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Cinética Química y Biológica

I N G E N I E R Í A B I O Q U Í M I C A

C U R S O D E V E R A N O

CINÉTICA QUÍMICA y BIOLÓGICA

Ingeniería de ReactoresLa gran diversidad de productos de consumo directo o que sirven como materia prima para la obtención de otros productos, requieren para su uso de alguna transformación química. A través de la Termodinámica, Cinética Química y Catálisis se pretende describir si una reacción química es factible de llevarse a cabo y con qué rapidez.

En la búsqueda de favorecer la realización de la reacción, la catálisis juega un papel muy importante, permitiendo que muchas reacciones que a pesar de que la termodinámica indique que sí se pueden llevar a cabo, si no fuese por la catálisis no tendrían algún sentido práctico.

El término catálisis agrupa al conjunto de procedimientos y conocimientos que permiten que la velocidad con la que trascurre una reacción se incremente in-situ. Bajo tal condición la catálisis es una rama de la cinética química.

La cinética química se ocupa del estudio dinámico de las reacciones químicas tomando en cuenta el mecanismo en el nivel molecular de tales transformaciones. El concepto de velocidad de reacción traduce la rapidez con la que en un sistema se produce una transformación química. La reacción química global se lleva a cabo a través de etapas las cuales en su conjunto constituyen el mecanismo de reacción. La velocidad se define en términos de parámetros que pueden ser medidos durante la transformación; así, podemos definirla como la variación de la concentración de uno de los reactivos que desaparece, o de uno de los productos que aparece, en el sistema respecto del tiempo.

A partir de estas tres ramas de la ciencia es posible reproducir una transformación química en un medio altamente controlado; en nuestro caso, este medio será el recipiente que llamamos el Reactor Químico, el cual dispondrá de su medio de calentamiento o enfriamiento para que la reacción se lleve a cabo a una temperatura apropiada. En sistemas homogéneos requerirá de un sistema de agitación para tratar de controlar que la rapidez de reacción se lleve a cabo en cierto valor y en el caso de sistemas catalíticos heterogéneos el reactor estará empacado con el catalizador que haya sido previamente seleccionado.

En reactores de operación continua el tiempo de reacción estará predeterminado por el tamaño del reactor, de tal manera que una variable de diseño será el volumen de dicho reactor. En operación discontínua el tiempo de reacción es el tiempo cronometrado desde que la reacción inicia. En ambos tipos de operaciones el tiempo requerido en una reacción es determinado por la conversión requerida. Ambas variables tiempo y

Emilio Márquez Paz1

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conversión están íntimamente relacionadas y una puede ser calculada a partir de la otra; para el caso de operación contínua el tiempo se denominará tiempo de residencia.

La aplicación de la Ingeniería Bioquímica tendrá como finalidad determinar el tamaño del reactor, el sistema de transferencia de calor (si se requiere) y el sistema de agitación, a partir de los requerimientos de mercado y de la información básica obtenida del uso de la termodinámica, la cinética química, de la catálisis y en su caso de fenómenos de transporte. Las variables de operación de proceso serán: Temperatura, Presión, Composición y Flujo másico inicial o masa inicial. Las variables de diseño serán Tiempo y Conversión.

Los factores principales en que se fundamenta el diseño de reactores son: 1. Las fases implicadas. 2. El intervalo de temperaturas. 3. La presión de operación. 4. El tiempo de residencia o la velocidad espacial. 5. La corrosión. 6. La transmisión del calor. 7. El control de la temperatura. 8. La agitación para lograr la uniformidad o el control de temperatura. 9. El funcionamiento discontinuo o continuo. 10. La velocidad de producción.

Para conseguir el control adecuado de una reacción, la temperatura debe mantenerse dentro de límites moderados por el empleo de intercambiadores de calor. En los aparatos industriales no siempre es posible mantener condiciones exactamente isotérmicas, pero puede lograrse una velocidad de reacción satisfactoria por regulación del intercambio de calor, conjuntamente con el ajuste de las temperaturas y concentraciones iniciales, y el empleo de catalizadores o inhibidores. Las condiciones de intercambio dependen de la superficie de transmisión del calor, del coeficiente global de transferencia de calor.

Figura 1.- Métodos característicos de transmisión de calor.

Con los métodos 1 y 2 es evidente que no es posible mantener la temperatura absolutamente constante sino dentro de un intervalo determinado.


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UNIDAD I.

CINÉTICA QUÍMICA

1.- En la mayoría de los procesos químicos, el reactor representa el corazón de la planta. Desde un punto de vista integrado, la secuencia básica de un proceso químico considera a una etapa de reacción seguida por una etapa de separación y purificación; en algunos casos hay varias etapas de separación, además de que también podría requerirse la purificación de la alimentación. El reactor pone en contacto íntimo a los reactivos y el catalizador, de manera que se propicien las condiciones apropiadas para que se lleve(n) a cabo la(s) reacción(es) química(s). El diseño apropiado de un reactor debe permitir la agitación y mezclado de los componentes del sistema reaccionante, disipar la energía de los alrededores hacia el sistema o viceversa, ya sea que se trate de una reacción endotérmica o exotérmica, para obtener la conversión máxima.

2.- Los objetivos de la cinética química, relacionados al diseño de reactores es: Proponer un modelo cinético para una reacción química, demostrar la validez del modelo propuesto con datos obtenidos experimentalmente y determinar los valores de las constantes cinéticas. Para ilustrar el procedimiento, consideremos que la experimentación se hace en un reactor intermitente.

a. Primero se deben determinar la temperatura y presión de la reacción. Estos parámetros usualmente dependen de consideraciones termodinámicas; por ejemplo, necesitamos cierta temperatura para alcanzar la energía de activación requerida para que la reacción suceda. Consideraciones de propiedad física; por ejemplo, necesitamos cierta temperatura para reducir la viscosidad, o cierta presión para mantener a los reactivos en la fase líquida. Consideraciones del proceso global, como la temperatura y presión de la alimentación, o la temperatura y presión del sistema reaccionante a la salida. Estas consideraciones conducen a valores estimados de la temperatura y presión de la reacción.

b. Otra consideración importante, aunque no siempre es obvia, es sobre la forma en que se va a mantener la temperatura y presión constante en los experimentos, así como el tipo de unidad a escala industrial que debe ser diseñada para mantener constante estos parámetros. El calor requerido por las reacciones endotérmicas o el generado por las reacciones exotérmicas debe ser añadido al sistema reaccionante o disipado hacia un líquido de enfriamiento, usando alguna versión de intercambio de calor a través de una superficie, como enchaquetamiento, serpentines y otros, o controlando la temperatura de la alimentación al reactor. Si la reacción es endotérmica la energía térmica requerida puede ser cedida por el calor latente del vapor saturado a presiones desde 1 bar hasta 10 bar. Sin importar el método, la cantidad de calor añadido o eliminado durante la experimentación debe ser medido y registrado, debido a que estos datos podrían ser requeridos para el diseño del sistema de intercambio de calor. Como un dato importante, el acero funde a 1350°C pero a 550°C pierde el 50% de su resistencia original.

c. Elegidas la temperatura y presión del sistema reaccionante se lleva a cabo la reacción obteniendo datos de variación de concentración respecto al tiempo.



d. En la siguiente etapa se postula un mecanismo de reacción. A partir de este mecanismo se propone la etapa determinante de la velocidad de reacción global. Al mecanismo de reacción postulado le corresponde un modelo cinético, mismo que será validado por el ajuste que se obtenga de los datos experimentales. El modelo cinético es confirmado y las constantes cinéticas calculadas, usando los llamados métodos integral, vida media y diferencial.

3.- Para establecer el modelo cinético y conocer los parámetros del mismo, de manera que podamos optimizar la cantidad de productos deseados y el tiempo de reacción, es necesario conocer la cinética de la reacción, es decir, si la reacción es elemental o no elemental, simple o múltiple, reversible o irreversible, de orden constante o cambiante. La cinética también establece las dependencias de la velocidad de reacción con la concentración a través del orden de reacción y de la constante de velocidad de reacción con la temperatura.

4.- Hay diferentes ecuaciones para expresar reacciones químicas: ecuación estequiométrica, de velocidad y molecular. Una ecuación estequiométrica solo expresa el balance de materia total, sin que necesariamente establezca el mecanismo de reacción; esta ecuación es la más fácil de obtener debido a que sus coeficientes pueden ser determinados por mediciones físicas de las cantidades de reactivos consumidos y de productos formados. La ecuación de velocidad expresa la velocidad de formación o desaparición de un componente particular, en términos de concentración o de alguna medición, ya sea presión a volumen constante, volumen a presión constante, conducción eléctrica, viscosidad, coeficiente de extinción molecular, presión, desviación de la luz polarizada, etc. Hay dos constantes en esta ecuación: la constante específica de velocidad de reacción (k) y el orden de reacción (n); para cuantificar ambas constantes se debe proponer un modelo cinético y comprobarlo experimentalmente. La ecuación molecular expresa el número de moléculas de cada reactivo que interaccionan unos con otros para formar los complejos intermediarios de alta energía, en la etapa limitante de velocidad, esto es, la reacción de velocidad más lenta comparada a la velocidad de las otras reacciones que forman la reacción química global. Debido a que la ecuación molecular representa verdaderas interacciones moleculares, sus coeficientes sólo pueden ser números enteros; esta ecuación puede ser difícil de determinar, debido a que requiere el aislamiento de la etapa controlante de la velocidad de reacción.

El conocimiento del modelo de velocidad de reacción permitiría proponer la etapa controlante de la velocidad de reacción global. Si el mecanismo de reacción fuera simple, los coeficientes de la ecuación molecular serían los coeficientes estequiométricos y por lo tanto, el orden de reacción parcial. Si el mecanismo de reacción fuera complejo, el orden de reacción parcial para cada reactivo, podría corresponder al coeficiente estequiométrico de cada reactivo en la reacción cuya velocidad controla a la velocidad de la reacción global.



Los tres tipos de ecuaciones son usadas en el dimensionamiento del reactor; la ecuación estequiométrica se necesita para los balances globales de materia y energía; establece la cantidad de calor que debe disipar el sistema reaccionante. La ecuación de velocidad, junto con la molecular, se usan para determinar el tipo de reactor a ser usado. La ecuación de velocidad permite el cálculo directo del tiempo de residencia requerido y por lo tanto, el volumen del reactor.

5.- La ley de acción de masas o ley de Guldberg-Waage establece que la velocidad de reacción es directamente proporcional al producto de productos de la actividad de las especies reactivas, elevado cada término a un exponente.

