universidad autÓnoma del estado de mÉxico maestrÍa...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS

AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES

AISLAMIENTO DE CEPAS Y OBTENCIÓN DE

METABOLITOS SECUNDARIOS DEL GÉNERO

ENTOMOPATÓGENO Cordyceps sensu lato DEL ESTADO

DE MÉXICO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS

AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES

PRESENTA:

BIÓL. LORENA LÓPEZ RODRÍGUEZ

COMITÉ DE TUTORES:

Dra. Cristina Burrola Aguilar. Tutor académico

Dra. Tatiana Ibeth Sanjuan Giraldo. Tutor adjunto

Dr. Moisés Tejocote Pérez. Tutor adjunto

El Cerrillo Piedras Blancas, Estado de México. Diciembre 2017

Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez

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Dedicatoria

Este camino no ha sido fácil por razones personales, académicas y espirituales, pero hoy después de la partida de mi padre y de tantos problemas puedo decir

he culminado este ciclo.

A ti mi Dios, que aunque nunca había creído completamente en ti, te conocí y te agradezco el permitirme seguir viva.

Con todo mi amor, dedico este trabajo a mi ángel, a mi gran motor, mi pequeño Ian.

A mi esposo quien ha estado apoyándome todo este camino, a mi mamá que siempre me ha dado lo mejor de ella.

Y obviamente a ti mi gran padre, a ti mi maestro, que aunque ya no estás en cuerpo, en mi corazón siempre vivirá tu amor y tus enseñanzas.

A mis hermanos que siempre han creído en mí, y aunque les encanta molestarme se que me aman y mucho de lo aprendido es gracias ha ellos.


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RESUMEN

Cordyceps sensu lato (s.l.) es un grupo de hongos ascomicetos parásitos de

artrópodos, hongos y gramíneas. La importancia de este grupo es ecológica,

agrícola, comestible, medicinal y por lo tanto económica. En México el estudio de

Cordyceps s.l. es incipiente, y nunca se había tenido la iniciativa de investigar los

metabolitos secundarios que presentan teleomorfos silvestres de este grupo en

México, ni tampoco la optimización de su cultivo in vitro. Para realizar esta

investigación, el primer objetivo fue revisar exhaustivamente literatura para conocer

el estado del conocimiento actual de Cordyceps s.l. en México y a partir de este

direccionar la investigación, el segundo objetivo fue determinar las condiciones

óptimas nutricionales del cultivo in vitro superficial y sumergido de dos cepas, en

condiciones de ausencia y presencia parcial de luz, y cuantificar un metabolito

llamado cordicepina con propiedades anticancerígenas, antibióticas y antivirales.

Para responder la siguiente pregunta ¿Producirán cordicepina cepas silvestres del

Estado de México?, y si esta fuera afirmativa ¿Qué efecto tendrían las fuentes de

nitrógeno y las diferentes condiciones de luz en la producción de biomasa, en la

morfología de las cepas y la velocidad de crecimiento en el cultivo superficial? y

¿Qué efecto tendrían las fuentes de nitrógeno y las diferentes condiciones de luz en

la producción de biomasa, en la morfología macroscópica y microscópica de los

pellets y la producción de cordicepina en cultivo sumergido?. Para resolver estas

preguntas se realizó un experimento multifactorial, donde las variables

dependientes fueron biomasa, velocidad de crecimiento, morfología macro y

microscópica de cepas y pellets, y producción de cordicepina. Las variales


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independientes fueron medios de cultivo y ausencia y presencia de luz. Los análisis

estadísticos fuerón un MANOVA, prueba de Tuckey con un nivel de confianza del

95%. Como resultados del primer objetivo, se registraron 25 especies de Cordyceps

sensu lato para México, distribuidas heterogéneamente en las tres familias que

conforman al grupo, de las cuales solo Tolypocladium capitatum y T.

ophioglossoides tienen un uso comestible tradicional, y Metharhizium anisopliae y

Beauveria bassiana son utilizadas como agentes de control biológico, sin embargo

hay una ausencia de conocimiento con respecto al potencial medicinal,

farmacológico y alimenticio de las especies registradas. De acuerdo al segundo

objetivo, se obtuvierón dos cepas con afinidad molecular con los marcadores

moleculares ITS y LSU a Cordyceps submilitaris. Las cepas mostrarón diferencias

en coloración de acuerdo a las condiciones lumínicas, siendo blanquecinas en

oscuridad y amarillentas en condiciones luminosas, la biomasa y velocidad de

crecimiento fue mayor en medios ricos en nutrientes y la producción de cordicepina

estuvo diectamente relacionada con la fuente de nitrógeno orgánico, por lo tanto las

cepas analizadas presentan potencial medicinal y farmacéutico.


