validación secundaria metodos normalizados cualitativos

PROCEDIMIENTO DE VALIDACIÓN

SECUNDARIA DE MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS NORMALIZADOS

CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09

Departamento o Unidad PRT- 712.00-XX

Página 1 de 11

1. OBJETIVO

Producir evidencia que el laboratorio es capaz de cumplir con las especificaciones técnicas

originales del método.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Se aplica en la validación secundara de métodos de ensayo microbiológicos normalizados

destinados a ensayos de presencia/ausencia.

3. FUNDAMENTO

El procedimiento para la validación de métodos microbiológicos normalizados es un

procedimiento que permite estimar el desempeño de los métodos escogidos para uso rutinario, a

través de la confirmación de una o más características de desempeño, en las condiciones de uso

del laboratorio.

Los criterios de elección de las características a evaluar para métodos cualitativos incluye:

Límite de Detección, Inclusividad, Exclusividad.

4. REFERENCIAS

4.1 “Curso-Taller sobre Validación de Métodos Microbiológicos”, Santiago de Chile, ISP,

24/9-5/10 2007.

Elaborado por Revisado por Aprobado por

TM. Lic. Fabiola Rojas C. TM. Lic. Mariana Fernández C. BQ. Viviana Cachica C.

Encargada Laboratorio Recuentos Encargada Calidad Depto. Jefe Sección Microbiología




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 2 de 11

5. TERMINOLOGÍA

Analito: es el microorganismo que se desea detectar o cuantificar.

Blanco: es el alimento a ser usado como matriz, en el cual no fue detectado el analito cuando fue

analizado por el método de referencia usado en el laboratorio, en diversas repeticiones.

Exactitud relativa: es la aproximación del acuerdo entre un resultado de prueba y el valor de

referencia aceptado. Para el propósito de este protocolo, el valor de referencia aceptado es

seleccionado como el valor obtenido por el método de referencia. Por tanto la expresión

“relativo” implica que el método de referencia no garantiza automáticamente el valor de

referencia aceptado. Cuando es aplicado a un grupo de resultados de la prueba, involucra una

combinación de componentes aleatorios y un error sistemático común o componente de los

sesgos.

Factor de overdispersión (u): Es la incertidumbre aleatoria debido a la naturaleza de los

métodos microbiológicos cuyos datos se presentan como una distribución diferente de la

distribución normal de Poisson y es medida en los términos de desviación estándar relativa.

Exclusividad: permite conocer el desempeño selectivo del método en relación a las cepas

interferentes normalmente presentes en el alimento.

Inclusividad: es la habilidad de un método de ensayo de detectar el analito de una gran variedad

de cepas del mismo grupo.

Limite de cuantificación para métodos cuantitativos: es la menor cantidad del analito que

puede ser medido y cuantificado con precisión y exactitud aceptables en condiciones

experimentales definidas para el método en validación.

Linealidad para métodos cuantitativos: es la habilidad de un método que, cuando es usado

con una determinada matriz, ofrece resultados que corresponden a una proporción de la cantidad

del analito presente en la muestra.Un aumento del analito en la muestra corresponderá a un

aumento lineal o proporcional en el resultado.

Límite de detección: es la menor concentración de un analito en una muestra, la cual puede ser

detectada con un nivel de confianza especificado en las condiciones definidas para el método.

Matrices: son los alimentos de cada categoría seleccionada, utilizados como base para los análisis en el procedimiento de validación.




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 3 de 11

Método Normalizado (MN): métodos internacionalmente aceptados y validados que está

siendo sometido a la validación secundaria.

Método de Referencia (MR): método en uso rutinario en el Laboratorio, cuyas características

de desempeño son bien conocidas.

Nivel de Fortificación (NF): es el número de unidades formadoras de colonia adicionado a cada

gramo o mililitro de la matriz de alimento en análisis durante el procedimiento de fortificación.

Overdispersión: variación en exceso de la aleatoriedad de Poisson, la cual es detectada

cualitativamente por el índice de dispersión de Poisson,

Repetibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por la aplicación de

un mismo procedimiento analítico, mismo material, en las mismas condiciones de análisis

(analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo.

Resultado extremo o Outlier: corresponde a cualquier valor extremo que ocurra debido a

situaciones anormales. En menos de 1% de las pruebas, estos resultados pueden ocurrir

aleatoriamente en situaciones normales.

Validación Primaria o Completa: se refiere al establecimiento de las especificaciones para el

desempeño de un método nuevo y/o una verificación experimental que un método teóricamente

cumple con criterios de calidad deseados.

Validación Secundaria: se refiere a la comprobación experimental de que un método

establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones, en las condiciones disponibles en el

laboratorio usuario.

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Materiales e Insumos

Cepas objetivo

Cepas interferentes

Caldo cerebro corazón (BHI)

Diluyentes

Agar selectivo específico del método a evaluar

Placas estériles

Pipetas estériles




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 4 de 11

6.2 Equipos

Baño de agua termorregulado

Incubadoras

Stomacher

7. DESARROLLO PARA LA VALIDACIÓN SECUNDARIA DE MÉTODOS

CUALITATIVOS

7.1 Límite de Detección de métodos cualitativos normalizados cuyas características de

desempeño de la validación preliminar están declaradas:

7.1.1 Considerando los criterios de elección de las características a evaluar, el

procedimiento de validación secundaria de métodos normalizados cualitativos

incluirá la evaluación de las características:

Límite de detección

Inclusividad.

Exclusividad.

7.1.2 Para los métodos de los cuales se conocen los valores de las características de

desempeño obtenidas en la validación primaria, la validación secundaria se

restringirá a la confirmación del límite de detección declarado, analizando como

mínimo 30 repeticiones en este nivel del límite de detección.

7.1.3 Las actividades relacionadas con la selección de matrices, fortificación de muestras,

pruebas para evaluación de inclusividad y exclusividad deberán seguir las mismas

instrucciones descritas para los métodos que no poseen las características de

desempeño declaradas.

7.2 Limite de Detección de métodos cualitativos normalizados cuyas características de

desempeño de la validación preliminar no están declaradas:

7.2.1 En la validación secundaria de métodos normalizados cualitativos que no tienen

declarado el límite de detección de la validación preliminar, pueden ser aplicadas las

ecuaciones descritas a continuación para la evaluación del límite de detección de

estos métodos.

7.2.2 Si el límite de detección es definido en términos de probabilidad de un resultado

positivo con un determinado intervalo de confianza (95%), el mismo puede ser




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 5 de 11

calculado de la probabilidad de los negativos que es ofrecida por la fórmula

originaria de los métodos cuantitativos:

p0=(1+u2c) -1/ u2 p0=1-p(+)=1-0,95 = 0,05 c = 2

-u

u

1) -(0,052

Donde: u2 es el factor de overdispersión (incertidumbre del recuento) y c es el número de

células.

7.2.3. Así para métodos cualitativos el límite de detección teórico a ser verificado seria 3 ufc

/25g (distribución de Poisson) para una probabilidad de 95% de detectar el analito, presente

en la alícuota analizada, según el procedimiento descrito a seguir.

7.3 Procedimiento para la determinación del límite de detección (LD)

7.3.1 Para obtener la probabilidad estadística de 95% de confianza es necesario generar,

como mínimo, 30 resultados en el nivel de fortificación en la prueba.

7.3.2 Los análisis para determinación del límite de detección deben ser realizadas todas en

el mismo día, por un mismo analista en cada etapa, utilizando los mismos equipos y

mismos lotes de medios de cultivo, reactivos y demás insumos.

7.3.3 Los resultados serán anotados en el RG-712.00-XXX ver (Anexo Nº 1).

7.3.4 Selección y Estudio de las Matrices

7.3.4.1 Cuando el método analítico a ser verificado se destina al análisis de todos los tipos

de alimentos, la matriz que se escoja para la validación secundaria será aquella donde

se espera las mayores dificultades para la recuperación del analito.

7.3.4.2 Cuando el método analítico a ser verificado se destina al análisis de un único tipo de

alimento, la validación secundaria deberá ser realizada usando esta matriz específica.

7.3.4.3 Pesar 900 g o medir 900 mL de la matriz escogida y homogeneizar muy bien.

7.3.4.4 Usando el método de referencia del laboratorio, confirmar la ausencia del analito en

la matriz seleccionada a través del análisis de 6 alícuotas de 25 g, retiradas de

diferentes partes del homogeneizado de la matriz (900 gramos o mililitros),

anteriormente preparada y homogeneizada. Registrar los resultados en el RG-712.00-

XXX (ver Anexo Nº 1). En caso de un producto estéril (ej. consevas) realizar solo un




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 6 de 11

análisis. Si todos los análisis se confirman como negativos, usar los 750 g, o 750 mL

restantes para la fortificación de la siguiente manera:

Si la matriz fuera sólida, fraccionar las 750 g en 30 alícuotas de 25g e identificar

adecuadamente antes de la fortificación.

Si la matriz fuera líquida, la fortificación deberá ser hecha en los 750 mL de matriz, antes del fraccionamiento en 30 alícuotas de 25 mL.

7.3.5 Condiciones para el ensayo de Selección y Estudio de las Matrices

Analito: usar una cepa del analito que normalmente está asociada a la categoría del alimento en prueba, o una que sea de interés para los programas de control de la

Institución.

Número de alícuotas: 30 alícuotas de 25 g o mL

Nivel de fortificación para métodos que no presentan declaración del limite de

detección: 3 ufc/25g o mL.

Nivel de fortificación para métodos que presentan el valor del límite de detección: verificar el valor declarado.

7.3.6 Procedimiento para la fortificación de la matriz 7.3.6.1 La fortificación de las muestras es hecha a través de la adición de diluciones

conocidas del microorganismo a prueba, a partir de su fase estacionaria, en la matriz

en cuestión, confirmada como negativa para el microorganismo a prueba, de acuerdo

con las siguientes instrucciones:

7.3.6.1.1 Preparar fase estacionaria del analito en caldo cerebro corazón (BHI), o en caldo

no selectivo específico para el analito.

7.3.6.1.2 Hacer diluciones de la fase estacionaria del analito hasta 10-9

en solución salina

peptonada, o el diluyente específico para el analito evaluado.

7.3.6.1.3 Hacer recuento en duplicado de las diluciones, 10-7

, 10-8

y 10-9

en agar para

recuento total (PCA o otro no selectivo apropiado para el microorganismo).

7.3.6.1.4 Realizar las lecturas y hacer los cálculos de los números de células en cada una de

las diluciones de la fase estacionaria del analito de manera de establecer la

dilución que será usada para la fortificación de la matriz y registrar los resultados

de los recuentos y del cálculo en el RG-712.00-XXX (ver Anexo Nº1).

7.3.6.1.5 Preparar nueva fase estacionaria en caldo cerebro corazón (BHI) o en caldo no

selectivo específico para el analito del mismo lote evaluado en el día anterior.

Preparar las diluciones necesarias y mantener en refrigeración hasta el momento

de la fortificación (no más que 20 minutos).

7.3.6.2 Si la matriz es sólida, realizar la fortificación en cada una de las 30 alícuotas

preparadas de acuerdo con el punto 7.3.4 a través de la adición del volumen y

dilución calculados para la obtención de 3ufc/25g (para métodos que no poseen la




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 7 de 11

declaración del valor del LD), o para la obtención del valor equivalente al límite de

detección declarado. Homogeneizar bien.

7.3.6.3 Si la matriz es líquida, realizar la fortificación de los 750 mL de la matriz preparada

de acuerdo con el punto 7.3.4, a través de la adición del volumen y dilución

calculados para la obtención de 90ufc/750 mL (para métodos que no poseen la

declaración del valor del LD), o para la obtención de 30 veces el límite de detección

declarado. Homogeneizar muy bien y después fraccionar en 30 alícuotas de 25 mL,

identificando adecuadamente.

7.3.6.4 Mantener en refrigeración hasta el inicio de los análisis (no más de 1 hora).

7.3.7 Análisis de las muestras 7.3.7.1 Analizar las 30 muestras usando el método a evaluar. Registrar los resultados en el

RG-712.00.XXX (ver anexo Nº1)

7.3.8 Tratamiento de los datos e Interpretación del Límite de Detección 7.3.8.1 Considerando los resultados positivos, determinar el porcentaje de recuperación

obtenida por la ecuación:

nº Pos x 100

% Recuperación = ------------------

30

7.3.9 Criterio de aplicación 7.3.10 Métodos que no poseen el LD declarado: Será confirmado el límite de detección de

la distribución de Poisson (3 ufc/25 g o mL) si el resultado del cálculo de

recuperación fuera mayor al 95%. Cuando la recuperación obtenida es menor al

95%, repetir la evaluación utilizando otro(s) nivel(es) de fortificación, como por

ejemplo 5 ufc/25 ml o g, de manera a establecer cual es el LD del método

normalizado en las condiciones de uso del laboratorio.

7.3.11 Métodos que poseen el LD declarado: Será confirmado el límite de detección

declarado si el resultado del cálculo de recuperación fuera mayor al 95%. Cuando la

recuperación obtenida es menor que 95%, repetir la evaluación antes de determinar

que el LD es diferente del declarado.

7.3.12 Si fuera de interés del laboratorio, determinar cual es el LD del método en las

condiciones de uso del laboratorio a través de la repetición con valores de

fortificación mayores.




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 8 de 11

7.3.10 Inclusividad 7.3.10.1La segunda etapa del procedimiento de verificación secundaria es la determinación de

la inclusividad, que permite conocer el desempeño del método en relación a los

analitos que primordialmente interesan al laboratorio.

7.3.10.2Condiciones para el ensayo de Inclusividad

Matrices: no serán usadas matrices

Analitos: diferentes cepas del analito en cuestión aisladas de diferentes tipos de

alimentos y regiones geográficas.

Número de muestras: 30 cepas puras del analito más prevalentes en la región o más frecuentemente aisladas en el laboratorio.

Concentración de los inóculos: debe estar entre 10 y 100 veces el límite de detección.

Número de repeticiones: una repetición por cepa.

7.3.10.3 Procedimiento para la inoculación: 7.3.10.3.1 Preparar fases estacionarias de los analitos de acuerdo con el descrito en 7.3.6 y

calcular las diluciones que permitan la obtención de la concentración deseada.

7.3.10.3.2 Hacer un recuento en PCA, por duplicado, para conocer el número real inoculado

en cada caso. Registrar los recuentos en RG-712.00.XXX (ver anexo Nº2) -

resultados Agar Plate Count (PCA). 7.3.10.3.3 Para cada analito, calcular las diluciones que permiten la obtención de inóculos con

la concentración de células entre 10 y 100 veces el LD.

7.3.10.3.4 Preparar nueva fase estacionaria usando el mismo lote de medio usado

anteriormente y diluir de acuerdo a lo calculado en 7.3.10.3.3

7.3.10.3.5 Inocular, con los volúmenes y diluciones calculadas para cada analito, el medio de

cultivo indicado para el enriquecimiento selectivo del método a probar.

7.3.10.3.6 Incubar y seguir el análisis de acuerdo con el indicado para el método.

7.3.10.3.7 Registrar los resultados en el Anexo RG-712.00-XXX (ver anexo Nº2) - Resultados

Presencia/Ausencia”.

7.3.10.4 Interpretación de los resultados 7.3.10.4.1 Analizar los resultados de inclusividad considerando tanto los aspectos

cualitativos (características de las cepas) como cuantitativos (nº de células

recuperadas) de los analitos evaluados.

