universidad nacional oe huancavelica · facultad de
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UNIVERSIDAD NACIONAL OE HUANCAVELICA · FACULTAD DE CIENCIAS DE INGENIERÍA
ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS
En el Auditórium de la Facultad de Ciencias de Ingeniería, a los 30 días del mes de mayo del año 2013, a
horas 8:00a.m, se reunieron los miembros del Jurado Calificador conformado por los siguientes: Mg. Bias
REYMUNDO CÓNDOR (PRESIDENTE),Ing. Yola Victoria RAMOS ESPINOZA (SECRETARIA), lng. Marino
ARTICA FÉLIX (VOCAL), designados con la Resolución de Consejo de Facultad W 003-2012-FCI-COyG
UNH, de fecha 22 de octubre del 2012, y ratificados con la Resolución de Decano W 168-2013-FCI-UNH de
fecha 30 de mayo del 2013, a fin de proceder con la evaluación y calificación de la sustentación del informe
final de tesis titulado: "INFLUENCIA DE LOS DILUTORES TRIS, SP-TALP Y ANDROMED SOBRE
LA VIABILIDAD DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMARIOS REFRIGERADOS DE ALPACAS
(Lama pacos)", presentado por los Bachilleres Cesar Chahuayo Chancha e Ignacio Paytan
Huamán, para optar el Título Profesional de Ingeniero Zootecnista; en presencia del Dr. Jaime Antonio
RUIZ BEJAR, Asesor del presente trabajo de tesis. Finalizado la evaluación a horas.~. :·.~-~.o--.; se invitó al
público presente y a los sustentantes abandonar el recinto. Luego de una amplia deliberación por parte de los
Jurados, se llegó al siguiente resultado:
Cesar CHAHUAYO CHANCHA . APROBADO [XI POR. ..... I!1..7-.?!.~~'!(
DESAPROBADO c:J Ignacio PAYTAN HUAMÁN
APROBADO fl/l A lJ D ~( 1!1 POR .............. (/' ............. .
DESAPROBADO c:J
En conformidad a lo actuado firmamos a continuación:
/
Vocal
"AÑO DE LA INVERSIÓN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA"
Universidad Nacional de Huancavelica (Creada por Ley N° 25265)
FACULTAD DE CIENCIAS DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA
TESIS
INFLUENCIA DE LOS DILUTORES TRIS, SP·TALP Y ANDROMED SOBRE LA VIABILIDAD DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMARIOS REFRIGERADOS DE ALPACAS (Lama pacos)
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:
REPRODUCCIÓN ANIMAL
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
INGENIERO ZOOTECNISTA
PRESENTADO POR:
Bach. CHAHUAYO CHANCHA, César Bach. PAYTÁN HUAMÁN, Ignacio
HUANCAVELICA- PERÚ 2013
El presente trabajo está
dedicado con todo cariño a
mis padres Máximo y Emilia
(+), hermanos y familiares
quienes me apoyaron en
todo momento de manera
incondicional.
Ignacio
Con todo cariño a toda mi
familia por su apoyo
incondicional, y a quienes
guían en mi peregrinar
Donato Chahuayo Arroyo
y Eulogia Chancha
Bendizú. mis padres.
César
AGRADECIMIENTO
A nuestros familiares en especial a vuestros padres y hermanos quienes
con su apoyo fraterno e incondicional aunaron esfuerzos en hacer
realidad una de nuestras metas.
A los Docentes de la Universidad Nacional de Huaricavelica de la Escuela
Académico Profesional de Zootecnia, quienes con paciencia y sapiencia
nos formaron durante nuestra permanencia como estudiantes.
Al Dr. Jaime Antonio RUIZ BÉJAR, Asesor de la tesis por su invalorable
ayuda y apoyo que nos brindó para la elaboración del presente trabajo.
A la lng. Leandra LANDEO JURADO, por su apoyo incondicional en la
ejecución de la tesis.
Al compañero José MALLMA MENDOZA, por los alcances
proporcionados durante la ejecución a fin de lograr resultados en la
investigación.
IN DICE
Caratula ............................................................................... . Dedicatorias ........................................................................ . Agradecimientos ................................................................... . Índice ................................................................................. . Lista de abreviaturas .............................................................. . Resumen .............................................................................. . Abstract. .............................................................................. . Introducción .......................................................................... .
CAPÍTULO 1 PROBLEMA 13 1.1. Planteamiento del problema.......................................... 13 1.2. Formulación del problema............................................... 15 1.3. Objetivos..................................................................... 15
1.3.1. Objetivo general...................................................... 15 1.3.2. Objetivos específicos............................................... 15
1.4. Justificación.................................................................. 15
CAPÍTULO 11 MARCO TEÓRICO Y CONCEPTUAL..................................... 17 2.1. Antecedentes teóricos.................................................... 17 2.2. Bases teóricos.............................................................. 19 2.3. Hipótesis..................................................................... 38 2.4. Definición de términos básicos......................................... 38
CAPÍTULO 111 MATERIALES Y MÉTODOS.................................................. 40 3.1. Lugar de ejecución........................................................ 40 3.2. Materiales y equipos .......................................... ;........... 40
3.2.1. Material biológico................................................... 40 3.2.2. Equipo de laboratorio............................................... 40 3.2.3. Materiales de trabajo en laboratorio............................ 41 3.2.4. Herramientas de laboratorio...................................... 41 3.2.5. Materiales de escritorio............................................ 41
· 3.2.6. Dilutores y reactivo.................................................. 42 3.3. Metodología.................................................................. 42
3.3.1. Toma de muestras................................................... 42 3.3.2. Ordeño de espermatozoides epididimarios................... 43 3.3.3. Evaluación de espermatozoides vivos y muertos........... 43 3.3.4. Evaluación de la motilidad de espermatozoides............ 44 3.3.5. Determinación de concentración de espermatozoides.... 44 3.3.6. Refrigeración de muestras......................................... 45 3.3. 7. Diseño experimental... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.3.8. Análisis estadístico................................................. 46
CAPÍTULO IV RESULTADOS 47 4.1 Presentación de resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7
CAPÍTULO V 52 DISCUSIONES.................................................................... 52 CONCLUSIONES................................................................ 54 RECOMENDACIONES......................................................... 55 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................ 56 ANEXO............................................................................. 62
Cuadro N°01
Cuadro N°02
Cuadro N°03
Cuadro N°04
Gráfico N° 01 Gráfico N°02
ÍNDICE DE CUADROS
Comparación de los dilutores... ......... ... ...... ............ ... 47 Resultados obtenidos en porcentaje de espermatozoides vivos ........................................................................ 48 Resultados obtenidos en motilidad de Espermatozoides vivos ....................................................................... 49 Resultados obtenidos en concentración de Espermatozoides epididimarios................................... 50
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Resultados obtenidos en porcentaje de Espermatozoides vivos...................................................................... 49 Resultados obtenidos en motilidad de Espermatozoides vivos ....................................................................... 50
Cuadro N° 1 A Cuadro N°2A Cuadro N°3A Cuadro N°4A
Cuadro N°5A Cuadro N°6A Cuadro N°7 A Cuadro N°8A Cuadro N°9A
Cuadro N°10A Cuadro N° 11A
Cuadro N° 12A
Cuadro N° 13A Cuadro N°14A Cuadro N° 15A Cuadro N°16A Cuadro N° 17 A
Cuadro N°18A Cuadro N°19A Cuadro N°20A Cuadro N°21 A
ANEXO DE CUADROS
Base de datos en número de espermatozoides vivos con dilutor tris...................................................... 63 Base de datos número de espermatozoides vivos con dilutor Sp-talp........................................ .. . . . . . . . 64 Base de datos número de espermatozoides vivos con dilutor andromed................................................ 65 Base de datos % de motilidad de espermatozoides con dilutor tris...................................................... 66 Base de datos % de motilidad de espermatozoides dilutor Sp-talp.................................................... 67 Base de datos % de motilidad de espermatozoides con dilutor andromed... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 68 Base de datos Concentración de espermatozoides millones/mi.......................................................... 69 Base de datos porcentaje de espermatozoides vivos para correr es programa SAS versión 9.2 en español... 70 Base de datos porcentaje de motilidad espermatozoides para correr es programa SAS versión 9.2 en español......................................... 71 Base de datos procesados con programa SAS, Porcentaje de espermatozoides vivos....................... 72 Base de datos procesados con programa SAS, análisis de varianza ANOV A.................................. 72 Análisis de varianza suma de cuadrados valor significativo......................................................... 73 Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, sp-talp y andromed... ... ... ... ... ....... ... ... ... ... ... ... ...... ..... 73 Porcentaje de motilidad a diferentes horas ............. .
74 Base de datos porcentaje de motilidad de espermatozoides epididimarios... .......................... 75 Análisis de varianza ANOVA. ................................ .
75 Análisis de varianza suma de cuadrados valor significativo........................................................ 76 Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, Sp-talp y andromed... ... ... ....... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... .... 76 Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, sp-talp y andromed... ... ... ... ... ........ ... ... ... ... ... ...... ... .... 77 Porcentaje de motilidad a diferentes horas ............... .
77 Comparación de letras ......................................... .
77
ANEXO DE FOTOS
FOTO N° 01 Identificando animales por boqueo después del pelado. 78 FOTO N° 02 Recogiendo muestras de animales adultos machos........ 78 FOTO Trasladando muestras al laboratorio de Biotecnologías N° 03 Reproductivas.......................................................... 79 FOTO Conservando muestras durante la evaluación de N° 04 viabilidad............................................................... 79 FOTO Preparando los dilutores en el laboratorio de N° 05 Biotecnologías Reproductivas ..................................... 80 FOTO N° 06 Tomando medidas del testículos................................ 80 FOTO N° 07 Extrayendo cola del epidídimo del testículo................... 81 FOTO N° 08 Ordeñando espermatozoides de la cola del epidídimo ..... 81
·FOTO N° 09 Controlando temperatura con platina temperada a 34 °C 82 FOTO Evaluando la viabilidad de los espermatozoides después N° 10 de la dilución........................................................... 82 FOTO Envasando las muestras que tienen más de 70% de . N° 11 viabilidad................................................................ 83 FOTO N° 12 Conservando al medio ambiente las muestras................ 83 FOTO N° 13 Conservando en refrigerado las muestras... . . . . . . . . . . . . . . . 84 FOTO Observando espermatozoides viables después de 8 N° 14 horas..................................................................... 84
ANOVA
l. A
cm
Col.
DMSO
mi
ul
No
Ul
T
Sp-talp
ug
mm
T. E
LH
GnRH
AMP
FSH
ADN
Et. al
LISTA DE ABREVIATURAS
Análisis de varianza
Inseminación artificial
centímetro
colaboradores
Dimetil solfóxido
mililitro
micro litro
Numero
Unidades internacionales
Tratamiento
Medio de trabajo
microgramos
milímetro
Transferencia de embriones
Hormona lutuinizante
Hormona gonadotropina reguladora
Adinocin Monofosfato
Hormona folículo estimulante
ácido desoxirribonucleico
Colaboradores
RESUMEN
El presente estudio se realizó en el laboratorio de biotecnología reproductiva de la Universidad Nacional de Huancavelica ubicado en el distrito, provincia, región de Huancavelica en Perú a 3 680 m.s.n.m. el objetivo fue evaluar la influencia de los dilutores Tris, Sp-talp y Andromed sobre la viabilidad de los espermatozoides epididimarios refrigerados de alpacas a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas. Para el cual se recuperó 60 pares de testículos (alpacas) de los animales que fueron beneficiados en el camal municipal de Huancavelica; los cuales se dividieron en tres tratamientos (dilutores) y seis bloques (tiempos) realizando 20 repeticiones en cada bloque; donde los espermatozoides fueron ordeñados a partir de la cola del epidídimo para ser ordeñados en los diferentes dilutores (Tris, Sp-talp y Andromed) agregando 1 mi de dilutor para cada muestra y luego fueron cultivados en la refrigeradora a 4 °C siendo evaluados a tiempos fijos utilizando los parámetros, como: % de espermatozoides vivos, %de motilidad y concentración (millones/mi).