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ABSTRACT

Cordyceps sensu lato (s.l.) is a group of fungi ascomicetes parasitic of arthropods,

fungi and grasses. The importance of this group is ecological, agricultural, edible,

medicinal and therefore economical. In Mexico, the study of Cordyceps s.l. is

incipient, and had never had the initiative to investigate the secondary metabolites

that have wild teleomorphs of this group in Mexico, nor the optimization of their

culture in vitro, so the first objetive of this research was to review literatura to know

current state of knowledge of Cordyceps s.l. in Mexico and from this research

direction. The second objetive was to determine the optimal nutritional conditions of

the in vitro culture of two strains, under conditions of partial presence and presence

of light, and to quantify a metabolite called cordycepin with anticancer, antibiotics

and antivirals properties. To answer the following question, will cordycepin produce

wild strains from the State the Mexico?, and if this were affirmative, what effect would

nitrogen sources and different light conditions have on biomass production, on the

morphology of the strains and the speed of growth in Surface cultivation?, and, What

effect would nitrogen sources and different light conditions have on biomass

production, macroscopic and microscopic morphology of pellets, and production of

cordycepin in submerged culture?. To answer these cuestions a multifactorial

experiment was carried out, where the dependent variables were biomass, speed of

growth, macro and microscopic morphology of strains and pellets, and production of

cordycepin. The independent variials were culture media and absence and presence

of light. Statistical analyzes were a MANOVA, tuckey test with a confidence level of

95%. As results of the first objetive, 25 species of Corduyceps sensu lato were


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recorded for Mexico, distributed in the three families that make up the group, of which

only Tolypocladium capitatum and T. ophioglossoides have a traditional edible use,

and Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana are used as biological control

agents, however there is an absence of knowledge regarding the medicinal,

pharmacological and nutrimental potential of the registered species. According to

the second objetive, two straisn were obtained, with molecular affinity of 95% with

molecular markets ITS and LSU to Cordyceps submilitaris. The strains showed color

differences according to light conditions, being whitish in darkness and yellow in

luminous conditions, the biomass and growth rate was higher in nutrient-rich media

and the production of cordycepin was directly related to nitrogen source, therefore

the analyzed strains present medicinal and pharmaceutical potential.


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AGRADECIMIENTOS

Agradezco el apoyo de cada persona que me compartió sus conocimientos y me

enseñó a ser y hacer mejor esta investigación.

En primera instancia agradezco a usted Dra. Cris, yo la quiero, respeto, admiro y le

agradezco todo su apoyo, porque si usted no hubiera aparecido en mi camino yo no

estaría aquí con estos resultados y de pie.

A usted Dra. Tatiana que me ha enseñado tanto de este grupo tan complejo he

interesante.

A ti Gris, porque desinteresadamente y de la manera más humilde me enseñaste a

mejorar mi redacción.

Al Dr. Roberto Garibay Orijel que me abrió las puertas de su laboratorio y me invito

a asistir al curso de Biología Molecular de Hongos.

A la Química Maria Magdalena Garcia Fabila que me permitió humildemente

trabajar en su laboratorio y cuantificar la tan codiciada cordicepina.

A la M. en C. Celia Elvira Aguirre Acosta del Instituto de Biología de la UNAM, que

me proporciono los ejemplares de MEXU para su revisión.

A mis compañeros de laboratorio que siempre con dudas tratamos de ayudarnos.

Especialmente a ti Yola, por tu gran amistad, y por siempre ayudarme ha corregir y

mejorar mi trabajo de investigación.

A la Secretaria de Investigación y Estudios Avanzados de la UAEM, por el

financiamiento del proyecto de investigación “Los hongos silvestres como estrategia

para el desarrollo sustentable en le Parque Ecológico Ejidal de Cacalomacán,

Estado de México”, clave 3687/2014/CIA, haciendo posible el presente trabajo.

Agradezco a la Red MEXBOL CONACYT proyecto 280896 por la financiación de la

secuenciación de ADN.

A CONACyT por la beca de manutención otorgada durante la maestría.


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CONTENIDO

I. Introducción general

II. Revisión de Literatura

i. Generalidades de Cordyceps sensu lato

ii. Clasificación taxonómica de Cordyceps sensu lato

iii. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos

iv. Distribución y diversidad de Cordyceps sensu lato en el mundo

v. Diversidad de Cordyceps sensu lato en México

vi. Diversidad de Cordyceps sensu lato en el Estado de México

vii. Usos medicinales de diferentes especies de Cordyceps sensu lato

viii. Cultivo in vitro de Cordyceps

ix. