo V
Figura IV.20 Regiones de compatibilidad y rangos de solución sólida de Ca3(PO4)2 a
900 ºC en la zona del sistema rica en fosfato tricálcico. Se muestra la existencia de dos
triángulos de compatibilidad (en azul), dos regiones de compatibilidad bifásica (en rojo) y
el rango de solución sólida (en verde).
Finalmente, en la figura IV.21, se representan las áreas de compatibilidad
establecidas en las zonas ricas en óxido de cinc y fosfato tricálcico en el sistema ternario
ZnO-CaO-P2O5.
Ca3(PO4)2 ss
(23)
Ca3(PO4)2
HAp(24)
(21)
(20) (19)
(18)
Ca3(PO4)2 ss+ HAp
Ca3(PO4)2 ss+ HAp+ ZnO
Ca3(PO4)2 ss+ Zn2Ca(PO4)2
+ ZnO
3.5 % mol ZnO
Ca3(PO4)2 ss+ ZnO
(22)Ca3(PO4)2 ss
(25)
119
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.21 Representación esquemática de las regiones de compatibilidad establecidas
en el sistema ZnO-CaO-P2O5 a 900ºC. Se muestra la existencia de cuatro triángulos de
compatibilidad (en azul) y tres regiones de compatibilidad bifásica (en rojo).
HAp
Zn2Ca(PO
4)2
Zn3(PO
4)2
Ca3(PO
4)2
ZnO
CaO
120
Capítulo V
IV.4 ESTUDIO DEL SISTEMA MgO-ZnO-CaO-P2O5
El estudio del diagrama de fases cuaternario MgO-ZnO-CaO-P2O5, al igual que en
el sistema ternario ZnO-CaO-P2O5, se ha dirigido al establecimiento experimental, de las
zonas del mismo que son de interés a los fines del presente trabajo. La notable influencia
que ejercen tanto el cinc como el magnesio en los límites de solución sólida del β-
Ca3(PO4)2 como en la temperatura de transformación polimórfica β→α del fosfato
tricálcico [17,22,29], ha puesto de manifiesto la necesidad de abordar el estudio de su
efecto conjunto.
En esta dirección y desde la perspectiva de los diagramas de fase, se procedió en
primer lugar al establecimiento de las compatibilidades en estado sólido en el sistema
MgO-ZnO-CaO-P2O5, en la región con un contenido de P2O5≤ 50 % mol.
Seguidamente el estudio se enmarcó en la zona rica en Ca3(PO4)2, determinando los
rangos de estabilidad en estado sólido, en función de la composición y la temperatura, de
los polimorfos del fosfato tricálcico en el sistema pseudo-ternario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2. Posteriormente se han establecido de forma esquemática los campos primarios
de cristalización de los polimorfos del fosfato tricálcico, α y β, y la zona bifásica que los
delimita α+β, en el subsistema: Ca3(PO4)2-Ca2P2O7-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
Estos estudios han permitido delimitar los campos de estabilidad de los polimorfos
β y α del fosfato tricálcico en presencia de Zn2+ y de Zn2+ y/o Mg2+ con el fin de definir las
zonas más idóneas para la posterior formulación y preparación de los biomateriales.
IV.4.1 Relaciones de compatibilidad en estado sólido en el sistema MgO-
ZnO-CaO-P2O5
Para su establecimiento se han tenido en cuenta todos los datos aportados por los
sistemas ternarios que conforman el sistema cuaternario, apartado IV.2, considerando en
todo momento la no existencia de compuestos cuaternarios dentro de la zona del sistema en
estudio, figura IV.22.
121
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.22 a) Diagrama de equilibrio de fases de los sistemas: MgO-ZnO-CaO-P2O5, b)
CaO-MgO-P2O5 según McCauley et al. [20], c) MgO-ZnO-P2O5 según Sarver et al [25] y
d) ZnO-CaO-P2O5 según L. Carbajal et al. [29].
El sistema CaO-MgO-ZnO, de acuerdo a los datos disponibles en la literatura [30–
32], se ha considerado un sistema eutéctico ternario simple que no presenta compuestos
binarios ni ternarios.
El establecimiento de las compatibilidades en estado sólido del sistema cuaternario
debe considerar la estabilidad de los compuestos Ca4(PO4)2O y HAp en función de la
temperatura y de la presión parcial de vapor de agua. De acuerdo a lo establecido en el
sistema binario CaO-P2O5 [7,11], las posibilidades que se plantean son las siguientes:
ZnO CaO
P2O5
MgO
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Ca2P2O7
CaMgP2O7
Mg(PO3)2
Ca(PO3)2Zn(PO3)2
Ca4(PO4)2O o HAp
McCauley et al. (1971)
b)
a)
Sarver et al. (1959)
c)
L. Carbajal et al. (2011)
ZnO
CaOP2O5
Zn3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
Ca3(PO4)2 HAp
Ca3(PO4)2 ss
d)
122
Capítulo V
P(H2O)=500 mm Hg (~66 kPa)
- CaO-HAp compatibles hasta 1360 ºC
- HAp-Ca3(PO4)2 compatibles hasta 1550 ºC
- CaO-Ca4(PO4)2O compatibles a temperaturas superiores a 1360 ºC
- Ca4(PO4)2O-HAp compatibles en el rango de temperatura 1360-1550 ºC
P(H2O)=0 mm Hg (Condiciones anhidras)
- CaO-Ca4(PO4)2O compatibles en todo el rango de temperaturas
- Ca4(PO4)2O-Ca3(PO4)2 compatibles hasta 1570 ºC
Puesto que los puntos invariantes que contienen al Ca3(PO4)2, de los sistemas
ternarios que conforman el sistema cuaternario, alcanzan temperaturas del orden de 1000
ºC, las compatibilidades en estado sólido en el sistema cuaternario deben establecerse a
temperaturas inferiores de a la citada. En esta dirección, la temperatura seleccionada para
realizar el estudio fue 900 ºC ya que además de ser utilizada en el estudio del sistema
ternario ZnO-CaO-P2O5, los restantes puntos invariantes de los sistemas involucrados en el
estudio eran superiores a la citada.
Esta temperatura permite también acotar las diferentes opciones de compatibilidad
en estado sólido definidas por las condiciones anhidras o no del estudio. En este sentido, a
900 ºC las posibles compatibilidades que involucran a Ca4(PO4)2O o HAp quedan
reducidas a determinar cual es la fase estable, puesto que a 900 ºC las dos fases no pueden
coexistir al mismo tiempo de acuerdo al sistema CaO-P2O5. A 900 ºC, en condiciones
anhidras (P(H2O)=0 mm Hg) el Ca4(PO4)2O será la fase estable mientras que en
condiciones no anhidras (P(H2O)=500 mm Hg), la HAp será la fase estable. Asimismo el
Ca4(PO4)2O o la HAp, son siempre compatibles con el CaO y el Ca3(PO4)2, lo que no
modifica las compatibilidades con el resto de los compuestos y facilita el estudio y la
representación esquemática de las compatibilidades en estado sólido del sistema
cuaternario MgO-ZnO-CaO-P2O5, en estudio.
123
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
A la hora de definir las diferentes compatibilidades en estado sólido se puso de
manifiesto, que los datos obtenidos en la revisión bibliográfica eran insuficientes para
definir las compatibilidades en estado sólido en el sistema ternario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2, puesto que existían dos posibles opciones en el mismo, figura IV.23.
Figura IV.23 Representación esquemática de las posibles compatibilidades en estado
sólido en el sistema pseudo-ternario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
Para establecer la compatibilidad se realizó un estudio experimental formulando la
composición 25 % mol Ca3(PO4)2, 50 % mol Zn3(PO4)2, 25 % mol Mg3(PO4)2. Dicha
composición [1] se localiza en el punto de intersección de las líneas de conexión que
definen los compuestos Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)2, figura IV.23.a y Ca3Mg3(PO4)2-
Mg3(PO4)2, figura IV.23.b, a través de la reacción Zn3(PO4)2 + Ca3Mg3(PO4)2 ↔
Zn2Ca(PO4)2 + Mg3(PO4)2. Una vez tratada dicha composición a 900 ºC (4+12+12) h con
dos etapas intermedias de remolienda, permitió establecer cuál de las dos líneas de
compatibilidad era la correcta. Los resultados del estudio por DRX permitieron establecer
que las fases Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)2 eran las fases estables y por tanto compatibles en el
estado sólido, y definir las tres regiones de compatibilidad en el sistema: Zn2Ca(PO4)2-
Zn3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
[1]
(% mol)
25 % mol Ca3(PO4)2
50% mol Zn3(PO4)2
25 % mol Mg3(PO4)2
Ca3(PO4)2 Mg3(PO4)2
a)
• Zn2Ca(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4-Ca3(PO4)2 (3 Fases)
• Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4 (3 Fases)
• Zn2Ca(PO4)2-Zn3(PO4)4-Ca3(PO4)2 (3 Fases)
Ca3(PO4)2 Mg3(PO4)2
Zn3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
[1]
25 % mol Ca3(PO4)2
50% mol Zn3(PO4)2
25 % mol Mg3(PO4)2
(% mol)
b)
• Zn2Ca(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4-Ca3(PO4)2 (3 Fases)
• Zn2Ca(PO4)2-Zn3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4 (3 Fases)
• Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)4-Ca3Mg3(PO4)4 (3 Fases)
124
Capítulo V
Ca3Mg3(PO4)4-Ca3(PO4)2, Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)4-Ca3Mg3(PO4)4 y Zn2Ca(PO4)2-
Zn3(PO4)4-Ca3(PO4)4, figura IV.23.a.
A partir de la información bibliográfica y de los datos experimentales obtenidos del
sistema ternario ZnO-CaO-P2O5 y del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2, se
procedió a establecer y representar de forma esquemática las compatibilidades en estado
sólido en el sistema.
La figura IV.24, muestra las compatibilidades en estado sólido delimitadas por los
sistemas MgO-ZnO-CaO y Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2. Se han establecido siete
volúmenes de compatibilidad, presentando todos ellos cuatro fases compatibles en el
estado sólido. Se han representado de forma esquemática las soluciones sólidas que
presentan las distintas fases, y finalmente para una mejor visualización se han desagregado
los diferentes volúmenes de compatibilidad establecidos. Señalar que el fosfato tricálcico,
Ca3(PO4)2, está presente en tres volúmenes de compatibilidad y que es compatible con los
siguientes compuestos: ZnO, MgO, Ca4(PO4)2O o HAp, Ca3Mg3(PO4)4 y Zn2Ca(PO4)2.
125
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.24 Representación esquemática de las regiones de compatibilidad en estado
sólido que delimitan los sistemas MgO-ZnO-CaO y Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
ZnO CaO
MgO
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
Ca4(PO4)2O
ZnO
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
V3 (4 Fases)
ZnOMg3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
V1 (4 Fases)
ZnO
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
V2 (4 Fases)
ZnO
MgO
Ca3(PO4)2Ca3Mg3(PO4)4
V5 (4 Fases)ZnO
MgO
Mg3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
V4 (4 Fases)
ZnO CaO
MgO
Ca4(PO4)2O o HAp
V6 (4 Fases)
ZnO
MgO
Ca3(PO4)2
Ca4(PO4)2O o HAp
V7 (4 Fases)
126
Capítulo V
Previamente a la determinación de las compatibilidades en estado sólido
delimitadas por los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y Ca2P2O7-Mg2P2O7-
Zn2P2O7, fue necesario definir perfectamente las compatibilidades en este último sistema.
La razón de este estudio fue la existencia de soluciones sólidas en todo el rango de
composiciones entre los compuestos isoestructurales Zn2P2O7 y Mg2P2O7, que da lugar a la
formación de dos zonas de compatibilidad bifásicas y una tercera zona donde la
compatibilidad en estado sólido es de tres fases, figura IV.25.
Figura IV.25 Representación esquemática de las regiones de compatibilidad en estado
sólido establecidas en el sistema pseudo-ternario Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7.
A partir de esta información, y de la previamente reportada en la literatura [20,25],
se establecieron y se representaron de forma esquemática las compatibilidades en estado
sólido delimitadas por los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y Ca2P2O7-Mg2P2O7-
Zn2P2O7, figura IV.26. En este caso se han establecido once volúmenes de compatibilidad,
coexistiendo en seis de ellos cuatro fases y en cinco de ellos tres fases. Señalar que el
fosfato tricálcico, Ca3(PO4)2, está presente en dos volúmenes de compatibilidad y que es
compatible con los siguientes compuestos: Ca3Mg3(PO4)4, Zn2Ca(PO4)2, CaMgP2O7 y
Ca2P2O7.
Ca2P2O7 Mg2P2O7
Zn2P2 O7
CaMgP2O7
(% mol)
Zn2-XMgXP2 O7
3 Fases2 Fases
2 Fases
127
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.26 Representación esquemática de las regiones de compatibilidad en estado
sólido que delimitan los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 y
Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7.
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
CaMgP2O7
Zn2Ca(PO4)2
V18 (4 Fases)
V14 (4 Fases)
Ca3(PO4)2Zn2Ca(PO4)2
Ca2P2O7
CaMgP2O7
Ca3Mg3(PO4)4
Mg2P2O7
CaMgP2O7
Zn2P2O7
Zn2Ca(PO4)2
V10 (4 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Ca2P2O7
CaMgP2O7Zn2+XMgXP2O7
V11 (4 Fases)
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Ca2P2O7
Mg2P2O7
V12 (3 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Zn2-XMgXP2O7
Zn2Ca(PO4)2 V15 (4 Fases)
Mg3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
V9 (4 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Ca3Mg3(PO4)4
Mg2P2O7
CaMgP2O7
Zn2-XMgXP2O7
V13 (3 Fases)
Zn3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Zn2-XMgXP2O7
V8 (3 Fases)
Mg3(PO4)2
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Zn2-XMgXP2O7
V16 (3 Fases)
Mg3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Mg2P2O7Zn2-XMgXP2O7
V17 (3Fases)
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Ca2P2O7
CaMgP2O7
128
Capítulo V
En último lugar, y siguiendo el mismo criterio que en las regiones anteriores se
establecieron las zonas de compatibilidad en estado sólido delimitadas por los sistemas
Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7 y Ca(PO3)2-Zn(PO3)2-Mg(PO3)2.
La revisión bibliográfica previamente realizada hace mención de la existencia de un
compuesto en la línea de conexión Ca(PO3)2-Zn(PO3)2-Mg(PO3)2, con una composición
cercana al 35 % mol CaO, 18 % mol MgO y 47 % mol P2O5 [20], que hipotéticamente
corresponde a la composición MgO·2CaO·3P2O5 o MgCa2(PO3)6. Como este compuesto no
ha sido verificado experimentalmente, en este estudio no se ha considerado a la hora de
establecer las relaciones de compatibilidad, aunque su hipotética presencia no modificaría
las compatibilidades en estado sólido establecidas, y únicamente desdoblaría las que
forman Zn(PO3)2-Mg(PO3)2-Ca2P2O7-Ca(PO3)2 en Zn(PO3)2-Mg(PO3)2-Ca2P2O7-
MgCa2(PO3)6 y Zn(PO3)2-MgCa2(PO3)6-Ca2P2O7-Ca(PO3)2
Como se puede apreciar en la figura IV.27, en este caso es posible representar cinco
volúmenes de compatibilidad, coexistiendo en tres de ellos cuatro fases y en dos de ellos
tres fases.
129
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.27 Representación esquemática de las regiones de compatibilidad en estado
sólido que delimitan los sistemas Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7 y Ca(PO3)2-Zn(PO3)2-
Mg(PO3)2.
En el sistema () se ha representado el hipotético compuesto MgCa2(PO3)6 y las
compatibilidades que originaría.
Ca2P2O7
Mg(PO3)2
Ca(PO3)2Zn(PO3)2
V23 (4 Fases)
Zn2P2O7
Mg2P2O7
CaMgP2O7
Mg(PO3)2
V21 (3 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Ca2P2O7
CaMgP2O7
Mg(PO3)2
V20 (4 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Ca2P2O7
Zn2P2O7
Mg2P2O7
CaMgP2O7
Mg(PO3)2
Ca(PO3)2Zn(PO3)2Zn2-XMgXP2O7
V19 (3 Fases)
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Zn(PO3)2
Ca2P2O7
Ca2P2O7
Zn2P2O7
Mg2P2O7
Mg(PO3)2
Zn(PO3)2
V22 (4 Fases)
Zn2-XMgXP2O7
Ca2P2O7
Zn(PO3)2
Mg(PO3)2
MgCa2(PO3)6
Ca2P2O7
Ca(PO3)2Zn(PO3)2
MgCa2(PO3)2
130
Capítulo V
Finalmente en la tabla IV.4, se resume la compatibilidad de fases en estado sólido
obtenida en cada una de las regiones estudiadas.
Tabla IV.4 Volúmenes de compatibilidad en estado sólido en el sistema
MgO-ZnO-CaO-P2O5.
Volúmenes de compatibilidad en estado sólido
Coexistencia de fases
MgO-ZnO-CaO/Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2
V1 (4 Fases) Zn2Ca(PO4)2-ZnO-Mg3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4
V2 (4 Fases) Zn3(PO4)2-ZnO-Mg3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2
V3 (4 Fases) Zn2Ca(PO4)2-ZnO-Ca3Mg3(PO4)4-Ca3(PO4)2
V4 (4 Fases) ZnO-MgO-Ca3Mg3(PO4)4-Mg3(PO4)2
V5 (4 Fases) ZnO-MgO-Ca3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4
V6 (4 Fases) ZnO-MgO-CaO-Ca4(PO4)2O o HAp
V7 (4 Fases) ZnO-MgO-Ca4(PO4)2O o HAp-Ca3(PO4)2
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2/Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7
V8 (3 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2
V9 (4 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4
V10 (4 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn2Ca(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4-CaMgP2O7
V11 (4 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn2Ca(PO4)2-CaMgP2O7-Ca2P2O7
V12 (3 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn2Ca(PO4)2-Ca2P2O7
V13 (3 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Ca3Mg3(PO4)4-CaMgP2O7
V14 (4 Fases) Zn2Ca(PO4)2-Ca3(PO4)2-Ca2P2O7-CaMgP2O7
V15 (4 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2
V16 (3 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Zn2Ca(PO4)2-Mg3(PO4)2
V17 (3 Fases) (Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Mg3(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4
V18 (4 Fases) CaMgP2O7-Zn2Ca(PO4)2-Ca3Mg3(PO4)4-Ca3(PO4)2
Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7/Ca(PO3)2-Zn(PO3)2-Mg(PO3)2
V19 (3 Fases) Zn(PO3)2-(Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Ca2P2O7
V20 (4 Fases) Mg(PO3)2-(Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-CaMgP2O7-Ca2P2O7
V21 (3 Fases) Mg(PO3)2-(Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-CaMgP2O7
V22 (4 Fases) Zn(PO3)2-(Zn2P2O7-Mg2P2O7)ss-Ca2P2O7-Mg(PO3)2
V23 (4 Fases) Zn(PO3)2-Mg(PO3)2-Ca2P2O7-Ca(PO3)2
131
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
IV.4.2 Rangos de estabilidad en estado sólido en función de la
temperatura y de la composición de los polimorfos α y α+β del fosfato
tricálcico en la zona rica en Ca3(PO4)2 del subsistema: Ca3(PO4)2-
Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2
La figura IV.28 muestra de forma esquemática, la situación del subsistema:
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2, perteneciente al sistema cuaternario MgO-ZnO-CaO-
P2O5, así como la zona rica en Ca3(PO4)2 objeto de estudio.
Figura IV.28 Diagrama de equilibrio de fases del sistema MgO-ZnO-CaO-P2O5. Esquema
de la zona de interés para la determinación de los rangos de estabilidad en estado sólido en
función de la temperatura y de la composición de los polimorfos α y α+β del Ca3(PO4)2.
Para el establecimiento de los rangos de estabilidad en estado sólido en función de
la composición y de la temperatura de los polimorfos α y α+β del Ca3(PO4)2 se procedió al
estudio de secciones isotermales sucesivas en este subsistema. En cada una de las
secciones isotermales seleccionadas se delimitaron los campos de estabilidad de los
polimorfos α y α+β del fosfato tricálcico. La evolución con la temperatura permitirá
ZnO CaO
P2O5
MgO
Zn3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Ca3(PO4)2
Ca3Mg3(PO4)4
Zn2Ca(PO4)2
Zona rica en Fosfato Tricálcico
132
Capítulo V
construir los correspondientes volúmenes de existencia y coexistencia de las fases α y α+β,
respectivamente.
Antes de abordar el estudio experimental del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2 se han tenido en cuenta todos los datos aportados previamente en la literatura de
los correspondientes sistemas pseudo-binarios que lo integran, apartado IV.2. La necesidad
de disponer de datos contrastados y actualizados del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2,
estudiado por Kreidler y Hummel ya en 1967 [17], junto a la falta de datos en la zona rica
en fosfato tricálcico a temperaturas superiores a 1400 ºC, hizo obligado la realización de
una revisión exhaustiva de este sistema. El sistema Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2, al haber sido
recientemente revisado y corregido por Carrodeguas et al. en 2008 [22], no se ha
considerado necesario someter a una nueva revisión.
IV.4.2.1 Revisión del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2
El procedimiento experimental seguido para el estudio de las transiciones de fase y
las relaciones de fusión del Ca3(PO4)2 en este sistema fue análogo al realizado en el caso
del sistema ternario, apartado IV.3. Para ello se seleccionaron y prepararon diferentes
composiciones en el rango 0-7.14 % mol de ZnO, con el objetivo de cubrir la región de
interés. Seguidamente se trataron térmicamente durante 12 h a temperaturas comprendidas
entre 1150 y 1470 ºC, después de una etapa previa de calcinación a 900 ºC durante 4 h y
molienda intermedia, ver capítulo III. Las composiciones químicas estudiadas se detallan
en la tabla IV.5.
133
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Tabla IV.5 Composiciones estudiadas en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2.
Para asegurar que las composiciones tratadas térmicamente habían alcanzado el
equilibrio termodinámico, algunas muestras fueron tratadas nuevamente durante un tiempo
más prolongado (48 h), no apreciando cambio alguno en las mismas.
Las muestras fueron caracterizadas térmica, mineralógica y microestructuralmente
empleando Análisis Térmico Diferencial (ATD), Difracción de Rayos X (DRX) y
Microscopia Electrónica de Barrido de Emisión de Campo (MEB-EC).
