viviana parreño
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Modelo cobayo Prueba de potencia de Vacunas virales Bovinas
Dra Viviana Parreño Instituto de Virología
CICV y A INTA Castelar Investigador Adjunto CONICET
PROSAIA Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:
En 1 año de trabajo se cerraron 3 guías:
Nº1 POTENCIA Y EFICACIA PARA VACUNAS DE BoHV-1 (IBR) (Octubre 2011)
POTENCY AND EFFICACY for bovine vaccines containing bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) causal agent of the Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR)
(Documento de trabajo del CAMEVET TRAMITE I)
Se contestaron las inquietudes de representante de USA
-Donna Gatewood, Section Leader, Virology, USDA/APHIS/VS/CVB PEL
-David Siev, Statistics Stetion Leader, USDA
PROSAIA Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:
1-CVB allows in vitro potency tests using a parallel line assay and a validated reference vaccine.
2-Original data set to obtain the SPLIT POINTS values for vaccine classification
3-Guinea pig receives two doses of vaccine, 21 days apart. Why the 2 vaccination schedules?
4- Note that the cutoffs proposed by the authors are intended to discriminate only between differences of at least one common logarithm (i.e. tenfold).
5- Report other parameter for the guinea pig model
ELISA: Predictivity, precision and accuracy 100% (all vaccines)
VN: Predictivity 75%, precision 90% (very satisfactory vaccines) - Accuracy 82%
IBR 23
IBR-DVB 44
IBR-DVB-PI3 53
IBR-DVB-PI3-BRSV 23
IBR-PI3 2
IBR-DVB-RVB 1
RVB 7
RVB-CVB 3
DVB-RVB 2
TOTAL 158
VALENCIA NÚMERO DE SERIES
PRODUCCIÓN de Vacunas Virales
No Vesiculares 2009 1
3 200
17
12
13
25
1616
53
Agropharma
Biogenesis Bagó
CDV
Tecnovax
Invesbio
ISG
Inmunovet
Rosenbusch
Fuerte Sancti Spiritu
OVER Lab Sta Elena
Zoovac
Richmond
Series presentadas
(total 158)
Cantidad de dosis
(Total 32.410.445)
Síndrome respiratorio
SDVE, Balcarce. 1995-2002
Dyctiocaulus
4%
Virus
53%
Intererminado
10%
Otros
32%
A pyogenes
3%
Otra bact
5%
M haemolytica
5%
P multocida
10%
H somnus
10%
n=96
Bacterias
Virus
BRSV
18%
PI3
15%
IBR
22%Otros
virus
5%
Otros
agentes
40%
Modelo cobayo Prueba de potencia de Vacunas virales Bovinas IBR
Vacunas evaluadas por SENASA-INTA:
Periodo: 2008 to 2011
Laboratorios productores: 11
Vacunas: 81 (59 acuosas y 22 oleosas)
Prueba de Potencia en cobayos
1. Codificación de las muestras de vacunas (planilla de codificación/
planilla de vacunación y sangrado/ planilla diaria)
2. Bioterio de inoculados- SENASA- Protocolo INTA
3. Los sueros obtenidos se fraccionan en cuatro paquetes
4. ELISA y VN se realizan en INTA
5. Una vez obtenidos los resultados, se realiza la
Decodificación de las muestras
IMPORTANTE
Los laboratorios involucrados en la prueba están invitados a presenciarla.
Una vez realizada la decodificación, los laboratorios pueden retirar una contramuestra de
sus sueros.
Dra. Virginia Barros DILAB-SENASA
Técnica
Criterio de Clasificación
POTENCIA
No
safistactoria
Satisfactoria
Muy
satisfactoria
ELISA < 1.93 1.93 a 3.02 > 3.02
VN < 1.31 1.31 a 2.05 > 2.05
Criterio de clasificación del Título de Ac estimado para
IBR a partir del Modelo Cobayo INTA
Cortes 2010
VACUNAS DE REFERENCIA
IBR oleosa y acuosa
CONTROLES
DE CALIDAD
VACUNA ACUOSA VACUNA OLEOSA
Fecha elaboración
vencimiento
Jun/08 – jun/10
24 meses
Jul/08 – jul/10
24 meses
Titulo viral BoHV-1
Infeccioso,
pre-inactivación
3.16 x 10 ^7 /dosis
3.16 x 10 ^7 /dosis
Esterilidad/inactivación
(formol residual)
Negativo/ inactivado
0.18%
Negativo/ inactivado
0.17%
pH 7.4 7.5
Adyuvante Al(OH)3 Oleoso/Agua en aceite
vis 37 cp 0.01 uSi/cm
Volumen de dosis
(Total de dosis )
5 ml
(1500 dosis)
3 ml
(2500 dosis)
RESULTADOS
73% (52/81) VACUNAS APROBADAS 25 VACUNAS RECHAZADAS
Vacunas evaluadas por SENASA-INTA:
Período: 2008 to 2011
Laboratorios productores: 11
Vacunas: 81 (59 acuosas y 22 oleosas)
CV: 14% CV: 20%
2008 2009 2010 2011
2008 2009 2010 2011
ELISA VN
RESULTADOS
IBR VACUNA de Referencia ACUOSA. Control chart
(Bioterio: SENASA post-4 años de elaboración)
MEDIA
-2sd
-3sd
+2sd
+3sd
ELISA cortes: 1,93-3,02 VN cortes: 1,31-205
El modelo COBAYO INTA representa
◦ una herramienta útil para controlar la inmunogenicidad de vacunas contra IBR del mercado.