(-ri) = ki .(Ci)ni

Donde: (Ci)ni = f(Ci) ki = Constante específica de velocidad de reacción

Las reacciones químicas que siguen un mecanismo de una etapa, se les llama reacciones elementales; si el mecanismo está formado por más de una etapa, se les llama reacciones no-elementales. Las reacciones no-elementales pueden ser consideradas como una serie de reacciones elementales en las que se forman intermediarios, como radicales libres, iones, complejos polares, complejos de transición o moléculas completas. Estos intermediarios pueden convertirse directamente a productos, o servir como elementos reactivos en las etapas de propagación de las reacciones en cadena. Para distinguir entre un mecanismo y otro, se debe tener la ecuación de velocidad y comparar con la ecuación estequiométrica; si el exponente de la concentración de cada especie química es igual a su respectivo coeficiente estequiométrico, tenemos una reacción elemental. Si esto no se cumple por lo menos en un término de concentración, tenemos una reacción no elemental; en este caso, probablemente la estequiometría resultante del modelo obtenido correspondería a la estequiometría de la reacción que forma una especie intermediaria y que controla la velocidad global de la reacción. Averiguar la etapa limitante de la velocidad de reacción, requiere una familiaridad con los tipos de reacciones. Por lo tanto, aún sin conocer el mecanismo de reacción, podríamos proponer modelos cinéticos para las reacciones químicas, primero suponiendo que se trata de una reacción elemental y comparando el modelo cinético con los datos experimentales; después de fallar en esta comparación y proponer otros modelos, se deberá suponer que se trata de una reacción no-elemental.

6.- El conocimiento del tipo de reacción es necesario para analizar datos experimentales, de manera que los valores numéricos de las constantes de velocidad puedan ser calculados.Primero hay que averiguar si se trata de una reacción simple o múltiple. Las reacciones múltiples pueden ser, en serie, en paralelo, o una combinación de ambas. La siguiente distinción es si la reacción es significativamente reversible o puede considerarse como



irreversible; si es irreversible solo necesitamos determinar una sola constante de velocidad (k1); si es reversible, necesitamos determinar una segunda constante de velocidad para la reacción inversa (k2). La tercera distinción es si la reacción es elemental o no-elemental.

7.- La distinción final de una reacción, es su clase. Hay dos clases muy amplias: homogéneas (en una sola fase) y las heterogéneas (fases múltiples). Este tipo de clasificación tiene impacto sobre el tipo de reactor que sería empleado en la operación comercial a escala completa.

8.- Presentación del software POLYMATH y práctica del mismo, calculando velocidades de reacción en sistemas intermitentes.

9.- Métodos analíticos para medir el progreso de la reacción experimental. Aunque el método más común es la determinación directa de la concentración de un componente dado como una función del tiempo, a menudo se infiere de otras mediciones como la presión, volumen, índice de refracción o conductividad eléctrica.

10.- Obtención de datos cinéticos. Aunque los datos termodinámicos algunas veces pueden ser obtenidos de la literatura o estimados por algunos métodos, los datos cinéticos casi siempre deben ser obtenidos experimentalmente. Los valores de concentración contra tiempo, son los datos típicos que se obtienen, y se usan para confirmar el modelo cinético de la reacción, así como cuantificar los valores de las constantes de velocidad de reacción (ki) y el orden de la reacción (ni), en la fórmula generalizada de la ecuación de velocidad:

(-ri) = ki f(Ci)donde f(Ci) = (Ci)ni

Los métodos que se usan para comprobar los modelos cinéticos son el: integral, vida media y diferencial.

11.- El método integral es el preferido particularmente cuando se trata con reacciones relativamente simples. Requiere de un número menor de datos y menos precisos. Para reacciones más complicadas, el método diferencial es mejor, debido a que no requiere del usuario la propuesta de una forma de ecuación de velocidad. Para el método integral, una vez propuesto el mecanismo de reacción, el ingeniero predice la forma de ecuación de

velocidad: (-ri) = ki f(Ci), que se arregla de la siguiente forma:

Esta ecuación se integra para dar:



f(Ci) contiene a las especies químicas de las que depende la velocidad de reacción, pero para obtener la función resultante de la integración F(Ci) o forma integrada, f(Ci) debe estar en función del reactivo limitante. Para esto es útil la tabla estequiométrica siguiente:

Especie Vi Alimentación Lo Convertido En el EquilibrioA A NAo,

CAo

PAo

XA.NAo

XA.CAo

XA.pAo

NA = NAo + XA.NAo

CA = CAo + XA.CAo

pA = pAo + XA.pAo

B B NBo

CBo

PBo

b/a.XA.NAo

b/a.XA.CAo

b/a.XA.pAo

NB = NBo + b/a.XA.NAo

CB = CBo + b/a.XA.CAo

PB = pBo + b/a.XA.pAo

P P NPo

CPo

PPo

p/a.XA.NAo

p/a.XA.CAo

p/a.XA.pAo

NP = NPo + p/a.XA.NAo CP = CPo + p/a.XA.CAo

PP = pPo + p/a.XA.pAo

Q Q NQo

CQo

PQo

q/a.XA.NAo

q/a.XA.CAo

q/a.XA.pAo

NQ = NQo + q/a.XA.NAo

CQ = CQo + q/a.XA.CAo PQ = pQo + q/a.XA.pAo

La forma integrada del modelo se usa, buscando una buena correlación con los datos experimentales, para calcular los valores de (ki) a diferentes valores de (Ci) y (t), o para trazar una gráfica de F(Ci) contra t. Si los valores de (ki) son constantes o alternantes, o produce una línea recta, el modelo se considera correcto y puede ser usado para dimensionar el reactor. Si los valores de (ki) no son constantes o alternantes, o los datos no se distribuyen linealmente, debe postularse un modelo nuevo y desarrollar una nueva ecuación de velocidad para comparar el comportamiento de los datos experimentales contra este modelo. La secuencia se repite hasta que los datos ajusten a la correlación. Para reacciones simples e irreversibles, con la participación de una especie reactiva, las formas integradas son relativamente sencillas de obtener.

12.- Las formas integradas para reacciones simples, irreversibles, orden entero y constante, y elementales están en el anexo de estas notas.

13.- Para el método diferencial no es necesario integrar la ecuación de velocidad y comparar los datos experimentales contra esta forma integrada; el ingeniero busca el ajuste de los datos experimentales directamente con la ecuación de velocidad. Con los datos experimentales de Ci vs t, se calculan o determinan por métodos numéricos, valores de (-ri) = -dCi/dt. Los valores de ki se calculan para diferentes valores de (-ri) y f(Ci) o se determinan gráficamente trazando (-ri) vs f(Ci) o log(-ri) vs log(f(Ci)).



14.- Después de que el modelo de la ecuación de velocidad se ha confirmado con datos experimentales obtenidos a temperatura constante y las constantes de velocidad de reacción se han calculado, éstas serán válidas sólo a esa temperatura. Para tener la variación de (k) con la temperatura se propone un modelo. En la mayoría de los casos, la dependencia de k con la temperatura sigue la ley de Arrhenius: k = ko EXP(-Ea/RT), de manera que el valor de k puede ser calculado a cualquier temperatura si se conoce la energía de activación (Ea) y el factor de frecuencia (ko). Si la energía de activación y el factor de frecuencia se desconocen, puede ser calculada de una gráfica de (lnk) contra (1/T); la pendiente de esa gráfica es igual a (-Ea/R). Los valores de (k) se obtienen repitiendo los experimentos a otras temperaturas.

15.- Como se mencionó en los puntos 5 y 6 de esta unidad, los modelos de ecuación de velocidad propuestos corresponden a reacciones elementales. Si aún no ha sido posible tener una ecuación de velocidad comprobada, debemos proponer modelos para reacciones no elementales. Recordemos que en las reacciones no elementales, el exponente de por lo menos una especie reactiva no es igual al coeficiente estequiométrico. Por lo tanto, para la misma ecuación estequiométrica, podemos proponer más de un modelo de ecuación de velocidad. Es importante repetir, que se trata de la misma ecuación estequiométrica, por lo que se mantienen las relaciones estequiométricas entre el consumo de reactivos y formación de productos.

16.- Las formas integradas para reacciones simples, irreversibles, orden entero o fraccionario, y no elementales están en el anexo de estas notas.

17.- Las reacciones químicas también pueden ser reversibles; es decir, los modelos de ecuación de velocidad requieren de dos constantes de velocidad. Una constante (k1) hacia la desaparición de reactivos y la otra (k2) hacia la formación de reactivos.

k1

Por ejemplo, para la reacción: A + B ↔ P + Q K2

El modelo de ecuación de velocidad, para la reacción química elemental, reversible sería:(-rA) = k1 CA CB – k2 CP CQ

El primer término representa a la velocidad de desaparición de los reactivos: (-rA) = k1 CA CB

y el segundo término representa la velocidad de formación de los reactivos: (+rA) = k2 CP CQ

Al principio de la reacción, el producto de (k2) por las concentraciones de los productos que se van formando es muy pequeño comparado con el producto de (k1) por las concentraciones de los reactivos. En la medida que avanza la reacción, la velocidad global de desaparición de A, representada por esta diferencia, se verá más afectada debido a que la velocidad de formación de A va aumentando: (-rA)global = (-rA) - (+rA)



En el equilibrio ambas velocidades se igualan y la velocidad global de desaparición de A es cero: (-rA)global = 0; (-rA)e = (+rA)e

De acuerdo a estos criterios, se puede saber si una reacción es irreversible o reversible. Una reacción es irreversible si a un tiempo suficientemente grande, la concentración del reactivo limitante se agota. Una reacción es reversible si a un tiempo suficientemente grande, la concentración del reactivo limitante alcanza un valor constante, así como los demás reactivos, si los hay, y los productos. Es decir, el reactivo limitante no es consumido en su totalidad.

18.- Los modelos de ecuación de velocidad para reacciones reversibles también pueden ser demostrados con los métodos integral y diferencial, de la misma manera como se hizo con las reacciones irreversibles. Con una modificación del modelo cinético, podemos identificar a f(Ci):

k1

A + B ↔ P + QK2

(-rA) = k1 CA CB – k2 CP CQ

(-rA) = k1 [CA CB – (k2/k1) CP CQ]Donde Ke = k1/k2 f(Ci) = [CA CB – (k2/k1) CP CQ]

19.- Las formas integradas para reacciones simples, reversibles, orden entero y elementales están en el anexo de estas notas.



EXPRESIONES CINETICAS INTEGRADAS

REACCIONES QUÍMICAS SIMPLES, IRREVERSIBLES, ELEMENTALES

REACCIÓN QUÍMICA EXPRESIÓN CINÉTICA FORMAS INTEGRADAS

k1

1) A Prods; (-rA) = k1 CA

k2

2) 2 A Prods; (-rA) = k2 CA²

k3

3) 3 A Prods; (-rA) = k3 CA³

k2

4) A + B Prods; (-rA) = k2 CA CB

Si CBO/CAO = M; CB ≠ CA

Si CBO/CAO = 1; CB/CA = 1

Si CBO » CAO; CB = CBO

donde k2’ = k2 CAO

k3

5) A + 2 B Prods; (-rA) = k3 CACB²

Si CBO/CAO = M; CB/CA ≠ 2



Si CBO/CAO = 2; CB/CA = 2


Si CAO » CBO; CA = CAO

k3

6) A + B + D Prods; (-rA) = (-rB) = (-rD) = k3 CA CB CD

Si CBO/CAO = M y CDO/CAO = N

Si CAO = CBO = CDO, entonces, CA = CB = CD

Si CDO » CBO y CBO = CAO, entonces, CD = CDO y CB = CA

Si CDO » CBO; CBO /CAO = M, entonces, CD = CDO y CB ≠ CA



REACCIONES QUIMICAS SIMPLES, IRREVERSIBLES, NO-ELEMENTALES


kn

9) n A Prods (-rA) = kn CAn

Para n ≠ 1 log(-rA) = log(kn) + n log(CA) log(t1/2) = log(A) + (1-n) logCAO

10) A + B Prods

10a) (-rA) = k3 CA² CB

Si CBO/CAO = M; CB ≠ CA

Si CBO/CAO = 1, entonces CA = CB

10b) (-rA) = k3 CA CB² Si CBO/CAO = M; CB ≠ CA

Si CBO/CAO = 1; CA = CB



REACCIONES QUIMICAS SIMPLES, IRREVERSIBLES, NO-ELEMENTALES


11) A + 2 B Prods

11a) (-rA) = k2 CA CB

Si CBO/CAO = M; CB ≠ 2CA

Si CBO/CAO = 2; CB = 2CA

11b) (-rA) = k3 CA² CB

Si CBO/CAO = M; CB ≠ 2CA

Si CBO/CAO = 2; CB = 2CA

kn

12) a A + b B Prods (-rA) = kn CAna CB

nb

Si CBO/CAO = M; M ≠ b/a entonces CB ≠ (b/a)CA

log(-rA) = log(kn) + na log(CA) + nb log(CB)

Si CBO/CAO = b/a; CB/CA = b/a (-rA) = kn’ CA

n; donde kn’ = kn (b/a)nb y n = na + nb

log(t1/2) = log(A) + (1-n) logCAO


(-rA) = kn CAna CBO

nb = kn’ CAna ; donde kn’ = kn CAO

nb

log(-rA) = log(kn’) + na log(CA)



Si CAO » CBO; CA = CAO

(-rA) = kn CAOna CB

nb = kn’’ CBnb ; donde kn’’ = kn CAO

na

REACCIONES QUÍMICAS SIMPLES, IRREVERSIBLES, NO-ELEMENTALES, CUYO ORDEN CAMBIA CON LA CONCENTRACIÓN DEL REACTIVO.


13) A Prods

donde el orden de la reacción cambia desde (m-n) cuando k2CA

n » 1, hasta m cuando k2CAn « 1

Si m = n = 1, el orden cambia desde cero hasta uno

REACCIONES QUIMICAS SIMPLES, REVERSIBLES, ELEMENTALES REACCIÓN QUÍMICA EXPRESIÓN CINÉTICA FORMAS INTEGRADAS k1

14) A P (-rA)global = k1 CA - k2 CP ; Si CPO/CAO = R k2

k1

15) A P + Q (-rA)global = k1 CA - k2 CP CQ ; Si CPO/CAO = R y CQO/CAO = S k2

donde A = R+S+RS k1

16) A 2 P (-rA)global = k1 CA - k2 CP² ; Si CPO/CAO = P k2

donde A = 4P+P²

k1

17) A + B P (-rA)global = k1 CA CB - k2 CP ; Si CBO/CAO = M y CPO/CAO = P k2



donde A = P+PM+M

REACCIONES QUIMICAS SIMPLES, REVERSIBLES, ELEMENTALES REACCIÓN QUÍMICA EXPRESIÓN CINÉTICA FORMAS INTEGRADAS

k1

18) 2 A Q (-rA)global = k1 CA² - k2 CQ ; Si CPO/CAO = P k2

donde A = 0.5+2P

k1

19) A + B P + Q (-rA)global = k1 CA CB - k2 CP CQ ; Si CBO/CAO = M, CPO/CAO = R, CQO/CAO = S

k2

donde A = M-RS; B = R+S+M+1; C = MR+MS+RS+MRS k1

20) A + B 2 P (-rA)global = k1 CA CB - k2 CP² ; Si CBO/CAO = M y CPO/CAO = P k2

donde A = P²+P²M+4PM; B = 4M-P²; C = 4P+4+4M

k1

21) 2 A P + Q (-rA)global = k1 CA² - k2 CP CQ ; Si CPO/CAO = R y CQO/CAO = S k2

donde A = 2RS+R+S; B = RS-1; C = R+S+2

k1

22) 2 A 2 P (-rA)global = k1 CA² - k2 CP² ; Si CPO/CAO = P k2

donde A = P²+2P; B = 1-P²; C = 2+2P



UNIDAD II

CATÁLISIS HETEROGÉNEA

Clasificación: De acuerdo con las condiciones en las que se llevan a cabo las reacciones es posible separar el fenómeno catalítico en tres dominios independientes.

a) Catálisis homogénea: Donde todas las especies cinéticamente activas, comprendido el catalizador, constituyen una misma fase, con una velocidad de reacción similar en todos los puntos. Se considera también en esta rama el caso en que uno de los reactivos es un gas y que los otros, con el catalizador, pertenecen a una misma fase líquida. Debido a la solubilidad del gas la transformación se produce en todo el líquido y no en la interfase gas-líquido. La naturaleza de los productos tampoco influye. En este tipo de catálisis las velocidades son generalmente elevadas, los venenos inofensivos y la posibilidad de estudio de mecanismos de reacción más fácil para poder aislar las especies intermedias.

b) Catálisis heterogénea: El catalizador es insoluble en los sistemas químicos en los cuales provoca la transformación y forma una fase distinta muy a menudo sólida. Existen dos fases y una superficie de contacto. La reacción se lleva a cabo en esta superficie de contacto y el fluido es una reserva de moléculas por transformar o que ya reaccionaron. Como la reacción química se pasa en dos dimensiones, al menos uno de los reactivos debe ser adsorbido químicamente. La catálisis heterogénea está limitada al estudio de reacciones provocadas en las moléculas por el campo de fuerza del sólido y se limita a algunos angstroms. Debe hacerse notar que la mayor parte de catalizadores sólidos son metales, óxidos, sulfuros metálicos o sales (sulfatos silicatos, fosfatos) con alta energía reticular.

c) Catálisis enzimática: Recibe su nombre del catalizador, que es una mezcla o molécula orgánica que generalmente contiene una proteína que forma un coloide liofílico. Dada la naturaleza particular del catalizador, la catálisis enzimática no pertenece clara y definitivamente al dominio de la catálisis homogénea. Está caracterizada por selectividades muy elevadas y bajas temperaturas. Se puede afirmar con base, que sin la catálisis enzimática no sería posible la vida. Es suficiente decir que el proceso base de la actividad vital, la asimilación del CO2 por la clorofila de las plantas es un proceso fotoquímico y catalítico. La transformación por las células, de albúminas, grasas carbohidratos así como la síntesis de otras moléculas son catalíticas. La formación de las cadenas de RNA, que es la base del código genético depende de la presencia de ciertas enzimas. La actividad catalítica de las enzimas es muchísimo mayor que los catalizadores inorgánicos: 1 mol de alcohol hidrogenasa transforma por segundo 720 moles de alcohol en ácido acético a 25°C mientras que a 200°C los catalizadores industriales como Pt, transforman 0.1 a 1 mol de alcohol por mol de catalizador. A 0°C la catalasa descompone 200000 moles de H202 por mol de enzima y por segundo en tanto que el inorgánico más activo, Pt, descompone a 20°C, 10 a 80 moles de H202 por mol de catalizador por segundo.

Aplicaciones Industriales

La mayoría de los procesos en catálisis utilizan catalizadores sólidos. Estos sólidos, de composición altamente compleja (en ocasiones llegan a tener 10 o más elementos en su fórmula), pueden ser sin embargo descritos en forma de tres componentes elementales: la fase activa, el soporte y el promotor.



La fase activa, como su nombre lo indica, es la directamente responsable de la actividad catalítica. Esta fase activa puede ser una sola fase química o un conjunto de ellas, sin embargo, se caracteriza porque ella sola puede llevar a cabo la reacción en las condiciones establecidas. Sin embargo, esta fase activa puede tener un costo muy elevado, como en el caso de los metales nobles (platino, paladio, rodio, etc.) o puede ser muy sensible a la temperatura (caso de los sulfuros de molibdeno y cobalto), por lo cual se requiere de un soporte para dispersarla, estabilizarla y proporcionarle buenas propiedades mecánicas.

El soporte es la matriz sobre la cual se deposita la fase activa y el que permite optimizar sus propiedades catalíticas. Este soporte puede ser poroso y por lo tanto presentar un área superficial por gramo elevada.

Esto es importante si la reacción química es suficientemente lenta; el soporte también debe tener resistencia mecánica elevada si se usan flujos muy rápidos, o tener resistencia térmica si la reacción es llevada a cabo en altas temperaturas. En algunos casos como en la reformación de gasolinas el soporte actúa también como una fase activa la cual sumada a la del platino permite el proceso completo de deshidrociclización (transformación de moléculas lineales de bajo octanaje como el hexano o el heptano en moléculas cíclicas aromáticas como el benceno o el tolueno). La forma física de este soporte también está definida por las condiciones de reacción (diseño del reactor) y puede ser en forma de esferas, palitos, anillos, mallas, hojuelas e inclusive monolitos en forma de panal. Los soportes pueden ser amorfos (SiO2, carbón), o cristalinos, como las zeolitas o la alúmina.

El promotor es aquella substancia que incorporada a la fase activa o al soporte en pequeñas proporciones, permite mejorar las características de un catalizador en cualquiera de sus funciones de actividad, selectividad o estabilidad. Se conocen dos tipos de promotores: texturales los que contribuyen a dar mayor estabilidad a la fase activa, y electrónicos, los que aumentan la actividad. Los casos más conocidos como promotores son el potasio (electrónico) y la alúmina (textural) en el catalizador de hierro para la síntesis del amoniaco.



Figura 2.- Aspecto físico de soportes para catalizadores.

Los sólidos catalíticos poseen en general fuertes campos interatómicos del tipo iónico o metálico. En general compuestos orgánicos covalentes no son catalíticos. Un requerimiento fundamental es que la estructura catalítica sea estable bajo las condiciones de reacción, por ejemplo el metal debe permanecer en estado metálico y no formar un compuesto (inactivo) con la molécula reaccionante.

Los metales que catalizan las reacciones de hidrogenación usualmente quimisorben el hidrógeno no muy fuerte y lo disocian homolíticamente. Son esencialmente metales del grupo VIII (Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, etc.) y el cobre en el grupo IV. También algunos metales catalizan oxidaciones porque quimisorben oxígeno, pero la mayoría de los metales en general no pueden ser usados como tal ya que se oxidan. Sin embargo en forma de óxido muchos metales sí son buenos catalizadores de oxidación (FeO, NiO, CuO, Cr2O3, etc). El oxígeno es más fuertemente adsorbido por los metales que el hidrógeno, de manera que se forman compuestos estables. Además los enlaces metal-oxígeno requieren energías más elevadas que los enlaces metal-hidrógeno para ser rearreglados y por lo tanto temperatura más elevadas.

Los catalizadores óxidos pueden ser clasificados en dos tipos: por estructura o por su enlace con el oxígeno. Aquellos que son de estructura iónica en los cuales los átomos de oxígeno son fácilmente transferidos, la substancia puede ser un buen catalizador de oxidación parcial; en general la movilidad de los átomos de oxígeno causa que se formen óxidos no estequiométricos, por ejemplo MoO3 y mezclas de algunos óxidos como Sb2O3 - SnO2 Bi2O3 - MoO3, y MoO3 - V2O5. Los óxidos en los cuales el oxígeno está más fuertemente unido, son estables aún en presencia de hidrógeno y pueden actuar como catalizadores de deshidrogenación en condiciones en las cuales los metales, tradicionalmente usados para estas reacciones, son fácilmente desactivados por depósitos carbonáceos, por ejemplo Cr2O3, Fe2O3.

Otro tipo de sólidos catalíticos son aquellos que pueden contener en su superficie grupos ácidos debido al gradual removimiento de agua en los tratamientos térmicos. Dentro de este grupo están incluidas las zeolitas (alumino-silícatos con estructura cristalina bien definida y con cavidades periódicas dentro de su estructura, figura 3.



La reacción química ocurre en etapas, que son, figura 4:

a) Adsorción de reactivos sobre la superficie,b) Reacción superficial,c) Desadsorción de los productos.

Figura 3.- Estructura de una zeolita (a) tipo A y (b) tipo X o Y. Figura 4.- Etapas de una reacción catalítica.

¿Qué causa que la superficie de un sólido adsorba a la molécula reaccionante, rearregle sus enlaces y desadsorba los productos de su superficie?

Todos los sólidos no son uniformes en el sentido que las propiedades físicas y químicas varían con la localización en la superficie. Aun en un metal puro los átomos en dislocaciones, esquinas y aristas son diferentes a los átomos de las caras. La heterogeneidad de las superficies catalíticas puede ser fácilmente mostrada por varios métodos como adsorción, envenenamiento, etc. Esta heterogeneidad condujo a H.S. Taylor en 1948 a proponer que la reacción catalítica sólo se lleva a cabo en algunos lugares específicos los cuales llamó sitios activos. Estos sitios pueden ser activos para una reacción pero no para otra y es difícil de identificarlos claramente en una reacción. Sin embargo, sí es posible estimar su número y se calcula que en los metales es del orden de 1015 átomos/cm2 y en los catalizadores ácidos de 1011 átomos/cm2. La aplicación industrial de un catalizador heterogéneo requiere de la optimización de las tres principales características de un catalizador: actividad, selectividad y estabilidad.

La actividad es la consecuencia directa del efecto acelerador, y se define como una velocidad de reacción en moles transformados por segundo y por gramo de catalizador. En el caso de algunos catalizadores se prefiere dar esta velocidad corregida por el área del catalizador o mejor aún normalizada por el número de átomos de catalizador que están en contacto con la reacción (turnover number). Esta última expresión de la velocidad ha sido muy útil para establecer una clasificación de las reacciones



catalíticas. Reacciones "fáciles" o insensibles a la estructura y reacciones "exigentes" o sensibles a la estructura. En el primer tipo de reacciones la velocidad depende tan sólo del número total de átomos de catalizador en contacto con el fluido, mientras que en el segundo caso depende sólo de algún tipo de átomo en particular, como por ejemplo átomos en las esquinas de los cristales de catalizador, un arreglo geométrico de átomos (dos o tres), etc.

La selectividad de un catalizador está relacionada con el efecto orientador de la reacción en una dirección preferente. Esta cualidad es debida a que el catalizador abre nuevos caminos de reacción con menor energía de activación, los cuales desembocan en una mayor cantidad del producto o en nuevos productos. Un catalizador es más selectivo mientras da mayor cantidad del producto deseado. La selectividad se puede definir como la cantidad de producto constituido en función de la velocidad total de formación de productos.

En la reacción: A → B + C

La selectividad hacia B será:

La estabilidad de un catalizador es la variable final a optimizar en su aplicación industrial y la que se relaciona directamente con la vida útil del catalizador. La vida de operación de un catalizador debe ser evaluada en función de la cantidad de productos formados, de manera que en el mínimo de tiempo debe permitir amortizar el costo del catalizador y la operación del proceso. Si bien en las condiciones de uso de los catalizadores en la actualidad casi todos éstos sobrepasan largamente este mínimo de vida útil, se requiere de una serie de prevenciones para evitar que el catalizador se desactive prematuramente.

El fenómeno de la desactivación está íntimamente ligada a la estabilidad del catalizador. Las principales causas de desactivación son:

1) Envenenamiento de la superficie catalítica por una molécula que se adsorbe fuertemente.2) Coquificación (formación de carbón) de la superficie por deshidrogenación de algunos

hidrocarburos cíclicos. 3) Reconstrucción térmica de la superficie con disminución del área activa (sinterización). 4) Pérdida de la fase activa por desgaste del catalizador.

Cuando algunos catalizadores se desactivan pueden ser regenerados para recuperar sus propiedades (totalmente o en parte). El proceso de regeneración está ligado al proceso de desactivación. Algunos catalizadores de procesos como el de desintegración catalítica se desactivan muy rápido por la formación de carbón en su superficie y deben ser continuamente regenerados. El proceso de fluidización de la desintegración catalítica



obedece a la necesidad de trasladar continuamente el catalizador del reactor al regenerador y viceversa.

Las principales características que distinguen a un catalizador son:

a) Un catalizador no puede actuar en reacciones termodinámicamente imposibles (∆Go>0). Esto literalmente significa que un catalizador no hace milagros. De la misma forma que la termodinámica establece que no puede existir la máquina de movimiento perpetuo, también delimita el campo de acción de los catalizadores.

b) Para una reacción en equilibrio,

el catalizador no modifica el valor de la constante de equilibrio Ke = k1/k2. Como consecuencia de lo anterior, un aumento de la velocidad en una dirección (k1) viene acompañado por un aumento similar en la constante de velocidad de la reacción inversa (k2). En un sentido práctico esto quiere decir que un catalizador de una reacción lo es igualmente para la reacción inversa. Esta condición se aplica igualmente al mecanismo catalítico bajo el principio de microrreversibilidad que dice que la reacción debe seguir los mismos pasos en un sentido o en el otro.

c) El catalizador puede tener uno o dos efectos sobre un sistema, un efecto acelerador o un efecto orientador. En el segundo caso, la función catalítica se observa en la variación de los valores de selectividad de un proceso cuando varias direcciones son termodinámicamente posibles. Así por ejemplo, el alcohol etílico puede descomponerse según las reacciones siguientes

I

II

La utilización de óxido de zinc como catalizador conduce casi exclusivamente a la reacción I. Si se emplea cobre como catalizador, la reacción II se produce en mayor extensión.

¡El hecho de que el catalizador abra una nueva ruta de reacción también se puede traducir en que la reacción llegue a otro lugar diferente del que deseábamos!

En general esto se corrige estudiando muchos catalizadores de los cuales escogemos el que mejor nos rinde el producto deseado.

d) El catalizador tiene una vida limitada, sin embargo, en lapsos cortos, se puede decir que permanece inalterado; esta característica es de suma importancia para estudios cinéticos.

El número de moléculas que transforma un catalizador por cada sitio catalítico (número de recambio) generalmente es muy elevado, lo cual hace que al cabo de algunas horas



el sitio catalítico haya sido usado miles de veces. En algunos procesos industriales la vida útil del catalizador puede ser de varios años para transformar una molécula de reactivo. Algunas veces esas moléculas que reaccionaron no salen de la superficie, cubriéndola y provocando una disminución del número de sitios activos.

Existen algunas sustancias que tienden a "frenar" las reacciones a través de un efecto llamado "inhibición", sin embargo, estas especies cinéticamente activas no son especies catalíticas, no se trata de un fenómeno catalítico en sí, ya que no se ponen en juego el mismo tipo de factores energéticos. Esto significa que no existe una catálisis negativa.

Un ejemplo experimental sencillo de la acción de un catalizador en fase homogénea gaseosa es el de la descomposición del éter etílico (comúnmente éter). La reacción sin catalizador a 700ºK da lugar a los siguientes productos:

C2H50C2H5 → 2CH4 + ½ C2H4 + CO

Se midió para esta reacción una energía de activación (barrera de energía para pasar de reactivos a productos) de 51.8 kcal/mol. Posteriormente bajo las mismas condiciones se introdujo iodo como catalizador, observándose que la desaparición del éter etílico fue 10000 veces más rápida, generando productos diferentes a los obtenidos en la reacción sin catalizador. La reacción con el catalizador fue:

C2H5OC2H5 → C2H6 + CH4 + CO

Con una energía de activación de 34.0 kcal/mol de manera que la presencia de iodo cambió la velocidad y la selectividad (orientación) de la reacción. El aumento en la velocidad debe relacionarse con la disminución en la barrera de energía que separa los reactivos de los productos y que bajó a 34 kcal/mol en presencia del catalizador. Como las dos reacciones se efectuaron en condiciones similares se pueden relacionar sus velocidades a partir de las ecuaciones de Arrhenius:

De donde se observa que el aumento en velocidad depende de k0 y k'0 y es exponencialmente proporcional a la diferencia en energías de activación. Si se asume que k0 y k0' son iguales, entonces el aumento que debería observarse es de 345000



veces. Este no es el caso, ya que sólo se observó un aumento de 10000 veces, por lo tanto hay un factor 34.5 menor que debe ser atribuido a la diferencia en las constantes k y k'0. De acuerdo a la teoría cinética de los gases esas constantes dependen del número de choques entre las moléculas de reactivo en el momento de la reacción; en el caso de la reacción sin catalizar es el número de choques entre moléculas de éter etílico, y en el caso de la reacción catalizada es el número de choques de las moléculas de éter etílico con el iodo.

Como la concentración de catalizador es muy baja (aproximadamente 1%) el número de choques es menor para la reacción catalizada, y por eso es que se presenta el factor 34.5 favorable a la reacción sin catalizador:

ko = 34.5 k´o

Sin embargo esta disminución en el número de choques efectivos se ve ampliamente compensada por el abatimiento en la energía de activación que al encontrarse en el término exponencial conduce a un aumento de 345000 veces en la velocidad. Así el aumento neto observado por la presencia del catalizador es de 10000 veces.

En la práctica este aumento de velocidad en presencia del catalizador es aprovechado para obtener la misma velocidad, o ligeramente superior, pero a temperaturas mucho más bajas que las utilizadas en el caso de la reacción sin catalizador. Adicionalmente, lo que resulta en ocasiones mucho más valioso, es que por acción del catalizador se obtienen productos que no pueden obtenerse de otra forma.