La configuración de fases estables presentes, detectadas por DRX y posteriormente
estudiadas por MEB-EC, se resumen en la tabla IV.6.
% mol
Composición ZnO CaO P2O5 (Zn+Ca)/P ratio
(1) - 75.000 25.000 1.50
(2) 0.120 74.880 25.000 1.50
(3) 0.240 74.760 25.000 1.50
(4) 0.480 74.520 25.000 1.50
(5) 0.750 74.250 25.000 1.50
(6) 0.952 74.048 25.000 1.50
(7) 1.125 73.875 25.000 1.50
(8) 1.917 73.083 25.000 1.50
(9) 2.625 72.375 25.000 1.50
(10) 3.375 71.625 25.000 1.50
(11) 3.855 71.145 25.000 1.50
(12) 4.500 70.500 25.000 1.50
(13) 5.250 69.750 25.000 1.50
(14) 7.140 67.860 25.000 1.50
134
Capítulo V
Tabla IV.6 Fases cristalinas detectadas por DRX en las composiciones estudiadas en el
sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 tras su tratamiento a las temperaturas indicadas.
Composiciones Temperatura (ºC) Fases cristalinas detectadas
1150 β-Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(1) 1200 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1250 α-Ca3(PO4)2
1150 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(2) 1200 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1150 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
1200 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(3) 1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2
1150 -Ca3(PO4)2
1200 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(4) 1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2 1350 α-Ca3(PO4)2
(5) 1400 α-Ca3(PO4)2
1450 α-Ca3(PO4)2
1150 -Ca3(PO4)2
(6) 1200 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
1250 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(7) 1400 α-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(8) 1400 α-Ca3(PO4)2
1450 α-Ca3(PO4)2
1470 α-Ca3(PO4)2
1350 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(9) 1400 α-Ca3(PO4)2-Ca3(PO4)2
1430 α-Ca3(PO4)2
1450 α-Ca3(PO4)2
1350 -Ca3(PO4)2
(10) 1400 α-Ca3(PO4)2--Ca3(PO4)2-
1430 α -Ca3(PO4)2
135
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
* Las fases cristalinas detectadas por DRX en cada composición se ordenaron en la tabla de sentido creciente-decreciente en relación al
porcentaje de fase obtenido.
Paralelamente, con el fin de complementar los resultados obtenidos en los ensayos
estáticos e identificar los procesos térmicos asociados a las transiciones de fases y las
relaciones de fusión a elevada temperatura, se estudió mediante Análisis Térmico
Diferencial (ATD), la evolución con la temperatura de una serie de muestras previamente
seleccionadas.
En la figura IV.29, se han representado y comparado las curvas de ATD obtenidas
en dichas composiciones. El primer pico endotérmico, [1], identificado en las
composiciones (1)-(3) corresponde con la transformación polimórfica β→α-Ca3(PO4)2, que
se produce al superar la línea que separa los campos β-Ca3(PO4)2 de β+α-Ca3(PO4)2. Esta
transformación es de tipo reconstructiva, conlleva rotura y formación de nuevos enlaces, y
por tanto es cinéticamente lenta. El segundo pico [2] está asociado a la transformación
desplazativa α→α´-Ca3(PO4)2, que es reversible y cinéticamente rápida respecto a la
primera transformación, β→α, y que se produce al alcanzar la zona de estabilidad de α+α´-
Ca3(PO4). Se observa claramente como la transformación β→α se desplaza hacia mayores
temperaturas, al aumentar el contenido de ZnO con respecto a la composición (1) que
contiene Ca3(PO4)2 sin dopar. Por el contrario la segunda transformación α→α´, observada
en las mismas composiciones se produjo sin variaciones significativas de la temperatura.
1450 α -Ca3(PO4)2
1350 -Ca3(PO4)2
1400 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(11) 1430 α-Ca3(PO4)2
1450 α-Ca3(PO4)2
1470 α-Ca3(PO4)2
(12) 1350 -Ca3(PO4)2
1400 -Ca3(PO4)2
1350 -Ca3(PO4)2
(13) 1400 -Ca3(PO4)2
1450 α-Ca3(PO4)2
136
Capítulo V
En el caso de las composiciones (4), (6) y (8), los picos asociados a la
transformación polimórfica β→α-Ca3(PO4)2, se produjeron en el rango de temperaturas
comprendido entre 1230-1311 ºC±10 ºC. En estas composiciones, el pico endotérmico
observado a temperaturas más elevadas [3], se atribuye a la formación de líquido debido a
que la composición supera la zona de estabilidad de α-Ca3(PO4)2 y alcanza el campo de
estabilidad α-Ca3(PO4)2+Líquido. Se observa claramente como dicha transformación se
desplaza hacía menores temperaturas al aumentar el contenido de ZnO en las
composiciones.
Figura IV.29 Curvas de ATD de composiciones seleccionadas formuladas en el sistema
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2.
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
Temperatura (ºC)
[1]
[1]
[1]
[1]
[1]
[1]
[2]
[2]
[2]
[3]
[3]
[3]
[4]
[4][5]
β→αα→αí
α→α+Líq
β→α+Líq
β→β+Líq
(1)
(2)
(4)
(3)
(8)
(6)
(11)
(14)
137
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Asimismo en las composiciones (11) y siguientes (12 y 13), se observó únicamente
un pico endotérmico a 1410±10 ºC pico que está asociado a la formación de fase líquida
debido a que la composición alcanza la zona de estabilidad de α-Ca3(PO4)2+Líquido.
Por último la composición (14) presenta una banda en torno a 1200 ºC relacionada
con la primera formación de fase líquida para esa composición, al alcanzar el campo de
estabilidad de β-Ca3(PO4)2SS + Líquido. El segundo pico endotérmico se corresponde con
la reacción peritéctica descrita en el análisis del comportamiento de la composición (11).
A partir de los ensayos estáticos realizados y los estudios dinámicos de ATD
descritos, ha sido posible establecer una nueva versión del diagrama de equilibrio de fases
del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 en la zona rica en Ca3(PO4)2, figura IV.30.
Figura IV.30 a) Revisión del diagrama de equilibrio de fases del sistema Ca3(PO4)2-
Zn3(PO4)2, en la zona rica en Ca3(PO4)2 a partir de los estudios realizados. b) Ampliación
de la zona del diagrama correspondiente a 0-2 % mol Zn3(PO4)2 en el rango de
temperaturas 1450-1600 ºC.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
Tem
pera
tura
(º
C)
Zn3(PO4)2% molCa3(PO4)2
β-TCPSS
α -TCPSS
α+α -TCPSS
α-TCPSS +Líq
α -TCPSS +Líq
Líq´
´´
β-TCPSS
+Líq
(1) (2)
(3)(4)
(6)
(5)(7)
(8)
(9) (10) (11) (12) (13)
(14)
α -TCPSS
α+α -TCPSS´
a) b)
´
138
Capítulo V
Los estudios llevados a cabo permitieron delimitar los campos de estabilidad de los
polimorfos del fosfato tricálcico y proponer las relaciones de fusión en la zona de alta
temperatura de este sistema. Se observó que la temperatura de transformación polimórfica
β→α-Ca3(PO4)2 aumenta con el contenido de Zn3(PO4)2 desde 1125±10 ºC, para el
Ca3(PO4)2 sin dopar, hasta 1425±10 ºC, temperatura de la reacción peritéctica α-
Ca3(PO4)2SS + Líquido↔β-Ca3(PO4)2SS. Asimismo cabe destacar que la temperatura del
sólidus, para composiciones a la derecha de este punto invariante peritéctico, disminuye
muy rápidamente con el incremento del contenido de Zn3(PO4)2, desde 1425±10 ºC para un
contenido de 7.5±0.2 % mol de Zn3(PO4)2, hasta 1150±10 ºC para un contenido de 9.5 %
mol de Zn3(PO4)2.
Los ensayos estáticos permitieron redefinir los campos primarios de cristalización
de los polimorfos β y α del Ca3(PO4)2 así como el área de estabilidad bifásica β+α que los
delimita. Simultáneamente, los ensayos dinámicos permitieron proponer la extensión de la
región bifásica α+α´-Ca3(PO4)2ss, poniendo de manifiesto su coexistencia en un rango muy
estrecho de temperaturas y composiciones.
Como puede apreciarse, se establecieron dos nuevos puntos invariantes de carácter
peritéctico en el sistema. El primero asociado a la reacción α´-Ca3(PO4)2SS + Líquido↔
α-Ca3(PO4)2SS, a 1485±10 ºC, donde α-Ca3(PO4)2 presenta una composición del 99.5 %
mol Ca3(PO4)2, y el segundo correspondiente a la reacción α-Ca3(PO4)2SS + Líquido↔
β-Ca3(PO4)2SS, a 1425±10 ºC, donde β-Ca3(PO4)2 presenta una composición del 92.5 %
mol Ca3(PO4)2.
IV.4.2.2 Sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2
Las modificaciones realizadas en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 expuestas en el
apartado anterior, han puesto de manifiesto la necesidad de incorporar estos nuevos
resultados al estudio experimental del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
La determinación experimental de los volúmenes de existencia de α y α+β-
Ca3(PO4)2 se realizó mediante el estudio de secciones isotermales comprendidas entre 1150
ºC y 1400 ºC. En este sentido, se diseñaron composiciones con contenidos variables en
ZnO y MgO que se sinterizaron a 1150 ºC, 1200 ºC, 1250 ºC 1350 ºC y 1400 ºC durante 12
h, empleando una vez más el método de congelación del equilibrio, “quenching”.
139
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Las composiciones químicas estudiadas y su ubicación en el sistema se detallan en
la tabla IV.7 y en la figura IV.31. La configuración de fases estables presentes, detectadas
por DRX y confirmadas por MEB-EC, se resumió en la tabla IV.8.
Tabla IV.7 Composiciones estudiadas en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
% mol
Composición MgO ZnO CaO P2O5 (Mg+Zn+Ca)/P
ratio
(1) - 0.120 74.880 25.000 1.50
(2) - 0.240 74.760 25.000 1.50
(3) - 0.480 74.520 25.000 1.50
(4) - 0.952 74.048 25.000 1.50
(5) - 1.917 73.083 25.000 1.50
(6) - 0.750 74.250 25.000 1.50
(7) 1.500 0.750 72.750 25.000 1.50
(8) - 2.625 72.375 25.000 1.50
(9) - 3.375 71.625 25.000 1.50
(10) - 3.855 71.145 25.000 1.50
(11) - 4.500 70.500 25.000 1.50
(12) 0.750 - 74.250 25.000 1.50
(13) 2.625 - 72.375 25.000 1.50
(14) 3.375 - 71.625 25.000 1.50
(15) 3.855 - 71.145 25.000 1.50
(16) - 1.125 73.875 25.000 1.50
(17) 2.250 1.125 71.625 25.000 1.50
(18) 4.500 1.125 69.375 25.000 1.50
140
Capítulo V
Tabla IV.8 Fases cristalinas detectadas por DRX en las composiciones estudiadas en el
sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 tratadas a distintas temperaturas.
Composición Temperatura (ºC) Fases cristalinas detectadas
1150 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(1) 1200 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1150 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
1200 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(2) 1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2
1150 -Ca3(PO4)2
1200 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(3) 1250 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1350 α-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2 1150 -Ca3(PO4)2
(4) 1200 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
1250 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2 1350 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1250 -Ca3(PO4)2
(5) 1350 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(6) 1350 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2
(7) 1350 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(8) 1350 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2 1400 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(9) 1350 -Ca3(PO4)2
1400 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(10) 1350 -Ca3(PO4)2 1400 -Ca3(PO4)2
(11) 1350 -Ca3(PO4)2
1400 -Ca3(PO4)2
(12) 1350 α-Ca3(PO4)2
1400 α-Ca3(PO4)2
141
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
* Las fases cristalinas detectadas por DRX en cada composición se ordenaron en la tabla de sentido creciente-decreciente en relación al
porcentaje de fase obtenido.
Los resultados obtenidos en el estudio de las secciones isotermales permitieron
delimitar los campos de estabilidad de α y α+β, a las temperaturas de 1150 ºC, 1200 ºC,
1250 ºC 1350 ºC y 1400 ºC, figura IV.31.
(13) 1350 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2 1400 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(14) 1350 -Ca3(PO4)2 1400 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2
(15) 1350 -Ca3(PO4)2
1450 -Ca3(PO4)2-α-Ca3(PO4)2 (trazas)
(16) 1400 α-Ca3(PO4)2
(17) 1400 α-Ca3(PO4)2-β-Ca3(PO4)2
(18) 1400 -Ca3(PO4)2
142
Capítulo V
Figura IV.31 Composiciones estudiadas en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
a) Delimitación experimental a escala de los campos de estabilidad de los polimorfos α y
α+β del Ca3(PO4)2 en cada sección isotermal. b) Representación esquemática de los
campos de estabilidad en cada una de la secciones isotermales, para mayor claridad.
Una vez delimitados experimentalmente los campos de estabilidad α y α+β en las
distintas secciones isotermales se establecieron los correspondientes volúmenes de
estabilidad, figura IV.32, en función de la temperatura y la composición.
Mg3(PO4)2
Zn3(PO4)2
1200 ºC
1250 ºC
1350 ºC
1400 ºC1 2 3 4 5 6
1
2
3
4
5
6
Ca3(PO4)2
1300 ºC
1150 ºC
1110 ºC
β
αα+β
β
αα+β
βαα+β
βαα+β
α+β
βα
1400 ºC
1350 ºC
1250 ºC
1200 ºC
1150 ºC
(1) (2)(3) (4)
(5)
(6)
(7)
(8) (9)
(10)
(11)
(12)
(13) (14)
(15)
(16)
(17)
(18)
a) b)
143
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.32 Representación a escala en función de la temperatura y de la composición de
los volúmenes de estabilidad de los polimorfos α y α+β del Ca3(PO4)2 en el sistema
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2.
Los resultados obtenidos indican que la incorporación de iones Zn2+ o de Mg2+ en
la estructura del fosfato tricálcico produce una importante reducción de los volúmenes de
estabilidad de α y α+β, muy acusada a bajas temperaturas, aunque también significativa a
altas temperaturas. Este hecho es importante para el diseño y formulación de
composiciones ya que reduce de forma notable las áreas de estabilidad y en definitiva las
zonas donde pueden formularse biomateriales que contengan a dichos polimorfos.
Zn3(PO4)2
1200 ºC
1250 ºC
1350 ºC
1400 ºC1 2 3 4 5 6
1
2
3
4
5
6
Ca3(PO4)2
1300 ºC
1150 ºC
1110 ºC
L Carbajal et al.
Mg3(PO4)2
1400 ºC
1110 ºC
α-Ca3(PO4)2 +β-Ca3(PO4)2
α-Ca3(PO4)2
2 % mol 5 % mol Zn3(PO4)2
2 % mol
5 % mol Mg3(PO4)2
144
Capítulo V
IV.4.2.3 Estudio de la incorporación de Zn2+ y Mg2+ en la fase β-Ca3(PO4)2 mediante
espectroscopía Raman
Los estudios realizados hasta el momento en los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4) y
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2 han demostrado que los cationes, Zn2+ y Mg2+ se
incorporan en solución sólida en la estructura del β-Ca3(PO4)2. Asimismo, se ha
corroborado que la presencia de estos dopantes en dicha estructura, influye
apreciablemente en la temperatura de transformación polimórfica β→α-Ca3(PO4)2,
estabilizando la fase β-Ca3(PO4)2.
El estudio de la incorporación de Zn2+ y Mg2+ en la estructura de β-Ca3(PO4)2
mediante Espectroscopía Raman se realizó en composiciones seleccionadas pertenecientes
a los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4) y Mg3(PO4)2-Zn3(PO4) tratadas a 900 ºC durante 12 h,
tabla IV.7.
Previamente al estudio espectroscópico se consideró conveniente, realizar en estas
composiciones, un análisis por DRX de los parámetros de red y del volumen de la celda
unidad de la estructura de β-Ca3(PO4)2 mediante el método Rietveld. Los parámetros
estructurales iniciales para realizar el refinamiento, se tomaron de los previamente
establecido por Yashima et al. [33].
Los resultados obtenidos pusieron en evidencia la disminución de los parámetros de
red a=b y c que se produce con el contenido de dopante y que da lugar a una importante
disminución del volumen de la celda unidad del β-Ca3(PO4)2, tabla IV.9.
145
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Tabla IV.9 Parámetros reticulares de la fase β-Ca3(PO4)2 calculados para las
composiciones selecionadas tratadas a 900 ºC 12 h.
El estudio por Espectroscopía Raman de los efectos derivados de la sustitución de
Ca2+ por Zn2+ y Ca2+ por Mg2+ en la estructura del β-Ca3(PO4)2 permitió confirmar la
formación de soluciones sólidas de carácter sustitucional, establecidas previamente por
DRX.
La figura IV.33 muestra el espectro Raman característico de las dos familias de
composiciones estudiadas, donde se identificaron los principales modos normales de
vibración asociados al grupo PO43-.
Composición a(Å) b(Å) c(Å) Volumen celda
unidad
TCP sin dopar 10.4358±0.0007 10.4376±0.0007 37.383±0.004 3527.01±0.07
(6) 10.4293±0.0008 10.4293±0.0008 37.374±0.005 3520.60±0.07
(8) 10.4029±0.0004 10.4029±0.0004 37.329±0.002 3498.60±0.04
(9) 10.3883±0.0005 10.3883±0.0005 37.292±0.003 3485.29±0.05
(10) 10.3813±0.0008 10.3813±0.0008 37.264±0.004 3477.95±0.06
(12) 10.4274±0.0007 10.4274±0.0007 37.390±0.004 3520.77±0.07
(13) 10.3988±0.0006 10.3988±0.0006 37.334±0.004 3496.25±0.07
(14) 10.387±0.001 10.387±0.001 37.293±0.008 3484.5±0.1
(15) 10.379±0.001 10.379±0.001 37.283±0.006 3478.3±0.1
146
Capítulo V
Figura IV.33 Espectro Raman característico de las composiciones estudiadas
mostrando los principales modos normales de vibración asociados al grupo PO43-.
Los picos y el hombro observados a ~948, 970 y 961 cm-1 corresponden con el
modo de tensión simétrico no degenerado, υ1, del enlace P-O. Las bandas situadas a 370-
505, 530-645, se atribuyeron a υ2 y υ4, modos de deformación correspondientes a las
vibraciones del enlace O-P-O, mientras que la banda situada a 995-1120 cm-1, corresponde
a υ3, modos de tensión asimétrico asociados al enlace P-O [34]. Todos estos modos, que
corresponden con las vibraciones internas de los iones PO43-, permitieron identificar la fase
β-Ca3(PO4)2 en las muestras. No se pudo distinguir la banda de menor intensidad situada a
150-300 cm-1, asociada a los modos de vibración de carácter traslacional de las subredes
Ca2+ y PO43-.
La estructura cristalina del β-Ca3(PO4)2 cristaliza en el grupo espacial R3c y se
puede describir como una serie de columnas A y B dispuestas paralelamente al eje c de la
celda unidad. La columna A, menos densa, tiene la forma P(1)O4 Ca(4)O3 Ca(5)O6 P(1)O4
mientras que la columna B, más densa, es del tipo P(3)O4 Ca(1)O7 Ca(3)O8 Ca(2)O8
P(2)O4 P(3)O4 [33]. Esta estructura presenta 42 tetraedros PO43- con 3 posiciones de
fósforo cristalográficamente distintas, denotadas P(1), P(2) y P(3), figura IV.34.
200 400 600 800 1000 1200
Inte
nsi
da
d R
aman
(u
.a)
Numero de Onda
ν4ν2
ν1
ν3
147
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.34 Entornos de los tetraedros de fosforo P(1), P(2) y P(3) en la estructura del β-
Ca3(PO4)2.
Las ocupaciones relativas de las tres posiciones de fósforo son 1:3:3 para P(1), P(2) y P(3)
respectivamente, ya que P(1) ocupa una posición cristalográfica especial.
Un análisis más profundo de los picos y el hombro asociados con el modo de
tensión simétrico no degenerado, υ1, del enlace P-O, modo dominante en los espectros de
Raman, ha permitido relacionar las señales obtenidas en los espectros de Raman con las
diferentes posiciones de fósforo anteriormente mencionadas. La figura IV.35, muestra la
región ampliada de los espectros de Raman obtenidos en las composiciones estudiadas en
el rango de 930-990 cm-1, así como el resultado de su deconvolución en tres componentes
de tipo lorenziano.
En el caso del espectro obtenido para la composición β-Ca3(PO4)2 sin dopar, las tres
posiciones de los átomos de fósforo P(1), P(2) y P(3) se observaron a 947 cm-1, 962 cm-1 y
970 cm-1 respectivamente [35].
148
Capítulo V
Analizando la evolución en cada familia de composiciones de los correspondientes
modos de vibración con el aumento del contenido de Zn2+ y Mg2+, figura IV.35 a y b, se
observó como las tres bandas asociadas a υ1 presentan distintos comportamientos al
incrementar el nivel de sustitución de dopante. La banda asociada a P(1) se desplaza
notablemente hacia mayores números de onda cuando aumenta tanto el contenido de ZnO
como de MgO, mientras que las bandas observadas a 962-963 cm-1 y a 970-971 cm-1,
correspondientes con los grupos P(2) y P(3), sólo presentan un ligero desplazamiento. Esta
evolución, en todos los casos, implica que la constante de fuerza del enlace P-O se
incrementa a medida que aumenta el contenido de dopante, provocando una disminución
de la distancia de enlace entre los átomos de fosforo y sus oxígenos coordinados.
Figura IV.35 Espectros Raman obtenidos en las composiciones estudiadas, a) en función
del contenido de ZnO y b) en función del contenido de MgO en el rango de 930 a 990 cm1.
El asterisco () en la figura permite visualizar la evolución de la banda asociada a P(1) a
medida que aumenta el contenido de dopante en cada familia de composiciones.