◦ Permite estudiar la estabilidad de la potencia entre lotes de vacunas y
de una misma vacuna en el tiempo.
Es un método de control más económico, más reproducible e insume menor tiempo que la prueba en bovinos. Evita el problema de contar con bovinos seronegativos en países endémicos como Argentina.
Es una prueba basada en métodos serológicos, que cumple con el
principio de las 3R (refinamiento, reducción y remplazo) de bienestar animal y que puede formar parte del principio de “consistencia” de GMP.
CONCLUSIONES
Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:
proyecto de resolución SENASA
“Regulación para las vacunas virales inactivadas no vesiculares para bovinos” .
Se realizó comentario a la consulta pública
N° 2: POTENCIA Y EFICACIA PARA VACUNAS DE PI-3. (Septiembre 2012)
(A presentar en reunion anual CAMEVET, San Pablo, Brasil - 3 al 5 de Octubre, 2012
N° 3: INOCUIDAD (Septiembre 2012)
PARAINFLUENZA 3 ROTAVIRUS
Dra Viviana Parreño
Sección de Virus Éntericos (Lab VD) Instituto de Virologa
CICV y A INTA Castelar [email protected]
Tel 4481 3006
Desarrollo y Validación Estadística
de un Modelo Cobayo para el control
de vacunas de Parainfluenza 3
Vacuna PI-3: Control de Calidad
Inmunogenicidad POTENCIA
Desempeño a campo Ensayo de Eficacia
? ?
Validación estadística de un modelo animal de laboratorio para evaluar vacunas de PI-3
◦ Estudio de la respuesta de anticuerpos frente a la vacunación en
el modelo cobayo y bovinos
◦ Análisis Estadístico en cada especie para definir categorías de calidad inmunogénica (POTENCIA) de las vacunas.
◦ Estudio de concordancia entre el modelo y la especie de destino:
Capacidad del Modelo cobayo de predecir la potencia de las vacunas de PI-3 en bovinos
1
2
3
4
0 30 60 90
A 1x108
B 5x107
C 1x107
D 1x106
E 1x105
Placebo/testigo
Ensayos Dosis Respuesta: Capacidad Discriminatoria
Vacunas Oleosas con concentraciones crecientes de PI-3
n=10 cobayos/vacuna
PI-3 IHA
a
b
a
b
c
Cobayos
Bovinos
Tiempo (días post vacunación)
PI-3: la prueba en cobayo
discriminó
significativamente entre
vacunas oleosas formuladas
con títulos de Ag de 10^5;
10^6 y títulos de 10^7 o
mayores a los 30 dpv
c
Titu
lo d
e A
c I
HA
an
ti P
I-3
Tiempo (días post vacunación)
21
1
2
3
4
0 30 60
A 1x108
B 5x107
C 1x107
D 1x106
E 1x105
Se observó una relación directamente proporcional entre la
Respuesta de Ac y la concentración de Ag en ambas especies
El patrón de respuesta fue similar en ambas especies animales
Cinética de la respuesta de Ac
Magnitud de la respuesta de Ac
CONCLUSIONES
El modelo cobayo arrojó resultados mas homogéneos
y presentó mayor capacidad discriminante que los bovinos
Ensayos Dosis Respuesta: Capacidad Discriminatoria
Vacunas Oleosas con concentraciones crecientes de PI-3
4,00 5,00 6,00 7,00 8,000,00
1,25
2,50
3,75
5,00
4,00 5,00 6,00 7,00 8,000,00
1,25
2,50
3,75
5,00
BOVINOS (60 dpv) COBAYOS (30 dpv)
Modelo lineal polinómico de 2º grado
R2 86%; p< 0,0001
Titulo de Ac IHA predicho:
-13,69 + 4,22 Ag PI-3 – 0,258 Ag PI-32
Modelo lineal polinómico de 2º grado
R2 82%; p< 0,0001
Titulo de Ac IHA predicho:
-3,139 + 1,71 Ag PI-3 – 0,1122 Ag PI-32
Tit
ulo
de
Ac
IHA
an
ti-P
I-3
(lo
g 1
0)
Estimacion de puntos de corte para clasificar vacunas de PI-3
Curva de regresión ajustada e intervalos de confianza y de predicción
Cada punto representa un promedio de 5 animales vacunados con vacuna de dosis creciente de PI-3
ESPECIE
Criterio de Clasificación VACUNAS
Concentración de Ag de PI-3/dosis
No
satisfactoria Menor de 10
6
Satisfactorias
[106- 10 7 )
Muy
satisfactorias 10 7 o mayor
COBAYO
< 1.5 1.5 a 2.4 > 2.4
BOVINO
< 2.8 2.8 a 3.1 > 3.1
Criterio de clasificación de vacunas para PI-3
Expresado como el log de las unidades inhibitorias de la hemoaglutinacion
(UIHA) anti-PI-3
Concordancia entre
El Modelo Cobayo y los Bovinos
Evaluar la capacidad de los modelos bovino y cobayo de
categorizar correctamente las vacunas Gold standard (de
formulación conocida)
Evaluar la concordancia de resultados de títulos de Ac. de
bovinos y cobayos en vacunas comerciales.