Hemos visto que el fenómeno catalítico heterogéneo requiere de la adsorción química en la superficie del catalizador de al menos uno de los reactivos. Dado que la reacción se lleva a cabo en la superficie del catalizador, el conocimiento de la cantidad de moléculas adsorbidas en esta superficie reviste gran importancia. Debemos recordar que el sistema catalítico heterogéneo está constituido por un fluido que es una reserva de moléculas por transformar o ya transformadas y una superficie (catalizador). La concentración de reactivo adsorbido se relaciona por lo tanto con la concentración (presión) del reactivo en la fase gas (fluido). Para encontrar esta relación supongamos un sólido al cual se le suministra una cierta cantidad de gas (por ejemplo hidrógeno). Parte del gas se adsorberá en la superficie del sólido y parte quedará en la fase gas. Cuando la adsorción se ha completado y se alcanza el equilibrio, la relación entre la concentración de gas adsorbido y la presión del gas con la que está en equilibrio a temperatura constante se denomina isoterma de adsorción.



Figura 4. Isoterma de adsorción de Langmuir.

La isoterma de adsorción tiene la forma que se muestra en la figura 4. Imaginando el fenómeno, dos magnitudes pueden ser fácilmente reconocidas: x, la cantidad adsorbida a una cierta presión P de la fase fluida, y xmax que sería la cantidad máxima que la superficie puede adsorber; definimos entonces la fracción de superficie recubierta como θ:

θ = x/xmax

Para encontrar la relación matemática entre el grado de recubrimiento θ y la presión de equilibrio del gas imaginemos una superficie que consiste en n "sitios" donde en cada "sitio" puede adsorberse una y sólo una molécula del gas. El equilibrio que habíamos considerado anteriormente es de tipo dinámico entre adsorción-desorción. El equilibrio puede representarse como:

adsorción (ka)

A + S A.S

desorción (kd)

La velocidad de adsorción viene dada por la expresión: Vads = ka [A] [S] y la velocidad de desorción por: Vdes = kd [A.S]

Donde [A] es la concentración del reactivo A y que podemos sustituir por la presión PA

al equilibrio, [S] representa la concentración de sitios vacíos y que podemos reemplazar por (1-θ), [A.S] es la concentración de sitios ocupados, la cual sustituimos por nθ. Cuando el equilibrio se alcanza, las velocidades de adsorción y desorción son iguales, por lo que obtenemos: Ka PAn(1- θ) = kdnθ

Haciendo un poco de rearreglo nos queda:



donde b = ka/kd se denomina coeficiente de adsorción de A en el sólido utilizado. Este término no es otra cosa que una constante de equilibrio cuya magnitud refleja la fuerza con que se adsorbe A, es decir, si b es muy grande, la molécula A se adsorbe fuertemente en la superficie. La relación entre el grado de recubrimiento y la presión fue derivada por Irving Langmuir y se le conoce comúnmente como la isoterma de Langmuir. El valor de b afecta a la forma de la isoterma de adsorción. Mientras más grande sea el valor de esta constante, mayor será el grado de recubrimiento a una presión de equilibrio dada. No todas las adsorciones obedecen la isoterma de Langmuir. Esto se debe a muchas razones pero la más importante es que se considera para su derivación el que todos los sitios en la superficie son energéticamente equivalentes, lo cual rara vez se encuentra en la práctica. Más aún, el calor de adsorción, en cual está cercanamente ligado a la fuerza del enlace entre la especie adsorbida y la superficie, disminuye al aumentar el grado de recubrimiento. De esta manera, otras isotermas han sido derivadas para eliminar la suposición de la equivalencia energética de los sitios.

LA CINÉTICA DE REACCIONES HETEROGÉNEAS CATALIZADAS

Cualquier reacción que tome lugar en una superficie comprende 5 pasos consecutivos, figura 5:

1) Difusión de reactivos a la superficie2) Adsorción de los reactivos3) Reacción en superficie4) Desorción de los productos5)Difusión de productos hacia la fase fluida.

Usualmente los pasos 1 y 5 son rápidos por lo tanto cualquiera de los pasos 2, 3 o 4 puede ser el paso limitante (el más lento) en cualquier reacción heterogénea. Langmuir asumió que el paso 3, la reacción en superficie es el paso lento del proceso, por lo que no es de extrañar que se utilice la isoterma de Langmuir para estimar la concentración de especies adsorbidas.



Figura 5. Pasos involucrados en una reacción de superficie.

La determinación de parámetros cinéticos en una reacción catalizada es importante desde muchos puntos de vista. Por ejemplo, la determinación de los órdenes de reacción respecto a reactivos y productos es esencial para el establecimiento del mecanismo de la reacción cuyo conocimiento es indispensable para optimizar el catalizador. Asimismo, la información concerniente a los órdenes de reacción se utiliza para el diseño de reactores, tamaño y forma del lecho catalítico, etc. Otro parámetro cinético de gran importancia, la energía de activación, nos da información acerca de cómo la temperatura afectará la velocidad de la reacción.

En la cinética de reacciones heterogéneas se asume que la reacción en superficie es el paso limitante en la mayoría de las reacciones catalíticas heterogéneas, por lo que el conocimiento de la concentración de reactivo adsorbido en la superficie es un dato indispensable para derivar cualquier expresión cinética. La isoterma de Langmuir nos provee de tal información.



UNIDAD III CINÉTICA ENZIMÁTICA

1.- La ecuación de Michaelis-Menten expresa la velocidad instantánea o velocidad inicial (-rA)i en relación a la velocidad máxima (Vmax) para cierta concentración inicial de sustrato. Esta ecuación es válida solo si (-rA) es medida a un tiempo suficientemente corto, de manera que CA permanezca esencialmente constante. Esto requiere que no más del 5% del sustrato sea utilizado en el ensayo de la actividad enzimáticaPara explicar la cinética de una reacción catalizada por enzimas, Briggs y Haldane así como Henri, Michaelis y Menten propusieron el mecanismo de reacción para las reacciones en que la enzima cataliza la transformación de un sustrato: k1 k3

E+A↔ E.A ↔ E+P k2 k4

donde la primera reacción es reversible con k1 y k2; la segunda reacción es irreversible ya que se considera que k3 es mucho mayor que k2 y k4. Si la cantidad total de enzima (CEt) está presente en cantidades catalíticas, entonces CA es mucho mayor que CEt y en un tiempo muy corto se alcanza el estado estacionario en el que CE.A permanece constante en el tiempo. Considerando estos parámetros, se deduce la conocida ecuación de Michaelis-Menten:

donde

La KM es una constante dinámica que expresa la relación entre las concentraciones reales en estado estacionario y relaciona la velocidad de una reacción catalizada por enzimas a la concentración de sustrato



2.- ¿Por qué determinar el KM? El KM establece un valor aproximado para el nivel intracelular del sustrato. Es poco probable que la concentración del sustrato sea mucho mayor o mucho menor que el KM. Si la concentración intracelular del sustrato fuera mucho menor que el KM, la velocidad de reacción sería muy sensible a los cambios en CA, pero la mayoría del potencial catalítico de la enzima se gastaría debido a que la velocidad de reacción pudiera ser mucho menor que la Vmax. No tiene sentido fisiológico en mantener CA

mucho mayor que el KM debido a que la velocidad de reacción no puede exceder la Vmax y la diferencia entre la velocidad de reacción a CA = KM y CA = 1000 KM solo es de dos veces. También, si CA es mucho mayor que el KM, la velocidad de reacción sería insensible a pequeños cambios en CA. Debido a que el KM es una constante para una enzima dada, su valor numérico proporciona un medio de comparar enzimas con orígenes diferentes (animal, vegetal, microbiano) o de diferentes tejidos o del mismo tejido en diferentes etapas de desarrollo. De esta forma podríamos determinar si una enzima E1 es idéntica a la enzima E2, o si son diferentes proteínas que catalizan la misma reacción. La velocidad máxima, Vmax, no es una constante, depende de (kcat) que sí es una constante y de la concentración de enzima en el ensayo. Un cambio en el valor efectivo de KM inducido por un ligando, es un modo de regular la actividad de una enzima; si el KM determinado in vitro resulta ser más alto que el fisiológico, entonces se podría investigar buscando la presencia de activadores que funcionen in vivo para disminuir el KM efectivo. Midiendo el efecto de diferentes compuestos sobre el KM de la enzima, podríamos identificar inhibidores fisiológicamente importantes.

Si conocemos el Km para una enzima actuando sobre un sustrato, podríamos ajustar las condiciones experimentales del ensayo de manera que la concentración del sustrato sea mucho mayor que el Km y por lo tanto determinar la velocidad máxima que en cierta manera representa una medida de la concentración total de enzima, CEt. La constante de Michaelis indica lo adecuado que un sustrato resulta para una enzima particular, comparado con otros sustratos alternos. Esto es, el sustrato con el KM más bajo tiene la afinidad aparente más alta por la enzima. El mejor sustrato es el que tiene la relación (Vmax/KM) más alta.

Para calcular los parámetros cinéticos de una reacción catalizada por enzimas, modificamos la ecuación de Michaelis-Menten, con el propósito de linealizarla obteniendo:

Ecuación de Lineweaver-Burk:

Ecuación de Hanes-Woolf:

Ecuación de Wolf-Augustinsson-Hofstee:



Ecuación de Eadie-Scatchard:

3.- Problema:Con los datos experimentales obtenidos para la reacción química catalizada por una enzima: A P calcular los parámetros cinéticos de la enzima.

Calculando las diferentes coordenadas, según la ecuación a utilizar, tenemos:



Trazando las gráficas correspondientes, tenemos:



4.- Inhibición de enzimas: Cualquier sustancia que reduce la velocidad de una reacción catalizada por enzimas, se puede considerar como un inhibidor. La inhibición de la actividad enzimática es uno de los medios de regulación de las células vivas y uno de los más importantes procedimientos diagnóstico de los enzimólogos. Los estudios de inhibición a menudo nos dan información respecto a la especificidad de una enzima, la arquitectura física y química del sitio activo y el mecanismo cinético de la reacción. En



nuestra vida diaria, los inhibidores de las enzimas pueden encontrarse disfrazados como medicamentos, antibióticos, conservadores, venenos y toxinas.

5.- Inhibición competitiva: El inhibidor competitivo es una sustancia que se une a la enzima libre aumentando el valor del KM y manteniendo constante la velocidad máxima. Por aumentar el KM, se entiende que el inhibidor se une al sitio activo de la enzima libre, de manera que el sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes, debido a la verdadera competencia por el mismo sitio activo. El inhibidor podría ser un análogo no metabolizable o derivado de un sustrato verdadero o un producto de la reacción. Para confirmar el mecanismo de inhibición debemos usar las gráficas ya descritas para calcular los parámetros cinéticos; para el inhibidor competitivo, la Vmax no cambia y los valores del KM

deben ser diferentes cuando se comparan los experimentos llevados a cabo con diferentes concentraciones de inhibidor con el experimento sin inhibidor. En las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, Woolf-Augustinsson-Hofstee y Eadie-Scatchard debemos sustituir K’M por KM, de manera que las líneas correspondientes se modifican según se vean afectadas por el K’M.