Llegando a resultados, donde los tres tratamientos son buenos, conservando el 68 % de la viabilidad con 64 % de motilidad en promedio hasta los 4 horas; pero el T3 es superior que T1 manteniendo el 79 % de viabilidad con 71 % de motilidad hasta 4 horas; respectivamente a los 8 horas, el T1 es superior que el resto conservando el 68% de viabilidad con 66 % de motilidad de los espermatozoides, con una concentración en promedio de 77.090.000 millones/mi. En conclusión los dilutores que mejor resultaron fueron del T1 y T3, entre si no presentan diferencias significativas pues los resultados fueron similares, se trabajó con 0.05 de nivel de confianza, en cambio el dilutor Sp- talp difiere significativamente si comparamos con los dos dilutores anteriores. Es decir existe diferencia significativa siendo el T2 el menos indicado para ser recomendado en el uso de la inseminación artificial de alpacas.
Palabras clave: Anormalidades espermáticas, Concentración espermática, Crioprotector, Espermatozoide, Motilidad espermática, Semen:
ABSTRACT
The present study was conducted in the laboratory of reproductive
biotechnology Huancavelica National University located in the district,
province, region of Huancavelica in Peru to 3680 masl the objective was to
evaluate the influence of Tris extenders, Sp-talp and Andromed on
epididymal sperm viability chilled to 00 alpacas, 04, 08, 12, 24 and 48
hours. To which recovered 60 pairs of testes (alpacas) of animals which
were benefited in the municipal slaughterhouse Huancavelica, which were
divided into three treatments (extenders) and six blocks (times) by
performing 20 repetitions in each block, where sperm were milked from the
tail of the epididymis to be milked in different extenders (Tris, Sp-talp and
Andromed) by adding 1 mi of dilutor for each sample and then were
cultured in the refrigerator at 4 o C being evaluated fixed times using the
parameters, such as:% of live sperm,% motility and concentration (million 1
mi).
Arriving results, where the three treatments are good, retaining 68% of the
viability with 64% motility on average up to four hours, but the T3 is higher
than T1 maintaining 79% viability with 71% motility to 4 hours,
respectively, after 8 hours, the T1 is higher than the rest retaining the 68%
viability with 66% of sperm motility, with an average concentration of 77.09
million million 1 mi. In conclusion, the best resulted were diluters of T1 and
T3, each not significantly different because the results were similar, we
worked with 0.05 confidence level, whereas the Sp-talp dilutor significantly
different if compared to the two previous diluters . Significant difference is
that the T2 being the least likely to be recommended in the use of artificial
insemination of alpacas.
KEY WORDS: Sperm abnormalities, sperm concentration, Cryoprotectant,
Sperm, Sperm Motility, Semen:
INTRODUCCIÓN
Las alpacas habitan en las zonas altoandinas del Perú, Bolivia, Chile,
Argentina y Ecuador; su crianza es una importante alternativa económica
para la población de estos países, sin embargo; los índices de
productividad en el ámbito de las comunidades son bajos y no permiten
obtener buenos parámetros reproductivos (Novoa 1991, Sumar 1 997).
La aplicación de la biotecnología reproductiva como la inseminación
artificial (I.A) en camélidos sudamericanos, puede servir como
herramienta para la mejora genética, potenciando el uso de machos
reproductores de buen diámetro de fibra, peso de vellón y sin defectos
genéticos, ya que se sabe que las alpacas macho solo pueden realizar 2
a 3 servicios por día, el uso de la colección y dilución de semen permitirá
el servicio de un mayor número de hembras con un solo eyaculado.
Para el desarrollo de la tecnología reproductiva en alpacas se busca
constantemente afinar protocolos para la diluir semen el cual nos permitirá
conservar espermatozoides viables con el fin de obtener una reproducción
adecuada utilizando un grupo de animales de alto valor productivo
mantenidos en núcleos genéticos y estos se convertirían en reproductores
para los criadores de alpacas y de esta manera contribuir al mejoramiento
de los ingresos de los criadores de alpacas.
En ese sentido la presente investigación tiene como objetivo evaluar la
influencia de los dilutores Tris, Sp-talp y Andromed en la viabilidad de Jos
espermatozoides epididimarios refrigerados a 4 oc de alpacas a 00, 04,
08, 12, 24 y 48 horas, para así contribuir en el desarrollo de los protocolos
de conservación de espermatozoides viables, las cuales podría utilizarse
en inseminación artificial con semen colectado, utilizando alpacas machos
elites de alto valor genético.
CAPITULO 1
PROBLEMA
1.1. Planteamiento del problema
La crianza de camélidos sudamericanos es una actividad de vital
importancia para un amplio sector de la población altoandina de Perú,
Bolivia, Argentina, Chile y Ecuador. Se estima que alrededor de 500
mil familias de la región andina dependen directamente de la
actividad con camélidos sudamericanos (Fernández, Baca, 1991 ), los
camélidos sudamericanos son especies muy importantes en la
economía andina; donde se puede aprovechar los subproductos de
estas especies como la carne, fibra, piel y estiércol, esta especie es
beneficioso para los criadores que habitan las zonas altoandinas por
encima de los 4,000 m.s.n.m. estos animales utilizan extensas áreas
de praderas naturales, que debido a factores asociados a la altitud no
podrían ser aprovechadas de manera eficiente por otros animales
domésticos (Tapia, 1993).
En la actualidad la explotación de los camélidos sudamericanos se
lleva a cabo bajo el sistema tradicional, el cual no siempre es eficaz,
agudizando problemas de morbilidad, mortalidad y baja eficiencia
reproductiva (Cárdenas et al, 1999); donde la tasa de natalidad anual
en la mayoría de explotaciones alpaqueras es de orden del 50 %
(Fernández, Baca, 1993), con índices de fertilidad de un 65 % (Apaza
et al, 1998), y preñez de 60% (Apaza et al, 2001 ), con un reemplazo
13
inadecuado de reproductores, desconocimiento de la fisiología
reproductiva e inapropiado empleo de reproductores en el
apareamiento (Apaza et al, 1998).
Esto ha llevado al desarrollo de técnicas avanzadas de
reproducción, tales como la trasferencia de embriones (T.E) y la
inseminación artificial (I.A). La inseminación artificial que aún se
encuentra en una etapa experimental (Taylor et al, 2000); (Von Baer
et al, 2003), podría incrementar animales genéticamente superiores y
así superar la limitante del número de crías (n:=:;6) que una hembra
puede producir durante toda su vida productiva (Franco et al, 1999),
así mismo permitirá potenciar el uso de machos, ya que no pueden
realizar más de 4 servicios fértiles por día (Bravo et al, 1997), debido
al escaso tamaño de sus testículos la producción de espermatozoides
es lenta y muchos intentos de monta no concluyen la penetración y
eyaculación (Ruiz J. 1999).
La crianza de alpacas merece de atención con los avances de
inseminación artificial que ha contribuido al progreso genético en
diversas especies de producción, especialmente en bovinos y ovinos;
sin embargo aún no se tiene estandarizado una metodología sobre
manejo de espermatozoides, aun a la fecha no reportan dilutores
adecuados para semen de alpacas.
En la actualidad existe una gran variedad de dilutores para diversas
especies domésticas; aun no se reporta un dilutor adecuado para
conservación de espermatozoides epididimarios refrigerados en
alpacas, por falta de estudios al tema de los dilutores y otros factores
que afecten sobre la motilidad.
Por todo lo planteado anteriormente y revisadas las bibliografías, al
no encontrar datos referentes a la viabilidad de espermatozoides
epididimarios de alpacas para el uso de un dilutor adecuado, nos
14
planteamos conocer la influencia de los dilutores tris, s-talp y
andromed sobre la viabilidad de espermatozoides epididimarios
refrigerados a 4 °C a distintas horas.
1.2. Formulación del problema
¿Cuál es la influencia de los dilutores Tris, Sp-talp y Andromed sobre
la viabilidad de espermatozoides epididimarios refrigerados de
alpacas (Lama pacos) a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas?
1.3. Objetivo
1.3.1. Objetivo general
Evaluar la influencia de los dilutores TRIS, SP-TALP y
ANDROMED en la viabilidad de los espermatozoides
epididimarios refrigerados de alpacas a 00, 04, 08, 12, 24 y 48
horas.
1.3.2. Objetivos específicos
•!• Evaluar el porcentaje de espermatozoides epididimarios
vivos refrigerados a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas a post
dilución.
•!• Evaluar el porcentaje de la motilidad en espermatozoides
epididimarios refrigerados a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas a
post dilución.
•!• Evaluar la concentración de espermatozoides epididimarios
en millones/mi.
1.4. Justificación
Los alpacas machos tienen limitante producción de
espermatozoides, ya que no pueden realizar más de 4 servicios
fértiles por día (Bravo et al, 1997), debido al escaso tamaño de sus
testículos la producción de espermatozoides es lenta y muchos
intentos de monta no concluyen la penetración y eyaculación (Ruiz,
15
·1999), el cual limita el potencial reproductivo a los animales de buena
calidad genética en esta especie. La crianza de alpacas también
merece de atención en vista de los avances en tecnologías
reproductivas como la inseminación artificial y la posibilidad de utilizar
técnicas reproductivas para superar estos bajos índices reproductivos,
sobre todo en la multiplicación de animales de alto valor productivo.
El presente trabajo de investigación se realiza con el fin de
potenciar el uso del eyaculado de los reproductores machos, ya que
no pueden realizar más de 4 servicios fértiles por día debido al escaso
tamaño de sus testículos, que hace que la producción de
espermatozoides sea lenta y mocho intentos de monta no concluyen
en penetración y eyaculación.
La dilución nos permite conservar espermatozoides viables con el
fin de obtener una reproducción adecuada utilizando un grupo de
animales de alto valor productivo mantenidos en núcleos genéticos y
estos se convertirían en reproductores para los criadores de alpacas y
de esta manera contribuir al mejoramiento de los ingresos de los
criadores de alpacas.
Los métodos de dilución de los espermatozoides que se evaluó no
son muy costosos por lo que los productores pueden adquirirlo en el
mercado nacional y también se busca que los profesionales pueden
aplicar la inseminación artificial con espermatozoides diluidos
ayudando en el incremento de la producción de alpacas.
Desde un punto de vista estratégico, el presente trabajo encaja
dentro de la política de investigación nacional, regional, local de
instituciones involucradas con prioridad en el desarrollo del sector
pecuario, habiéndose hecho hasta la fecha esfuerzos individuales que
no tienen repercusión de importancia social.
16
CAPITULO 11
MARCO TEÓRICO Y CONCEPTUAL
2.1. Antecedentes teóricos
Huanca y Gauly (2001 ), para la conservación del semen refrigerado
en llamas, se evaluó la acción de BSA +glucosa, desde una motilidad
inicial de 57.6 %, descendió a 43.0 % a las 24 horas, hasta este
porcentaje es aceptable para realizar la inseminación artificial, por lo
que se recomienda su uso, a partir de las 24 horas la motilidad va
descendiendo progresivamente.
Ratto el al (1999), realizaron la comparación de tres dilutores en la
refrigeración de espermatozoides epididimarios, utilizando los
dilutores: tris + fructosa + ácido cítrico + yema (20 %), leche
descremada + glucosa y leche descremada + sales, realizando la
colección de espermatozoides postmortem desde el epidídimo, se
realizó el lavado de estos en solución TALP y centrifugados, se realizó
el enfriamiento lento hasta 5 oc y se mantuvo así por 72 horas, luego
se calentaron en baño María por 3 minutos y fueron evaluados, el
segundo dilutor fue el mejor ya que solo disminuyo su motilidad solo
cerca de 10%, el primer dilutor causa una gran caída de la motilidad
entre las 48 y 72 horas, mientras que el ultimo dilutor causo una
disminución de la motilidad en cerca de 50%, se recomienda el uso
del dilutor kenney (leche descremada+ glucosa) para ser utilizado en
la conservación de espermatozoides colectados del epidídimo.
17
(j8
Bravo (2002), reporta que muchos dilutores para semen han sido
utilizados en programas de inseminación artificial en muchas especies
domesticas; se ensayó varios dilutores para semen de alpacas, entre
ellos leche descremada, PBS, glucosa-citrato, yema-glucosa-citrato,
triladyl, tris, de todos estos el mejor dilutor encontrado fue el tris; en
un estudio para probar la acción de tres dilutores y su evaluación
después de 2 horas, se utilizaron PBS, leche descremada y glucosa
yema-citrato, obteniéndose 61.1, 60.8 y 64.0 % de espermatozoides
vivos respectivamente en el momento de la colección, estos
porcentajes disminuyeron después de dos horas de incubación en
agua a 37°C a 22.2, 15.6 y 35.4% respectivamente y al evaluarlos
después de 24 horas, la glucosa-yema-citrato obtuvo 70 % de
espermatozoides vivos, leche descremada tuvo 68% y glucosa citrato
60%.
Rivera (1998), indica que el tiempo de sobrevivencia de
espermatozoides colectados por vagina artificial es importante por lo
cual se evaluó la acción de la yema de huevo en la conservación y la
glicerina en la congelación, usados en diferentes concentraciones,
encontrándose que la mejor proporción de yema de huevos es de 20 %
ya que la glicerina a diferentes concentraciones no representa
diferencia significativa. A las 18 horas se tuvo una sobrevivencia de
21.78 %, con un porcentaje inicial de 56.66%. Sin embargo, ningún
componente lipídica ha sido capaz de imitar y sustituir la yema de
huevo en los procedimientos de congelación, lo que puede sugerir
que la sinergia de varios componentes que figuran en la yema de
huevo como son los antioxidantes, y micro elementos, pueden ser
claves en el proceso (Maldjiana et al, 2005).
Fowler (1989), menciona que existen escasos trabajos de I.A han
sido publicados hasta el presente en camélidos sudamericanos,
debido quizás a la falta de una metodología fiable de recolección de
18
semen y a las características seminales de alta viscosidad, baja
motilidad y baja concentración espermática.
Gordon (1997), menciona que la finalidad de diluir el semen es
aumentar el volumen del eyaculado y facilitar la preservación de la
viabilidad del espermatozoide por un tiempo mayor. Un diluyente
eficiente mantiene o mejora el medio que rodea al esperma
suministrándole energía y protección contra productos del
metabolismo y variaciones de temperatura.
Mendoza et al (2008), reporta otros dilutores probados en semen
de alpaca colectado por vagina artificial fueron el PBS, Citrato, Tris y
Lardy + yema, la sobrevivencia de espermatozoides fue de 5, 4.48,
0.0 y 16.62% respectivamente, el Lardy yema disminuyo a 10.35 % a
los 45 minutos.
2.2. Bases teóricos
2.2.1. El testículo
2.2.1.1. Anatomía del testículo
Los testículos son las gónadas masculinas y están
contenidos en una bolsa de piel especializada
denominada escroto (Sisson 1975), que protege y soporta
a los testículos. La función principal del escroto es regular
la temperatura interna de las gónadas mediante la
contracción involuntaria del músculo dartos, que recubre
el escroto interna y basalmente (Salisbury et al, 1978).
Los testículos están recubiertos por dos capas serosas
de la túnica vaginalis, y una capa de tejido conectivo
denso e irregular, que constituye la túnica albugínea
(Wrobel y Dellmann, 1993). De la túnica albugínea
emergen trabéculas de tejido conectivo que convergen en
19
el mediastino ubicado en el centro del · parénquima
testicular, y dividen al testículo en un número variable de
lobulillos testiculares que contienen de 1 a 4 túbulos
seminíferos contorneados.
Los túbulos seminíferos se unen a la salida de cada
lobulillo, y forman los túbulos rectos agrupados en el
mediastino, que a su vez conforman la rete testis
(Sisson, 1975). De la rete testis sale una docena de
túbulos llamados vasos eferentes que convergen en la
porción dorsal del mediastino para luego llegar a la
cabeza del epidídimo (Salisbury et al, 1978).
2.2.1.2. Compartimientos testiculares
El testículo tiene tres compartimientos funcionales
(Amann y Schanbacher 1983):
a. El compartimiento intersticial, contiene las células de
Leydig (que rodean cada túbulo seminífero y lo bañan
con un fluido rico en testosterona) y vasos sanguíneos
y linfáticos.
b. El compartimiento basal (separado del anterior por la
lámina propia testicular), que incluye la base de las
células de Sértoli (células de sostén), y las
espermatogonias (células espermáticas precursoras,
que se dividirán por mitosis).
c. El compartimiento adluminal, que incluye la porción
apical de las células de Sértoli, y los espermatocitos y
espermátides. Aquí ocurre la espermiogénesis
{diferenciación de las espermátides a
espermatozoides) (Johnson y Everitt, 1980).
20
2.2.1.3. Función testicular
El testículo tiene dos funciones principales que son:
a) secreción de hormonas masculinas, como la
testosterona y androstenediona a través del proceso de
esteroidogénesis, en las células de Leydig (Amann et
al, 1983).
b) producción de espermatozoides a través del proceso
de espermatogénesis, en los túbulos seminíferos
(Amann y Schanbacher, 1 983); (Chenoweth, 1 997).
2.2.1.4. Esteroidogénesis
Las células de Leydig producen hormonas masculinas
como respuesta a su estimulación por parte de .la
hormona luteinizante (LH), liberada por la hipófisis, a su
vez estimulada por la GnRH secretada por el hipotálamo
(Chenoweth, 1 997). La testosterona producida por las
células de Leydig es necesaria, entre otras cosas, para la
función de las células de Sértoli y la producción de
espermatozoides (Maddocks et al, 1 995); (Chenoweth,
1997).
2.2.1.5. Espermatogénesis
La espermatogénesis es la suma de las divisiones
mitóticas y meióticas de células espermáticas
precursoras, que ocurren dentro del túbulo seminífero y
resultan en la formación de los espermatozoides
(Chenoweth, 1997) y se inicia a partir de la pubertad
(Salisbury et al, 1 978). El ciclo de la espermatogénesis
21
en el toro adulto dura aproximadamente 61 días
(Chenoweth, 1997).
Este proceso se lleva a cabo en los compartimientos
basal y adluminal del túbulo seminífero, separados
funcionalmente entre sí por las células de Sértoli, que
garantizan el ambiente propicio para que se lleve a cabo
la espermatogénesis (Maddocks et al, 1995).
Bajo la acción de la FSH las células de Sértoli secretan
glicoproteínas como transferrina, ceruloplasmina, inhibina,
y proteína transportadora de andrógeno ABP (Griswold,
1995).
La espermatogénesis incluye dos fases:
a. Espermatocitogénesis, en la cual
espermatogonias sufren división celular
transformarse en espermátides.
las
hasta
b. Espermiogénesis, en la que las espermátides sufren
cambios morfológicos progresivos y se transforman en
espermatozoides completamente formados (Salisbury
et al, 1978).
Las espermatogonias contienen el número de
cromosomas característico de la célula somática de la
especie y están categorizadas en:
a}. Espermatogonia tipo A, que incluye espermatogonias
A 1 y formas celulares más diferenciadas llamadas
espermatogonias A2, A3, A4;
b). Espermatogonia intermedia o "In", derivada de A4.
22
e). Espermatogonia tipo 8, que incluye 81 y 82 (Salisbury
et al., 1978, Ekstedt et al., 1986; Hafez, 1989).
Luego del crecimiento y desarrollo de los
espermatocitos primarios siguen dos divisiones celulares.
De la primera división se producen dos espermatocitos
secundarios de cada uno de los espermatocitos primarios;
y de la segunda división se producen dos espermátides
de cada espermatocito secundario (Salisbury et al, 1978).
Durante la espermiogénesis ocurren cambios
morfológicos como la formación del acrosoma, la
condensación de la cromatina nuclear, el desarrollo de la
cola, y la pérdida del "Cuerpo Residual de Regaud"
(sobrante de la espermátide que no es necesario para el
espermatozoide maduro) (Wrobel y Dellman, 1993). La
espermiogénesis ha sido dividida en fase de Golgi, fase
de capuchón, fase del acrosoma y fase de maduración
(Ekstedt et al., 1986; Hafez, 1989; Wrobel y Dellman,
1993).
La LH es liberada en 3-4 episodios diarios que
persisten por aproximadamente 1.5 horas y tiene una
acción indirecta sobre la espermatogénesis a través de la
estimulación de la producción de testosterona por las
células de Leydig; y la FSH actúa sobre las células de
Sértoli estimulando la espermiogénesis (Amann, 1983).
La espermatogénesis puede ser afectada por diversos
factores. Así tenemos que es afectada negativamente por
el incremento de la temperatura escrotal que puede
ocurrir por procesos de inflamación, fiebre, o temperatura
ambiental muy elevada. Cuando se afecta la
23
espermatogénesis todos los estadios de espermatogonias
mueren, las espermátides sufren anormalidades
estructurales y metabólicas, disminuye la proporción de
espermatozoides vivos y progresivos móviles, y se
incrementan las atipias por defectos de cabeza
principalmente (Amann y Schanbacher, 1983).
2.2.2. El epidídimo
2.2.2.1. Anatomía del epidídimo
El epidídimo es un túbulo elongado y tortuoso
empaquetado en un saco de tejido conectivo que es una
extensión de la túnica albugínea (Salisbury et al, 1978;
Chenoweth, 1997).
Anatómicamente el epidídimo consta de tres partes
bien definidas: cabeza, cuerpo y cola (Sisson, 1975;
Chenoweth, 1997). La cabeza es la parte más grande,
recorre el polo dorsal del testículo y desciende en forma
de asa en la. superficie dorso lateral del testículo. El
cuerpo del epidídimo se extiende hacia el polo distal del
testículo como una banda de 1 cm de ancho y se une
íntimamente a la cara caudo-medial del testículo. La cola
del epidídimo tiene forma cónica y se une estrechamente
por su base mayor al polo distal del testículo (Salisbury et
al, 1978).
Las convoluciones del epidídimo van disminuyendo en
amplitud progresivamente desde la cabeza al cuerpo, en
el cual se aprecia una constricción delgada de la túnica
albugínea; pero a nivel de la cola aumentan el diámetro
del túbulo y el tamaño de las convoluciones (Salisbury et
al, 1978).
24
2.2.2.2. Función del epidídimo
Las funciones del epidídimo son el transporte y la
maduración de los espermatozoides (Chenoweth, 1997),
los cuales, a través del pasaje por los conductos
eferentes y el epidídimo, adquieren la habilidad de tener
movimiento progresivo lineal y la capacidad de fertilizar
(Johnson y Everitt, 1980). Durante este proceso, en la
célula espermática ocurren cambios funcionales,
bioquímicos y morfológicos (Johnson et al, 1980).
También ocurre la reabsorción e intercambio de fluidos
(Salisbury et al, 1978). Específicamente, en la cabeza del
epidídimo ocurre la reabsorción de solutos y fluidos, en el
cuerpo del epidídimo la maduración espermática, y en la
cola del epidídimo el almacenamiento de los
espermatozoides fértiles (Amann y Schanbacher, 1983).
En su origen los espermatozoides son incapaces de
moverse, de allí que el transporte inicial a la rete testis
es dependiente del fluido secretado por las células de
Sértoli. En los conductos eferentes, cabeza y cuerpo del
epidídimo el transporte es mediado por el epitelio del
epidídimo, específicamente las células ciliadas y las
principales, y contracciones peristálticas de la
musculatura lisa de los conductos eferentes y la cabeza y
cuerpo del epidídimo, más la presión hidrostática interna
(Johnson et al, 1980).
Es importante puntualizar que los espermatozoides
inmóviles que son transportados al lumen del túbulo
seminífero, una vez separados de la célula de Sértoli,
tienen una cantidad de citoplasma residual de las
25
espern:tátides retenida por las células de Sértoli, y otra
porción se queda unida al espermatozoide emergente y
forma la "gota citoplasmática" (Chenoweth, 1997).
En cambio, en la cola del epidídimo los movimientos
peristálticos son menos frecuentes y los conductos
deferentes son inactivos, excepto cuando la musculatura
es estimulada a contraerse (Amann y Schanbacher,
1983), por lo que el tránsito en esta porción del epidídimo
sí es afectado por la eyaculación. El número de
espermatozoides en la cola del epidídimo es máximo
cuando los animales no han eyaculado en 7 días, pero se
reduce en al menos 25% en animales que eyaculan
diariamente o con un día de por medio (Amann y
Schanbacher, 1983).
Los espermatozoides son producidos continuamente a
pesar de la eyaculación frecuente y entran al epidídimo a
una tasa constante; sin embargo, si no son eyaculados,
algunos son eliminados periódicamente con la orina
(Amann y Schanbacher, 1983).
Un solo epidídimo tiene capacidad para almacenar 4 mi
de fluido rico en espermatozoides, con una concentración
de 3.55 x 109 espermatozoides/mi, que ocupa la mitad del
volumen total (Salisbury et al, 1978).
El ambiente al que se enfrentan las células
espermáticas al llegar al epidídimo es diferente al de los
túbulos seminíferos y conductos eferentes. Tal diferencia
se debe a los cambios en la composición del fluido
drenado por la rete testis, debido a que la presencia de
26
la barrera hemotesticular es incompleta en esta región
(Johnson y Everitt, 1980).
El fluido producido por las células secretoras del
epidídimo es rico en carnitina, glicerilfosforilcolina y varias
glicoproteínas, y generalmente es de color amarillento
(Johnson y Everitt, 1980).
La maduración espermática en el epidídimo es
dependiente de las secreciones epiteliales, del transporte
de sodio y potasio, de los andrógenos, y de la
temperatura escrotal (Amann y Schanbacher, 1983). Los
cambios estructurales de los espermatozoides se deben a
la utilización de fosfolípidos y colesterol como sustratos
durante la maduración en el epidídimo. En estos cambios
se completa el proceso de condensación nuclear, los
espermatozoides pierden la gota citoplasmática, aumenta
la negatividad de la carga superficial, y ocurren ligeros
cambios en la morfología del acrosoma (Johnson y
Everitt, 1980).
2.2.3. Morfología del espermatozoide
El espermatozoide es una célula alargada especializada
cuya única función es fertilizar al ovocito y está formada por tres
componentes principales: cabeza, cuello y cola (Hafez, 1986).
La cabeza del espermatozoide contiene el material genético
y mide 8-10 micrones de largo, 4-5 micrones de ancho y 0.5
micrones de grosor (Hafez, 1986).
En la cabeza del espermatozoide se encuentran el núcleo
celular y el acrosoma. El núcleo es ovalado, aplanado, y la
cromatina está compactada y conformada por ADN unido a
histonas espermáticas (Salisbury et al, 1978).
27
El acrosoma tiene forma de capuchón y cubre el polo
anterior de la cabeza espermática (Salisbury et al, 1978). En la
región anterior tiene el cuerpo apical, y en la caudal tiene un
estrechamiento que conforma el segmento ecuatorial, asociado
a los procesos de envejecimiento celular (Salisbury et al, 1978).
Además, tiene una membrana acrosomal de doble pared, interna
y externa, conectadas por puentes; dichas membranas se
fusionan en su extremo caudal (Hafez, 1986).
El acrosoma contiene varias enzimas hidrolíticas (acrosina,
hialuronidasa, esterasas e hidrolasas ácidas) que participan
activamente en el proceso de la fecundación (Hafez, 1989).
Entre el núcleo espermático y el acrosoma se encuentra la
sustancia perinuclear (Me. Donald, 1991 ). La base del núcleo
está rodeada por la vaina post-acrosómica donde hay proteínas
ricas en azufre y receptores moleculares que reconocen al
ovocito durante la fecundación (Salisbury et al, 1978).
El cuello del espermatozoide es una estructura corta (0.4-1.5
micrones de largo) ubicada entre la cabeza y la pieza intermedia.
Tiene un centríolo rodeado de 9 fibras periféricas orientadas
longitudinalmente que se continúan con las fibras exteriores de
la pieza intermedia (Salisbury et al, 1978).
La cola del espermatozoide está dividida en 3 partes bien
diferenciadas: la pieza media, la pieza principal, y la pieza
terminal (Me. Dona Id, 1991 ).
La pieza media tiene 2 microtúbulos centrales y 9 dupletas
periféricas que constituyen el filamento axial. Estas estructuras a
su vez están rodeadas por 9 fibras exteriores orientadas
longitudinalmente y conectadas a las fibras del cuello. Además,
las mitocondrias dispuestas en patrón helicoidal conforman el
28
aparato metabólico y rodean las 9 fibras exteriores (Me. Donald,
1991 ). Un engrosamiento en forma de anillo señala el límite
entre la pieza media y la pieza principal (Salisbury et al, 1978).
La pieza principal es la porción más larga del flagelo, la
estructura del filamento axial es idéntica a la estructura de la
pieza media (Me. Donald, 1991 ), e igualmente está rodeado por
las fibras exteriores que son continuación de la pieza media
(Hafez, 1989).
2.2.3.1. Alteraciones de la morfología espermática
Las desviaciones morfológicas de la estructura normal
del espermatozoide son consideradas anormales. Las
anomalías espermáticas se han clasificado en primarias y
secundarias según la estructura anatómica en la que se
generan. La mayoría de los defectos de la cola del
espermatozoide también son considerados anomalías
primarias, entre ellas están el defecto en la pieza media,
"defecto dag", presencia de gota cito plasmática proximal,
cola fuertemente enrollada (Chenoweth, 1997).
La mayoría de los defectos de la cola del
espermatozoide también son considerados anomalías
primarias, entre ellas están el defecto en la pieza media,
"defecto dag", presencia de gota citoplasmática proximal,
cola fuertemente enrollada (Chenoweth, 1997).
Las anomalías espermáticas secundarias son aquellas
originadas dentro del epidídimo. Entre ellas se
encuentran: cabeza ancha, cabezas libres, membranas
del acrosoma separadas y dobladas, gota citoplasmática
distal, colas con curvas suaves, colas enrolladas en la
porción terminal (Chenoweth, 1997).
29
Se considera que al menos el 70 % de los
espermatozoides evaluados deben ser normales
(Chenoweth, 1997). El nivel de tolerancia máximo para los
defectos de cabeza es de 15-20%, mientras que el nivel
de tolerancia para los defectos de acrosoma y cola es de
25% (Chenoweth, 1997).
2.2.4. Espermatozoides
El espermatozoide es la única célula diseñada para
abandonar el organismo y así poder completar su función
biológica de unión al ovocito maduro durante la fecundación,
formando el zigoto.
El rol principal es el transporte de un paquete, constituido
por el genoma nuclear y el centriolo, hasta el ovocito. Para
realizar esta tarea, el espermatozoide está equipado con una
batería de estructuras especializadas los que garantizan la
interacción particular con el tracto genital femenino y el ovocito y
sus envolturas. Las cualidades que deben tener los
espermatozoides de un eyaculado fecundante son: motilidad
progresiva, morfología normal, metabolismo energético activo,
motilidad hiperactiva, integridad estructural y funcional de la
membrana, integridad de las enzimas asociadas con la
fecundación, capacidad de penetración y transferencia óptima
del material genético (Graham, 1996).
2.2.5. Concentración de espermatozoides/mi
El cálculo del número de espermatozoides por unidad de
volumen es el más importante criterio para la evaluación
potencial de un macho. La concentración es determinada
30
usando un hematocitómetro o cámara de Neubauer después de
una apropiada dilución (Rivera, 1998).
[ ] L = # de espermatozoides x 50 x 1 00 x 1 OOO=N/ml
Dónde:
# = La suma de espermatozoides.
50 = Superficie contada en la cámara de Neubauer.
100 = Es el grado de dilución del semen.
1 000 = transformación de mm3 a mi.
El resultado final se multiplica por la cantidad de eyaculado en
mi.
2.2.6. Motilidad
Es el movimiento que tienen los espermatozoides e indica el
grado de energía de los mismos.
La motilidad es una característica de la célula espermática y
se trata de uno de los parámetros más importantes en las
contrastaciones seminales, debido a que es imprescindible para
que se produzca la fecundación (Rivera, 1998). Los
espermatozoides pueden presentar dos tipos de movimiento:
);> Movimiento de rotación, (circular).
);> Movimiento progresivo (Lineal):
2.2.7. Motilidad individual:
Para observar el movimiento individual de las células se
mezcla una gota de semen con un pequeño volumen de una
solución salina fisiológica y se observa al microscopio bajo un
cubre objetos, con lente de gran aumento 40X (Pérez y Pérez,
1990).
31
El movimiento individual se observa rectilíneo y progresivo
además del porcentaje de espermatozoides que se mueven. Se
requiere como mínimo para un eyaculado un mínimo progresivo
de 70%. (Jara, 2000)
2.2.8 Motilidad masal
Es un movimiento de superficie que refleja la proporción de
espermatozoides que presentan algún tipo de movimiento. Para
observarlo se deposita una gota de semen puro y se coloca en
un portaobjetos, se examina en un microscopio óptico a 40X
aumentos y se valora la velocidad con la que se mueven los
remolinos que se forman en la superficie de la gota de semen.
Se les da una valoración de O a 5, siendo solamente utilizados
para inseminación aquellos que presenten una motilidad masal
buena (4) o muy buena (5).
2.2.9. Viabilidad
La viabilidad es el alargamiento de la vida útil de los
espermatozoides sin dañar las membranas plasmáticas se
valora de O a 1 00 %.
La rotura de la membrana plasmática está claramente asociada
con la pérdida de viabilidad celular, pero una membrana
plasmática intacta no siempre indica que la célula sea viable.
Los daños que pueden producirse en éstas pueden ser
modificaciones en su organización, permeabilidad y composición
lipídica.
2.2.1 O. Metabolismo del espermatozoide
La principal fuente de energía disponible para los
espermatozoides son los carbohidratos de sustrato extracelular,
y metabolizan rápidamente los monosacáridos como la glucosa;
pero tienen capacidad muy limitada para utilizar otros azucares o
32
carbohidratos más complejos, porque la glucosa se liga a
proteínas de transporte para atravesar la membrana plasmática
(Áivarez y Storey en 1984), donde la necesidad energética es
suplida en 90% por los sustratos exógenos y el restante 1 0% por
fuentes intracelulares como los fosfolípidos (Áivarez y Storey en
1984 ), dicen que este metabolismo produce cantidades
significativas de peroxido de hidrógeno en las mitocondrias, que
tiene un efecto adverso sobre las membranas por causar la
peroxidación de los lípidos, comprometiendo la integridad
estructural, la motilidad, y la viabilidad espermática (Áivarez y
Storey en 1984).
2.2.11. Dilutores
Los dilutores de espermatozoides contienen componentes
protectores que permiten la sobrevivencia fuera de tracto
reproductivo. Además de esto aumentan el volumen de la dosis
inseminante. Yema de huevo, leche y glicerol son los
componentes más adicionados para la protección de los
espermatozoides frente al descenso de temperatura. Las
lipoproteínas presentes en la leche y la yema de huevo protegen
a los espermatozoides del choque térmico. Substratos
metabolizables como glucosa constituyen la fuente de energía
para las células espermáticas. Los diluyentes deben contener
sustancias con alta capacidad tampón para neutralizarlos. Los
antibióticos son adicionados en forma rutinaria a los diluyentes
para retardar o eliminar el crecimiento de bacterias que
invariablemente contaminan el semen como consecuencia de la
recolección, los antibióticos más empleados son la penicilina G
potásica o sódica cristalina, la gentamicina o amikacina, la
estreptomicina o penicilina G-potásica cristalina. La combinación
de penicilina G-potásica cristalina con amikacina fue más eficaz
33
en el control de bacterias anaerobias. La presión osmótica y el
pH del diluyente deben ajustarse para favorecer la sobrevivencia
espermática. El pH de los diluyentes puede variar entre 6,7 y 7,2
sin afectar la calidad espermática durante el almacenamiento
(Pineda y Pinilla, 2007).
(Vaughan et al, 2003), los dilutores que mantuvieron mayor
número de espermatozoides vivos, como: tris tamponado 70%;
tryladil 65%; yema de huevo, glucosa y citrato 8%.
La yema de huevo se ha identificado con efectos positivos
en la refrigeración y la congelación de los gametos masculinos.
Es posible que permita intercambios de componentes lipídicos
con los espermatozoides durante la criopreservación (Maldjiana
et al, 2005).
(Westemdorf et al, 1975), Desarrollaron dos métodos de
congelación que pueden ser aplicados a nivel comercial y que en
esencia son los que se continúan utilizando hoy en día. Ambos
métodos utilizan diluyentes que están basados en la utilización
de la yema de huevo y glicerol como agentes crioprotectores,
una concentración elevada de azúcares y la adición de un
agente detergente (Orvus et paste). El método alemán utiliza un
medio que consta de lactosa (11 %) y yema de huevo (20%) y
envasa las muestras seminales en pajuelas de 5 mi.
Con respecto a los diluyentes, un punto clave durante el
proceso de enfriamiento y congelación son sus lípidos. Los
lípidos desempeñan un papel clave durante la criopreservación
de semen porcino. Algunas fracciones lipídicas han sido
identificadas de gran importancia en la protección de los
espermatozoides. Sin embargo, ningún componente lipídico ha
sido capaz de imitar y sustituir la yema de huevo en los
34
procedimientos de congelación, lo que puede sugerir que la
sinergia de varios componentes que figuran en la yema de ,
huevo como son los antioxidantes, y micro elementos, pueden
ser claves en el proceso (Maldjiana et al, 2005).
2.2.12. Crioprotectores
En el primer grupo se encuentran las sustancias que poseen
bajos pesos moleculares (Mizukami et al, 1999) y que, por lo
tanto, penetran al citoplasma (Holt, 2000), tales como glicerol,
metano!, etilenglicol, 1 ,2- propanodiol, butanediol, aceta mida y
dimetil sulfóxido (DMSO). El segundo grupo reúne aquellas
sustancias que no penetran la membrana celular debido a su
alto peso molecular como el polivinil alcohol (PVA), hialuronato
de sodio y la albúmina (Mizukami et al, 1999).
Así mismo, se demostró que concentraciones de 7.5% de
DMSO resultaban en altas tasas (p<0.05) de movilidad
espermática, porcentaje de fertilización (54±5.6%) y protección a
la ultraestructura (membrana citoplasmática) en comparación
con aquellas células en donde la concentración de DMSO era
baja (2.5%) (He y Woods, 2004). No obstante, cuando los
niveles de DMSO se elevan a una concentración de 15%,
provocan daños en la membrana en cerca del 61% de las
células espermáticas y de un 23% en membrana nuclear (Taddei
et al., 2001).
(Polge et al, 1949), menciona que desde el descubrimiento
del glicerol como agente crioprotector efectivo de la membrana
contra el descenso de temperatura es la yema de huevo. A
diferencia de la refrigeración del semen, el proceso de
congelación necesita también del empleo de un agente
crioprotector que permita un descenso mayor de la temperatura.
35
Desde el descubrimiento del glicerol como agente crioprotector
efectivo (Polge et al. 1949) Sin embargo la utilización
generalizada de semen congelado no se ha extendido en las
otras especies domésticas (Parks y Graham, 1992).
El crioprotector permite a las células sobrevivir a las tasas de
enfriamiento lo suficientemente lentas como para permitir la
salida de agua intracelular y así evitar la formación de hielo
intracelular. La fracción de agua no cristalizada y la formación de
hielo alcanzan un equilibrio cuando la fracción de agua no
congelada es muy baja y la concentración de solutos es muy
alta. De esta manera, el crioprotector hace que el punto de
equilibrio se alcance antes de forma que la concentración de
solutos no llegue a ser demasiado alta. Otra acción del
crioprotector es la formación de puentes de hidrógeno con los
grupos polares de la cabeza de los lípidos de membrana,
logrando reemplazar el agua bajo condiciones de deshidratación.
El crioprotector previene la cristalización eutéctica al aumentar la
viscosidad de los solutos del medio. Por lo tanto, tenemos dos
funciones importantes del crioprotector: minimizar el efecto
solución y aumentar la viscosidad de las soluciones intra y
extracelulares produciendo una salida de agua más lenta
(Bwanga, 1991 ).
(Gao et al, 1993), por lo general se añade el crioprotector en
medios de yema al semen después de enfriarlo y esta
incorporación debe ser por etapas lo que permite una mayor
proporción de espermatozoides sobrevivientes.
(Olivares y Urdaneta, 1985), emplearon 14% de glicerol en
la fracción 8 a base de yema y citrato, es decir quedando una
concentración final de 7 % de glicerol, este proceso es general
36
en la criopreservacion de semen, y para el periodo de
estabilización un tiempo entre 3 a 6 horas.
La yema de huevo se ha identificado con efectos positivos
en la refrigeración y la congelación de los gametos masculinos.
Es posible que permita intercambios de componentes lipídicos
con los espermatozoides durante la criopreservación (Maldjiana
et al, 2005).
2.2.13. Método de extracción de los espermatozoides
epididimarios de CSA.
Lavado del epidídimo.
Esta técnica consiste en la disección de los epidídimos y
posterior lavado de los mismos con soluciones apropiadas. En
general se utiliza en especímenes de matadero o en animales
muertos de alto valor genético, ya que inutiliza al animal para
reproducción.
2.2.14. Método de refrigeración
El proceso de refrigeración forma parte del proceso de
congelación del semen; sin embargo, también puede utilizarse
como método de conservación a corto plazo para lo que necesita
medios diluyentes adecuados que deben contener componentes
específicos, es decir, una solución tampón, sales, azúcares y
sustancias que aporten una cierta protección de la membrana
contra el descenso de temperatura, como la yema de huevo. A
diferencia de la refrigeración del semen, el proceso de
congelación necesita también del empleo de un agente
crioprotector que permita un descenso mayor de la temperatura.
Hafez (2002), recomienda que luego de la mezcla realizada
se enfría gradualmente hasta 5 oc en todas las especies excepto
37
en el verraco que suele mantenerse a 15 °C. El enfriamiento
debe ser lento, tomando por lo menos 1 hora, este proceso suele
realizarse protegiendo con un recipiente en una camisa de agua
para amortiguar el shock térmico.
Gueto et al (2003), el enfriamiento se realiza a razón de 2 oc cada 3 minutos y permanece a 5 °C durante 45 a 60 minutos
antes de proceder al agregado del diluyente 8 que contiene el
crioprotector.
Hu anca y Gauly (2001 ), para la conservación del semen
refrigerado en llamas, se evaluó la acción de BSA + glucosa,
desde una motilidad inicial de 57.6 %, descendió a 43.0% a las
24 horas, hasta este porcentaje es aceptable para realizar la
inseminación artificial, por lo que se recomienda su uso, a partir
de las 24 horas la motilidad va descendiendo progresivamente.
2.3. Hipótesis
Ha = Los dilutores Tris, Sp-talp y Andromed tienen mejor influencia
sobre la viabilidad de espermatozoides epididimarios de alpaca
(Lama pacos) a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas en refrigeración.
Ho =Los dilutores Tris, Sp-talp y Andromed no influyen sobre la
viabilidad de espermatozoides epididimarios de alpaca (Lama
pacos) a 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas en refrigeración.
2.4. Definición de términos básicos
Anormalidades espermáticas: Consiste en determinar el porcentaje
de espermatozoides anormales presentes en el eyaculado.
Concentración espermática: Consiste en determinar el número de
espermatozoides por mi o cm3.
38
Crioprotector.-son sustancias de alta solubilidad y toxicidad a altas
concentraciones, por lo que deben tener bajo peso molecular para
entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener máximo protector.
Además un buen crioprotector debe inhibir la acción enzimática,
disminuyendo, e inclusive eliminando la actividad de radicales libres
responsables de lisis celular, antes, durante y después de la
congelación y descongelación
Diluyente: Es la solución acuosa que permite aumentar el volumen
del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias y preservar las
características funcionales de las células espermáticas y mantener el
nivel de fertilidad adecuado.
Dilutor.- es un diluidor gravimétrico que realiza diluciones basadas
en el control de peso.
Espermatozoide: Es la única célula diseñada para abandonar el
organismo y así poder completar su función biológica de unión al
ovocito maduro durante la fecundación, formando el zigoto.
Motilidad espermática.- Es la capacidad de los espermatozoides
para moverse en un espacio determinado.
Mortalidad espermática: es el número de muertos de los
espermatozoides en una población determinada de muestra y durante
un espacio de tiempo dado.
Semen: esperma, fluido secretado por el pene al final del coito que
contiene los espermatozoides ( espermios del macho) y secreciones
acompañantes.
39
CAPÍTULO 111
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Lugar de ejecución
El presente trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de
Biotecnologías Reproductivas de la Universidad Nacional de
Huancavelica, que está ubicado en el distrito, provincia y
departamento de Huancavelica. A una altitud de 3,680 msnm, longitud
oeste 7 4° 98' y 12° 78' latitud sur; el clima es trio, siendo la
temperatura media anual que varía entre 8 a 12 °C y una
precipitación pluvial anual de 829.6 mm.
3.2. Materiales y equipos.
3.2.1. Material biológico.
~ 60 pares de Testículos (alpaca).
3.2.2. Equipos de laboratorio
~ Microscopio óptico.
~ Micropipeta.
~ Cámara de flujo laminar.
~ Centrifuga.
~ Balanza de precisión.
~ Refrigeradora.
~ Platina temperada.
~ Cámara fotográfica.
40
3.2.3. Materiales de trabajo en laboratorio.
~ Caja tecnoport.
~ Guardapolvo.
~ Mascarillas descartables.
~ Gorras descartables
~ Guantes quirúrgico descartable estéril.
~ Bolsas polietileno.
3.2.4. Herramientas de laboratorio
~ Tubos falcón.
~ Cámara de neubauer.
~ Tejera recta.
~ Portaobjeto.
~ Cubreobjetos.
~ Micropuntillas.
~ Puntillas para micropipetas de 0,5- 1 O u l.
~ Puntillas para micropipetas de 20 - 1 00 u l.
~ Puntillas para micropipetas de 100 - 1 000 u l.
~ Micropuntillas
~ Agua bidestilada.
~ Placas Petri.
3.2.5. Materiales de escritorio
~ Computadora.
~ Regla de 30 centímetros.
~ Papel bond A4 de 80 gr.
~ Impresiones.
~ Lapiceros.
~ Cuaderno de apuntes.
~ Plumón indeleble.
~USB.
41
};> Paquete estadístico SAS 9.2.
3.2.6. Dilutores y Reactivos.
};> sp-talp.
};> tris.
};> andromed.
};> Eosina.
};> Yema de huevo.
};> Nigrosina.
};> Agua bidestilada.
};> Suero fisiológico al 9%.
};> Alcohol de 90°.
3.3. Metodología
3.3.1. Toma de muestra.
Para la experimentación, utilizamos 60 pares de testículos de las
alpacas sacrificados, todos de raza Huacaya y seleccionados de
buen tamaño de testículo libre de enfermedades ginecológicas
de una edad homogénea (boca llena), para la evaluación
microscópica de los espermatozoides epididimarios refrigerados
en distintos tiempos. A estos testículos se realizó análisis en tres
tratamientos (dilutores) y 6 bloques (horas) cada uno con sus
respectivas identificaciones para cada repetición de tratamientos
acuerdo al siguiente detalle:
T1 (dilutor tris)=evaluación porcentual de espermatozoides vivos,
motilidad y concentración a 0,4, 8, 12, 24 y 48 horas.
T2 (dilutor sp-talp)=evaluación porcentual de espermatozoides
vivos, motilidad y concentración a 0,4, 8, 12, 24 y 48 horas.
42
T3 (dilutor andromed)=evaluación porcentual de
espermatozoides vivos, motilidad y concentración a 0,4, 8, 12,
24 y 48 horas.
Los testículos fueron seleccionados según el tamaño y a la edad
del animal.
3.3.2. Ordeño de espermatozoides epididimarios
Los testículos fueron lavados con solución fisiológica a 37 oc, y se separaron las colas epididimarios mediante un corte con
ayuda de una tijera recta.
Se colocó epidídimos en placas Petri estériles, cada una de
las muestras se diluyó agregando dilutores a igual volumen (1
mi/muestra); a una temperatura de 37 oc.
Los epidídimos fueron prensados suavemente con pinza
para lograr la salida de los espermatozoides de los conductos
epididimarios, y luego las muestras fueron almacenados en un
tubo eppendorf de 1 mi, de acuerdo a lo descrito por (Morton et
al, 2007), evaluándose la viabilidad, vivos, muertos y
concentración espermática.
3.3.3. Evaluación de espermatozoides vivos y muertos
Se evaluó la viabilidad de espermatozoides a post
refrigeración de todas las muestras por medio de coloración con
eosina nigrosina, sobre un portaobjeto colocando 1 O ul de
colorante y 1 Oul de espermatozoide diluido, de esta forma se
mezcló y se dejó sobre una platina temperada a 3rc durante
dos minutos antes de realizar un extendido con otro portaobjeto;
luego se fijó en la platina temperada durante 1 minuto para
contar 200 células en microscopio de contraste de fases con
43
objetivo de 40X, considerando como vivos a los
espermatozoides que no aceptaron el colorante (trasparente) y
como muertos a los coloreados.
3.3.4. Evaluación de la motilidad de espermatozoides
Las evaluaciones de motilidad individual realizamos al
microscopio utilizando objetivo de 40X, colocando una gota de
1 Oul de muestra en un portaobjeto para su respectiva
observación de motilidad individual y se calificó en forma
subjetiva por un mismo evaluador en un mínimo tiempo (1
minuto) considerando como porcentaje de espermatozoides con
motilidad normal; los que mostraron un patrón de movimiento
v1goroso, progresivo y homogéneo. La evaluación se realizó a
partir de una muestra de cada tratamiento para ello se toma en
cuenta como: 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas, el procedimiento fue
lo mismo para todos.
3.3.5. Determinación de concentración de espermatozoides
Se utilizó un hemocitómetro (cámara de Neubauer), también
se utilizó una micropipeta de 1 O micro litros y una micropipeta de
1000 microlitros. Posteriormente se le agrega con la otra
micropipeta 990 microlitros de agua destilada para así poder
obtener una dilución de 1: 100. Después de la dilución,
enseguida se realizó el llenado de la cámara neubauer, para
hacer el conteo respectivo con el objetivo 40X se localizó el área
central de la cámara. Esta área está formada por 25 cuadros,
subdivididos a su vez en 16 cuadros más pequeños. Una vez
localizada en el área de observación, se realizó el conteo,
considerando únicamente los espermatozoides presentes en los
5 cuadros grandes del rayado; los cuatro de las esquinas y uno
del centro, se hizo el conteo tanto en la parte anterior y posterior
44
~1
de la cámara. Los espermatozoides que pasaron la línea central
del cuadro no fueron contados y los que estaban dentro del
cuadro si fueron contados. Se utilizó un contador manual para
esta operación.
3.3.6. Refrigeración de muestras.
Las evaluaciones de la viabilidad de los espermatozoides
realizamos al microscopio utilizando objetivo de 40X, colocando
una gota de 1 Oul de muestra en un portaobjeto para su
respectivo conteo en distintos puntos llegando a utilizar un
patrón a base de 200 espermatozoides; la evaluación se realizó
a partir de una muestra de cada tratamiento para ello se toma
en cuenta como: 00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas, el procedimiento
fue el mismo para todos.
3.3.7. Diseño experimental
Para la presente investigación se trabajó con 60 pares de
testículos de alpacas sacrificados en el camal municipal de
Huancavelica, las cuales formaron tres tratamientos y 6 bloques
cada una con 20 repeticiones, para el presente trabajo se utilizó
el diseño de bloques completamente al azar (DBCA), y para el
análisis estadístico se usó el modelo aditivo lineal expresado en:
Dónde:
Yijk = u = Ti = Bj = Eijk =
1 Yljk =u+ Ti+ Bj + Eijk 1
% de motilidad y % de vivos y muertos. Media general de los espermatozoides vivos y muertos Efecto del dilutor adicionado con Tris, Sp-talp y Andromed tomado como fijo tres tratamientos. Efecto del tiempo (00, 04, 08, 12, 24 y 48 horas en refrigeración). Error aleatorio en cada tratamiento.
45
3.3.8. Análisis estadístico
Se utilizó el procedimiento del modelo aditivo lineal con
programa estadístico SAS 9.2 español, para el cálculo de
análisis de varianza y para la comparación de medias se utilizó
la prueba de Duncan a un nivel de confianza de 0.05.
46
CAPITULO IV
RESULTADOS
4.1. Presentación de resultados
4.1.1. Cuadro N° 01: Comparación de los dilutores
%DE %DE TRATAMIENTOS CONCENTRACIÓN
VIVOS MOTILIDAD
TRIS YEMA 56,6a 56,2a 78,475.000
millones/mi
ANDROMED 49.8a 48.2a 77,250.000
millones/mi
SP-TALP 27.3b 24.8b 75,545.000
millones/mi
Fuente: Elaboración propia.
Los resultados que se presentan en el cuadro N° 01 el dilutores
Tris cuenta con 56,6a % de espermatozoide viables, con una
motilidad de 56,2a % y con una concentración de 78,475.000
Millones/mi por lo tanto no es significativamente diferente al
dilutor Andromed que cuenta con 49.8a% de viabilidad, con 48.2
47
% de motilidad y una concentración de 77,250.000 millones/mi
siendo estos dilutores similares y superiores a el dilutor Sp talp
que solo cuenta con 27.3b% de espermatozoides vivos, 24.8b%
de motilidad y con una concentración de 75,545.000 millones/mi
con estos resultados concluimos que la viabilidad de los
espermatozoides se lograron con los dilutores Tris y Andromed
siendo recomendables para el uso mejores que el dilutor Sp-talp.
4.1.2. Cuadro N° 02: Resultados obtenidos en porcentaje de
Espermatozoides vivos
TRATAMIENTOS
BLOQUES Tris Sp -talp Andromed Promedios
yema (1) (2) (3) %
O horas ( 1) 84 85 81 83a
4 horas (2) 76 49 79 68ab
8 horas (3) 68 21 58 49bc
12 horas (4) 58 6 50 38cd
24 horas (5) 34 3 27 21de
48 horas (6) 20 o 4 Se
Promedios 56,6a 27,3b 49,7a
%
Fuente: Elaboración prop1a.
Según los resultados obtenidos en el cuadro N° 2, se observa
que no hay diferencias significativas entre los tres tratamientos
(dilutores), para las cero horas; a partir de las 4 horas difieren
significativamente los resultados.
48
Gráfico N° 01 Resultados de espermatozoides vivos
PROMEDIO DE ESPERMATOZOIDES VIVOS
90 VI
g 80
> 70 VI w o 60 o N 50 o !i 40
~ 30 w e; 20 w
~ 10 "#.. o
o 4 8 12 24 48
HORAS HORAS HORAS HORAS HORAS HORAS
Fuente: Elaboración propia.
-TRIS YEMA%
-SP-TALP%
-ANDROMED%
Los resultados de porcentaje de la viabilidad de
espermatozoides epididimarios de alpaca según la grafico
observamos que los dilutores tris y andromed se conservan
mejor hasta las 8 horas que alcanza con una viabilidad de 68 %
y 58% para tris y andromed respectivamente.
4.1.3. Cuadro N° 03: Motilidad de Espermatozoides
Porcentaje de motilidad BLOQUES TRATAMIENTOS
tris yema Sp-talp Andromed promedios (1) (2) (3)
O horas (1) 84 82 84 83,2a 4 horas (2) 74 48 71 64,2ab 8 horas (3) 66 14 57 45,7bc
12 horas (4) 57 4 47 36,1cd
24 horas (5) 35 1 27 21,0de
48 horas (6) 21 o 3 8,0e
promedios 55,9 24,9 48,2 Fuente: Elaboración prop1a.
49
Gráfico N° 02 porcentaje de motilidad espermatozoides vivos
PROMEDIO DE MOTILIDAD
o
90
80
70
~ 60
~ so o ~ 40 w o 30 ~
20
10
o o 4
-TRIS YEMA
-SP-TALP
-ANDROMED
8 12 24 48
HORAS HORAS HORAS HORAS HORAS HORAS
Fuente: Elaboración propia.
Los resultados observados en el gráfico N° 2 el porcentaje de
motilidad de espermatozoides alcanzan una motilidad
epididimarios de alpaca según la grafico observamos que los
dilutores tris y andromed se conservan mejor hasta las 12 horas
con un 57% y 47% de motilidad con una motilidad inicial de 84%
para ambos dilutores por lo que se recomienda su uso a partir de
00 a 12 horas.
4.1.4. Cuadro N° 04: Resultados obtenidos en concentración de
Espermatozoides epididimarios.
DILUTORES NUMERO DE ESPERMATOZOIDES/ML
TRIS YEMA 78,475.000 millones/mi
SP-TALP 75,545.000 millones/mi
ANDROMED 77,250.000 millones/mi
PROMEDIO 77,090.000 millones/mi
Fuente: Elaboración prop1a.
so
En el cuadro N° 04 se observa la cantidad de espermatozoides
epididimarios para el dilutor tris alcanzó 78,475.000 millones/mi
estos datos son considerado como media del total de 20
repeticiones por bloque en cada tratamiento (dilutor) se realizó el
mismo procedimiento para cada tratamiento donde el sp- talp
75.545.000 millones/mi y andromed tuvo una concentración
77.250.000 millones/mi de espermatozoides, finalmente como
promedio total es 77,090.000 millones/mi de espermatozoides
epididimarios de alpacas de edad boca llena.
51
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
En presente estudio se logró evaluar el porcentaje de espermatozoides
vivos obtenidos del epidídimo de alpacas machos de edad boca llena,
donde con los dilutores tris y Andromed logramos obtener mejor
influencia sobre la viabilidad de espermatozoides con los siguientes
resultados 56,6% - 56,2% con una concentración de 78,475.000
millones/mi espermatozoides epididimarios de alpacas de edad boca llena
para el dilutor tris en cambio con el dilutor Andromed logramos un 49.8%
y 48.2% de espermatozoides vivos y motilidad, respectivamente por otra
parte la concentración espermática es 77,250.000 millones/mi, de esta
forma se obtuvo una viabilidad adecuada hasta las 12 horas, Los
resultados por (Bravo, 2002) ensayó varios dilutores para semen de
alpacas, entre ellos leche descremada, PBS, glucosa-citrato, yema
glucosa-citrato, triladyl, tris, de todos estos el mejor dilutor encontrado fue
el tris, se utilizaron PBS, leche descremada y glucosa-yema-citrato,
obteniéndose 61.1, 60.8 y 64.0 % de espermatozoides vivos
respectivamente en el momento de la colección, estos porcentajes
disminuyeron después de dos horas de incubación en agua a 37°C a 22.2,
15.6 y 35.4% respectivamente.
De acuerdo a los resultados mostrados en el cuadro No 01 los dilutores
que muestran mejores resultados en cuanto a los espermatozoides vivos
52
son los dilutores tris y Andromed con promedio de vida que alcanzaron
56,6% y 49.8 % de vida, por lo tanto no son significativamente diferentes
pues los resultados son similares siendo estas las más recomendables
frente al resultado 27.3 del dilutor sp talp. De la misma forma la motilidad
del tris y Andromed son los siguientes 56,2 y 48.2 expresados en
porcentaje respectivamente, no existe diferencia significativas entre
ambos dilutores, pero estas si difieren con el dilutor sp- tal siendo este
último el menos indicado para la refrigeración a 4°C de temperatura donde
fueron evaluados los espermatozoides epididimarios
Es necesario mencionar que los tres dilutores tuvieron una motilidad
inicial entre 84% - 82% de las cuales el dilutor sp tal descendió abismal
hasta las 04 horas en terca 45%de motilidad. Mientras que los dilutores
tris y Andromed tuvieron mejor el comportamiento hasta las 12 horas con
57 y47 % de motilidad tiempo similar a los que menciona (Huanca y
Gauly, 2001), donde para la conservación del semen refrigerado en
llamas, evaluó la acción de BSA + glucosa, desde una motilidad inicial de
57.6 %, descendió a 43.0% a las 24 horas, hasta este porcentaje(%) es
aceptable para realizar la inseminación artificial.
De acuerdo a los resultados obtenidos las concentraciones de
espermatozoides obtenidos a partir del epidídimo mas no de la
eyaculación del animal siendo los resultados que a continuación es de
77,090.000 millones/mi dato del promedio de la concentración de los
espermatozoides de los tres dilutores las que consideramos que no
coincidimos por Según reportados por (Camacho, 2000), la cifra media de
concentración del eyaculado completo del verraco es de 300,000
espermatozoides por mm3 cabe señalar este último dato es obtenido
como resultado del eyaculado de verraco sea muy posible por las
diferentes especies y la técnica de extracción de espermatozoides las que
no coincidan con nuestros resultados.
53
CONCLUSIÓN
De acuerdo a nuestros resultados existe la influencia de los dilutores
sobre la viabilidad de los espermatozoides epididimarios siendo mejores
el Tris y Andromed.
Desde las 00 horas hasta las 12 horas los espermatozoides
epididimarios se considera recomendable pues cuenta con porcentajes de
espermatozoides vivos recomendados para la inseminación artificial en
alpacas.
La motilidad de los espermatozoides a partir de las 12 horas desciende
considerablemente en refrigerado no siendo indicado para el uso de los
dilutores tris, y andromed.
El dilutor sp talp es recomendable usar hasta las 4 primeras horas
pues a partir de las 08 horas ya no es recomendable el uso de este
dilutor, el porcentajes de motilidad disminuyo rápidamente alcanzando
alrededor del 90 % de descenso respectivamente.
Los valores de la concentración de espermatozoides alcanzaron
77,090.000 millones/mi. En promedio, las mismas que garantizan una
buena viabilidad para la inseminación artificial.
La concentración se determinó 77,090.000 millones/mi de
espermatozoides extraídas a partir de la cola epididimaria, y el cual es
recomendable para inseminación artificial.
54
RECOMENDACIÓN
1. Se recomienda inseminar alpacas con semen refrigerados de acuerdo
a los protocolos alcanzados en el presente estudio con el uso de los
dilutores Tris, Sp-talp y Andromed.
2. Para la conservación de espermatozoides epididimarios en alpacas se
recomienda utilizar los dilutores tris y andromed como una alternativa
hasta las 12 horas pues como primera opción es el dilutor tris 58% y
en segunda opción el andromed 50% ambos dilutores cuentan con los
promedios de vida aceptable trabajos en inseminación artificial en
alpacas.
3. Se recomienda evaluar minuciosamente de la motilidad antes de tomar
cualquier decisión pues estas deben contar como mínimo un 80% de
motilidad porcentajes mayores a este garantizaran una buena viabilidad
y por ende una mejor fertilidad.
4. Se recomienda tomar en cuenta la concentración de espermatozoides
que existe en 1 mi. Toda vez nos indicara confianza para determinar la
viabilidad de espermatozoides y su capacidad fecundante en alpacas.
55
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trabajo para optar al título de médico veterinario; Universidad de la
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245-257.
61
ANEXOS
62
BASE DE DATOS
Cuadro N° 1 A. Base de datos en número de espermatozoides vivos con
dilutor tris.
HORAS
N°DE
RE PETICIONE o 4 8 12 24 48
S
1 158 144 125 112 75 48
2 162 145 133 95 88 42
3 157 132 135 95 85 68
4 169 163 128 131 82 63
5 175 157 149 151 132 99
6 172 167 132 119 77 54
7 182 114 122 66 31 19
8 173 164 103 126 47 36
9 166 156 140 136 100 24
10 155 132 124 123 110 60
11 174 165 138 111 39 20
12 183 172 165 133 78 44
13 192 172 168 166 58 34
14 123 168 175 69 25 21
15 165 143 105 95 33 29
16 186 156 152 95 47 36
17 149 132 113 135 95 48
18 156 120 114 105 35 28
19 168 163 155 143 76 23
20 189 180 140 108 44 10
152,2 135, 115, 67,8 PROMEDIOS 167,7 40,3
5 8 7 5
Fuente: Elaboración propia
63
Cuadro N° 2 A. Base de datos número de espermatozoides vivos con
dilutor Sp-talp.
HORAS
N°DE REPETICIONE o 4 8 12 24 48
S 1 159 142 85 43 13 o 2 189 97 62 14 6 o 3 166 143 98 45 39 o 4 149 113 77 42 16 o 5 160 127 86 45 32 o 6 142 77 15 o o o 7 172 68 17 o o o 8 195 43 17 o o o 9 192 132 43 11 o o 10 165 107 17 o o o 11 159 111 7 o o o 12 184 67 14 o o o 13 169 72 27 o o o 14 185 129 17 o o o 15 156 123 19 9 o o 16 177 76 19 11 o o 17 158 67 61 10 o o 18 167 92 68 19 o o 19 191 75 43 2 2 o 20 161 96 39 6 o o
PROMEDIO 169,
8 97,85 41,55 12,85 5,4 o
Fuente: Elaboración prop1a
64
Cuadro N° 3 A. Base de datos número de espermatozoides vivos con
dilutor andromed.
HORAS
N°DE RE PETICIONE o 4 8 12 24 48
S 1 157 142 87 4 o o 2 226 210 192 130 68 12
3 190 97 78 45 25 o 4 126 222 150 149 64 9
5 190 198 68 50 25 o 6 194 174 123 112 55 16
7 150 158 67 84 o o 8 189 228 172 160 41 6
9 117 201 116 77 34 7
10 220 118 104 83 76 o 11 133 104 100 93 2 o 12 130 117 122 117 65 o 13 172 156 142 107 92 o 14 142 132 108 98 98 o 15 117 181 132 145 130 30
16 169 158 95 68 35 24
17 196 145 113 126 62 o 18 148 140 125 114 45 25
19 145 140 108 105 85 o 20 132 156 112 117 76 12
PROMEDIO 162,1 158,8
5 5
115,
7 99,2 53,9 7,05
Fuente: Elaboración prop1a
65
Cuadro N° 4 A. Base de datos % de motilidad de espermatozoides con
dilutor tris.