Concordancia el modelo cobayo y la especie de destino
para clasificar vacunas de Referencia (gold std) contra PI-3
Cobayo
Bovino
No satif.
(X<2.80)
satisfactoria
(X≥2.80)
No satisfactoria
(x<1.50) 19 0
Satisfactoria
(X≥1.50) 2 18
n 39 Weighted Kappa
0,898
Standard error
0,07
95% CI 0,760 to 1,000
17 vacunas dosis rta oleosas
6 vacunas experimentales de concentración conocida
(5 acuosas y 1 oleosa)
16 controles negativos (placebos y testigos)
Concordancia
casi perfecta
71 vacunas
39 GOLD STD + 32 COMERCIALES
Concordancia el modelo cobayo y la especie de destino
para clasificar vacunas COMERCIALES contra PI-3
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00
PI3IHAC30
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
PI3
IHA
B60
B
OV
INO
cobayo
Bovino (X≥2.8)
Cobayo (x≥1.5)
No satisfactoria
Satisfactoria
No satisfactoria
33 0 33 (46,5%)
Satisfactoria 8 30 38 (53,5%)
41 (57,7%)
30 (42,3%)
71
Concordancia
MUY BUENA
Concordance correlation coefficient weighted Kappa
0,7771
95% Confidence interval 0,6681 to 0,8534
Pearson ρ (precision) 0,7971
Bias correction factor Cb (accuracy)
0,9748
32 vacunas comerciales
12 vacunas no satisfactorias bov-cob
(3 no poseen PI-3 en su formulación)
12 vacunas satisfactorias bov-cob
6 discordantes: cob + bov -
ACUOSA OLEOSA
GOLD STD COMERCIAL
Tipo de Vacuna
1,00
1,75
2,50
3,25
4,00
Titu
lo d
e A
c IH
A a
nti-P
I3
ACUOSA OLEOSA
1,5
2,4
ACUOSA OLEOSA
GOLD STD COMERCIAL
Tipo de Vacuna
1,00
2,00
3,00
4,00
Titu
lo d
e A
c a
nti-P
I-3
ACUOSA OLEOSA
2,8
El modelo COBAYO INTA representa
◦ una herramienta útil para controlar la inmunogenicidad de vacunas contra PI-3 y predecir su potencia en la especie de destino.
Es un método de control más económico, más reproducible e insume menor
tiempo que la prueba en bovinos. Evita el problema de contar con bovinos seronegativos en países endémicos como
Argentina.
Evita el problema de utilizar bovinos con anticuerpos calostrales que interfieren el desarrollo de la respuesta inmune humoral
Es una prueba basada en métodos serológicos, que cumple con el principio de las
3R (refinamiento, reducción y remplazo) de bienestar animal y que puede formar parte del principio de “consistencia” de GMP.
CONCLUSIONES
Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:
Próximo tema a trabajar con el grupo ad hoc VACUNAS VIRALES: POTENCIA Y EFICACIA PARA ROTAVIRUS.
Daniela Rodriguez
Nancy Suarez Perez
Lic Laura Marangunich
Ing Maria Virgina Lopez
EQUIPO ESTADÍSTICO
Maria Marta Vena y equipo
AGRADECIMIENTOS
Virginia Barros
Hugo Murcia
Valeria Gonzalez
Thomas
Ricardo D’Aloia
Eduardo Maradei
ELISA IBR
Anti bovine IgG(H+L)
Peroxidase labeled Anti guinea pig IgG(H+L)
Peroxidase labeled
POD
ABTS/H202
KITS DIAGNOSTICOS
IBR VACUNA de Referencia OLEOSA. Control chart
(Bioterio: SENASA post-4 años de elaboración)
0,5 2 3,5 12 14 17 21 23 25 28 29 33 48 50 52
2008 2009 2010 2011
MEDIA
-2sd
-3sd
+2sd
+3sd
CV: 14%
0,5 2 3,5 12 14 17 21 23 25 28 29 33 48 50 52
2008 2009 2010 2011
CV: 17%
RESULTADOS
ELISA cortes: 1,93-3,02 VN cortes: 1,31-205