7.3.10.4.2 Es deseable que el método evaluado sea capaz de recuperar todos los analitos de

interés prioritarios, los cuales son normalmente recuperados por el método de

referencia.




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 9 de 11

7.3.11 Exclusividad 7.3.11.1La tercera etapa del procedimiento de verificación secundaria es la determinación de

la exclusividad, que permite conocer el desempeño selectivo del método en relación a

los interferentes que primordialmente interesan al laboratorio.

7.3.11.2 Condiciones para el ensayo

Matrices: no serán usadas matrices

Analitos: diferentes cepas de interferentes que comúnmente están presentes en los

alimentos analizados por el laboratorio.

Número de muestras: 30 cepas puras de los interferentes.

Concentración de los inóculos: debe estar entre 103 y 10

4

Número de repeticiones: una repetición por cepa.

7.3.11.3 Procedimiento para la inoculación 7.3.11.3.1 Preparar fases estacionarias de los microorganismos de acuerdo con el descrito en

7.3.6 y calcular las diluciones que permitan la obtención de la concentración

deseada.

7.3.11.3.2 Hacer un recuento en PCA, por duplicado, para conocer el número real inoculado

en cada caso. Registrar los recuentos en el RG-712.00.XXX (ver anexo Nº 3) -

resultados Agar Plate Count (PCA).

7.3.11.3.3 Para cada microorganismo, calcular las diluciones que permiten la obtención de

inóculos con la concentración de células entre 103 y 10

4.

7.3.11.3.4 Preparar nueva fase estacionaria usando el mismo lote de medio usado

anteriormente y diluir de acuerdo a lo calculado en 7.3.11.3.3.

7.3.11.3.5 Inocular el medio de cultivo indicado para el enriquecimiento selectivo del

método a probar con los volúmenes y diluciones calculadas para cada

microorganismo.

7.3.11.3.6 Incubar y seguir el análisis de acuerdo con el indicado para el método

7.3.11.3.7 Registrar los resultados en el RG-712.00-XXX- Resultados Presencia/Ausencia.

7.3.12 Interpretación de los resultados

7.3.12.1Analizar los resultados de exclusividad considerando tanto los aspectos cualitativos

(características de las cepas, cuales cepas no fueron inhibidas) como cuantitativos

(inhibición total o parcial) de los interferentes evaluados.

7.3.12.2Es deseable que el método evaluado sea capaz de inhibir total o parcialmente la

mayoría de los microorganismos interferentes, especialmente aquellos que presentan

la mayor posibilidad de competición o confusión con el analito.




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 10 de 11

7.3.13 Registro Final

7.3.13.1Al terminar los ensayos, registre todos los resultados obtenidos en RG-712.00-XXX

(ver anexo Nº 4).

8. REGISTROS

Identificación

del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y

disposición

RG-712.00-XXX Archivador rotulado

Registros ¿?

Acceso restringido

al personal de la

Sección de

Microbiología

Alimentos

Papel 5 años y eliminado en

trozos a en basura

normal


Registros ¿?

Acceso restringido

al personal de la

Sección de

Microbiología

Alimentos


trozos a en basura

normal


Registros ¿?

Acceso restringido

al personal de la

Sección de

Microbiología

Alimentos


trozos a en basura

normal


Registros ¿?

Acceso restringido

al personal de la

Sección de

Microbiología

Alimentos


trozos a en basura

normal




CUALITATIVOS

Fecha emisión:

Revisión:

Fecha revisión:

20/10/09


Página 11 de 11

9. TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº Pág.

Modificada

Motivo del cambio Fecha Aprobación

10. ANEXOS

10.1 Anexo Nº1 Registro Validación Secundaria para métodos Normalizados Cualitativos:

Límite de Detección RG-712-00-XXX.


Inclusividad RG-712-00-XXX.


Exclusividad RG-712-00-XXX.


Aprobación Final RG-712-00-XXX.

validación secundaria metodos normalizados cualitativos

Documents