6.- Inhibición no-competitiva: Un tipo clásico de sustancia no tiene efecto sobre la unión del sustrato, por lo tanto, KM = K’M y viceversa. El sustrato y el inhibidor se unen reversiblemente al azar e independientemente a sitios diferentes, esto es, el inhibidor I se une a la enzima y al complejo E.A, el sustrato se une a la enzima y al complejo E.I; sin embargo, el complejo resultante en ambos casos, E.A.I es inactivo catalíticamente. A cualquier concentración del inhibidor, una concentración de sustrato infinitamente alta no podría desplazar al inhibidor para generar E.A, po lo tanto, se puede predecir que la velocidad máxima en ausencia de inhibidor siempre será mayor que la velocidad máxima en presencia del inhibidor. El valor del KM no varía debido a que a cualquier concentración de inhibidor no-competitivo, las formas de enzima que pueden unir al sustrato (E y E.I) tienen la misma afinidad por el sustrato. El efecto del inhibidor no-competitivo es como si hubiera menos enzima total presente. Para confirmar el mecanismo de inhibición debemos usar las gráficas ya descritas para calcular los parámetros cinéticos; para el inhibidor no-competitivo, el KM no cambia y los valores de la Vmax deben ser diferentes cuando se comparan los experimentos llevados a cabo con diferentes concentraciones de inhibidor con el experimento sin inhibidor. En las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, Woolf-Augustinsson-Hofstee y Eadie-Scatchard debemos sustituir V’max por Vmax, de manera que las líneas correspondientes se modifican según se vean afectadas por la V’max.

7.- Inhibición incompetitiva: Una sustancia que se une reversiblemente al complejo E.A produciendo un complejo inactivo E.A.I; el inhibidor I no se une al enzima E. La inhibición incompetitiva pura puede ser rara en reacciones con un sustrato y es común en reacciones multisustrato. Representa un ejemplo simple de la adición secuencial de dos ligandos enzimáticos en un orden obligado. La inhibición sería incompetitiva con respecto



a un sustrato dado si el inhibidor se une a la enzima sólo después de que el sustrato se une. A cualquier concentración de inhibidor, una concentración infinita de sustrato no podría liberar al complejo E.A.I para dar E.A; algo del complejo E.A.I improductivo siempre estará presente. Se predice que la velocidad máxima disminuye, pero a diferencia del inhibidor no-competitivo, el KM también disminuye. Para determinar el mecanismo de inhibición debemos usar las gráficas ya descritas para calcular los parámetros cinéticos; para el inhibidor incompetitivo, cambian los valores tanto de la Vmax como del KM, cuando se comparan los experimentos llevados a cabo con diferentes concentraciones de inhibidor con el experimento sin inhibidor. En las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, Woolf-Augustinsson-Hofstee y Eadie-Scatchard debemos sustituir K’M por KM y V’max

por Vmax, de manera que las líneas correspondientes se modifican según se vean afectadas por V’max y K’M.

8.- Inmovilización de Enzimas. Fundamentos, Métodos y Aplicaciones

La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la producción industrial de productos químicos, farmacéuticos, alimentos; en el tratamiento de resíduos; en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas aplicaciones.

En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, también sus aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica.

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:

1. Presentan una gran actividad catalítica;2. Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y

regioespecificidad);3. Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.

A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar.



Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

9.- Aspectos Generales sobre la inmovilización de Enzimas

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, organelas, células, etc. por su unión a un soporte.

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costos del proceso.3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la

aplicación de la enzima inmovilizada. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son:

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas

fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización.4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías: Retención física. 2) Unión química.

10.- Métodos de Inmovilización de Enzimas por Retención FísicaAtrapamiento

Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluída dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran



sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.

Inclusión en membranasDividida en dos tipos:

1) Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas inversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos.

2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor.

En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre la membrana que formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos formas:

1) Mediante el paso de una solución amortiguada de enzima a través de la membrana;2) Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.

11.- Métodos de Inmovilización de Enzimas por Unión QuímicaUnión a soportes

Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más



corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:

1. Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)

2. Soportes órganicos. Se pueden clasificar en:Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc), proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).Polímeros sintéticos: divididos en: poliolefinas (como el poliestireno), polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) y otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).

Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión covalente.AdsorciónEn la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en la adsorción, son:

1. El pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido;

2. La fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína;

3. El diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima;

4. La presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimática del derivado.

Como principales ventajas de este método destacan:

1. Su preparación sencilla,2. Su bajo costo,3. No hay cambios de especificidad enzimática,4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:

1. La optimización de las variables que controlan la adsorción,2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecánico,3. La unión al soporte es débil.

Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear resinas de intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

Unión covalente



La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y los ácidos aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Este método presenta las siguientes ventajas:

1. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;2. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho

fluidizado o tanque agitado.4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de los disolventes

orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de inconvenientes:

1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.

3. La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.

Reticulado

También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre



una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional.

Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos.

12.- Efectos de la Inmovilización

A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno.

Efectos en la estabilidadGeneralmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones:

1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unión a soportes. La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima.

2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.

3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio.

4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de



oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona que en el medio de reacción. En otros casos el soporte tiene un efecto amortiguador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “acuofilia” del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación activa.

Efectos en la actividad enzimáticaTras la inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que:

1. La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está impedido,

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima,

3. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva,

4. Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la enzima.

Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberán principalmente a efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.

1. Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno. Resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el

sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración de sustrato es menor que en el resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de concentración a través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (KM’);

Resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada. Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales, como por ejemplo: disminuir el tamaño del biocatalizador, aumentar la concentración de sustrato, incrementar la agitación o el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de KM’ disminuye.

2. Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de KM’ aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolución. Hornby y cols. desarrollaron una expresión matemática que permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los factores de difusión como los electrostáticos. La expresión de Michaelis-Menten en este caso es:



+

Término de Término Difusión electrostático

Donde:X = Espesor de la capa de Nernst; D = Coeficiente de difusión; T = Temperatura (ºK); Z = Valencia del sustrato; F = Constante de Faraday; R = Constante universal de los gases y V = Gradiente de potencial en el soporte.

Se puede disminuir el valor de KM’, variando tanto el término de difusión como el término electrostático. En el primer caso, la disminución del valor de KM’ se consigue al disminir el tamaño del soporte (con lo que disminuye el término “x”) o al aumentar el flujo o la agitación. En el término electrostático, si “z” y “V” tienen el mismo signo, es decir si el soporte y el sustrato tienen la misma carga, el término electrostático es menor de 1 y KM’ aumenta. Si tienen cargas opuestas, la KM’ disminuye. Si no poseen carga, KM’ sólo dependerá del término de difusión.

3. Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser válido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drásticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes sólidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeños, muestran una actividad muy baja hacia proteínas, polisacáridos y ácidos nucléicos. Este “efecto estérico” se puede evitar mediante una inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más largo.

4. Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente por ejemplo, CM-sephadex, tendrá en su microentorno una concentración mayor de hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente por ejemplo, DEAE-sephadex.

13.- Elección del Método de Inmovilización

Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización (Tabla 1) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tomar en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.



Tabla 1. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización

MÉTODO INCLUSIÓN DE MEMBRANAS

ATRAPAMIENTO RETICULADO ADSORCIÓN UNIÓN COVALENTE

Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla DifícilFuerza de unión Débil Media Débil-Media Media Fuerte

Actividad enzimática

Media-Alta Baja Baja Media Alta

Regeneración del soporte

Posible Imposible Imposible Posible Difícil

Costo del proceso

Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto

Validez General General Limitada General LimitadaResistencia microbiana

Sí Sí Sí No No

Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor costo proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones establecida por el Working Party on Immobilized Biocatalysts (Guidelines for the characterization of immobilized biocatalysts. Enzyme Microb Technol 5: 304-307, 1983).

Caracterización de un Derivado Inmovilizado Descripción general

1. Esquema de reacción2. Enzimas a insolubilizar3. Tipo de soporte empleado4. Método de inmovilización

Preparación

1. Condiciones de reacción2. Rendimiento en peso seco3. Actividad residual del sobrenadante

Caracterización fisico-química

1. Configuración del biocatalizador2. Grado de hinchamiento3. Grado de compresibilidad en columna4. Abrasión en sistemas de agitación5. Velocidad mínima de fluidización

Cinética



1. Estabilidad de la enzima almacenada2. Estabilidad operacional3. Posibilidad de reutilización4. Grado de conversión5. Limitaciones difusionales

14.- Aplicaciones de la Enzimas InmovilizadasLas aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:

1. Aplicaciones analíticas: biosensores.2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas.3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento

de residuos.

BiosensoresLos biosensores son una herramienta imprescindible tanto en medicina (los niveles séricos de glucosa, lactato y ácido úrico se pueden detectar mediante electrodos enzimáticos disponibles comercialmente; la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse) como en el control de calidad de los alimentos (grado de contaminación microbiana, o cuantificar el azúcar presente en bebidas) y en el control medioambiental (detectar la presencia de residuos tóxicos, pesticidas, herbicidas como contaminantes en el agua). En principio, se puede diseñar un biosensor para cualquier tipo de compuesto que sea capaz de interaccionar específicamente con un sistema biológico. El biosensor contiene una molécula biológica inmovilizada (enzimas, células, anticuerpos) próxima a un traductor que, en contacto con el analito, transformará la señal química producida en una señal eléctrica o de otro tipo (óptica, calorimétrica, acústica, etc.

Los métodos de inmovilización más utilizados en el diseño de biosensores son la inclusión en membranas semipermeables y la unión covalente a membranas. En ambos casos, las enzimas inmovilizadas van adheridas a la superficie sensible del electrodo.

Aplicaciones en la Industria Farmacéutica

La Industria Farmacéutica trabaja con moléculas lábiles, y en muchos casos con moléculas quirales. El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a la síntesis química en pasos clave, donde no conviene trabajar a temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato. Las enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con una estructura tridimensional asimétrica definida que permiten la obtención de productos de gran pureza óptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las reglamentaciones exigen la síntesis de compuestos ópticamente puros, ya sean fármacos, hormonas o antibióticos.



Obtención de antibióticos ß-lactámicos

Los antibióticos ß-lactámicos semisintéticos, se sintetizan a partir del ácido 6-amino penicilánico (6-APA) y del ácido 7-amino cefalosporánico (7-ACA) o el ácido 7-amino desacetoxi-cefalosporánico (7-ADCA). El 6-APA, precursor de las penicilinas semisintéticas (amoxicilina, ampicilina, etc.), se obtiene industrialmente mediante la hidrólisis de la penicilina G catalizada por las penicilina G acilasas inmovilizadas de E. coli o Bacillus megaterium. Se calcula que la producción anual mundial de 6-APA mediante este método fue de 7500 toneladas en 1992.