P(3)
P(2)P(1)
b)
Número de onda (cm-1)
3.855 % mol MgO
962947
970
963951971
2.625 % mol MgO
963949971
3.375 % mol MgO
963949971
930 940 950 960 970 980 990
0 % mol MgO (TCP sin dopar)
0.750 % mol MgO
962948
970
P(3)
P(2)P(1)
a)
962947
0.750 % mol ZnO (6)
962947
970
962947
970
930 940 950 960 970 980 990
970
0 % mol ZnO (TCP sin dopar)
Inte
nsi
dad
Ra
ma
n (u
.a)
Número de onda (cm-1)
2.625 % mol ZnO (8)
949970
962
3.375 % mol ZnO (9)
950971
962
3.855 % mol ZnO (10)
951971
963
149
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
La figura IV.35, permitió observar la distorsión que producen el Zn2+ y Mg2+ en los
tetraedros de PO43-, al incorporarse en la estructura del β-Ca3(PO4)2. En esta dirección, a
partir de los espectros obtenidos, se ha representado el desplazamiento Raman asociado a
la banda P(1) en función del contenido de dopante, figura IV.36, tanto para el ZnO, figura
IV.36.a como para el MgO figura IV.36.b. En ambas familias de composiciones se observa
una correlación de tipo lineal entre el desplazamiento Raman y el contenido de dopante.
Figura IV.36 Evolución de la banda asociada a P(1) en función del contenido de: a) ZnO y
b) MgO.
Trabajos anteriores [34–36], ha demostrado que ambos cationes pueden sustituir al
Ca2+ en dos sitios diferentes: Ca(4) en coordinación trigonal planar y Ca(5) en
coordinación octaédrica, con preferencia por esta última [28,36,39]. Estos autores también
manifiestan que estos dopantes se incorporan en primer lugar en las posiciones Ca(5), que
representan el 9.09 % de los Ca, siendo posteriormente sustituidos los sitios de Ca(4), que
constituyen el 4.55 % de los Ca.
Puesto que los niveles de dopante que contienen las muestras (4 % mol ZnO=1.23
% atómico Zn2+) son inferiores al umbral necesario para llenar las posiciones Ca(5), se
puede que las posiciones Ca(4) no se ven afectadas por la incorporación de iones Zn2+ o de
Mg2+ por Ca2+ en β-Ca3(PO4)2 a estos niveles de dopante.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
947
948
949
950
951
952
De
spla
zam
ien
to R
am
an
P(1
) (c
m-1)
% mol ZnO
pendiente=1.048
r2=0.99961
a)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
947
948
949
950
951
952
pendiente=1.088
r2=0.99628
De
spla
zam
ien
to R
am
an
P(1
) (c
m-1)
% mol MgO
b)
150
Capítulo V
Por este motivo el mayor desplazamiento de la señal Raman asociado a los
tetraedros P(1) es fundamentalmente consecuencia de la estructura abierta característica de
la columna de tipo A en la que se encuentran situados dichos tetraedros, lo que permite una
distorsión más acusada de los mismos pese a que éstos se encuentran unidos a posiciones
Ca(5), a través de posiciones Ca(4). En el caso de los tetraedros P(2) y P(3), la estructura
muy cerrada de la columna de tipo B, bloquea este efecto, pese a la existencia de uniones
directas a Ca(5) a través de sus oxígenos puente.
Si se representa para cada composición estudiada el volumen de la celdilla unidad y
de los parámetros de red a=b en función del desplazamiento Raman asociado a los grupos
P(1), figura IV.37.a y b, se obtiene una correlación lineal para ambas familias de
composiciones. Estos resultados también permiten deducir que el efecto de la sustitución
de los Ca2+ por Zn2+ y Ca2+ por Mg2+ en las posiciones Ca(5) es equivalente o que las
posibles diferencias si las hubiera, no son detectables por Raman.
En el caso del parámetro de red c el efecto de la sustitución es también equivalente
aunque no lineal, figura IV.37.c, lo que sugiere una mayor distorsión en este eje
cristalográfico.
151
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Figura IV.37 Evolución para cada composición del a) volumen de la celda unidad, b)
parámetro de red a=b y c) parámetro de red c, del β-Ca3(PO4)2 en función del
desplazamiento Raman asociado a la banda P(1).
El análisis conjunto de los resultados obtenidos por DRX y espectroscopía Raman
indica que la contracción del volumen de la celda unidad producido por el aumento de la
fuerza de los enlaces P-O por efecto de la sustitución de los Ca2+ por Zn2+ y Ca2+ por Mg2+
en las posiciones Ca(5), podría ser la causa que justifica la estabilidad de la fase β-
Ca3(PO4)2 en los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2-Mg3(PO4)2 con la
temperatura.
947 948 949 950 951 952
3480,0
3490,0
3500,0
3510,0
3520,0
3530,0
% mol ZnO
Vo
lum
en c
elda
un
idad
(Å
)
Desplazamiento Raman P(1) (cm-1)
a)
% mol MgO
947 948 949 950 951 95210,37510,38010,38510,39010,39510,40010,40510,41010,41510,42010,42510,43010,43510,44010,445
% mol ZnO
P
ará
me
tro
de
re
d a
(Å
)
Desplazamiento Raman P(1) (cm-1)
b)
% mol MgO
947 948 949 950 951 95237,240
37,260
37,280
37,300
37,320
37,340
37,360
37,380
37,400
% mol ZnO
P
ará
me
tro
de
re
d c
(Å
)
Desplazamiento Raman P(1) (cm-1)
c)
% mol MgO
152
Capítulo V
IV.5 CONCLUSIONES PARCIALES
Se han establecido experimentalmente a 900 ºC las compatibilidades en estado
sólido del fosfato tricálcico y del óxido de cinc en el sistema ternario ZnO-CaO-P2O5. Se
han delimitado los campos de estabilidad monofásicos donde es estable el fosfato tricálcico
y la zona bifásica donde coexisten en equilibrio fosfato tricálcico e hidroxiapatita. Se ha
establecido experimentalmente a 900 ºC: el límite de solución sólida de Ca2+ en Zn3(PO4)2
en el sistema Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2, fijándolo en un 0.6±0.1 % mol de CaO y el límite de
solución sólida de Zn2+ en Ca3(PO4)2 en el sistema ZnO-Ca3(PO4)2, fijándolo en un
3.6±0.5 % mol de ZnO.
Los estudios experimentales en el subsistema Ca3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2 han
demostrado que el compuesto Ca19Zn2(PO4)14 es en realidad una solución sólida de
Zn3(PO4)2 en Ca3(PO4)2.
Se han establecido a 900 ºC las compatibilidades en estado sólido en los sistemas
Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2, Ca2P2O7-Mg2P2O7-Zn2P2O7 y MgO-ZnO-CaO-P2O5, en
este último caso para contenidos de P2O5 inferiores o iguales al 50 % mol. El Ca3(PO4)2
está presente en cinco volúmenes de compatibilidad en estado sólido donde coexisten
cuatro fases. Las fases que son compatibles con el fosfato tricálcico son: ZnO, MgO,
Ca4(PO4)2O, HAp, Ca3Mg3(PO4)4, CaMgP2O7 y Ca2P2O7.
La revisión del sistema pseudo-binario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 en la región rica en
Ca3(PO4)2, ha permitido delimitar los campos de estabilidad de los polimorfos α, β, α+β y
α+α´ del fosfato tricálcico y proponer las relaciones de fusión en la zona de alta
temperatura de este sistema. Se han establecido dos puntos invariantes de carácter
peritéctico asociados a las reacciones: α´-Ca3(PO4)2SS + Líquido↔α-Ca3(PO4)2SS
a 1485±10 ºC, donde α-Ca3(PO4)2 presenta una composición del 99.5 % mol Ca3(PO4)2 y
α-Ca3(PO4)2SS + Líquido↔β-Ca3(PO4)2SS a 1425±10 ºC, donde β-Ca3(PO4)2 presenta una
composición del 92.5 % mol Ca3(PO4)2.
Se ha establecido en este sistema pseudo-binario el límite de solución sólida de
Zn2+ en Ca3(PO4)2, fijándolo en el 7.5±0.2 % mol de Zn3(PO4)2 a 1425±10 ºC.
153
Estudio de los diagramas de equilibrio de fases ZnO-CaO-P2O5 y MgO-ZnO-CaO-P2O5
Se han determinado los rangos de estabilidad en estado sólido de los polimorfos α y
α+β del fosfato tricálcico, entre 1100 y 1400 ºC, en la región rica en Ca3(PO4)2 en el
sistema pseudo-ternario Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2-Ca3(PO4)2. El estudio realizado permite
definir los rangos de composición y temperatura, para la formulación y preparación de
biomateriales basados en fosfato tricálcico modificados con óxido de cinc y óxido de
cinc/óxido de magnesio.
Los estudios estructurales llevados a cabo han demostrado que el mecanismo de
sustitución de Ca2+ por Zn2+ y Ca2+ por Mg2+ en la estructura del β-Ca3(PO4)2 es
equivalente. La incorporación de Zn2+ o Mg2+ produce una distorsión en la red cristalina
que se observa principalmente en las posiciones cristalográficas P(1) de fósforo y en menor
medida en las posiciones P(2) y P(3). A este hecho se atribuye la estabilidad de la fase β-
Ca3(PO4)2 a mayor temperatura.
154
Capítulo V
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Capítulo V
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
159
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
V. Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO
y ZnO/MgO
V.1 INTRODUCCIÓN
La obtención de biocerámicas basadas en fosfato tricálcico ya sean densas o
porosas, en forma de recubrimiento, cemento o formando parte de materiales compuestos,
para aplicaciones de relleno, sustitución y/o reconstrucción de tejidos óseos, requiere en
primera instancia de la preparación de compuestos cerámicos particulados con
determinadas especificaciones.
El método de síntesis por reacción en estado sólido se ha seleccionado y utilizado
como método de obtención de los biomateriales en la presente memoria de Tesis Doctoral,
ya que permite realizar un control riguroso de cada etapa del procesamiento, derivando en
la obtención de compuestos cerámicos optimizados para su posterior sinterización. Los
productos formulados, una vez sintetizados, se consolidan a alta temperatura, a fin de
favorecer los procesos de interdifusión iónica y las reacciones en estado sólido necesarias
para que se produzcan las transformaciones de fase requeridas, obteniendo finalmente el
material cerámico deseado. En esta dirección, el estudio realizado en este capítulo se ha
dirigido a analizar y definir, partiendo de un exhaustivo control químico, los diversos
parámetros físico-químicos que condicionan la síntesis por reacción en estado sólido, con
el objetivo de establecer su relación con las propiedades de los materiales.
El control de la síntesis y del procesado ha permitido obtener biomateriales
homogéneos basados en fosfato tricálcico modificados con ZnO y ZnO/MgO, con
propiedades estructurales, mineralógicas, microestructurales y biológicas optimizadas.
160
Capítulo V
V.2 SÍNTESIS, SINTERIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON
ZnO
La información obtenida en el capítulo IV, ha permitido definir los rangos más
idóneos de composición y temperatura en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 , para el diseño y
formulación de los biomateriales basados en los polimorfos β y/o α del fosfato tricálcico
modificados con ZnO. Las formulaciones de las composiciones han tenido en cuenta los
datos previamente reportados en la literatura que ponen de manifiesto la posible toxicidad
del ZnO a contenidos superiores al 1.0 % en peso [1,2].
V.2.1 Síntesis de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico
modificados con ZnO
Esta parte del estudio se subdivide en dos etapas: en la primera se realizará una
caracterización granulométrica y térmica de las mezclas homogéneas en verde de los
materiales de partida, y en la segunda, se abordará la caracterización físico-química y
térmica de los compuestos cerámicos tratados a 900 ºC, que conduce a la sinterización de
biomateriales basados en Ca3(PO4)2 (TCP) y Ca3(PO4)2 modificados con ZnO (Zn-TCP).
V.2.1.1 Caracterización de los compuestos cerámicos en verde
En este apartado se aborda el estudio granulométrico y el comportamiento térmico
de las mezclas homogéneas de materiales de partida de alta pureza utilizados para
sintetizar, en polvo, TCP y Zn-TCP precursores de los materiales que posteriormente serán
sinterizados.
V.2.1.1.1 Distribución de tamaño de partícula y superficie específica
En la tabla V.1 y figura V.1, se presentan la distribución de tamaños de partícula
y superficie específica de las mezclas homogeneizadas de TCP estequiométrico, y las
composiciones 0.125 Z y 1.0 Z. Los polvos de TCP exhiben una distribución trimodal y
un perfil más ancho que el resto de las mezclas que presentan distribuciones bimodales,
161
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
ligeramente más estrechas. Sin embargo todas las composiciones tienen tamaños medios
de partícula cercanos, en el rango de 9.5 a 14.0 μm y una superficie específica entre 1.6-
1.7 m2/g.
Tabla V.1 Valores de tamaño medio de partícula y superficie específica obtenidos en
las mezclas homogeneizadas.
Figura V.1 Distribución de tamaño de partícula de las mezclas en verde de TCP, 0.125 Z
y 1.0 Z.
V.2.1.1.2 Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG)
A fin de obtener una visión previa de los procesos de reacción y en consecuencia
definir los tratamientos térmicos adecuados que garanticen la obtención de los materiales
deseados, las mezclas homogeneizadas de materiales de partida se estudiaron mediante
ATD-TG.
En la figura V.2, se muestran las curvas de ATD-TG, registradas desde 25-1500 ºC
a una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min, para las mezclas de las composiciones
estudiadas: TCP estequiométrico, 0.125 Z y 1.0 Z, formuladas de acuerdo a la reacción:
X ZnO + (3-X) CaCO3 + 2 NH4H2PO4 → [ZnXCa(3-X)](PO4)2 + ↑3 H2O + ↑2 NH3 +↑(3-X) CO2
(Ecuación V.1)
d50(μm) Se (m2/g)
TCP 13.5 1.6 0.125 Z 9.8 1.7 1.0 Z 13.9 1.6
0,1 1 10 100 10000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
TCP 0.125 Z 1.0 Z
Dis
trib
ució
n en
frec
uenc
ia (
%)
Diámetro esférico equivlente (m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Dis
trib
ució
n ac
umua
tiva
(%)
162
Capítulo V
Figura V.2 Curvas de a) ATD y b) TG obtenidas para las mezclas correspondientes a las
composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z.
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Temperatura (ºC)
TCP 0.125 Z 1.0 Z
a)
AT
D (V
)
exo
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600-50
-40
-30
-20
-10
0
b)
TCP 0.125 Z 1.0 Z
Pér
dida
de
peso
(
)
Temperatura (ºC)
163
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
En todas las curvas de ATD, figura V.2.a, se evidencian tres picos endotérmicos. El
primer pico que aparece a una T=200 ºC está asociado, a una pérdida de peso de 13.5 %,
figura V.2.b. Teniendo en cuenta los DRX obtenidos a 250 ºC, en los que únicamente se
detectaron difracciones asociadas a la fase cristalina CaCO3, podremos atribuir este
proceso endotérmico a la fusión y descomposición parcial del fosfato amónico según la
reacción:
NH4H2PO4(s)↔NH3(g)+H3PO4(l) (Ecuación V.2)
El siguiente evento térmico, que se corresponde con un segundo pico más ancho en
forma de duplete y que se observa en el intervalo de temperaturas entre 715-860 ºC, está
asociado a una pérdida de peso del 14.8 %. Al igual que en el caso anterior, los DRX
realizados a 700 y 860 ºC permitieron identificar los procesos involucrados. En los
difractogramas obtenidos a 700 ºC se observaron por un lado difracciones atribuidas a
CaCO3 de menor intensidad respecto de las obtenidas a 250 ºC, picos de difracción
asociados a la fase β-TCP y difracciones de baja intensidad asociadas a la fase HAp. Este
resultado puso de manifiesto la descomposición parcial de CaCO3 a 700 ºC y la incipiente
formación de β-TCP. Los difractogramas obtenidos a 860 ºC, confirmaron la cristalización
de β-TCP y la presencia de pequeñas cantidades de los compuestos intermedios de
reacción, HAp y β-Ca2P2O7. Puesto que no se observaron picos asociados a CaCO3 a esta
temperatura, se pudo certificar la total descomposición del CaCO3 residual a 860 ºC.
En la composición 1.0 Z, se constató la formación de β-TCP por la presencia de un
pico exotérmico a 836 ºC, que se relacionó con la presencia de ZnO que activa la
cristalización de este compuesto.
Finalmente el último pico endotérmico se observó en el rango de temperaturas
comprendido entre 1440-1467 ºC. Este pico se atribuyó a la transformación polimórfica
α→α´-TCPSS en el caso de las composiciones TCP y 0.125 Z y a la formación de líquido
enekl caso de la composición 1.0Z, al alcanzar esta composición la temperatura donde
coexisten en equilibrio α-TCPSS + Líquido, de acuerdo con los estudios llevados a cabo en
el diagrama de equilibrio del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2, capítulo IV.
En todas las composiciones se observó experimentalmente una pérdida total de
peso en el rango 41.7-41.3 %, (TCP y 1.0 Z), a la temperatura de 900 ºC, figura V.2.b. Los
164
Capítulo V
valores teóricos de pérdida de peso calculados, considerando la volatilización H2O, NH3 y
CO2, en las composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z corresponden con un 41.50 %, 41.48 % y
41.25 % respectivamente, valores que se ajustan casi perfectamente con los obtenidos
experimentalmente.
A la vista de estos resultados se seleccionó 900ºC como la temperatura óptima de
síntesis para las distintas mezclas. El tiempo de tratamiento se estableció en 2 h. Este ciclo
térmico garantizará la completa descomposición de los reactivos empleados, favoreciendo
las reacciones de formación de las fases requeridas.
V.2.1.2 Caracterización de los compuestos cerámicos sintetizados
El tratamiento térmico de síntesis previo a la sinterización forma parte del proceso
cerámico y tiene como objetivo producir un sistema particulado, reaccionado y adecuado
para la posterior sinterización. En este sentido, en este apartado se abordará el estudio del
comportamiento térmico, mineralógico y estructural de las composiciones sintetizadas para
posteriormente proceder a la sinterización de los biomateriales basados en TCP y Zn-TCP.
V.2.1.2.1 Espectroscopía de Infrarrojo mediante transformada de Fourier (IR-TF)
Para determinar y conocer las características estructurales de los compuestos
sintetizados a 900 ºC 2 h, éstos se caracterizaron mediante Espectroscopía de Infrarrojo,
técnica de gran utilidad para distinguir e identificar fases secundarias o la presencia de
productos sin reaccionar o descomponer.
En la figura V.3, se muestran los espectros normalizados de IR-TF adquiridos en el
rango de 400-4000 cm-1 de las composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z tratadas térmicamente
a 900 ºC durante 2 h. En los espectros obtenidos se observan los principales modos
normales de vibración asociados al grupo PO43- [3,4]. El pico observado a 940 cm-1
corresponde con el modo de tensión simétrico no degenerado, υ1, del enlace P-O. Las
bandas situadas a 553 y 605 cm-1 se atribuyeron al modo de deformación triplemente
degenerado, υ4 y la banda observada ~420 cm-1 al modo de deformación doblemente
degenerado, correspondientes ambos a las vibraciones de deformación del enlace O-P-O.
165
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
También se observó la banda asociada al modo de tensión asimétrico triplemente
degenerado, υ3, asociado al enlace P-O, en el rango 962-1062 cm-1.
En ningún caso se observaron bandas asociadas a los modos de vibración de los
grupos NH4+ y CO3
2-, poniendo de manifiesto la completa síntesis del material y en
definitiva la efectividad del proceso de reacción inducido por el tratamiento térmico.
Figura V.3 Espectros de IR-TF de las composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z tratadas a 900
ºC 2 h.
V.2.1.2.2 Difracción de rayos X (DRX)
Los difractogramas correspondientes a las muestras TCP, 0.125 Z y 1.0 Z tratadas a
900 ºC, se muestran en la figura V.4. En todos los compuestos se identificaron las
difracciones características de la fase β-TCP, de acuerdo con la ficha nº 702065 de la base
de datos JCPDS, figura V.4.a.
1.0 Z
Abs
orba
ncia
(u.
a)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
TCP
Número de onda (cm-1)
0.125 Z
166
Capítulo V
Figura V.4 a) DRX de las composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z tratadas a 900 ºC 2 h. b)
Ampliación del difractograma en la región 2θ desde 30.8 º hasta 31.7 º.
No de detectaron difracciones asociadas a compuestos de partida sin reaccionar o
compuestos intermedios de reacción. Asimismo la ausencia de difracciones asociadas a
ZnO, junto con el ligero desplazamiento observado en la difracción principal del β-TCP
con el aumento del contenido de ZnO, figura V.4.b, evidencia la incorporación de Zn2+ en
solución sólida en la estructura del β-TCP, y la evolución de la composición del β-
Ca3(PO4)2 hacia β-ZnxCa(3-x)(PO4)2 solución solida durante el tratamiento térmico a 900 ºC.
V.2.1.2.3 Distribución de tamaño de partícula y superficie específica
El empleo de una temperatura de tratamiento cercana a la reacción de
descomposición del carbonato de calcio (900 ºC 2 h), dio lugar a un refinamiento del
tamaño de partícula. La distribución de tamaños de partícula y la superficie específica de
los polvos tratados a 900 ºC 2 h, se muestran en la figura V.5 y en la tabla V.2.
20 25 30 35 40
31.0 31.5
b)
-TCP
Inte
nsid
ad (
u.a.
)
2
TCP 0.125 Z 1.0 Z
a)
167
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Tabla V.2 Valores de tamaño medio de partícula y superficie específica obtenidos en las
composiciones tratadas a 900 ºC 2 h.
Figura V.5 Distribución de tamaño de partícula de las composiciones de TCP, 0.125 Z y
1.0 Z tratadas a 900 ºC 2 h.
A la vista de los resultados se observa que todas las muestras exhiben una
distribución unimodal, más estrecha, reduciendo en un orden de magnitud los valores
medios de tamaño de partícula (d50), con respecto a las muestras de partida. Este hecho y el
aumento de los valores de superficie específica favorecerá la reactividad y su posterior
sinterización.
V.2.1.2.4 Análisis Térmico Diferencial y Termogravimetría (ATD-TG)
En este estudio se evaluó la influencia del ZnO en el proceso de transformación
polimórfica β→α del TCP. Para ello las composiciones homogeneizadas se trataron
térmicamente a 900 ºC durante 12 h. En este caso, el tiempo de tratamiento de los
compuestos en polvo se incrementó a fin de asegurar la completa cristalización de la fase
β-TCP.
d50(μm) Se (m2/g)
TCP 1.0 7.0 0.125 Z 1.0 7.5 1.0 Z 0.8 6.4
0.1 1 10 100 10000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Dis
trib
ució
n ac
umua
tiva
(%)
Dis
trib
ució
n en
frec
uenc
ia (
%)
Diámetro esférico equivlente (m)
TCP 0.125 Z 1.0 Z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
168
Capítulo V
En la figura V.6, se muestran las curvas de ATD, registradas desde 25-1500 ºC a
una velocidad de calentamiento de 3 ºC/min, para las muestras tratadas térmicamente a 900
ºC durante 12 h.
Figura V.6 Curvas ATD obtenidas para las composiciones TCP, 0.125 Z y 1.0 Z tratadas a
900 ºC 12 h.
El pico endotérmico observado en todas las composiciones estudiadas (1167-1278
ºC), figura V.6, corresponde con la transformación polimórfica β→α-TCP, que es de tipo
reconstructiva y conlleva rotura y formación de nuevos enlaces. De acuerdo con los datos
de la bibliografía [5–7], el rango de temperaturas en el que tiene lugar la transformación
β→α varía entre 1110-1200 ºC.
En el caso de la composición TCP sin dopar, dicha transformación tiene lugar a
1167 ºC, mientras que en el resto de las composiciones estudiadas, se observa como al
aumentar el contenido de ZmO, este evento se desplaza hacia mayores temperaturas, desde
1192 ºC hasta 1278 ºC. Además, se evidencia una progresiva inhibición de esta
transformación a medida que aumenta el contenido de dopante, hecho que se pone de
900 1000 1100 1200 1300 1400
T=1228 ºC
T=1230 ºC
T~1278 ºC
T=1192 ºC
T=1167 ºC
0.125 Z
Temperatura (ºC)
0.25 Z
0.5 Z
TCP
1.0 Z
169
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
manifiesto particularmente en la composición 1.0 Z, donde se observa un perfil más
suavizado de la curva de ATD en comparación con el resto de composiciones. Este
resultado pone de manifiesto que la incorporación de ZnO en solución sólida en β-TCP
produce un efecto estabilizador de su estructura que conduce a su estabilidad a tempeturas
mas elevadas.
Esta información y la extraída a partir de los correspondientes diagramas de
equilibrio de fases , capítulo IV, ha permitido acotar y definir entre 1000 y 1250 ºC el
rango óptimo de temperaturas para realizar los tratamientos de sinterización. Estos
tratamientos térmicos garantizarán la obtención de biomateriales monofásicos y bifásicos,
basados en β, α y β + α-TCP, con oxido de cinc en solución sólida.
V.2.2 Sinterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico
modificados químicamente con ZnO
Las compuestos en polvo tratados a 900 ºC 2 h, se conformaron en forma de disco y
se sinterizaron convencionalmente durante 12 horas a 1000, 1075, 1150 y 1250ºC en el
caso de la composición TCP sin dopar y a 1150, 1200 y 1250 ºC para las composiciones
Zn-TCP. Este tiempo asegurará el equilibrio termodinámico y por consiguiente la
obtención de materiales termodinámicamente y en definitiva resultados resproducibles.
V.2.3 Caracterización de compuestos cerámicos basados en fosfato
tricálcico modificados con ZnO
En este apartado se procedió a la caracterización mineralógica, estructural y
microestructural de los materiales obtenidos tras la sinterización, así como a la realización
de los ensayos de bioactividad, en soluciones acelulares, en suero fisiológico artificial
(SFA).
170
Capítulo V
V.2.3.1 Caracterización mineralógica
V.2.3.1.1 Difracción de rayos X (DRX)
El análisis cualitativo de las fases cristalinas presentes en los materiales
sinterizados se ha realizado por DRX. En las composiciones estudiadas se identificaron las
fases β-TCP (ficha nº 702065), α-TCP (ficha nº 702065) o una mezcla de ambos
polimorfos, en función del contenido de ZnO y de la temperatura de tratamiento. (figura
V.7)
Figura V.7 DRX correspondientes a la composición TCP sinterizada a 1075, 1150 y
1250 ºC durante 12 h.
Los DRX de la muestra TCP obtenidos a 1075 ºC presentan picos de difracciones
características de la fase β-TCP. Esta temperatura fue la máxima temperatura a la que se
pudieron sinterizar materiales monofásicos sin dopar basados en β-TCP. A medida que
aumenta la temperatura de sinterización, 1150 ºC, se observa como la fase β-TCP
comienza a transformar, coexistiendo picos de difracción asociados a los polimorfos β y α-
TCP. Finalmente a 1250 ºC, los materiales presentan como única fase α-TCP, lo que indica
que a esta temperatura la transformación polimórfica ha sido completada.
La serie de difractogramas obtenidos en los materiales dopados con oxido de cinc,
Zn-TCP, se recoge en la figura V.8.
20 25 30 35 40
In
ten
sid
ad
(u
.a.)
2
TCP
1250 ºC
1150 ºC
1075 ºC
171
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Figura V.8 DRX correspondientes a las composiciones Zn-TCP sinterizadas a a) 1150,
b) 1200 y c) 1250 ºC durante 12 h.
20 25 30 35 40
0.25 Z
~,
0.5 Z
,
1.0 Z
,
T=1150 ºC
0.125 Z
,
Inte
nsi
da
d (
u.a
.)
2
a)
20 25 30 35 40
0.125 Z
Inte
nsid
ad (
u.a.
)
2
0.25 Z
0.5 Z
T=1200 ºC 1.0 Z
b)
20 25 30 35 40
0.125 Z,
,,, ,
Inte
nsid
ad
(u
.a.)
2
0.25 Z,
>>,,, ,
0.5 Z,
,,, ,
T=1250 ºC 1.0 Z,
,,, ,
c)
172
Capítulo V
La ausencia de fases minoritarias o picos de difracción asociados al ZnO, así como
el desplazamiento observado de la difracción principal del β-TCP, con el aumento del
contenido de ZnO, es coincidente con los resultados previamente obtenidos en los
compuestos sintetizados. Este hecho permite concluir que la composición de los
materiales se mantiene después del proceso de sinterización.
La cuantificación de la proporción de fases cristalinas presentes en los materiales
después del tratamiento térmico se realizó empleando el método Rietveld a partir de los
difractogramas de RX adquiridos. La tabla V.3, muestra los valores obtenidos, expresados
en porcentaje en peso de β y/o α-TCP presentes en las muestras. El error de las medidas
varía entre el 1 y el 3 % en peso.
Tabla V.3 Cuantificación de los polimorfos β y/o α-TCP presentes en las muestras de TCP
y Zn-TCP en función de temperatura de sinterización.
Composición Temperatura (ºC) % en peso β-TCP % en peso α-TCP
1000 100 0 TCP 1075 100 0
1150 80 20 1250 0 100 1150 32 68
0.125 Z 1200 15 85 1250 4 96 1150 52 48
0.25 Z 1200 33 67 1250 16 84 1150 100 0
0.5 Z 1200 57 43 1250 37 63 1150 100 0
1.0 Z 1200 93 7 1250 75 25
173
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
En la figura V.9, se ha representado la evolución de la proporción de α-TCP y de
β-TCP de las distintas composiciones en función del contenido de ZnO para cada
temperatura de sinterización.
Figura V.9 Proporción de fases presentes a) β-TCP y b) α-TCP en las composiciones
estudiadas en función del contenido de ZnO y de la temperatura de sinterización.
En la figura V.9.a se observa claramente como la proporción de fase β-TCP
aumenta con el incremento del contenido de ZnO y con la temperatura de tratamiento. La
proporción de esta fase disminuye a su vez con la temperatura sinterización para
contenidos constantes de ZnO en las composiciones. Se observa el comportamiento
contrario en el caso de la fase α-TCP, figura V.9.b. Este hecho confirma nuevamente que el
Zn2+ estabiliza la estructura del β-TCP haciendo que este polimorfo sea estable a
temperaturas mas elevadas.
V.2.3.2 Análisis de las transiciones de fase, densificación y microestructura
V.2.3.2.1 Proceso de densificación y microestructura
La densificación de las muestras, respecto de la densidad real, se evaluó analizando
el efecto de la temperatura de sinterización y del contenido de ZnO en las composiciones.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0
20
40
60
80
100
a)
% e
n p
eso
-
TC
P
% en peso ZnO
T=1150 ºC T=1200 ºC T=1250 ºC
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
0
20
40
60
80
100 T=1150 ºC T=1200 ºC T=1250 ºC
b)
% e
n pe
so
-T
CP
% en peso ZnO
174
Capítulo V
Figura V.10 Densificación obtenida en las muestras a) TCP y b) Zn-TCP en función de la
temperatura de sinterización, para diferentes contenidos de ZnO.
En la figura V.10 se puede observar el notable aumento de la densificación
obtenido en las muestras de TCP sin dopar en el rango de temperaturas comprendido entre
1000-1150 ºC, figura V.10.a, como resultado del proceso de sinterización en estado sólido.
El posterior aumento de la temperatura de sinterización hasta 1250 ºC, que coincide con
una disminución en la densificación, figura V.10.a, pone en evidencia los fenómenos de
expansión que se producen en esta familia de materiales derivados de la completa
transformación de la fase β a α-TCP, hecho que será perfectamente observable en el
estudio microestructural de esta composición (ver figura V.11.d mas adelante).
El análisis de los resultados obtenidos, indica que la máxima densificación (>90 %
respecto de la densidad real) en las muestras de TCP sin dopar se alcanza a la temperatura
de 1150 ºC. Los valores de porosidad abierta varían entre el 21 % y el 8 %, para
temperaturas de tratamiento comprendidas entre 1000 y 1250 ºC.
En el caso de las muestras de Zn-TCP, figura V.10.b, los resultados más
significativos derivados de los valores de densificación obtenidos indican que, para
contenidos de dopante iguales o inferiores a 0.500 % en peso de ZnO y temperaturas de
sinterización de 1200 ºC, los fenómenos de expansión asociados a la transformación
polimórfica β→α son críticos a la hora de densificar este tipo de muestras. En
contraposición, los resultados obtenidos en las muestras 1.0 Z, ponen de manifiesto la
posibilidad de actuar composicionalmente sobre la densificación de los muestras mediante
1000 1050 1100 1150 1200 1250
75
80
85
90
95
100a)
TCP
De
nsi
fica
ció
n (
%)
Temperatura (ºC)1150 1200 1250
75
80
85
90
95
100
0.125 Z 0.25 Z 0.5 Z 1.0 Z
De
nsi
fica
ció
n (
%)
Temperatura (ºC)
b)
175
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
la estabilización térmica de la fase β-TCP con la temperatura. En esta dirección, la
inhibición progresiva de la transformación polimórfica que producen contenidos de
dopante del 1.000 % en peso ZnO, permitirán la obtención de biomateriales monofásicos y
bifásicos basados en β y β+α con densificaciones del 92 %, en todo el rango de
temperaturas estudiado, 1150-1250 ºC. Todas las muestras presentan valores de porosidad
abierta en el rango comprendido entre un 5 y un 10 %.
Estos resultados evidencian como en el diseño de biomateriales de TCP de elevada
densidad es esencial la realización de un control riguroso de la composición (dopantes) y el
tratamiento térmico.
De forma paralela se procedió a la caracterización microestructural de las muestras
obtenidas, a medida que avanzan los procesos de densificación y transformación, mediante
MEB-EC. Para facilitar la identificación de las diferentes fases cristalinas, las muestras se
pulieron ceramográficamente hasta alcanzar la reflexión especular y posteriormente se
atacaron químicamente con ácido acético diluido al 5 % durante 30 s.
La figura V.11, permite observar las superficies atacadas químicamente de las
muestras de TCP sinterizadas a 1000 ºC, 1075 ºC, 1150 ºC y 1250 ºC, durante 12 h, donde
se pueden seguir en función de la temperatura la evolución del proceso de densificación y
transformación de la fase β-TCP a α-TCP.
El notable aumento de la densificación obtenido en las muestras de TCP sin dopar
en el rango de temperaturas comprendido entre 1000-1075 ºC, figura V.10.a, se observa
microestructuralmente en las figuras V.11.a y b, en las que se pone en evidencia los
procesos característicos asociados a fenómenos de coalescencia entre las partículas y
posterior avance de la sinterización.
La microestructura que presenta la muestra tratada a 1150 ºC evidencia el inicio y
posterior avance de la transformación β→α-TCP en diferentes zonas de las muestras. Este
hecho viene a confirmar que la fase α-TCP se genera a través de un mecanismo de
nucleación heterogénea. Los procesos de nucleación de la fase α-TCP se inician en la fase
β-TCP aunque el estudio microestructural ha vuelto a constatar que el proceso de
nucleación y crecimiento de la fase α-TCP se favorece en sitios preferenciales [8], tales
como imperfecciones estructurales y poros y en menor medidas temperaturas en los bordes
de grano de la fase β-TCP, figura V.11.c.
176
Capítulo V
Figura V.11 Micrografías de las superficies atacadas químicamente de las muestras de
TCP sinterizadas a) a 1000 ºC, b) a 1075 ºC, c) a 1150 ºC y d) 1250 ºC, durante 12 h.
La figura V.12 muestra la evolución microestructural de las muestras Zn-TCP
sinterizadas a 1150 y 1250 ºC durante 12 h. La cuantificación realizada a partir de los
DRX, apartado V.3.1, permitió la inmediata identificación de las fases presentes, β y α-
TCP, en función de la proporción mayoritaria/minoritaria, en las microestructuras. Los
tamaños de grano en las microestructuras obtenidas se cuantificaron mediante análisis de
imagen.
TCP T=1000 ºC
100 % β
10 μm
a)
TCP T=1150 ºC
80 % β 50 μm
20 % α
c) TCP T=1250 ºC d)
30 μm
100 % α
10 μm
TCP T=1075 ºC b)
100 % β
177
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
.
Figura V.12 Micrografías de las superficies atacadas químicamente de las muestras de Zn-
TCP: a), c), e) y g) sinterizadas a 1150 ºC y b), d), f) y h) sinterizadas a 1250 ºC, durante
12 h.
0.125 Z T=1250 ºC b)
50 μm
4 % β
96 % α
50 μm
c) 0.25 Z T=1150 ºC
48 % α
52 % β
0.5 Z T=1150 ºC e)
50 μm
100 % β
1.0 Z T=1150 ºC g)
100 % β
50 μm
1.0 Z T=1250 ºC h)
75 % β
25 % α
50 μm
0.25 Z T=1250 ºC
50 μm
16 % β
84 % α
d)
50 μm
37 % β
63 % α
0.5 Z T=1250 ºC f )
50 μm
32 % β
68 % α
a) 0.125 Z T=1150 ºC
178
Capítulo V
En la microestructura de las composiciones 0.125 Z y 0.25 Z, sinterizadas a
1150 ºC, figura V.12.a y c, se observan ambas fases bien diferenciadas. La fase que
presenta una morfología más suavizada en las imágenes corresponde con el polimorfo β-
TCP, mientras que la que tiene una apariencia más rugosa, derivada de su mayor
susceptibilidad frente al ataque químico realizado, corresponde con el polimorfo α-TCP.
En estas dos microestructuras, 0.125 Z y 0.25 Z sinterizadas a 1150 ºC, el avance
de la transformación polimórfica β→α se observa nítidamente, constituyendo la fase α-
TCP la matriz del material. La morfología de la fase α-TCP está constituida por granos
cuasi-equiaxiales de tamaño comprendido entre 5-10 μm distribuidos homogéneamente,
aunque menores que los de la fase β-TCP. Los cristales de β-TCP presentan una
disposición lineal agrupada de granos, semejante a cadenas alargadas, con un tamaño en el
rango de 10-15 μm.
En las composiciones 0.5 Z y 1.0 Z sinterizadas a 1150 ºC, figura V.12.e y g, se
evidencia, en ambas muestras, una estructura monofásica homogénea constituida
exclusivamente por cristales de β-TCP de tamaño de grano en el entorno de 10 μm.tras.
A temperaturas de sinterización de 1250 ºC, las microestructuras observadas en las
muestras 0.125 Z y 0.25 Z, figura V.12.b y d, ponen de manifiesto el estado avanzado de la
transformación polimórfica β - α, siendo α-TCP la fase mayoritaria presente. Se observan
granos aislados correspondientes a la fase β-TCP alojados en la matriz de α-TCP, en mayor
proporción, a medida que aumenta el contenido de ZnO en las muestras.
En el caso de las composiciones 0.5 Z y 1.0 Z sinterizadas a 1250 ºC, figura V.12.f
y h se obtienen nuevamente microestructuras bifásicas de β/α-TCP, donde la fase α-TCP
constituye la matriz continúa.
Aunque en la composición 1.0 Z, figura V.12.h, los granos de β-TCP se distribuyen
formando los mismos agregados alargados previamente observados en las microestructuras
correspondientes a los materiales 0.125 Z y 0.25 Z sinterizados a 1150 ºC, cabe destacar un
aumento significativo del tamaño de grano de la fase β-TCP y su posterior coalescencia.
Este hecho se hace cada vez más evidente al aumentar el contenido de ZnO, obteniendo
tamaños medios alrededor de 20 μm.
179
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
V.2.3.2.2 Transiciones de fase y su estudio mediante la distribución microestructural
En relación a la distribución de los polimorfos α y β en las microestructuras
bifásicas, queda patente como la fase β-TCP está más homogéneamente distribuida en la
matriz de α-TCP en la muestra 0.5 Z sinterizada a 1250 ºC, figura V.12.f, en comparación
con la muestra 0.125 Z sinterizada a 1150 ºC, figura V.12.a. La distribución más
homogénea de granos de β-TCP obtenida en las microestructuras de las muestras
sinterizadas a 1250 ºC, está directamente relacionada con la mayor estabilidad inicial de
dicha fase antes de su posterior transformación a α-TCP.
En esta dirección en la muestra 1.0 Z sinterizada a 1250 ºC, figura V.12.h, se
observa como la transformación polimórfica β→α se produce masivamente en los bordes
de grano de la fase β-TCP. A medida que disminuye el contenido de dopante, se observa
claramente como la fase α-TCP envuelve gradualmente a los granos de β-TCP hasta
obtener microestructuras constituidas por granos de β-TCP aislados, alojados en la matriz
de α-TCP, como se observa en las muestras 0.125 Z y 0.25 Z sinterizadas a 1250 ºC, figura
V.12.b y d.
En el caso de las muestras 0.125 Z y 0.25 Z sinterizadas a 1150 ºC, los granos de la
fase β-TCP presentan una menor densificación y tamaño como consecuencia de la menor
temperatura de sinterización, y por tanto los granos más pequeños de β-TCP se
transforman por completo a la fase α, obteniendo distribuciones microestructurales
heterogéneas constituidas por granos de β-TCP agregados linealmente en matrices porosas
de α-TCP.
A la vista del análisis de los resultados obtenidos se pudo observar claramente
como tienen lugar los procesos de estabilización, densificación y transformación de la fase
β-TCP por la adición de dopante, fenómeno que se produce de forma más acusada al
incrementar la temperatura. Señalar que el crecimiento del tamaño de grano, se produce
fundamentalmente al incrementar el contenido de dopante y es más acusado a mayores
temperaturas.
Un aspecto a indicar es que todas las muestras, en mayor o menor medida,
presentan microgrietas tanto inter como transgranulares, lo que condicionará su respuesta
mecánica, tal como ha sido indicado por diferentes autores [9–11].
180
Capítulo V
Las causas que justifican este hecho son, fundamentalmente, las diferencias en los
coeficientes de expansión térmica de las fases constituyentes, así como las tensiones
generadas a consecuencia de los cambios drásticos en volumen que se producen durante las
transformaciones polimórficas. Los ciclos rápidos de calentamiento y enfriamiento son
también un factor crítico en este proceso.
En el caso de los materiales monofásicos las microgrietas se producen
probablemente durante el enfriamiento debido la gran anisotropía cristalográfica que
presentan tanto la fase β-TCP, como la fase α-TCP y que se refleja en sus coeficientes de
expansión térmica [10,11].
Por último en los materiales bifásicos de β/α-TCP se deben tener en cuenta las
tensiones generadas a consecuencia de los cambios de volumen (~7 %) que se producen a
medida que avanza la transformación polimórfica β→α-TCP durante los ciclos de
calentamiento, así como las diferencias entre los coeficientes de expansión térmica medios
de ambas fases, β-TCP, α (500-1000ºC)=20.2 x10-6 ºC-1 y α-TCP, α=7.77 x10-6 ºC-1
[10,11].
V.2.4 Estudios “in vitro” de los compuestos cerámicos basados en fosfato
tricálcico modificados con ZnO en disoluciones acelulares
Los experimentos en suero fisiológico artificial (SFA) son un requisito previo a la
experimentación animal para la predicción del comportamiento “in vivo” de los
biomateriales con aplicaciones óseas, capítulo III. Los experimentos en SFA pueden dar
lugar a resultados muy diferentes en función de la composición química de los materiales,
de sus características físico-químicas y finalmente de su microestructura. Las condiciones
de ensayo son un factor muy importante a tener en cuenta.
V.2.4.1 Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA)
La evaluación de la reactividad en SFA se realizó en las composiciones de TCP
sinterizadas a 1075 y 1250 ºC y en las composiciones 0.125 Z, 0.5 Z y 1.0 Z sinterizadas a
1150 y 1250 ºC. Estas muestras se seleccionaron en base a que exhibían porcentajes de
porosidad abierta similares, en el rango 5-8 %, requisito fundamental para poder establecer
181
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
un estudio comparativo. Asimismo la influencia de la topografía superficial se minimizó a
través de una etapa de pulido previa a los ensayos, evaluando seguidamente la rugosidad.
Todas las muestras estudiadas presentaban valores de rugosidad media (Ra) y en
profundidad (RZ) de ~0.7±0.1 mm y ~5.5±0.9 mm, respectivamente. Igualmente se
realizaron ensayos de bioactividad en la composición TCP sinterizada a 1000 ºC, que
presentaba valores de porosidad abierta de un 21 %, significativamente superior en
comparación con el resto de composiciones.
V.2.4.1.1 Perfiles de liberación iónica
En la figura V.13 se observan los perfiles de liberación de las especies iónicas de
Ca y P en SFA de las muestras de TCP sin dopar sinterizadas a 1000 (β-TCP), 1075 (β-
TCP) y 1250 ºC (α-TCP), para cada tiempo de inmersión.
Figura V.13 Concentración de iones Ca y P en SFA en función del tiempo de inmersión en
las muestras de TCP sin dopar a) basadas en β-TCP y sinterizados a 1000 y 1075 ºC y
b) basadas en α-TCP y sinterizados 1250 ºC.
El pH aumenta en todas las muestras de TCP sin dopar desde 7.40±0.02 a
7.60±0.05 después de la primera semana de exposición y se mantiene constante hasta la
finalización de los ensayos.
0 1 2 3 4-20-15-10-505
101520
-TCP 1250 ºC -TCP 1000 ºC -TCP 1075 ºCC
once
ntra
ción
ióni
ca
Ca (mg/l)
P (mg/l)
a)
Ca (mg/l)P (mg/l)
b)
0 1 2 3 4
SFA
SemanasSemanas
182
Capítulo V
Los perfiles de liberación iónica obtenidos en el caso de las muestras sin dopar
basadas en β-TCP sinterizadas a 1000 y 1075 ºC, figura V.13.a, muestran dos tendencias
opuestas y bien definidas. En las muestras de menor densidad, sinterizadas a 1000 ºC, la
concentración de iones Ca y P en el medio decrece continuamente hasta la tercera semana
de inmersión, para posteriormente incrementar su valor, mientras que en las muestras
sinterizadas a 1075 ºC se observa un aumento desde la primera semana de inmersión.
Aunque la elevada solubilidad de estos materiales está ampliamente reportada en la
literatura [12], y teniendo en cuenta que cuando un material denso se sumerge en un fluido,
todas las reacciones químicas y físicas tienen lugar en la interfase material-líquido, el
consumo (la absorción/adsorción) de iones de Ca y P del medio observado en la
composición β-TCP sinterizada a 1000 ºC parece estar directamente relacionada con la
elevada porosidad abierta (21 %) y mayor superficie específica que presentan están
muestras [13]. Como no se observó precipitación superficial de agregados de Ca y P en
forma de HAp tras las cuatro semanas de exposición al SFA, este hecho evidencia la
limitada o casi nula disolución de esta composición.
Las muestras de β-TCP sinterizadas a 1075 ºC, figura V.13.a, presentan una
solubilidad creciente en el medio a medida que se incrementa el tiempo de inmersión,
puesto que se observa un aumento de la concentración de iones Ca y P en el medio.
Asimismo, las muestras basadas en α-TCP sinterizadas a 1250 ºC, figura V.13.b,
presentan un perfil de disolución, a partir de la segunda semana de inmersión, comparable
al de los materiales de β-TCP sinterizados a 1075 ºC.
Cabe destacar que la disolución de las muestras de α-TCP sinterizadas a 1250 ºC es
prácticamente similar a las de β-TCP sinterizadas a 1075 ºC, y aunque los trabajos
reportados en la literatura ponen de manifiesto la mayor reactividad de los materiales
basados en α-TCP respecto de los de β-TCP [14], las ligerísimas diferencias observadas en
los perfiles de disolución obtenidos, parecen estar condicionados por la porosidad y la
superficie específica. En este sentido, las muestras de β-TCP sinterizadas a 1075 ºC
presentan una porosidad abierta del 8 %, que es superior a las de las muestras de α-TCP
sinterizadas a 1250 ºC. Por tanto la mayor solubilidad de la fase α-TCP queda compensada
por su menor porosidad, igualandose ambos comportamientos.
183
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
La figura V.14, muestra los perfiles de liberación iónica de Ca, P y Zn en SFA
obtenidos en las muestras de 0.125 Z, 0.5 Z y 1.0 Z sinterizados a 1150 y 1250 ºC para
cada periodo de tiempo ensayado. Los perfiles de disolución obtenidos en cada caso se han
ordenado en función de las fase mayoritaria presente en las microestructuras de los
muestras desarrollados.
Figura 5.14 Concentración de iones Ca, P y Zn en SFA en función del tiempo de
inmersión en los materiales de ZnTCP a), b), c) sinterizados a 1150 ºC y d), e), f)
sinterizados 1250 ºC.
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
Co
nce
ntr
aci
ón
ión
ica
C
on
cen
tra
ció
nió
nic
a
Semanas
Ca (mg/l)
P (mg/l)
Con
cent
raci
ónió
nic
a
Ca (mg/l)
P (mg/l)
b)
T=1150 ºCa)
c)
0.125 Z (68 % en peso -TCP)
0.5 Z (100 % en peso -TCP) 1.0 Z (100 % en peso -TCP)
0.125 Z (68 % en peso -TCP) 0.5 Z (100 % en peso -TCP) 1.0 Z (100 % en peso -TCP)
Zn (mg/l)
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
0 1 2 3 4-0,025
-0,013
0,000
0,013
0,025
0,038
0,050
Zn (mg/l)
Ca (mg/l)P (mg/l)
SFA
SFA
SFA
Ca (mg/l)P (mg/l)
e)
T=1250 ºCd)
f)
0.125 Z (96 % en peso -TCP) 0.5 Z (63 % en peso -TCP)
1.0 Z (75 % en peso -TCP)
0.125 Z (96 % en peso -TCP) 0.5 Z (63 % en peso -TCP) 1.0 Z (75 % en peso -TCP)
0 1 2 3 4 Semanas
184
Capítulo V
El pH aumenta en todas las muestras de Zn-TCP desde 7.40±0.02 a 7.70±0.05
después de la primera semana de exposición y se mantiene constante hasta la finalización
de los ensayos.
En el caso de las muestras 0.125 Z sinterizadas a 1150 ºC (68 % en peso de α-TCP
y 8 % de porosidad abierta), la liberación de Ca y P, figura V.14.a, presenta una tendencia
similar a las muestras de α-TCP sin dopar, figura V.13.b. Durante las primeras dos
semanas de inmersión el perfil de disolución en estas muestras se asemeja al de un material
de α-TCP sin dopar, evidenciando la disolución de esta fase en las primeras etapas de
disolución. Para tiempos de inmersión superiores, la disolución de las muestras se hace
cada vez más patente, liberando una concentración al medio de iones Ca de 1.5 mg/l en tres
semanas. La mayor reactividad podría estar relacionada con el inicio de la disolución de la
fase minoritaria constituyente de las mismas, β-TCP, que como se observó en el estudio
previo su proceso de liberación de iones se produjo a partir de la tercera semana de
inmersión. Este aumento, podría estar asociado además con la mayor porosidad abierta (8
%) que presentan estas muestras respecto al material de referencia α-TCP (6 %).
Las composiciones 0.125 y 0.5 Z sinterizadas a 1250 ºC, figura V.14.d, con un (96
% en peso α-TCP y 5 % de porosidad abierta) y (63 % en peso α-TCP y 5 % de porosidad
abierta) respectivamente, presentan una liberación de iones Ca y P ligeramente inferior a la
de la muestra de referencia α-TCP, aunque de tendencia similar, pero sin observar
incrementos de valor a partir de la tercera semana de inmersión. Esta menor reactividad se
atribuye a la menor porosidad de las muestras y su mayor tamaño de grano.
En las muestras 0.5 y 1.0 Z tratadas a 1150 ºC (100 % en peso β-TCP y 6 % de
porosidad abierta), la liberación de iones Ca y P exhibe una tendencia similar a la de la
muestra de referencia β-TCP sinterizada a 1075 ºC, figura V.14.a. En el caso de estas
composiciones el contenido de ZnO ciertamente parece influenciar los perfiles de
disolución obtenidos. Hasta la tercera semana de inmersión, ambas muestras, presentan una
liberación continúa de iones Ca y P en el medio, seguido de lo cual se produce una notable
disminución del contenido iónico de Ca y P en disolución, principalmente en la
composición dopada con un 1.000 % en peso de ZnO. Como estas dos muestras exhiben
una proporción de fases y configuración microestructural, densificación, porosidad abierta
y rugosidad superficial comparables, la composición química es el parámetro que parece
185
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
estar controlando esta disminución del contenido iónico de Ca y P en solución, indicativo
de un proceso de precipitación.
La mayor estabilidad en SFA en comparación con el resto de composiciones
estudiadas se ha obtenido en la composición 1.0 Z sinterizada a 1250 ºC (75 % en peso β-
TCP y 5-6 % de porosidad abierta), figura V.14.e. Este comportamiento se atribuye
principalmente a las características microestructurales del material. En estas
microestructuras, el relativamente elevado tamaño de grano alcanzado por la fase β-TCP a
esta temperatura, proporciona una elevada estabilidad microestructural que se traduce en
una muy baja o nula disolución de la muestra en el medio.
Como tendencia general, en las muestras basadas en Zn-TCP, el ZnO parece
desempeñar una función decisiva en su comportamiento en SFA, activando generalmente
la precipitación sobre la muestra de iones de Ca y P de la disolución, a partir de la tercera
semana de exposición.
Finalmente las figuras V.14.c y f, muestran los perfiles correspondientes a la
liberación de iones de Zn obtenidos en las muestras 0.125, 0.5 y 1.0 Z sinterizadas a 1150
y 1250 ºC respectivamente, para cada tiempo de exposición. La mayor parte del Zn
liberado en las muestras tratadas a 1150 ºC, figura V.14.c, se produce en las primeras
semanas de inmersión, alcanzando un perfil asintótico a partir de la segunda semana de
exposición. Asimismo los resultados obtenidos indican que la liberación de Zn2+ no está
relacionada con la posición de Ca2+ en ambos polimorfos, y su lixiviación es
independientemente de la fase en la que se encuentre alojado y se produce desde las zonas
de contacto suero/material.
Las muestras sinterizadas 1250 ºC, figura V.14.f, presentan un comportamiento
análogo a las tratadas a 1150 ºC. En este caso la liberación de Zn es ligeramente menor y la
saturación se produce a las tres semanas de exposición, consecuencia directa de la menor
porosidad abierta de las muestras.
En todos los casos estudiados se han obtenido valores similares lo que ha permitido
identificar el límite de solubilidad de Zn2+ en SFA, en el rango 0.025-0.030 mM.
186
Capítulo V
Todos estos resultados ponen de manifiesto la posibilidad de modular la reactividad
de los materiales en suero fisiológico artificial, aprovechando la versatilidad que ofrecen
los parámetros de diseño y procesamiento.
V.2.4.1.2 Caracterización de precipitados superficiales de Ca y P
Una vez finalizados los ensayos de bioactividad, los cambios superficiales
producidos en los materiales a consecuencia de su exposición en SFA, se evaluaron
cualitativamente mediante MEB-EC y espectroscopía Raman.
V.2.4.1.2.1 Caracterización microestructural
En general, los materiales de TCP, no presentan alteraciones significativas tras su
exposición en SFA, incluso después de las cuatro semanas de inmersión. Sólo a partir de la
tercera semana de inmersión presentan algunas modificaciones superficiales en ciertas
áreas. La composición 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC y ensayada a cuatro semanas fue la
única que presentaba agregados superficiales característicos de la apatita biológica.
La figura V.15, muestra los precipitados superficiales de Ca y P observados en la
composición 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC después de cuatro semanas de exposición en SFA.
Figura V.15 Micrografías obtenidas de los precipitados superficiales de Ca y P observados
en los materiales 1.0 Z sinterizados a 1150 ºC durante 12 h y expuestos en SFA cuatro
semanas, a) baja magnificación y b) alta magnificación.
1.0 Z T=1150 ºC 4 Semanas
50 μm
a)
5 μm
b)1.0 Z T=1150 ºC 4 Semanas
187
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Estos precipitados se encuentran distribuidos homogéneamente cubriendo toda la
superficie del material y exhiben una morfología globular compuesta por cristales más
pequeños en forma de escama, típicos de la apatita [15].
V.2.4.1.2.2 Espectroscopía Raman
Los precipitados de Ca y P observados se caracterizaron estructuralmente mediante
Espectroscopía Raman a temperatura ambiente.
La figura V.16, muestra la colección de espectros Raman normalizados adquiridos
en el rango de 100-1200 cm-1 obtenidos en la muestra 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC durante
12 h, después de un tiempo de exposición en SFA de cuatro semanas. La adquisición de los
espectros se realizó mediante un barrido a lo largo de una línea perpendicular a la
superficie de la muestra (contenida en el plano XZ). El diseño experimental empleado se
ha representado esquemáticamente en el detalle de la figura V.16. Los espectros mostrados
corresponden con los adquiridos cada 2 μm, desde la superficie de la muestra Z=2 hacia el
interior Z=-4, considerando Z=0 la distancia en la que la superficie de la muestra estaba en
foco. Asimismo se incluyeron los espectros correspondientes a los compuestos puros, HAp
y β-TCP, considerados de aquí en adelante como referencias.
En los espectros obtenidos se observan los principales modos normales de
vibración asociados al grupo PO43-. Los picos y el hombro observados a 949, 970 y 961
cm-1 corresponden con el modo de tensión simétrico no degenerado, υ1, del enlace P-O. Las
bandas situadas a 370-505, 530-645, 995-1120 cm-1 se atribuyeron a υ2 y υ4, modos de
deformación correspondientes a las vibraciones del enlace O-P-O y a υ3, los modos de
tensión asimétrico correspondientes al enlace P-O [16]. La asignación de estos modos,
correspondientes con las vibraciones internas de los iones PO43-, permitió identificar la fase
β-TCP en las muestras. La banda de menor intensidad situada a 150-300 cm-1, debida a las
vibraciones internas correspondientes a los modos de vibración de carácter traslacional de
las subredes Ca2+ y PO43-, no se distinguieron en este caso particular.
Cabe destacar las importantes diferencias que presentan los espectros adquiridos a
Z=0 μm y Z=2 μm. En estos espectros el pico de mayor intensidad aparece situado a
962 cm-1, en la región de frecuencias del modo de tensión simétrico no degenerado del
188
Capítulo V
grupo PO43. Este resultado permitió identificar la presencia de HAp en la superficie del
material [17]. El resto de las bandas asociadas a la HAp, situadas en las regiones de
frecuencia 400-490, 570-625 y 1020-1095 cm-1 y correspondientes a los modos internos υ2,
υ4 y υ3 del grupo PO43-, como solapaban con los modos normales de la fase β-TCP, no se
pudieron identificar con claridad.
Figura V.16 Colección de espectros Raman adquiridos en la muestra 1.0 Z sinterizada a
1150 ºC durante 12 h expuesta en SFA durante cuatro semanas. Se incluyen los espectros
de las muestras puras de HAp y β-TCP (referencias) y un detalle del diseño experimental
empleado en el estudio.
200 400 600 900 1000 1100 1200
Z=-2
Z= 0
Z= 2
HAp
Ref
eren
cias
Número de onda (cm-1)
Inte
nsid
ad (
u.a)
TCP
Z=-4
X (m)
Z (m)
Z=2Z=0Z=-4
Muestra
189
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
En la figura V.17, se muestra una imagen procesada a partir de la colección de
espectros de Raman adquiridos en la muestra 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC durante 12 h.
Esta imagen se configuró integrando en el rango de frecuencias 954-966 cm-1 el pico de
mayor intensidad atribuido previamente a HAp, en el total de 10.000 espectros adquiridos
en el plano XZ. Este tipo de imágenes permiten elaborar el perfil de distribución de la capa
superficial de HAp precipitada en la superficie y complementar la información procedente
de las imágenes obtenidas por MEB-EC. En este sentido, se pudo obtener información
relacionada con el espesor y la distribución topográfica de la capa de HAp precipitada en la
superficie del material, que aunque no continua, presentaba un espesor relativamente
homogéneo que variaba entre una y dos micras.
Figura V.17 Imagen de Raman procesada a partir de los espectros de obtenidos en el plano
XZ adquirida en la muestra 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC durante 12 h después expuestos en
SFA durante cuatro semanas.
El conjunto de resultados derivados de los estudios bioactividad, permiten afirmar
que la solución sólida de Zn2+ en el material parece activar la precipitación superficial de
agregados de Ca y P a partir de la tercera semana de inmersión, obteniendo en la
composición 1.0 Z sinterizada a 1150 ºC, agregados superficiales de HAp después de s
cuatro semanas de exposición.
5 10 15 20
-10-9-8-7-6-5-4-3-2-101234
250
5
Z (m
)
X (m)0
5 m
190
Capítulo V
V.3 CONCLUSIONES PARCIALES DE LOS BIOMATERIALES
BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO
La información suministrada por el estudio del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 junto
con el control composicional y de las variables de procesado ha permitido sintetizar por
reacción en estado sólido compuestos precursores de fosfato tricálcico dopados con ZnO
altamente reactivos.
Los estudios térmicos y estructurales permitieron definir las temperaturas óptimas
de tratamiento para la síntesis y la sinterización de biomateriales de β-TCP, α-TCP y α+β-
TCP dopados con ZnO.
El efecto estabilizador que ejerce el Zn2+ en la estructura del polimorfo β-TCP, ha
permitido modular las características mineralógicas y microestructurales de los materiales.
El estudio realizado en función del contenido de ZnO y de la temperatura de sinterización,
permite diferentes combinaciones y configuraciones microestructurales, obteniendo
biomateriales monofásicos y bifásicos basados en polimorfos β y α del TCP de mineralogía
y microestructura controlada.
Los estudios de bioactividad en SFA de los biomateriales de TCP y Zn-TCP, han
demostrado que las características mineralógicas y microestructurales dominan la
reactividad de los materiales en SFA.
Se ha establecido que el ZnO desempeña una función relevante en la
disolución/precipitación de los materiales en SFA, produciendo una disminución del
contenido iónico de Ca y P en disolución a partir de la tercera semana de exposición. Se ha
observado que el ZnO acelera la precipitación superficial de HAp en los materiales
basados en β-TCP, especialmente en la composición 1.000 % en peso de ZnO sinterizada a
1150 ºC.
191
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
V.4 SÍNTESIS, SINTERIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
BIOMATERIALES BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON
ZnO/MgO
Una vez estudiado y establecido en el apartado V.2 el método de síntesis y
obtención de biomateriales basados en TCP de alta pureza, modificados a partir de
adiciones controladas de ZnO, se procedió a la preparación de biomateriales codopados
con Zn2+ y Mg2+, formulando composiciones en el sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2.
La información extraída a partir del estudio del correspondiente diagrama de
equilibrio de fases, capítulo IV, junto con la derivada en el estudio realizado en el apartado
V.2 de este capítulo, ha permitido definir los rangos más idóneos de composición y
temperatura para el diseño y formulación de los biomateriales basados en los polimorfos β
y/o α del fosfato tricálcico con ZnO y MgO en solución sólida.
El estudio de la influencia de ZnO ha puesto de manifiesto que contenidos de 1.000
% en peso de ZnO, son adecuados para generar biomateriales con buenas características
físico-químicas, que activan la precipitación superficial de HAp y desarrollan su potencial
osteoconductor. Se debe destacar la elevada estabilidad termodinámica de estos materiales,
lo que permite deducir comportamientos muy estables a largos períodos de uso. Por este
motivo fundamental se fijo composicionalmente el contenido de ZnO a 1.000 % en peso en
la formulación de los materiales codopados.
V.4.1 Síntesis de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico
modificados con ZnO/MgO
Como la síntesis de los materiales codopados se ha realizado de forma análoga a la
previamente descrita para el caso de los biomateriales dopados con cinc, apartado V.2, en
este apartado se analizarán únicamente los aspectos más relevantes de la caracterización
realizada de las mezclas homogéneas en verde de los materiales de partida y de los
compuestos cerámicos tratados térmicamente a 900 ºC, utilizados, para sinterizar
biomateriales basados en Ca3(PO4)2 con ZnO y MgO en solución sólida (ZnMg-TCP).
192
Capítulo V
V.4.1.1 Caracterización de los compuestos cerámicos en verde
Todas las mezclas homogéneas de los materiales de partida en polvo exhiben
tamaños medios de partícula, d50, y superficie específica en los rangos 9.8-13.9 μm y
1.6-1.7 m2/g, respectivamente.
La caracterización térmica realizada previamente mediante ATD-TG en los
compuestos homólogos con cinc, apartado V.2.1.1.2, ha permitido identificar los procesos
de reacción que se producen. Las composiciones que contienen MgO en las mezclas de
compuestos correspondientes: 1.0 Z 0.125 M, 1.0 Z 0.25 M, 1.0 Z 0.5 M y 1.0 Z 1.0 M,
presentan un comportamiento equivalente. En todas las composiciones de ZnMg-TCP
elegidas se mantuvo constante la relación (Ca+Zn+Mg)/P=1.5, evidenciándose la completa
descomposición de los reactivos empleados a temperaturas ≥ 860 ºC, según la siguiente
reacción:
X ZnO + Y MgO + (3-X-Y) CaCO3 + 2 NH4H2PO4 →
[ZnXMgYCa(3-X-Y)](PO4)2 + ↑3 H2O + ↑2 NH3 +↑(3-X-Y) CO2
(Ecuación V.2)
A la visita de los resultados y siguiendo el mismo criterio que el apartado V.2, se
seleccionó nuevamente como temperatura óptima de síntesis para las distintas mezclas
estequiométricas, 900 ºC con un tiempo de tratamiento de 2 h.
V.4.1.2 Caracterización de los compuestos cerámicos calcinados
La completa descomposición de los reactivos empleados y la formación de los
nuevos compuestos se comprobó mediante Espectroscopia de Infrarrojo.
En todos los compuestos presinterizados se obtuvo una distribución de tamaño de
partícula más estrecha, d50=1.3-1.7 y un aumento significativo en la superficie específica,
respecto de las mezclas homogeneizadas en verde, en el rango de 4.0-5.0 m2/g.
193
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
El estudio realizado por DRX de las muestras de ZnMg-TCP, se expone en la figura
V.18. En esta figura se han incluido los difractogramas previamente obtenidos de TCP y
1.0 Z como referencia. En ninguna de las composiciones tratadas a 900 ºC, se observaron
picos de difracción asociados a compuestos sin reaccionar, compuestos intermedios de
reacción o difracciones asociadas al ZnO o al MgO, figura V.18.a. En la ampliación
realizada de la difracción principal del β-TCP, figura V.18.b, se evidencia la formación de
soluciones solidas mixtas de Zn2+ y Mg2+ en la estructura del β-TCP a partir del
desplazamiento gradual observado de este pico de difracción con el contenido de dopante.
Este resultado indica que los materiales codopados tras el tratamiento térmico de síntesis
evolucionan hacia la composición β- ZnxMgyCa(3-x-y)(PO4)2.
Figura V.18 a) DRX correspondientes a las composiciones TCP, 1.0 Z, 1.0 Z 0.125 M y
1.0 Z 1.0 M tratadas a 900 ºC 2 h. b) Ampliación del difractograma en la región 2θ desde
30.8 º hasta 31.7 º.
Para definir la temperatura de tratamiento térmico de sinterización de estas
composiciones, se evaluó la influencia conjunta del ZnO y del MgO en el proceso de
transformación polimórfica β→α del TCP. En la figura V.19, se muestran las curvas de
20 25 30 35 40
31.0 31.5
b)
-TCP
Inte
nsid
ad (
u.a.
)
2
TCP 1.0 Z 1.0 Z 0.125 M 1.0 Z 1.0 M
a)
194
Capítulo V
ATD, registradas para la mezcla de las diferentes composiciones en polvo previamente
tratadas a 900 ºC durante 12 h.
Figura 5.19 Curvas ATD obtenidas para las composiciones TCP, 1.0 Z y 1.0 Z 0.125 M,
1.0 Z 0.25 M, 1.0 Z 0.5 M y 1.0 Z 1.0 M tratadas térmicamente a 900 ºC 12 h.
El pico endotérmico [1] identificado en la figura V.19 correspondiente a la
transformación polimórfica β→α-TCP, se desplaza hacia mayores temperaturas, desde
1192 ºC hasta 1380 ºC con el aumento del contenido de MgO. Este hecho confirma
nuevamente que el Zn2+ y del Mg2+ estabilizan la estructura del β-TCP haciendo que su
transformación a α -TCP se produzca a temperaturas más elevadas.
Esta información y la extraída a partir de los correspondientes diagramas de
equilibrio de fases, capítulo IV, ha permitido definir la temperatura de sinterización en
1350 ºC, permitiendo la obtención de biomateriales basados en β, β + α y α-TCP con
oxido de cinc y oxido de magnesio en solución sólida.
900 1000 1100 1200 1300 1400
1.0 Z
TCP
Temperatura (ºC)
1.0 Z 0.125 M
1.0 Z 0.25 M
1.0 Z 0.5 M
1.0 Z 1.0 M
β→ α [1]
[1]
[1]
[1]
[1]
[1]
195
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
V.4.2 Sinterización de compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico
modificados con ZnO/MgO
Los compuestos codopados en polvo de ZnMg-TCP tratados a 900 ºC por un
periodo de tiempo de 2h, se conformaron en forma de disco y se sinterizaron
convencionalmente a 1350 ºC, durante 12 h.
V.4.3 Caracterización de compuestos cerámicos basados en fosfato
tricálcico modificados con ZnO/MgO
Siguiendo el mismo planteamiento que para los materiales dopados con cinc, se
procedió a la caracterización mineralógica, estructural y microestructural de los materiales
obtenidos tras la etapa de sinterización. En esta caracterización se incluyeron igualmente
los ensayos de bioactividad en SFA realizados.
V.4.3.1 Caracterización mineralógica
V.4.3.1.1 Difracción de rayos X (DRX)
En todas las composiciones sinterizadas a 1350 ºC se identificaron las fases β-TCP,
α-TCP o una mezcla de ambos polimorfos, en función del contenido de MgO, figura V.20.
En la figura V.20.a, se presentan la serie de difractogramas obtenidos de los materiales de
ZnMg-TCP sinterizados a 1350 ºC durante 12 h.
196
Capítulo V
Figura V.20 a) DRX correspondientes a las composiciones ZnMg-TCP sinterizadas a
1350 ºC 12 h. b) Ampliación de los DRX en el rango 2θ: 30-35 º.
La incorporación de Zn2+ y Mg2+ produce el desplazamiento progresivo del pico de
difracción principal del β-TCP, figura V.20.b, corroborando la formación de soluciones
solidas mixtas de carácter sustitucional de Zn2+ y Mg2+ en la estructura de este compuesto,
ZnXMgYCa(3-X-Y)(PO4)2.
La cuantificación de las fases presentes en los materiales después del tratamiento
térmico evidencia la estabilización de la fase β-TCP con el contenido de dopante
permitiendo la obtención materiales codopados con un 85 % en peso de β-TCP a 1350 ºC,
para contenidos de 1.000 % en peso de ZnO y 1.000 % en peso de MgO, tabla V.4 y figura
V.21.
20 25 30 35 40
1.0 Z
In
ten
sid
ad
(u.a
.)
2
1.0 Z 0.125 M
1.0 Z 0.25 M
1.0 Z 0.5 M
>
a)
1.0 Z 1.0 M
>>
30 31 32 33 34 35
-TCP
b)
,
2
197
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Tabla V.4 Cuantificación de los polimorfos β y/o α-TCP presentes en los materiales
ZnMg-TCP desarrollados a 1350 ºC.
Figura V.21 Proporción de fases presentes: β-TCP y α-TCP, en las composiciones
estudiadas de ZnMg-TCP, en función del contenido de MgO.
V.4.3.2 Densificación y caracterización microestructural
La figura V.22 muestra la evolución de la densidad en función del contenido de
MgO en las muestras sinterizadas a la temperatura de 1350 ºC. En todas las composiciones
se obtienen densificaciones superiores al 92 %.
Aunque la inhibición de la transformación polimórfica β→α con el aumento del
contenido del MgO a estas temperaturas no es completa, se han obtenido materiales
basados en β-TCP (85 % en peso de β-TCP) con una densificación superior al 99 % para
Composición Temperatura (ºC) % en peso β-TCP % en peso α-TCP
1.0 Z 1350 35 65 1.0 Z 0.125 M 1350 47 53 1.0 Z 0.25 M 1350 56 44 1.0 Z 0.5 M 1350 71 29 1.0 Z 1.0 M 1350 85 15
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0
20
40
60
80
100
-TCP -TCP
Pro
porc
ión
de fa
se (
% e
n pe
so)
% en peso MgO (1 % en peso ZnO)
198
Capítulo V
un contenidos del 1.000 % en peso de ZnO y 1.000 % en peso de MgO. En todas las
muestras desarrolladas se obtiene además una importante reducción de la porosidad abierta
alcanzando valores en el entorno del 1-3 %.
Figura V.22 Densificación obtenida en las muestras ZnMg-TCP en función del contenido
de MgO, a la temperatura de 1350 ºC.
La evolución microestructural de las composiciones tratadas a 1350 ºC se estudió
nuevamente mediante MEB-EC. La observación al microscopio electrónico de las
muestras tratadas térmicamente a 1350 ºC puso de manifiesto las diferentes características
morfológicas y de tamaño de grano de las fases β y α-TCP desarrolladas a esta temperatura
en comparación a las obtenidas a la temperatura de 1250 ºC dopadas con oxido de cinc.
Dada la importancia que tienen estos factores sobre las propiedades de los materiales, se
consideró conveniente realizar un detallado análisis microestructural de las muestras.
En la figura V.23, se muestran las microestructuras presentes en las muestras
ZnMg-TCP sinterizadas a 1350 ºC durante 12 h.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
75
80
85
90
95
100
T=1350 ºC
Den
sific
aci
ón (
%)
% en peso MgO (1 % en peso ZnO)
199
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
.
Figura V.23 Micrografías de las superficies atacadas químicamente de las muestras de
ZnMg-TCP: a) 1.0 Z, b) 1.0 Z 0.125 M, c) 1.0 Z 0.25 M, d) 1.0 Z 0.5 y e) 1.0 Z 1.0 M
sinterizadas a 1350 ºC durante 12 h.
Todas las microestructuras tratadas a 1350 ºC revelan un tamaño de grano de la fase
β, en el rango 25-45 μm, que es significativamente superior al desarrollado en las muestras
dopadas con cinc (15-20 μm), sinterizadas a temperaturas iguales o inferiores a 1250 ºC.
1.0 Z T=1350 ºC a)
50 μm
35 % β
65 % α
1.0 Z 0.125 M T=1350 ºC b)
47 % β
53 % α
50 μm
1.0 Z 0.5 M T=1350 ºC d)
71 % β
29 % α 50 μm
1.0 Z 1.0 M T=1350 ºC e)
85 % β 15 % α
50 μm
200
Capítulo V
La micrografía correspondiente a la composición 1.0 Z sinterizada a 1350 ºC, figura
V.23.a y b, ha permitido observar una textura cristalina con un alto grado de
transformación a α-TCP, donde esta fase conforma una matriz continua, quedando aislados
los granos de β-TCP. La elevada temperatura de sinterización reduce no solo la porosidad
sustancialmente sino que produce el cierre progresivo de la misma.
A medida que se añade MgO, la matriz de α-TCP va disminuyendo conformándose
una estructura continua de agregados de β-TCP que de forma gradual constituye la nueva
matriz del material. Paralelamente se evoluciona hacía microestructuras altamente
densificadas (superiores al 97 %) y más homogéneas figuras V.23.c-e.
Al igual que en el caso de los materiales modificados con cinc, apartado V.2.3.1.3,
todos estos materiales, presentan microgrietas tanto inter como transgranulares.
V.4.4 Estudios “in vitro” de los compuestos cerámicos basados en fosfato
tricálcico modificados con ZnO/MgO en disoluciones acelulares
V.4.4.1 Ensayos de Bioactividad “in vitro” en Suero Fisiológico Artificial (SFA)
La evaluación de la reactividad en SFA se realizó en las composiciones 1.0 Z
dopada con oxido de cinc y en las denominadas 1.0 Z 0.125 M, 1.0 Z 0.5 M y 1.0 Z 1.0
M dopadas con oxido de cinc y oxido de magnesio, todas ellas sinterizadas a 1350 ºC.
Todas las muestras ensayadas exhibían porcentajes de porosidad abierta similares, en el
rango 1-3 %. La influencia de la topografía superficial se minimizó una vez más a través
de una etapa previa de pulido, evaluando seguidamente la rugosidad. Todos los materiales
estudiados presentaban valores de rugosidad media (Ra) y de profundidad (RZ) de ~0.8±0.1
mm y ~5.0±0.9 mm, respectivamente.
V.4.4.1.1 Perfiles de liberación iónica
La figura V.24, muestra los perfiles de liberación iónica de Ca, P, Zn y Mg en SFA
obtenidos en las muestras sinterizadas a 1350 ºC, para cada periodo de tiempo ensayado.
201
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Figura V.24 Concentración de iones a), b) Ca, P c) Zn y d) Mg en SFA en función del
tiempo de inmersión en las muestras de Zn-TCP y ZnMg-TCP sinterizadas a 1350 ºC.
Aunque los perfiles de disolución obtenidos en las muestras de Zn-TCP y ZnMg-
TCP se han organizado en función de la fase mayoritaria presente en las microestructuras,
figura V.24.a y b, los cambios registrados en la composición del SFA y especialmente en
las especies iónicas Ca y P, no revelaron tendencias diferenciadas que permitan distinguir
los procesos de disolución de materiales basados en α o de β-TCP.
Todas las muestras ensayadas exhiben una baja reactividad durante todos los
estadios del experimento figura V.24.a y b. Este comportamiento indica que ni β-TCP ni α-
TCP se disuelven de manera apreciable incluso después de cuatro semanas de exposición.
Estos resultados se pueden relacionar directamente con las características estructurales y
microestructurales de estos materiales previamente estudiadas en los apartados V.4.3.2 y
V.4.3.3. La notable reducción en la porosidad abierta, consecuencia de su alta densidad y
el notable crecimiento de grano desarrollado, son las causas que determinan la baja
0 1 2 3 4-15
-10
-5
0
5
10
15
20
1.0 Z 0.125 M (53 % en peso -TCP) 1.0 Z 0.5 M (71 % en peso -TCP) 1.0 Z 1.0 M (85 % en peso -TCP)
T=1350 ºC
Semanas
Co
ncen
trac
ión
ión
ica
1.0 Z (65 % en peso -TCP)
Ca (mg/l)
P (mg/l)
SFA
Ca (mg/l)
P (mg/l)
b)a)
0 1 2 3 4
Semanas
0 1 2 3 4-0,025
-0,013
0,000
0,013
0,025
0,038
0,050
1.0 Z 0.125 M (53 % wt -TCP) 1.0 Z 0.5 M (71 % wt -TCP) 1.0 Z 1.0 M (85 % wt -TCP)
Semanas
Con
cent
raci
ón ió
nica
1.0 Z (65 % en peso -TCP)
SFA
d)c)
Mg (mg/l)
0 1 2 3 4-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
1.0 Z 0.125 M (53 % en peso -TCP)
Semanas
1.0 Z 0.5 M (71 % en peso -TCP) 1.0 Z 1.0 M (85 % en peso -TCP)
1.0 Z (65 % en peso -TCP)
Zn (mg/l)
202
Capítulo V
disolución de las muestras en este medio, indicando una alta estabilidad y una baja
reactividad. Además, la mayor estabilidad de la fase β-TCP con el aumento del contenido
de dopante y la más alta temperatura de sinterización de las muestras, son la razón de la
baja solubilidad de esta familia de materiales [18,19].
No obstante, y pese a estas consideraciones, se detecta, aunque en menor
proporción que en los materiales dopados con óxido de cinc sinterizados a 1250 ºC, una
liberación de iones Zn desde el comienzo del ensayo. Esta liberación presenta una
tendencia similar a la previamente observada en los materiales monodopados y la
saturación se alcanza a una concentración de 0.015 mg/l, desde la primera semana de
inmersión, figura V.24.c, valor que es un 50 % inferior a las composiciones dopadas
únicamente con oxido de cinc previamente mencionadas. En contraposición la liberación
de iones Mg2+ en el medio, que se activa a partir de la tercera semana de inmersión, es dos
órdenes de magnitud superior a la de iones Zn2+ (1.5 mg/l). figura V.24.d.
V.4.4.1.2 Caracterización de precipitados superficiales de Ca y P
Una vez finalizados los ensayos de bioactividad, los cambios superficiales
producidos en los materiales a consecuencia de su exposición en SFA, se evaluaron
cualitativamente mediante MEB-EC.
V.4.4.1.2.1 Caracterización microestructural
En general ninguno de los materiales químicamente modificados Zn-TCP y ZnMg-
TCP y sinterizados a 1350 ºC, presentan alteraciones significativas tras su exposición
durante cuatro semanas al SFA. Únicamente la composición 1.0 Z 1.0 M sinterizada a
1350 ºC y ensayada a cuatro semanas presentaba agregados superficiales característicos de
la apatita biológica.
La figura V.25, muestra los precipitados superficiales de Ca y P observados en la
composición 1.0 Z 1.0 M sinterizada a 1350 ºC después de cuatro semanas de exposición al
SFA.
203
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
Figura V.25 Micrografías obtenidas de los precipitados superficiales de Ca y P observados
en los materiales 1.0 Z 1.0 M sinterizados a 1350 ºC durante 12 h y expuestos en SFA
cuatro semanas, a) baja magnificación y b) alta magnificación.
Las microestructuras obtenidas evidencian la precipitación de agregados
superficiales de Ca y P en zonas preferenciales del material, tales como bordes de grano
imperfecciones estructurales y poros.
Este estado incipiente del proceso de nucleación ha permitido ahondar en los
procesos involucrados, identificando un mecanismo de nucleación heterogéneo de los
agregados de apatita biológica en estos materiales. La superficie del nucleante heterogéneo
(en ese caso el material ensayado) facilita la formación de la nueva fase, actuando como
catalizador de la nucleación, y favoreciendo la génesis de los cristalitos que darán lugar a
la fase apatita, que nuclea en los sitios preferenciales previamente mencionados donde la
energía superficial efectiva es menor [8]. Seguidamente se producirá el crecimiento de los
núcleos de Ca y P formados durante el proceso de solución/precipitación de iones sobre su
superficie.
50 μm
a) 1.0 Z 1.0 M 4 Semanas
30 μm
b) 1.0 Z 1.0 M 4 Semanas
204
Capítulo V
V.5 CONCLUSIONES PARCIALES DE LOS BIOMATERIALES
BASADOS EN Ca3(PO4)2 MODIFICADOS CON ZnO/MgO
La información suministrada por el estudio del sistema Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2-
Mg3(PO4)2 y los resultados extraídos a partir del estudio de los materiales dopados con
ZnO, permitió sintetizar por reacción en estado sólido compuestos precursores de fosfato
tricálcico dopados con ZnO y MgO altamente reactivos. Los estudios térmicos y
estructurales permitieron definir, al igual que en los materiales dopados con oxido de cinc
las temperaturas óptimas de síntesis y la sinterización.
El efecto estabilizador que ejercen el Zn2+ y el Mg2+ simultáneamente en la
estructura del polimorfo β-TCP, ha permitido modular las características mineralógicas y
microestructurales de los materiales.
Los estudios de bioactividad en SFA de los biomateriales de TCP y ZnMg-TCP,
han demostrado nuevamente que las características mineralógicas y microestructurales
dominan la reactividad de los materiales en SFA. Se ha constatado la baja reactividad y la
elevada estabilidad en el proceso de solución/precipitación de agregados de Ca y P en
forma de HAp. La mayor temperatura de sinterización que implica un mayor grado de
sinterización y el consiguiente crecimiento cristalino son las causas que justifican este
comportamiento.
Se ha observado en los ensayos de bioactividad en SFA que los iones Mg2+ se
lixivian en mayor proporción que los iones de Zn2+. Este hecho es consecuencia de la
mayor solubilidad de Mg2+ en SFA.
205
Biomateriales basados en Ca3(PO4)2 modificados con ZnO y ZnO/MgO
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206
Capítulo V
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Capítulo VI
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
209
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
VI. Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
VI.1 INTRODUCCIÓN
En el capítulo V se han presentando las características físico-químicas de los
diferentes materiales obtenidos en los sistemas Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y Ca3(PO4)2-
Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2, así como el comportamiento de los mismos durante su degradación
“in vitro” en suero fisiológico artificial. Puesto que estos materiales han sido desarrollados
con la finalidad de ser empleados en aplicaciones biomédicas, es indispensable proceder al
estudio de su respuesta biológica. Este aspecto de su comportamiento es fundamental,
porque una vez aplicados clínicamente deben asumir las funciones de los tejidos u órganos
naturales, por lo que han de ser capaces de imitar en la medida de lo posible las
propiedades del tejido natural en su ambiente biológico [1].
Teniendo en consideración que los materiales desarrollados deben cumplir ciertos
requisitos de factibilidad funcional, bioestabilidad y biocompatibilidad, los estudios “in
vitro” son el primer paso utilizado para la comprensión de la interacción material-célula, la
posible citotoxicidad y la consiguiente biocompatibilidad de los mismos [2]. Los cultivos
celulares son sistemas ideales para el estudio y observación de un determinado tipo de
células bajo condiciones específicas. En este sentido, este tipo de ensayos “in vitro” son
enormemente útiles para la evaluación de los efectos biológicos de los biomateriales, por lo
que su uso está, a día de hoy, extensamente difundido, ya que no requieren, en primera
instancia, del empleo de ensayos de experimentación animal [3,4].
Como los materiales preparados en la presente memoria de Tesis Doctoral tienen
como finalidad ser utilizados en aplicaciones de reparación, restauración y regeneración
ósea, lo más oportuno a la hora de analizar la respuesta celular de los mismos es el empleo
de células óseas. Por este motivo, en los diferentes ensayos se emplearon células
provenientes de la línea celular MG-63, constituida por células de osteosarcoma humano
de tipo osteoblástico, ampliamente utilizadas en este tipo de estudios biológicos [5–9].
Previo al análisis de la respuesta celular de esta familia de materiales
biodegradables basados en TCP, y teniendo en consideración que éstos han sido
210
Capítulo VI
modificados composicionalmente con ZnO y con ZnO y MgO, se procedió inicialmente a
la cuantificación del grado de toxicidad de los iones Zn2+ y Mg2+, realizando experimentos
de inhibición de crecimiento celular, empleando disoluciones concentradas de ZnCl2 y
MgCl2 en medio de cultivo.
Seguidamente y teniendo en cuenta los numerosos parámetros que influyen en los
ensayos de interacción material-célula, tales como; topografía, porosidad, mojabilidad,
composición química, proporción y distribución de las fases constituyentes [10–12], se han
llevado a cabo ensayos exploratorios a corto plazo en contacto directo material-célula.
Asimismo como los productos de degradación que se liberan a los tejidos
circundantes pueden afectar el comportamiento celular, se realizaron ensayos indirectos
material-célula analizando los extractos de degradación de los materiales tras diferentes
tiempos de exposición.
Este tipo de ensayos han permitido evaluar las características de los materiales y
analizar la degradación de los mismos, lo cual es indispensable en el análisis integral de
cualquier biomaterial.
VI.2 EXPERIMENTOS DE INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO
CELULAR EMPLEANDO DISOLUCIONES CONCENTRADAS DE
ZnCl2 Y MgCl2
Para evaluar el grado de toxicidad de iones de Zn2+ y Mg2+ en contacto con las
células MG-63, se prepararon disoluciones concentradas de ZnCl2 y MgCl2 en medio de
cultivo (DMEM), abarcando rangos de concentración comprendidos entre 0-600 μM y 0-
200 mM, respectivamente.
La selección de los rangos de concentración de cada una de estas sales de cloro
empleadas, se acotó en base a estudios previos que reportaban concentraciones que
reducían el número de células viables al 50 %. Estas concentraciones fueron de 50 mM de
Mg2+ y de 120 a 201 μM de Zn2+, en función de la línea celular [13–15].
211
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
Seguidamente se procedió a la incubación de estas disoluciones concentradas, en
placas de extracción de 24 pozos “24 well-plates” (área superficial ~1.5 cm2), en contacto
directo con el cultivo celular previamente incubado durante 48 h.
Una vez trascurrido un periodo de exposición de 48 h, el estudio de las alteraciones
vitales de las células, debido a la presencia en el medio de cultivo de estos iones, se dirigió
fundamentalmente a realizar estudios cualitativos y cuantitativos de la morfología y
distribución de las células adheridas a la superficie de los pozos de cultivo y de la
viabilidad y proliferación celular, figura VI.1. Asimismo se determinó la máxima
concentración iónica no tóxica a partir de la cual se producía una muerte celular del 50 %
(dosis letal-LD50).