HORAS
N°DE REPETICIONE o 4 8 12 24 48
S 1 90 80 70 70 35 30
2 90 70 60 57 40 25
3 80 80 70 40 40 25
4 85 70 60 60 35 30
5 95 90 80 80 60 50
6 80 80 68 55 45 30
7 78 50 50 35 20 8
8 80 65 50 60 30 15
9 85 75 70 60 50 15
10 80 74 70 70 60 35
11 85 82 75 50 15 12
12 80 80 80 65 40 20
13 85 80 80 70 38 17
14 90 83 80 45 10 6
15 75 63 50 50 15 10
16 85 68 60 35 25 20
17 80 70 65 70 50 30
18 80 65 50 50 30 15
19 85 75 70 60 45 12
20 85 75 60 50 15 5
PROMEDIOS
% 83,65 73,75 65,9 56,6 34,9 20,5
Fuente: Elaboración prop1a
66
¿q
Cuadro N° 5 A. Base de datos % de motilidad de espermatozoides dilutor
Sp-talp.
HORAS
N°DE REPETICIONE o 4 8 12 24 48
S 1 85 60 40 15 5 o 2 88 48 15 3 1 o 3 80 65 43 20 5 o 4 80 50 30 22 7 o 5 85 72 45 15 6 o 6 85 40 3 o o o 7 80 40 3 o o o 8 85 40 3 o o o 9 90 70 5 2 o o 10 85 50 4 .o o o 11 75 50 2 o o o 12 85 20 2 o o o 13 80 40 4 o o o 14 85 60 3 o o o 15 83 50 3 1 o o 16 80 30 4 3 o o 17 79 45 15 2 o o 18 80 42 16 3 o o 19 80 35 20 1 o o 20 78 45 15 1 o o
PROMEDIO% 82,40 47,60 13,75 4,40 1,20 o Fuente: Elaboración prop1a
67
Cuadro N° 6 A. Base de datos % de motilidad de espermatozoides con dilutor andromed.
HORAS
N°DE REPETICIONE o 4 8 12 24 48
S 1 85 70 35 2 o o 2 80 78 70 60 15 4
3 85 38 35 32 10 o 4 80 78 70 60 15 4
5 75 38 35 32 o o 6 85 80 73 70 41 5
7 80 55 30 20 13 1
8 95 85 65 60 35 10
9 85 80 50 20 13 1
10 90 87 70 60 45 o 11 80 78 52 32 0.8 o 12 88 75 75 70 40 o 13 75 70 60 55 45 o 14 85 60 60 50 40 o 15 90 80 72 70 60 15
16 80 70 40 30 25 15
17 82 80 60 50 20 o 18 85 80 70 60 15 10
19 80 70 65 55 40 o 20 85 70 60 55 40 3
PROMEDIO% 83,5 71,1 57,35 47,15 26,95 3,4
Fuente: Elaboración propia
68
¡q
Cuadro N° 7 A. Base de datos Concentración de espermatozoides millones/mi.
DILUTORES
N°DE TRIS SP-TALP ANO ROMEO REPETICIONES YEMA
1 95,000.000 78,000.000 78,500.000
2 86,000.000 90,000.000 77,500.000
3 75,000.000 16,700.000 85,000.000
4 68,000.000 45,000.000 77,500.000
5 75,000.000 75,000.000 85,000.000
6 60,000.000 77,500.000 79,000.000
7 75,000.000 75,000.000 90,000.000
8 80,000.000 87,500.000 67,500.000
9 57,500.000 100,000.000 80,000.000
10 85,500.000 90,000.000 87,500.000
11 77,500.000 97,500.000 90,000.000
12 60,000.000 72,500.000 75,000.000
13 70,000.000 75,000.000 82,500.000
14 96,000.000 92,500.000 90,000.000
15 76,000.000 92,000.000 48,000.000
16 85,000.000 95,000.000 82,500.000
17 95,000.000 75,200.000 42,500.000
18 87,500.000 37,500.000 82,500.000
19 82,500.000 82,000.000 57,000.000
20 83,000.000 57,000.000 87,500.000
PROMEDIO 78,475.000 75,545.000 77,250.000
Fuente: Elaboración propia
69
f7
Cuadro N° 8 A. Base de datos porcentaje de espermatozoides vivos para correr es programa SAS ., 9 2 - 1 vers1on . en espano .
o/o DE BLOQUE DILUTORE HORA
ESPERMATOZOIDES S S S
VIVOS
1 1 o 84
2 1 4 76
3 1 8 68
4 1 12 58
5 1 24 34
6 1 48 20
7 2 o 85
8 2 4 49
9 2 8 21
10 2 12 6
11 2 24 3
12 2 48 o 13 3 o 81
14 3 4 79
15 3 8 58
16 3 12 50
17 3 24 27
18 3 48 4
Fuente: Elaboración propia
70
Cuadro N° 9 A. Base de datos porcentaje de motilidad espermatozoides para correr es programa SAS versión 9.2 en español.
%DE ESPERMATOZOIDES BLOQUES DILUTORES HORAS
VIVOS
1 1 o 84
2 1 4 74
3 1 8 66
4 1 12 57
5 1 24 35
6 1 48 21
7 2 o 82
8 2 4 48
9 2 8 14
10 2 12 4
11 2 24 1
12 2 48 o 13 3 o 84
14 3 4 71
15 3 8 57
16 3 12 47
17 3 24 27
18 3 48 3
Fuente: Elaboración propia
71
PORCENTAJE DE ESPERMATOZOIDES VIVOS
Cuadro N° 10 A: Base de datos procesados con programa SAS, Porcentaje de espermatozoides vivos
- ~r - -
• ... ' • ' • - ~ ~ ~ 1 ~~ '
. .
1 1 o 84 2 1 4 76 3 1 8 68 4 1 12 58 5 1 24 34 6 1 48 20 7 2 o 85 8 2 4 49 9 2 8 21 10 2 12 6 11 2 24 3 12 2 48 o 13 3 o 81 14 3 4 79 15 3 8 58 16 3 12 50 17 3 24 27 18 3 48 4
Cuadro N° 11A: Base de datos procesados con programa SAS, ANALISIS DE VARIANZA ANOVA
Información de nivel de clase
Clase Niveles Valores
DILUTOR 3 1 2 3
HORAS 6 o 4 812 24 48
Número de observaciones leídas 18
Número de observaciones usadas 18
72
CUADRO N° 12 A: Análisis de varianza suma de cuadrados valor significativo
Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr
>F
Modelo 7 14801.72222 2114.53175 16.59
<.0001
Error 10 . 1274.55556 127.45556
Total corregido 17 16076.27778
R-cuadrado CoefVar Raíz MSE Respuesta Media
0.920718 25.30675 11.28962 44.61111
Cuadrado de
Fuente DF Anova SS la media F-Valor
Pr> F
HORAS 5 11974.94444 2394.98889 18.79
<.0001
DILUTOR 2 2826.77778 1413.38889 11.09
0.0029
CUADRO N°13 A: Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, sp-t 1 d d a p y an rome Prueba del rango múltiple de Duncan para respuesta
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error de cuadrado medio 127.4556
Rango crítico 14.52 15.18
Duncan Agrupamiento Media N Dilutor
A 56.667 6 1
A 49.833 6 3
8 27.333 6 2
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
73
/~
l } CUADRO N°14 A: porcentaje de motilidad a diferentes horas
PRUEBA DEL RANGO MUL TIPLE DE DUNCAN PARA
RESPUESTA
Alpha 0.05
Error Oegrees of Freedom 10
Error de cuadrado medio 127.4556
Número de medias 2 3 4 5
6
Rango crítico 20.54 21.46 22.01 22.35
22.59
Duncan Agrupamiento Media N Horas
A 83.333 3 o 8 A 68.000 3 4
8 e 49.000 3 8
o e 38.000 3 12
o E 21.333 3 24
E 8.000 3 48
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
74
PORCENTAJE DE MOTILIDAD
CUADRO N° 15 A: Base de datos porcentaje de motilidad de espermatozoides epididimarios
OBSERVACIÓN DILUTOR HORAS RESPUESTA 1 1 o 84 2 1 4 74 3 1 8 66 4 1 12 57 5 1 24 35 6 1 48 21 7 2 o 82 8 2 4 48 9 2 8 14 10 2 12 4 11 2 24 1 12 2 48 o 13 3 o 84 14 3 4 71 15 3 8 57 16 3 12 47 17 3 24 27 18 3 48 3
CUADRO N°16 A: Análisis de varianza ANOVA
CLASE NIVELES VALORES
DILUTOR 3 123
HORAS 6 o 4 8 12 24 48
Número de observaciones leídas 18
Número de observaciones usadas 18
75
(o
CUADRO N° 17 A: Análisis de varianza suma de cuadrados valor significativo
suma de cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor
Pr> F
Modelo 7 14721.38889 2103.05556 16.86
<.0001
Error 10 1247.55556 124.75556
Total corregido 17 15968.94444
R-cuadrado CoefVar Raíz MSE Respuesta Media
0.921876 25.94184 11.16940 43.05556
Cuadrado de
Fuente DF Anova SS la media F-Valor
Pr> F
HORAS 5 11540.94444 2308.18889 18.50
<.0001
DILUTOR 2 3180.44444 1590.22222 12.75
0.0018
CUADRO N°18 A: Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, sptalp y andromed
prueba del rango múltiple de DUNCAN para
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error de cuadrado medio 124.7556
Número de medias 2 3
Rango crítico 14.37 15.01
76
CUADRO N°19 A: Porcentaje de media entre los dilutores tris yema, sptalp y andromed
Duncan agrupamiento media N dilutor
A 56.167 6 1
A 48.167 6 3
B 24.833 6 2
. . Med1as con la m1sma letra no son s1gmf1cat1vamente diferentes .
CUADRO N° 20 A: porcentaje de motilidad a diferentes horas
Prueba del rango múltiple de Duncan para
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error de cuadrado medio 124.7556
Número de medias 2 3 4 5 6
Rango crítico 20.32 21.23 21.77 22.12 22.35
CUADRO N° 21 A: Comparación de letras
Duncan Agrupamiento Media N HORAS
A 83.333 3 o B A 64.333 3 4
B e 45.667 3 8
D e 36.000 3 12
D E 21.000 3 24
E 8.000 3 48
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
77
VISTAS FOTOGRAFICAS
FOTO N° 01 Identificando animales por boqueo después del pelado
78
1
1
FOTO N° 03. Trasladando muestras al laboratorio de Biotecnologías Reproductivas.
FOTO N° 04. Conservando muestras durante la evaluación de viabilidad.
L_ 79
FOTO N° 05. Preparando Jos dilutores en el laboratorio de Biotecnologías Reproductivas
FOTO N° 06. Tomando medidas del testículos.
ttfUJn Ujll n¡uu ¡m ''lll !l\ 11 H \1 i \ 1\\111\m'\~l\1\t\ tt\~n\ o 1 ? 8 í:. 5 6 - -
80
81
FOTO N° 09. Controlando temperatura con platina temperada a 34 °C. ~- , 1
¡' 1 t 1
FOTO N° 10. Evaluando la viabilidad de los espermatozoides después de la dilución
82
1
FOTO N° 11. Envasando las muestras que tienen más de 70% de viabilidad
FOTO N° 12. Conservando al medio ambiente las muestras.
83
84