Obtención de fármacos ópticamente puros

La actividad biológica, la toxicidad, la distribución y el metabolismo de un fármaco dependen en gran medida de su estereoquímica. En algunos casos, un enantiómero presenta actividad mientras que el otro no tiene efecto farmacológico; uno es tóxico frente al otro que demuestra ser seguro y activo; e incluso hay casos en los que uno es agonista frente al otro que se comporta como antagonista. A pesar de todo, la mayoría de estos fármacos se han vendido como mezclas racémicas hasta hace poco al no existir una normativa clara al respecto, ni métodos económicos para realizar la separación de enantiómeros. La Industria Farmacéutica ha empezado a superar este último problema introduciendo métodos enzimáticos en la obtención de fármacos ópticamente puros. Un ejemplo es el empleo de lipasas microbianas inmovilizadas en la obtención de antiinflamatorios no esteroídicos. El isómero S de estos ácidos (ibuprofeno, naproxeno o ketoprofeno) es el que posee actividad terapéutica.

Aplicaciones en la Industria Alimentaria

Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparación y la conservación de los alimentos. Normalmente, las enzimas solubles añadidas son inactivadas por calentamiento una vez que el tratamiento ha concluido. En ocasiones se permite que continúe su actividad para que los alimentos desarrollen el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La inmovilización permite que las enzimas puedan ser reutilizadas repetidamente en operaciones contínuas o discontínuas. De todas maneras, existen limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos económicos y sanitarios inherentes al procesado de alimentos

En la hidrólisis de proteínas Las enzimas proteolíticas se emplean en la modificación del contenido proteico de los

alimentos. De esta forma se han conseguido hidrolizados de proteínas de trigo mediante el uso de pepsina y proteasa coinmovilizadas en quitosana. Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en la disminución del contenido de lactoglobulina en la leche, en la industria quesera y en la solubilización de concentrados proteínicos de pescado.

En la hidrólisis de hidratos de carbono

La presencia de lactosa en la leche (4.3-4.5%) y en algunos derivados lácteos es perjudicial para aquellas personas que carecen de lactasa intestinal, y su ingesta provoca diarreas y diversos trastornos intestinales. La eliminación de este azúcar se puede conseguir tratando la leche con ß-galactosidasa de levaduras inmovilizada en fibras de acetato de celulosa y



es de gran importancia en la preparación de productos lácteos dietéticos. Su eliminación también es interesante en la preparación de helados, ya que la lactosa tiende a cristalizar a temperaturas bajas.

El proceso de degradación del almidón, procedente de diversas fuentes vegetales como el maíz, se realiza mediante la utilización de amilasa, glucoamilasa y glucoisomerasa inmovilizadas. De esta manera, se consigue un jarabe enriquecido en fructosa, que sirve de edulcorante en bebidas refrescantes como la CocaCola o PepsiCola.

La pectinasa se emplea para hidrolizar la pectina, componente estructural de frutas y verduras. Esto permite la obtención de un jugo menos viscoso y más concentrado. La pectinasa se emplea inmovilizada sobre diferentes soportes (PVC, poliéteres, poliacrilamidas, alúmina, etc.).

Las lipasas inmovilizadas de diversos microorganismos se han empleado en la interesterificación de aceites y grasas. Este método permite transformar el aceite de palma en un sucedáneo de la manteca de coco, componente principal del chocolate. El chocolate contiene aproximadamente un 30% de manteca de coco, por lo que este proceso es potencialmente muy interesante en la industria. Mediante el empleo de la lipasa inmovilizada adecuada, se puede sustituir el ácido palmítico de las posiciones 1 y 3 del aceite de palma por ácido esteárico.

Aplicaciones en la Industria Química

Un ejemplo lo protagoniza la obtención industrial de acrilamida, compuesto ampliamente utilizado en la preparación de diferentes polímeros, aditivos y en el tratamiento del petróleo. Para ello se emplean células de R. rhodochrous inmovilizadas en un gel de poliacrilamida. Este microorganismo es rico en nitrilo hidratasa, una enzima que es capaz de convertir el acrilonitrilo en acrilamida.

La obtención de productos de alto valor añadido es también un campo importante para la síntesis catalizada por enzimas inmovilizadas. Como ejemplos podríamos citar la síntesis de péptidos, fragancias e insecticidas.

Tratamientos de aguas residuales

Recientemente, se ha desarrollado un método para la reducción de nitratos a nitritos en aguas residuales que emplea enzimas inmovilizadas. El benceno es otro compuesto muy tóxico que puede ser degradado mediante células de Pseudomonas putida atrapadas en geles de poliacrilamida.

Lecturas recomendadas:

Wingard, L.B. (1972) Enzyme Engineering, Interscience Publishers, New York. Taylor, R.F. (1991) Protein Immobilization: fundamentals and applications, Marcel Dekker, New York.

Klibanov, A.M. (1983) Immobilized enzymes and cells as practical catalysts. Science 219: 722-727. Goldstein, L. (1976) Kinetic behaviour of immobilized enzyme systems. Methods Enzymol. 44: 397-443.

Working Party on Immobilized Biocatalysts (1983) Guidelines for the characterization of immobilized biocatalysts. Enzyme Microb. Technol. 5: 304-307.

Margolin, A.L. (1993) Enzymes in the synthesis of chiral drugs. Enzyme Microb. Technol. 15: 266-280. Honda, Y.; Kako, M.; Abiko, K.; Sogo, Y. (1993) Industrial Application of immobilized enzymes, Tanaka, A. et al.

eds. Marcel Dekker, pág. 209-234.



UNIDAD IVCINÉTICA MICROBIANA

1.- Sistemas de Cultivo y Aspectos Generales de Biorreactores

El equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentador. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua.

Sistemas de cultivoPara un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor (ver Fig. 15).

Velocidad de = velocidad de - velocidad + velocidad - velocidadAcumulación ingreso de salida de formación de consumo

(1)donde V es el volumen de cultivo, F1 es caudal de alimentación, F2 el de salida, Ci1 la concentración del componente "i" en la alimentación y Ci la concentración en el caudal de salida, la que, si el cultivo esta bien mezclado, se puede asumir idéntica a la que hay dentro del biorreactor. Los restantes términos, (+rfi) y (-rci) se refieren a la velocidad de formación y consumo del componente "i" respectivamente.



Por otra parte el volumen de cultivo variará en el tiempo según sean F1 y F2 .Suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales resulta:

(2)Ahora bien, dependiendo de como sean F1 y F2 surgen, básicamente, tres sistemas de cultivo:

1. Cultivo continuoAmbos caudales son iguales y por la ec. (2) V es constante, por lo tanto la ec. (1) se reduce a:

…(3)

2. Batch alimentadoEl caudal de salida, F2 , es nulo, por lo que V aumentará en el tiempo en función del caudal de entrada.

(4)

y en el balance de materia se anula el término F2 Ci resultando:

(5)Debe destacarse que en este caso V permanece dentro del operador diferencial pues varia con el tiempo según la ec. (4). Por tal motivo el batch alimentado, a diferencia del caso anterior, tiene duración limitada en el tiempo ya que el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que posee el biorreactor.

3. Batch



Ambos caudales son nulos por lo que V es constante y en la ec. (1) se anulan los términos F1 Ci1 y F2 Ci

(6)La duración del cultivo batch es, por supuesto, también limitada en el tiempo y depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch.Analizaremos ahora con más detalle cada uno de los sistemas vistos aplicando en particular los balances de materia a la biomasa X, al producto P, y al sustrato limitante de crecimiento S. Para los dos primeros sólo es necesario considerar la cinética de formación (+rX) y (+rp) respectivamente, con lo cual rci = 0 en ambos casos. Para el sustrato se tiene el caso inverso y sólo deberá considerarse la velocidad de consumo (-rs). Si por las características del proceso, la lisis celular o la descomposición del producto son importantes, deberá incluirse en el balance un término adicional que contemple este aspecto.

2.- Cultivo continuoPara poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F y por un rebalse se mantiene el volumen constante. El caudal de salida contendrá células, medio de cultivo parcialmente agotado y, eventualmente, algún producto. Si alimentamos con medio fresco significa que X1 = 0 y P1 = 0, por lo que sólo deberemos considerar la concentración de sustrato limitante del crecimiento S1, en la alimentación. En base a estas consideraciones los balances de materia para X, S y P serán (ver ec. (3)):

(7)

(8)

(9)En estado estacionario las concentraciones dentro del biorreactor permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero las ecs. (7), (8) y (9). De la primera, y teniendo en cuenta que (+rX) = µx, resulta:

(10)donde D es la velocidad de dilución. Si se reemplaza µ por la ec. (19) del capítulo 5 resulta que la concentración de S en estado estacionario es:

(11)



donde S representa la concentración en estado estacionario. De la ec. (8) surge:

(12)Por la ec. (26) del capítulo 5:

además µ = D, por lo tanto la concentración de biomasa en estado estacionario es:

(13)Si en particular S es la fuente de carbono y energía, (-rs) vendrá dado por la ec. (29) del capítulo 5 y X será:

(14)Cuando ms = 0, la ecuación (14) se reduce a la ec. (13).La Fig. 16 muestra como varían la concentración de sustrato en estado estacionario en función de la velocidad de dilución. La curva superior corresponde a la ec. (13) y la inferior a la ec. (14), pudiéndose observar en este último caso que el efecto del mantenimiento celular se hace notable a bajas velocidades de dilución. En ambos casos puede apreciarse que existe un valor de D por encima del cual X = 0, con lo que, por la ec. (13) o (14) S = S1. Si se reemplaza este valor en la ec. (11) se obtiene la velocidad de dilución crítica Dc .

(15)

Si como ocurre normalmente S1 » Ks se tiene que Dc = µm, lo cual es un criterio muy útil en el momento de seleccionar un valor de D apropiado, ya que deberá cumplirse que D < µm. En caso contrario ocurrirá el "lavado" del cultivo, debido a que la velocidad de salida de las



células del biorreactor será mayor que la de crecimiento. Debe tenerse en cuenta que la Fig. 16 se representa en caso que S1 está dado por la ecuación de Monod, pero si en el medio del cultivo hay sustancias inhibidoras del crecimiento, o son formados por los microorganismos, o el sustrato limitante es el inhibidor, deberán emplearse las expresiones de µ correspondientes.

Formación de producto:En estado estacionario, la ecuación (9) se reduce a:

(16)o bien

(17)donde P representa la concentración de producto en estado estacionario. Dependiendo de como sea la cinética de formación del producto será la forma de la curva P vs. D.

Alternativamente puede emplearse, y de hecho se emplea, el cultivo continuo para elucidar qué tipo de relación existe entre qp y µ, ya que es uno de los factores a tener en cuenta para planear la estrategia de producción.

Determinación de los parámetros de crecimiento: El cultivo contínuo es sumamente útil para determinar parámetros de crecimiento tales como Ks , µm o Y'x/s . Así reordenando la ec. (11) se obtiene:

(18)Graficando 1/D en función de 1/S, los puntos deberán ajustarse a una recta cuya intersección con el eje 1/D dará el valor de 1/µm y la pendiente Ks/ µm; si es que el cultivo puede ser representado por una cinética como la de Monod.