Figura VI.1 Esquema del procedimiento experimental seguido en los ensayos de
inhibición del crecimiento celular mediante el empleo de disoluciones concentradas de
ZnCl2 y MgCl2.
Estudio:Respuesta celular
48 h
100.000 células/ml
48 h
MgCl2:
0-200 mM
ZnCl2:
0-600 µM
212
Capítulo VI
Para establecer la influencia de la concentración iónica en el comportamiento
celular, los resultados obtenidos se normalizaron respecto al ensayo control, que
correspondía a una concentración de 0 M de ZnCl2 y MgCl2.
La figura VI.2, muestra los valores obtenidos de viabilidad y proliferación celular
en las diferentes disoluciones concentradas de ZnCl2 y MgCl2 después de un tiempo de
exposición de 48 h. Como tendencia general, al aumentar la concentración de iones Zn2+ y
Mg2+ en disolución, se produce una disminución progresiva de la viabilidad y proliferación
celular, alcanzando una dosis letal, LD50, para una concentración en disolución de
ZnCl2=150 μM y MgCl2=85 mM, respectivamente, figura VI.2.a y c. Estos resultados
indican que concentraciones de iones Zn2+ y Mg2+ superiores a estos valores, inducen
toxicidad en el medio celular.
Aunque se han obtenido diferencias significativas positivas y negativas respecto del
ensayo control, figura VI.2.b y d, la más relevante se observa en la ampliación de la figura
VI.2.b, donde se pone de manifiesto un aumento significativo de la viabilidad celular, para
una concentración de iones de Zn2+ en disolución de 0.4 μM, en el rango de concentración
0-100 μM.
213
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
Figura VI.2 Cuantificación, después de 48 h de ensayo, de la viabilidad y proliferación
celular en función de la concentración en las disoluciones: a) [ZnCl2]=0-600 μM, b)
[ZnCl2]=0-100 µM, c) [ZnCl2]=1-4 μM, d) [MgCl2]=0-200 mM, e) [MgCl2]=0-100 mM, f)
[MgCl2]=1-4 mM.
Se representa el valor medio ± intervalo de confianza y el nivel de significación obtenido
en el análisis de la varianza efectuado frente a los valores obtenidos respecto de ensayo
control ( p < 0.05).
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
120
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
[ZnCl2] M)
a)
LD50
0 20 40 60 80 100
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
[ZnCl2] (M)
0 1 2 3 49095
100105110115
b)
* 0.4 M
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
20
40
60
80
100
120
c)
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
[MgCl2] mM)
LD50
0 20 40 60 80 100
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135d)
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
[MgCl2] (mM)
0 1 2 3 49095
100105110115
c)
a) b)
d) e)
f)
214
Capítulo VI
Los aspectos más significativos relacionados con el estudio cualitativo de las
alteraciones vitales y morfológicas de las células, debido a la incorporación en el medio de
cultivo de iones Zn2+ y Mg2+ en distintas concentraciones, después de 48 h de exposición,
se evaluaron mediante microscopía óptica de luz reflejada (MOLT).
En la figura VI.3 se muestran las imágenes más relevantes obtenidas en el estudio
realizado en un medio de cultivo expuesto a disoluciones concentradas de ZnCl2.
Figura VI.3 Micrografías obtenidas mediante microscopía óptica de las células
MG-63 previamente incubadas durante 48 h y expuestas a las diferentes disoluciones
concentradas de ZnCl2, durante 48 h.
100 μm
[ZnCl2]=0 μMa) [ZnCl2]=0.4 μMb)
100 μm
[ZnCl2]=100 μMc)
100 μm
[ZnCl2]≥200 μMd)
100 μm
215
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
La figura VI.3.a muestra la micrografía correspondiente al ensayo control que no
estuvo expuesto a ningún agente externo. Las células adheridas a los pozos de cultivo
presentan una morfología alargada, poligonal extendida, característica de las células de
tipo osteoblasto. A las 48 horas se observa cómo las células han alcanzado un crecimiento
confluente que cubre toda la superficie de la placa de cultivo. Asimismo se observan
células con una apariencia más redondeada lo que indica que se encuentran en etapa de
división.
La figura VI.3.b, corresponde con las células expuestas a una concentración de
[ZnCl2]=0.4 μM. En este caso se observa una morfología y confluencia similar a la
observada en el ensayo control. Destacar la mayor proporción de células con aspecto
redondeado característico de división celular. Este hecho corroboraría el aumento
significativo de la viabilidad celular obtenido con respecto al ensayo control, figura VI.2.a.
En la figura VI.3.c, se observan las imágenes obtenidas de las células expuestas a
una concentración de [ZnCl2]=100 μM. Al igual que en los casos anteriores, a estas
concentraciones de iones Zn2+ en disolución, las células no presentan alteraciones
significativas respecto al ensayo control, manteniendo la morfología típica osteoblástica,
poligonal extendida con cuerpos celulares compactos, previamente observada.
Finalmente, las alteraciones morfológicas observadas para una concentración de
[ZnCl2]≥200 μM, figura VI.3.c, ponen de manifiesto la toxicidad inducida por los iones de
Zn2+ a estas concentraciones, produciéndose la total separación del cuerpo celular de la
superficie del sustrato, indicativo de la muerte celular.
VI.3 EXPERIMENTOS DE INTERACCIÓN DIRECTA MATERIAL-
CÉLULA
Para evaluar la respuesta biológica de los materiales de TCP, Zn-TCP y ZnMg-
TCP, y analizar los efectos que pudiera originar su composición sobre los distintos
aspectos de la actividad y comportamiento de los osteoblastos MG-63, se realizaron
ensayos de interacción directa material-célula durante 48 h, figura VI.4.
216
Capítulo VI
Los experimentos se dirigieron principalmente a analizar el efecto de la
composición de los materiales en la adhesión, distribución, viabilidad y proliferación
celular.
Figura VI.4 Esquema del procedimiento experimental seguido en los ensayos de
interacción directa material-célula.
Se debe señalar que son múltiples las variables que influyen en este tipo de
experimentos, la composición química y la diferente proporción y distribución de las fases
presentes que puede llevar a diferentes velocidades de degradación. Además se deben tener
en consideración otras variables tales como las características topográficas y la porosidad.
Con objeto de minimizar estos efectos, en la medida de los posible y previo a la
realización de los experimentos, las variables topográficas que afectan en gran medida a
este tipo de ensayos [16], se minimizaron a través de una etapa de pulido, obteniendo
valores comparables de Ra=0.8±0.1 μm y RZ=5.0±0.9 μm en todas las muestras. Asimismo
en cada serie de composiciones sometidas a estudio, se seleccionaron muestras con valores
de porosidad abierta similares, requisito fundamental para realizar un estudio comparativo.
48 h
100.000 células/ml
Estudio: Respuesta celular
TCP Zn-TCP ZnMg-TCP
217
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
VI.3.1 Compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados
con ZnO
Teniendo en consideración que los materiales desarrollados interaccionarán
activamente durante el proceso de reabsorción, y que el efecto de los iones Zn2+ produce
una acusada inhibición del crecimiento celular a concentraciones en disolución
significativamente inferiores a las obtenidas en presencia de iones Mg2+, el análisis de la
posible toxicidad de las muestras Zn-TCP se realizó sobre las muestras de TCP
sinterizadas a 1075 ºC (muestra de referencia) y 0.125 Z y 1.0 Z sinterizadas a 1150 ºC.
Estas muestras se escogieron en base a que presentaban los perfiles de liberación iónica
más significativos en SFA, indicativo de su mayor reactividad en este medio, ver capítulo
V, y que presentaban unos valores de porosidad abierta relativamente semejantes, en el
rango del 5 al 9 %.
VI.3.1.1 Análisis cualitativo de la adhesión, morfología y distribución celular
La figura VI.5 muestra las imágenes obtenidas por Microscopía Láser Confocal de
Barrido (MCBL) de las células MG-63 en contacto con las superficies pulidas de los
materiales ensayados.
Figura VI.5 Micrografías obtenidas mediante MCBL de las células MG-63 en contacto
directo, durante 48 horas, con los materiales: a) TCP sinterizado a 1075 ºC, b) 0.125 Z y c)
1.0 Z sinterizados a 1150 ºC.
250 μm
a)
250 μm
b)
250 μm
c)
218
Capítulo VI
El color verde observado en las micrografías se consigue con la tinción del citosol
de las células vivas. Las imágenes obtenidas del TCP sinterizado a 1075 ºC, figura VI.5.a,
y de las composiciones 0.125 Z y 1.0 Z sinterizadas a 1150 ºC, figura VI.5.b y c,
respectivamente, muestran la alta adhesión y propagación celular alcanzada a lo largo de la
superficie de los materiales. Las células presentan un contacto íntimo y morfología
osteoblástica típica con forma poligonal extendida. Asimismo se observa una adaptación
de las extensiones citoplasmáticas a la superficie de los materiales.
Cualitativamente se observa que a medida que aumenta el contenido de ZnO en las
muestras, las células alcanzan un mayor contacto físico entre sí. Este hecho es más
relevante en el caso de la composición 1.0 Z, conformando una capa densa y confluente
que recubre prácticamente toda la superficie del material.
Estos resultados ponen de manifiesto que para contenidos en peso de ZnO iguales o
inferiores a 1.000 %, la composición química de los materiales presenta una influencia
positiva en la adhesión y morfología celular.
VI.3.1.2 Análisis cuantitativo de la viabilidad celular
Seguidamente se cuantificó la viabilidad de las células MG-63, en contacto con la
superficie de las diferentes composiciones durante 48 horas.
Con el objetivo de establecer el efecto de la incorporación del ZnO en la respuesta
biológica y así realizar un estudio comparativo, los resultados obtenidos se normalizaron
respecto a la muestra TCP sin dopar (muestra de referencia), figura VI.6.
219
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
Figura VI.6 Cuantificación de la viabilidad de las células MG-63 en contacto directo con
los materiales después de 48 horas de interacción.
TCP sinterizado a 1075 ºC y las composiciones 0.125 Z y 1.0 Z sinterizadas a 1150 ºC
Se representa el valor medio ± intervalo de confianza y el nivel de significación obtenido
en el análisis de la varianza efectuado frente a los valores obtenidos respecto del control
(TCP sin dopar) (p > 0.05, p < 0.05, p < 0.01).
En todas las composiciones se observó un aumento significativo de la proliferación
celular, respecto de la muestra de referencia (TCP sin dopar). Resaltar que el material 1.0 Z
exhibe los valores de proliferación más altos, lo que indica que esta composición es la que
mas estimula la actividad mitocondrial y por consiguiente la viabilidad de este tipo de
células. La cuantificación realizada a partir de las imágenes obtenidas por microscopía
confocal ha corroborado los resultados obtenidos.
Los estudios realizados han permitido concluir que la adición de ZnO favorece la
adhesión, morfología, distribución y proliferación de las células. Además se ha puesto de
manifiesto que el aumento de la proliferación celular está directamente relacionada con
liberación de iones de Zn2+ al medio, lo que está en consonancia con la información
disponible en la literatura [17,18].
TCP 0.125 Z 1.0 Z0
20
40
60
80
100
120
140
Via
bili
da
d C
elu
lar
(%)
220
Capítulo VI
Teniendo en cuenta que los valores más altos de viabilidad se han obtenido para la
composición 1.0 Z, con un contenido de dopante de 1.000 % en peso de ZnO, y que en los
resultados obtenidos en los ensayos realizados con disoluciones concentradas de ZnCl2 se
observó un aumento significativo de viabilidad para una concentración en disolución de
[Zn2+]=0.4 μM, se puede inferir que el material dopado con un 1.000 % en peso de óxido
de cinc induce una concentración de Zn2+ en solución en ese orden de valor. Este hecho
justificaría su buen comportamiento y además permite también deducir que ese orden de
magnitud debe ser la referencia para la optimización del dopado y en definitiva el diseño
composicional del estos materiales
VI.3.2 Compuestos cerámicos basados en fosfato tricálcico modificados
con ZnO/MgO
Paralelamente al estudio de los materiales modificados con ZnO, Zn-TCP, se
realizaron experimentos análogos en los materiales codopados con ZnO y MgO, ZnMg-
TCP.
El primer aspecto a considerar en los materiales codopados es que la mayor
densificación que presentan estas composiciones bifásicas, al haber sido sinterizados a
mayor temperatura, 1350 ºC, no permitió distinguir, en los ensayos en SFA, los procesos
de disolución asociados a cada fase ni distinguir la aportación de cada una de ellas.
A efectos de analizar la influencia en la respuesta biológica asociada a la
incorporación de ZnO y MgO, para este estudio se seleccionó la muestra de TCP como
referencia y todas las muestras de ZnMg-TCP, por exhibir similares valores de porosidad
abierta, en el rango 1-3 %.
VI.3.2.1 Análisis cualitativo de la adhesión, morfología y distribución celular
La figura VI.7 muestra las imágenes obtenidas por Microscopía Láser Confocal de
Barrido (MCBL) de las células MG-63 en contacto con las distintas superficies de los
materiales de TCP sin dopar y ZnMg-TCP ensayados.
221
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
Figura VI.7 Micrografías obtenidas mediante MCBL de las células MG-63 en contacto
directo, durante 48 horas, con los materiales: a) TCP sinterizado a 1075 ºC, b) 1.0 Z y c)
1.0 Z 0.125 M, c) 1.0 Z 0.5 M y d) 1.0 Z 1.0 M, después de 48 h de exposición. Las
composiciones b), c), d) y e) fueron sinterizadas a 1350 ºC.
La observación de las células cultivadas sobre las muestras de TCP sin dopar,
figura VI.7.a, Zn-TCP, figura VI.7.b y ZnMg-TCP, figura VI.7.c-d, sinterizadas a
1350 ºC, muestran en todos los materiales ensayados una alta adhesión y propagación
celular cubriendo toda la superficie de la muestra. Las células presentan un contacto íntimo
y morfología osteoblástica típica con forma poligonal extendida. Asimismo se observan
numerosos filamentos extracelulares y una adaptación de las extensiones citoplasmáticas a
la superficie de los materiales. Los ensayos realizados mostraron una influencia positiva en
todas las muestras, aunque a nivel cualitativo por MCBL no se pudieron observar
diferencias entre ellas que permitieran discriminar el efecto asociado al contenido de
dopante y a las fases presentes.
TCP T=1075 ºC
50 μm
a)1.0 Z T=1350 ºC b)
50 μm
1.0 Z 0.125 M T=1350 ºC c)
50 μm
1.0 Z 0.5 M T=1350 ºC d)
50 μm
1.0 Z 1.0 M T=1350 ºC e)
50 μm
222
Capítulo VI
VI.3.2.2 Análisis cuantitativo de la viabilidad y proliferación celular
Los resultados correspondientes a la cuantificación de la viabilidad y proliferación
celular realizada en los materiales de Zn-TCP y ZnMg-TCP sinterizados a 1350 ºC se
muestran en la figura VI.8. Para establecer el efecto en la respuesta celular asociado a la
incorporación de ZnO y MgO en la composición de los materiales, nuevamente los
resultados obtenidos en las muestras Zn-TCP y ZnMg-TCP, se normalizaron respecto al
TCP sin dopar (muestra de referencia).
Figura VI.8 Cuantificación de la viabilidad y proliferación de las células MG-63 en
contacto directo con los materiales después de 48 horas de exposición.
TCP sinterizado a 1075 ºC y las composiciones 1.0 Z, 1.0 Z 0.125 M, 1.0 Z 0.5 y 1.0 Z
1.0 M sinterizadas a 1350 ºC
Se representa el valor medio ± intervalo de confianza y el nivel de significación obtenido
en el análisis de la varianza efectuado frente a los valores obtenidos respecto del control
(TCP sin dopar) (p > 0.05, p < 0.05, p < 0.01).
TCP
1.0 Z
1.0 Z
0.12
5 M
1.0 Z
0.5 M
1.0 Z
1.0 M
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
223
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
La cuantificación realizada permitió establecer diferencias significativas entre las
muestras ensayadas. A excepción de la composición 1.0 Z 1.0 M todas las muestras
presentaron valores de proliferación celular superiores a la muestra de referencia.
La muestra 1.0 Z sinterizada a 1350 ºC exhibe, después de 48 horas, los valores de
viabilidad más altos lo que implica que esta composición estimula en mayor medida la
actividad mitocondrial y por consiguiente la viabilidad celular. Este hecho indica que se
indujo un efecto positivo en las células Mg-63 que estuvieron en contacto directo durante
48 horas con la superficie de las muestras.
Otro aspecto relevante, similar al obtenido en los materiales de TCP y Zn-TCP,
apartado VI.3.1.2, es que la presencia aislada de iones de Zn2+, a estos tiempos de
exposición, ejerce un mayor y más acusado efecto estimulador en la actividad
mitocondrial, que cuando se encuentra en combinación con iones de Mg2+.
Aunque todos los estudios de interacción directa material-célula han dado lugar a
resultados positivos, no identificando en ninguno de los materiales ensayados signo alguno
de citotoxicidad, es necesario profundizar en estudios sitemáticos que permitan separar las
variables y correlacionarlas con el comportamiento celular. Estos estudios permitirán una
mayor comprensión de los factores que afectan el comportamiento celular, y en definitiva
permitirá optimizar las características de los biomateriales.
VI.4 EXPERIMENTOS DE INTERACCIÓN INDIRECTA
MATERIAL-CÉLULA
Como se ha mencionado con anterioridad la reabsorción de un material
biodegradable es un factor relevante de su comportamiento puesto que una vez implantado
los productos que se disuelvan de dicho material se incorporarán a los fluidos corporales.
En esta dirección se han realizado estudios adicionales indirectos material-célula con la
finalidad de evaluar el efecto de dichos productos sobre el comportamiento y la actividad
celular.
Los ensayos se realizaron en materiales TCP, Zn-TCP y ZnMg-TCP que se
incubaron en un medio de cultivo en ausencia de células durante periodos de exposición
224
Capítulo VI
de 1, 2 y 3 semanas. Seguidamente los extractos de los materiales se recogieron y el
sobrenadante en cada caso (medio de cultivo obtenido tras su exposición a un determinado
material) se puso en contacto con un cultivo celular, previamente incubado, durante 48 h.
Las alteraciones vitales de las células expuestas a los productos lixiviados por los
materiales se analizaron mediante estudios, cualitativos fundamentalmente morfológicos y
cuantitativos de la viabilidad y proliferación celular, a 48 h de exposición, figura VI.9.
Figura VI.9 Esquema del procedimiento experimental seguido en los ensayos de
interacción indirecta material-célula.
Tiempo de exposición:7 días14 días21 días
Productos de degradación lixiviados(Zn, Mg, Ca, P)
• TCP• Zn-TCP• ZnMg-TCP
100.000 células/ml
48 h
48 h
Estudio: Respuesta celular
225
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
Los resultados obtenidos de viabilidad y proliferación celular, se compararon
respecto al ensayo control, correspondiente con el medio de cultivo que no estuvo expuesto
a ningún material y que fue incubado 1, 2 y 3 semanas, respectivamente. En todas las
composiciones ensayadas, se observaron diferencias estadísticamente significativas
respecto al control, lo que indicó que los extractos afectaron la actividad y el
comportamiento celular. Pese a esta evidencia, en ninguna de las muestras ensayadas se
obtuvieron porcentajes de viabilidad y proliferación celular inferiores al 90 %, lo que
indica que los resultados obtenidos pueden ser considerados positivos.
Posteriormente, y a efectos de analizar en cada muestra la influencia positiva o
negativa de los productos lixiviados y realizar un análisis comparativo, los resultados de
viabilidad y proliferación celular de cada composición se normalizaron respecto los
extractos liberados a cada tiempo de exposición de la muestra de referencia TCP sin dopar.
La figura VI.10, muestra los resultados obtenidos normalizados respecto a la
muestra de referencia TCP sin dopar tras el proceso de cuantificación realizado a cada
tiempo de exposición.
226
Capítulo VI
Figura VI.10 Cuantificación de la viabilidad y proliferación de las células MG-63 después
de 48 h en contacto con los extractos de TCP sinterizado a 1075 ºC y de las composiciones
1.0 Z, 1.0 Z 0.125 M, 1.0 Z 0.5 y 1.0 Z 1.0 M sinterizados a 1350 ºC.
Se representa el valor medio ± intervalo de confianza y el nivel de significación obtenido
en el análisis de la varianza efectuado frente a los valores obtenidos respecto del control
(TCP sin dopar) (p > 0.05, p < 0.05, p < 0.01).
A 48 h de tiempo de exposición, se observa que los extractos de los diferentes
materiales producen ligeras alteraciones en el comportamiento celular. Como tendencia
general, los resultados de viabilidad y proliferación celular, en los extractos de 1 semana
mostraron una tendencia creciente, respecto a la muestra de referencia (TCP), en
prácticamente todos los materiales modificados. Esto hecho muestra que los cultivos son,
en cierta medida, sensibles a la liberación de iones de Zn2+ y Mg2+.
A tiempos de degradación superiores, únicamente los extractos correspondientes a
la composición 1.0 Z, mantuvieron esta tendencia. Estos resultados nuevamente ponen de
7 Día
s
14 D
ías
21 D
ías
7 Día
s
14 D
ías
21 D
ías
7 Día
s
14 D
ías
21 D
ías
7 Día
s
14 D
ías
21 D
ías
7 Día
s
14 D
ías
21 D
ías
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
1.0
Z 1.0
M
1.0
Z 0.5
M
1.0
Z 0.1
25 M
1.0
Z
Viabilidad celular (%) Proliferación celular (%)
TCP
227
Estudios de citotoxicidad y biocompatibilidad “in vitro” mediante un cultivo primario de osteoblastos humanos
manifiesto que esta composición es la que presenta mayor viabilidad y proliferación celular
y en definitiva mejor comportamiento.
V.5 CONCLUSIONES PARCIALES
Los experimentos de inhibición de crecimiento celular empleando disoluciones
concentradas de ZnCl2 y MgCl2 han permitido establecer el grado de toxicidad de iones
Zn2+ y Mg2+ en contacto con células MG-63 de tipo osteoblasto humano, observando que
concentraciones superiores de ZnCl2=150 μM y MgCl2=85 mM, inducen toxicidad en el
medio celular.