Por otra parte reordenando la ec. (14) resulta:

(19)de donde la gráfica de D (S1-S) /X en función de D permitirá estimar 1/Y'x/s y ms.Obviamente en este caso el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía.

3.- Batch. alimentado



Para iniciar un batch alimentado valen las mismas consideraciones que se hicieron para iniciar un cultivo contínuo, salvo que en este caso supondremos que se inicia la alimentación del cultivo cuando el sustrato limitante se ha agotado.

Si bien éste no es un requisito indispensable, permite simplificar el tratamiento matemático y además es un buen punto de partida con respecto al objetivo del batch alimentado, es decir: controlar la velocidad de crecimiento mediante la velocidad de alimentación. También supondremos que alimentamos con medio de cultivo fresco, es decir que X1 = 0 y P1 = 0. Luego los balances de materia para X, S y P serán (ec. (5)):

(20)

(21)

(22)

A fin de no extender innecesariamente el tratamiento matemático discutiremos solamente la formación de biomasa y el consumo de sustrato. De todos modos, si (+rp) es conocida, el procedimiento no varía mayormente.

Si en la ec. (21) se reemplaza (-rs) por (+rx)/Yx/s y se tiene en cuenta la ec. (20) resulta:

(23)Si deseamos que la velocidad de crecimiento esté controlada por la de alimentación, ésta deberá ser tal que en todo momento sea S = 0 y por lo tanto d(SV)/dt = 0. Esto equivale a decir que el sustrato es consumido totalmente en cuanto ingresa al biorreactor. Luego:

(24)e integrando

(25)donde Xo y Vo representan la concentración de biomasa y el volumen de cultivo en el momento de iniciar la alimentación. La variación de V con el tiempo se obtiene integrando la ec. (4).

(26)El criterio para diseñar una alimentación adecuada se obtiene combinando las ecs. (20) y (24), de donde a t = 0, resulta:



(27)La ec. (27) se puede emplear para cualquier valor de µ hasta µm, por lo tanto la ec.(27) puede reescribirse como:

(28)Como criterio adicional conviene seleccionar el valor de S1 tan alto como sea posible y F relativamente pequeño a fin de evitar la excesiva dilución del cultivo.

La contrapartida es que la duración del batch alimentado puede prolongarse excesivamente, por lo que normalmente se trata de encontrar la solución de compromiso, donde intervienen además, aspectos económicos.

El valor de µ durante el batch varía permanentemente, ya que por la ec. (20) es:

(29)Sustituyendo las ecs. (24) y (25) en la ec. (29) resulta:

(30)Por tanto µ disminuye con el tiempo. Esto es válido solamente para el caso tratado aquí, es decir con F y S1 constantes, pero nada impide hacer alimentaciones con F = F(t) o S1 = S1 (t), con lo cual puede lograrse, por ejemplo, que µ se mantenga constante o bien que aumente hasta valores cercanos a µm. La diversidad de alimentaciones posibles que pueden emplearse es, quizás, una de las características más apreciables del batch alimentado. La otra es que este sistema de cultivo es muy apropiado para obtener altas concentraciones de biomasa, muy superiores a las que se podrían obtener en un batch, donde la limitación está dada por la concentración inicial de nutrientes del medio de cultivo que pueden tolerar los microorganismos.

Si se considera el mantenimiento celular, el valor de (-rs) para la fuente de carbono y energía vendrá dado por la ecuación (29) del capítulo 5, y mediante un proceso similar al descrito resulta:

(31)Resolviendo la ecuación diferencial se obtiene:

(32)



También se demuestra que en este caso el criterio para calcular la alimentación está dado por:

(33)

En la Figura 17 se representa la ec. (32) para distintos valores de ms, y la ec. (25) que corresponde al caso en que ms = 0. Se observa claramente que cuanto mayor es ms

menor es la cantidad de biomasa obtenida, además las curvas con ms distinto de 0 tienden asintóticamente a un valor máximo que está dado por:

(34)Este valor se obtiene directamente de la ec. (31) haciendo d(XV)/dt = 0. En estas condiciones la totalidad de la fuente de carbono y energía que ingresa al biorreactor se utiliza para mantenimiento celular y por lo tanto ya no es posible aumentar la cantidad de biomasa. Alternativamente, si el cultivo se realiza con el objeto de obtener un producto perteneciente al grupo I (asociado al metabolismo energético), convendrá trabajar siempre en las condiciones indicadas, ya que toda la fuente de carbono suministrada se transformará en el producto deseado.

4.- BatchAplicando la ec. (6) a la biomasa, al producto y al sustrato resulta:

(35)



(36)

(37)Suponiendo que no se forma producto y que la relación entre µ y S puede ser representada por la ecuación de Monod surge que:

(38)

(39)El sistema formado por las ecs. (38) y (39) posee solución analítica, pero en ésta no aparece X en forma explícita por lo que resulta de escasa utilidad.En cambio es posible analizar casos particulares haciendo algunas suposiciones.Por ejemplo se puede asumir que durante una buena parte del tiempo se cumplirá que S » Ks, por lo tanto las ecs. (38) y (39) se reducen a:

(40)

(41)Por tanto bajo las condiciones indicadas el crecimiento se llevará a cabo con el máximo valor de S posible. Integrando la ec. (40) con la condición a t = 0, X = Xo, se llega a la expresión:

(42)o bien:

(43)La ec. (42) establece que para S » Ks el crecimiento es exponencial (fase exponencial), y por la ec. (43) es posible calcular el valor de µm graficando el lnX en función del tiempo.

La variación de S con t se obtiene introduciendo la ecuación (42) en la ecuación (41) e integrando con la condición de que a t = 0, S = So:

(44)



A medida que el cultivo transcurre, S disminuye hasta que se llega a la condición en que S es comparable a Ks y por lo tanto dX/dt comienza a disminuir (fase de desaceleración) hasta hacerse finalmente nula cuando S = 0. En este punto se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el batch (fase estacionaria).

La concentración final de biomasa, Xf, se puede calcular si se conoce el Yx/s

(45)puesto que Sf = 0 resulta: Xf = X0 + Yx/s So (46)Alternativamente se pueden emplear las ecs. (45) o (46) para calcula el Yx/s.

En la Fig. 18 se representan las distintas fases de crecimiento hasta aquí descritas, que surgen de suponer válida a la ecuación de Monod. Sin embargo antes de la fase exponencial suele existir otra fase (I) conocida como fase de retardo, durante la cual la concentración de biomasa no se modifica substancialmente, pero ocurren profundos cambios en la composición macromolecular y en el "estado fisiológico" de las células, ambos tendientes a adaptarlas al nuevo entorno. Si se considera esta fase, debe aplicarse una corrección ala ec. (43), lo que esencialmente consiste en restarle al tiempo real el tiempo transcurrido hasta que efectivamente comienza el crecimiento

(47)donde t,. da cuenta de la duración de la fase de retardo.

Normalmente esta fase no es deseable ya que significa una pérdida de tiempo, por lo que usualmente se trata de minimizarla. Una forma de lograrlo consiste en hacer crecer el inóculo en un medio de cultivo igual al que se va a emplear posteriormente, y además transferirlo cuando las células se encuentran en plena fase exponencial.

Por otra parte después de la fase estacionaria sobreviene la fase de declinación (V) que consiste en una disminución de la concentración de biomasa debida a la lisis celular. Esta fase puede representarse considerando una cinética adicional en el balance de materia, aspecto que ya fue discutido.



El cultivo tipo "batch", si bien es quizás el más difundido, es el que menos posibilidades de control ofrece. Una vez sembrado el medio de cultivo y fijada la temperatura, las células quedan "libradas a su propia suerte" o, dicho de otro modo, a su propia potencialidad, que se manifiesta creciendo a la máxima velocidad que le permite el medio de cultivo empleado, siendo el operador un mero espectador de los acontecimientos. En este aspecto tanto el cultivo continuo como el "batch" alimentado superan ampliamente al "batch".

5.- BiorreactoresEl biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos.

Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:

a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.

b) Mantener constante y homogénea la temperatura.c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el

sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado.



Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté provisto de un sistema de agitación, además para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo. Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y el "air lift". En el primero de ellos (Figura 19) la agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor.

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el 02 hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor generado, por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilización. El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0.45 micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas.



En los reactores de tipo "air lift" (Figura 20) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación. Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado.

6.- Transferencia de oxígenoLa velocidad de transferencia de oxígeno, OTR o RO2, desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación:

(48)donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, C es la concentración de oxígeno disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de oxígeno disuelto que. estaría en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. El KLa depende del diseño del biorreactor, de las condiciones de operación (caudal de aire, agitación) y de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor KLa. El KLa es una medida de la capacidad que posee un biorreactor para suministrar O2 y el rango de valores usuales está comprendido entre 50 h-1 y 1000h-1.Es útil en este punto retomar el ejemplo visto al final del capítulo 5 y calcular el KLa necesario para que la velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto



significa que R02 deberá ser igual a 1526 mg L-1 h-1. Asumiendo que C* = 7.8 mg L-1 y C = 0.5 mg L -1 , resulta

Por tanto valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurarán, para el ejemplo visto, que el cultivo no está limitado por oxígeno. Cuando la velocidad de consumo del oxígeno varía con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo "batch", el cálculo de KLa necesario se realiza empleando el máximo valor de RO2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de 02 durante todo el cultivo.

Con estos conceptos finaliza el tratamiento de los aspectos fundamentales de los procesos de fermentación. Resta tratar las aplicaciones de la Microbiología Industrial y las posibilidades que pueden presentarse en el futuro. Como ejemplo de esas aplicaciones se pueden mencionar a los procesos correspondientes a la producción de levadura de panificación, penicilina y otro correspondiente al tratamiento de efluentes. La producción de levadura es un proceso clásico de las primeras etapas del desarrollo de la Microbiología Industrial, mientras que el de penicilina representa un cambio fundamental en la evolución de nuestra disciplina, a partir de 1945. En ambos procesos se demuestra la integración de varios de los aspectos básicos tratados con anterioridad.Finalmente la elección del tema de tratamiento de efluentes industriales responde a la trascendencia cada vez más importante que tiene el problema de la contaminación ambiental y a las soluciones que ofrece la Microbiología Industrial para encararlo.

Lecturas recomendadas: Principles of microbe and cell cultivation. S.J.Pirt. Blackwel l Scientific Publications (1975) Fermentation kinetics and modelling. C.G.Sinclair and B. Kristiansen. Ed. J.D. Bu'Lock. Open University Press

(1987). Biochemical Engineering Fundamentals. J.E. Bailey and D.F. Ollis. Mc Graw-Hill Book Company (1986). Biochemical Engineering. S. Aiba, A.E. Humprey and N.F. Millis. Academic Press,1973.


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