Los estudios de interacción material-célula realizados tanto en configuración
directa como indirecta en todas las muestras ensayadas, han demostrado resultados
positivos de viabilidad, proliferación y crecimiento celular. Este hecho indica que todas las
composiciones estudiadas pueden ser consideradas biocompatibles.
Los estudios de viabilidad y de proliferación celular han demostrado que el Zn2+
por sí solo, ejerce un mayor y más acusado efecto estimulador de la actividad mitocondrial
y por consiguiente en la actividad celular que cuando se encuentra en combinación con
Mg2+. Este hecho pone de manifiesto que su presencia a nivel de traza se considera
esencial en la formulación de un osteoimplante.
Puesto que el umbral de concentración a la que iones Zn2+ pueden inducir
citotoxicidad es inferior a la de los iones Mg2+, el diseño de los biomateriales dopados con
óxido de cinc y óxido de magnesio deberá conjugar el efecto estimulante en la actividad
celular inducida por los ambos dopantes.
228
Capítulo VI
BIBLIOGRAFÍA
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229
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Capítulo VII
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
233
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
VII. Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
VII.1 INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el desarrollo biomateriales de fosfato tricálcico con fines
regenerativos consiste en diseñar un material capaz de estimular la respuesta celular y
soportar las cargas demandadas, transfiriéndolas de forma progresiva al hueso durante el
proceso de reemplazamiento gradual por el nuevo tejido.
Esta familia de cerámicas si bien podrían considerarse casi los biomateriales
“ideales”, por poseer una composición química muy similar al componente inorgánico del
hueso y exhibir una elevada biocompatibilidad y osteointegración, presenta unas limitadas
prestaciones mecánicas que restringen su uso a zonas donde no se requieran elevadas
cargas mecánicas. Por esta razón se emplean en la actualidad de forma mayoritaria como
recubrimientos de prótesis metálicas, como cementos óseos o bien formando parte de
materiales compuestos.
En la presente memoria de Tesis Doctoral los materiales de fosfato tricálcico
modificados con óxido de cinc y óxido de cinc/óxido de magnesio han demostrando
ampliamente, en los ensayos “in vitro”, su viabilidad para ser empleados como sustitutivos
óseos ya que participan plenamente en los procesos de degradación y reabsorción,
estimulando la respuesta celular y mejorándola con respecto al TCP sin modificar. En
general, estos materiales han mostrado una buena estabilidad estructural y buena
manejabilidad lo que podría permitir ampliar su campo de aplicación. Además, teniendo en
cuenta que existe una proporcionalidad inversa entre los requerimientos biomecánicos del
implante con el porcentaje y tamaño de la porosidad, en este apartado se plantea un nuevo
método de obtención de estos biomateriales que mejore e implemente sus prestaciones
mecánicas.
En el presente capítulo se realiza un estudio preliminar donde se propone el empleo
de un método novedoso y avanzado de sinterización que permite la consolidación de piezas
con elevada densidad y escaso crecimiento cristalino [1–3]. Este método permitirá la
obtención de biocerámicas densas con propiedades mecánicas potencialmente mejoradas y
así ampliar su campo de aplicación a zonas del sistema esquelético donde se requiera de
234
Capítulo VII
moderadas prestaciones mecánicas y elevado flujo sanguíneo. Entre estas aplicaciones se
encuentran la reconstrucción maxilofacial, fusión de vértebras de la columna,
reconstrucción de la cresta ilíaca y reconstrucción del oído medio.
VII.2 SINTERIZACIÓN MEDIANTE CORRIENTE ELÉCTRICA
PULSADA “SPARK PLASMA SINTERING”
El método avanzado de sinterización no convencional empleado para la obtención
de piezas cerámicas de elevada densidad, está basado en la sinterización de materiales
mediante una corriente eléctrica pulsada. Para ello se ha empelado como equipo de
sinterización el conocido como Spark Plasma Sintering (SPS), que utiliza una corriente
pulsada al tiempo que aplica una presión mecánica uniaxial durante el ciclo térmico [4–6].
Las principales ventajas del SPS frente a los métodos de sinterización convencional
empleados hasta el momento, son una mayor velocidad de calentamiento y menores
temperaturas de sinterización y tratamiento. Esto permitirá controlar el desarrollo
microestructural obteniendo materiales de elevada densidad con crecimiento cristalino
limitado.
VII.2.1 Montaje experimental
El equipo de SPS empleado consta de una cámara de vacío de acero inoxidable en
la que se colocan los diferentes componentes; pistones, espaciadores y el troquel, todos
ellos de grafito. La figura VII.1, se muestra un esquema del equipo de SPS empleado.
235
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
Figura VII.1 Esquema del montaje y componentes del equipo de SPS.
Aunque está cámara permite trabajar en distintas condiciones atmosféricas, los
ensayos se han realizado en atmósfera de vacío, aplicando una presión uniaxial durante el
ciclo térmico. Los compuestos presintetizados en polvo se colocaron en el interior del
troquel de grafito, previamente recubierto con una lámina de un material conductor que
evita la oxidación y permite el calentamiento de la muestra. Este troquel, confinado por dos
pistones, está a su vez en contacto con dos electrodos metálicos a través de una serie de
espaciadores de grafito, haciendo que todo el conjunto esté conectado, permitiendo el paso
de la corriente eléctrica. La circulación de la corriente se realiza mediante pulsos, donde
cada pulso tiene una duración de 3.3 ms, empleándose habitualmente un patrón de pulsos
compuesto por 12 pulsos desactivados (12:2). El seguimiento de la temperatura se ha
realizado focalizando un pirómetro en el orificio que presenta el troquel a la mitad de su
altura y de profundidad que alcanza hasta la mitad del espesor de la pared.
VII.2.2 Procedimiento experimental
Los ensayos de sinterización mediante SPS se realizaron en composiciones TCP sin
dopar, 1.0 Z y 1.0 Z 1.0 M con una relación (Mg+Zn+Ca)/P ligeramente superior a 1.5
previamente sinterizadas a 900 ºC 2 h. Esta formulación se realizó para asegurar la
presencia de un pequeña proporción de HAp en los materiales.
PRESIÓN
PRESIÓN
Generador de
corriente
Troquel de grafito
Polvo
Cámara de vacío
Orificio de enfoque del pirómetro
Pistón
Espaciadores
Electrodo
236
Capítulo VII
Tras la realización de varios ensayos de sinterización por SPS de los materiales se
optimizaron los parámetros de sinterización y se llevaron a cabo todos los ensayos en las
mismas condiciones.
Se colocaron 4 g de polvo en el interior de un troquel con un diámetro de 20 mm.
Una vez colocados los pistones, el polvo se prensó manualmente con una carga de 2 MPa.
El dispositivo formado por el troquel y los pistones fue alineado con los espaciadores y el
electrodo. Posteriormente se aplicó de forma automática a través del sistema de presión del
equipo una carga de 6.2 kN (20 MPa).
La temperatura de ensayo seleccionada fue 1100 ºC, inferior a la temperatura de
transformación β→α-TCP, a fin de obtener materiales basados en β-TCP y así evitar las
tensiones asociadas a los cambios en volumen asociados a la transformación polimórfica a
α-TCP durante el calentamiento, y las que se producen durante el enfriamiento, a
consecuencia de la anisotropía cristalográfica de esta última fase.
Para evitar que dicha temperatura fuera sobrepasada durante el ensayo, se empleó
una secuencia de rampas de calentamiento, de 50 ºC/min en el intervalo comprendido entre
50-800 ºC y de 25 ºC/min en el intervalo comprendido entre 800-1100 ºC. Cuando se
alcanzó la temperatura máxima de sinterización, 1100 ºC, esta se mantuvo durante 5 min.
Una vez finalizado el tiempo de permanencia, el flujo de corriente eléctrica se
interrumpió y comenzó el proceso de enfriamiento. Durante todo el ciclo de calentamiento
se aplicó una carga uniaxial de 15.7 kN (50 MPa), presión que se alcanza durante el primer
minuto del ensayo. Esta carga disminuyo hasta un valor de 6.2 kN (20 MPa) al acabar el
tiempo de permanencia a la máxima temperatura. Todos los ensayos fueron realizados en
atmósfera de vacío de 4 MPa.
Los parámetros de la sinterización; voltaje, intensidad de corriente, temperatura,
presión de vacío, presión uniaxial y desplazamiento respecto del eje Z (dz) fueron
registrados de forma continua durante el ensayo.
237
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
VII.2.3 Estudio de los procesos de sinterización
El seguimiento de los procesos de sinterización tanto avanzados como
convencionales de las composiciones presinterizadas, se realizó mediante la curva de
desplazamiento respecto del eje Z (dZ) o curva de contracción registrada por el equipo de
SPS, y a partir de las curvas de dilatometría de alta temperatura (DAT) registradas a una
velocidad de 3 ºC/min, en cada caso.
Los datos de contracción registrados en las curvas de SPS han sido previamente
corregidos eliminando así el efecto debido a los componentes de grafito.
La figura VII.2 muestra las curvas de DAT y de desplazamiento respecto del eje Z
(dZ) de las composiciones TCP, 1.0 Z y 1.0 Z 1.0 M sintetizadas y presinterizadas
previamente a 900 ºC 2 h.
Aunque las composiciones presinterizadas en cada ensayo presentan un
comportamiento a contracción equivalente, figura 7.2 a y b, hay que destacar que en las
muestras sinterizadas convencionalmente, los procesos de contracción tienen lugar en un
intervalo de temperaturas muy amplio, entre 275 ºC para el TCP y aproximadamente
400 ºC para la muestras 1.0 Z y 1.0 Z 1.0 M y con velocidades de contracción
relativamente equivalentes. Asimismo de las curvas de DAT se puede inferir que el TCP
sin dopar alcanza la máxima densificación a 1175 ºC mientras que las composiciones
dopadas alcanzan la máxima densificación a la temperatura ~1300 ºC. Este hecho puede
ser inicialmente asociado a la inhibición de la transformación polimórfica que produce la
adición de MgO en la composición 1.0 Z 1.0 M.
En el ensayo de SPS este intervalo de temperaturas en el que se produce la
contracción se reduce considerablemente, siendo inferior a 200 ºC, y totalmente similar
para las tres composiciones. En todas las muestras la máxima densificación se alcanza a
1125 ºC.
238
Capítulo VII
Figura VII.2 Contracción lineal obtenida en función de la temperatura a) durante los
ensayos convencionales de sinterización sin presión (DAT) y b) durante los ensayos de
SPS.
Otro aspecto destacable está relacionado con las pendientes de las curvas de
contracción obtenidas. La composición 1.0 Z 1.0 M en el ensayo por SPS presenta una
curva de contracción lineal de pendiente más pronunciada indicando que la cinética del
proceso de contracción es más elevada. Esta mayor velocidad de contracción obtenida en el
ensayo SPS en esta muestra se atribuye a la doble sustitución en la estructura cristalina, ya
que el contenido de ZnO en la proporción estudiada la muestra 1.0 Z no modifica dicha
pendiente. En el caso de los ensayos convencionales, la incorporación de MgO en la
800 900 1000 1100 1200 1300 1400-0.30
-0.25
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
TCP Sin presión 1.0 Z Sin presión 1.0 Z 1.0 M Sin presión
Con
trac
ción
dZ /d
Z0
Temperatura (ºC)
a)
800 900 1000 1100 1200 1300 14006.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0
TCP SPS 1.0 Z SPS 1.0 Z 1.0 M SPS
b)
Con
trac
tion
d Z (
mm
)
Temperatura (ºC)
239
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
composición 1.0 Z produce un ligero aumento de la velocidad de contracción activando
levemente los procesos de densificación y sinterización.
VII.3 CARACTERIZACIÓN DE LOS BIOMATERIALES
OBTENIDOS MEDIANTE “SPARK PLASMA SINTERING”
VII.3.1 Caracterización Mineralógica y Microestructural
Todas las muestras TCP, 1.0 Z y 1.0 Z 1.0 M sinterizadas a 1100 ºC durante
5 minutos presentaron una densidad aparente comprendida entre 3.05-3.06 g/cm3, que
representa el 99.3-99.7 % de la densidad real de estos materiales. El análisis cualitativo de
las fases cristalinas realizado por DRX, ha permitido identificar en todas las composiciones
sinterizadas por SPS la fase β-TCP (ficha nº 702065) y en menor proporción la fase HAp
(ficha nº 760694).
La figura VII.3, permite observar las microestructuras de la muestras sinterizadas
por SPS donde se refleja la eleva densificación alcanzada, figura VII.3.a, c y e, y el
limitado crecimiento cristalino desarrollado en las muestras, característico de esta técnica
de sinterización. Asimismo se observa la presencia de cristales dispersos de HAp en menor
proporción alojados en matrices de β-TCP. Los valores promedio de los granos de β-TCP
que conforman las muestras son un orden de magnitud inferior a los obtenidos en las
muestras sinterizadas convencionalmente, figuras VII.3.b, d y f.
240
Capítulo VII
15 μm
1.0 Z 1.0 M T=1100 ºC 5 minSin atacar
e)
Figura VII.3 Micrografías de las superficies de las muestras pulidas y atacadas/no
atacadas, a) TCP sin atacar, b) TCP atacada, c) 1.0 Z sin atacar, d) 1.0 Z atacada, e) 1.0 Z
1.0 M sin atacar y f) 1.0 Z 1.0 M atacada, sinterizadas mediante SPS.
15 μm
TCP T=1100 ºC 5 minSin atacar
a)
15 μm
TCP T=1100 ºC 5 minAtacada
b)
15 μm
1.0 Z T=1100 ºC 5 minSin atacar
c)
15 μm
1.0 Z T=1100 ºC 5 minAtacada
d)
15 μm
1.0 Z 1.0 M T=1100 ºC 5 minAtacada
f)
241
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
VII.4.1 Caracterización Mecánica
Los biomateriales cerámicos obtenidos mediante ambos métodos de sinterización
fueron caracterizados mecánicamente, determinando su módulo de elasticidad y su
microdureza Vickers.
El modulo elástico y la microdureza Vickers se determinó según el método de
Oliver y Pharr de 1992 [7], implementado en el equipo de micro-indentación utilizado.
VII.4.1.1 Fundamento teórico
El valor de la dureza Vickers (H) en Pa se obtuvo a partir de la huella de
indentación empleando la siguiente ecuación [8]:
0.47 (Ecuación VII.1)
Donde P es la carga aplicada en N y r es el radio de la huella.
El módulo de elasticidad (E) fue calculado por el software del equipo a partir de las
curvas de carga-penetración [7], considerando la zona lineal de la curva de descarga y su
pendiente en el intervalo 60-95 % de la descarga. El cálculo de E se llevo a cabo
empleando las siguientes expresiones [9]:
√
√ (Ecuación VII.2)
Donde P es la carga aplicada, h la penetración alcanzada y E* es el módulo de elasticidad
del material compuesto que viene dado por:
(Ecuación VII.3)
Donde ν es el coeficiente de Poisson y los subíndices S e I corresponden al sustrato y al
indentador de diamante, respectivamente.
242
Capítulo VII
VII.4.1.2 Módulo de Elasticidad y Dureza Vickers
En la figura VII.5 se observa la evolución del modulo de elasticidad y de la
microdureza Vickers en función de la temperatura de sinterización para materiales
obtenidos mediante sinterización convencional y mediante SPS. En la figura se han
incluido valores de E y Hv extraídos de la literatura correspondientes a materiales densos y
lámina gruesa basados en TCP puro [10,11].
Figura VII.5 Evolución del módulo de Young en los materiales de TCP y Zn-TCP
sinterizados convencionalmente sin presión en función de la temperatura.
900 1000 1100 1200 1300 1400 15000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0
-TCP puro
Tanimoto el al. Wang et al. TCP 0.125 Z 0.25 Z 0.5 Z 1.0 Z
Hv (
GP
a)
Temperatura (ºC)
-TCP puro
1.0 Z 0.125 M 1.0 Z 0.25 M 1.0 Z 0.5 M 1.0 Z 1.0 M
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500102030405060708090
100110120130
-TCP puro
TCP 0.125 Z 0.25 Z 0.5 Z 1.0 Z
Temperatura (ºC)
E (
GP
a)
Wang et al.
1.0 Z 0.125 M 1.0 Z 0.25 M 1.0 Z 0.5 M 1.0 Z 1.0 M
SPS
SPS
a)
b)
Sinterización Convencional
Sinterización Convencional
243
Sinterización y obtención de biomateriales de fosfato tricálcico mediante Spark Plasma Sintering
Todos los materiales obtenidos mediante SPS presentan un aumento muy
significativo de los valores de E, figura VII.5.a y Hv, figura VII.5.b, respecto de los
obtenidos a través de métodos convencionales de sinterización. Esta mejora observada en
los parámetros mecánicos analizados está directamente relacionada con la elevada
densidad y el limitado crecimiento del tamaño de grano alcanzado en los mismos. En este
sentido, se ha observado que la reducción de un orden de magnitud en el tamaño de grano
medio de las muestras sinterizadas por SPS (2.5 μm) respecto de las sinterizadas a través
de métodos convencionales de sinterización (25 μm), produce un aumento del orden del
40 % en el módulo de elasticidad y casi triplica el valor de la dureza Vickers.
VII.4 CONCLUSIONES PARCIALES
El método avanzado de sinterización mediante corriente eléctrica pulsada (SPS) ha
permitido la consolidación a menores temperaturas y tiempos de tratamiento de muestras
cerámicas basadas en β-TCP y β-TCP con ZnO y ZnO/MgO en solución sólida, de elevada
densidad, con propiedades mecánicas mejoradas y con un muy limitado crecimiento grano
que es un orden magnitud inferior al de los materiales sinterizados convencionalmente.
244
Capítulo VII
BIBLIOGRAFÍA
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Capítulo VIII
Conclusiones Generales
247
Conclusiones Generales
VIII. Conclusiones Generales
A continuación se exponen, de forma general las conclusiones más relevantes de la
presente memoria de Tesis Doctoral:
Se han establecido mediante estudios experimentales las compatibilidades en estado
sólido del fosfato tricálcico en los sistemas ternario ZnO-CaO-P2O5 y cuaternario
ZnO-MgO-CaO-P2O5, específicamente las regiones ricas en fosfato tricálcico en
ambos sistemas y en óxido de cinc en el sistema ternario. El Ca3(PO4)2 está presente
en cinco volúmenes de compatibilidad en estado sólido donde coexisten cuatro fases.
Las fases que son compatibles con el fosfato tricálcico son: ZnO, MgO, Ca4(PO4)2O,
HAp, Ca3Mg3(PO4)4, CaMgP2O7 y Ca2P2O7.
Se han revisado los rangos de solución sólida en los sistemas: Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2 y
Ca3(PO4)2-ZnO, estableciendo experimentalmente a 900 ºC: el límite de solución
sólida de Ca2+ en Zn3(PO4)2, en el subsistema Zn3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2, fijándolo en el
0.6±0.1 % mol de CaO y el límite de solución sólida de Zn2+ en Ca3(PO4)2 en el
sistema ZnO-Ca3(PO4)2, fijándolo en el 3.6±0.5 % mol de ZnO. Se ha demostrando
que el compuesto Ca19Zn2(PO4)14 en el subsistema Ca3(PO4)2-Zn2Ca(PO4)2 es en
realidad una solución sólida de Zn2Ca(PO4)2 en Ca3(PO4)2.
Se han delimitado y establecido mediante estudios experimentales, en la región rica en
Ca3(PO4)2 del sistema pseudo-binario Ca3(PO4)2-Zn3(PO4)2, los campos de estabilidad
de los polimorfos α, β, α+β y α+α´ del fosfato tricálcico y las relaciones de fusión en la
zona de alta temperatura de este sistema. Se ha determinado el límite de solución
sólida de Zn2+ en Ca3(PO4)2, fijándolo en el 7.5±0.2 % mol de Zn3(PO4)2 a 1425 ºC y
dos puntos invariantes de carácter peritéctico asociados a las reacciones: α´-
Ca3(PO4)2SS + Líquido↔α-Ca3(PO4)2SS, a 1485±10 ºC, y α-Ca3(PO4)2SS + Líquido↔β-
Ca3(PO4)2SS, a 1425±10 ºC
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Capítulo VIII
Se han determinado los rangos de estabilidad en estado sólido de los polimorfos α y
α+β del fosfato tricálcico, entre 1100 y 1400 ºC, en la región rica en Ca3(PO4)2 en el
sistema pseudo-ternario Zn3(PO4)2-Mg3(PO4)2-Ca3(PO4)2. Se han definido los rangos
de composición y temperatura, que permiten la formulación y preparación de
biomateriales basados en fosfato tricálcico con óxido de cinc y óxido de cinc/óxido de
magnesio en solución sólida.
El control composicional y de las variables de procesado ha permitido sintetizar y
sinterizar por reacción en estado sólido compuestos basados en fosfato tricálcico
altamente reactivos y biomateriales monofásicos y bifásicos basados en polimorfos β y
α-Ca3(PO4)2 dopados con ZnO y ZnO+MgO.
El efecto estabilizador que ejercen el Zn2+ y el Zn2++Mg2+ de forma conjunta, en la
estructura del polimorfo β-Ca3(PO4)2, ha permitido modular las características
mineralógicas y microestructurales de los materiales, en función de la composición y
de la temperatura. Esta información permite controlar el diseño de biomateriales de
diferentes configuraciones mineralógicas y microestructurales.
Los resultados satisfactorios obtenidos en los estudios “in vitro” del comportamiento
bioactivo en suero fisiológico artificial (SFA) y de citotoxicidad y biocompatibilidad
en cultivos primarios de osteoblastos humanos, han demostrado ampliamente la
viabilidad composicional y microestructural de los materiales. Aunque se ha
establecido que el umbral de concentración de iones Zn2+ que inducen citotoxicidad,
es inferior a la de los iones Mg2+, su presencia a nivel de traza se considera esencial en
la formulación de un osteoimplante. El Zn2+, ejerce un mayor y más acusado efecto
estimulador, por si solo, que cuando se encuentra en combinación con Mg2+.
El estudio preliminar mediante la técnica de Spark Plasma Sintering (SPS) ha
permitido la consolidación a menores temperaturas y tiempos de tratamiento de
materiales de fosfato tricálcico dopados con óxido de cinc y óxido de cinc/óxido de
magnesio de elevada densidad y escaso crecimiento cristalino. La mejora de los
parámetros mecánicos analizados abre nuevas posibilidades de aplicación de estos
materiales.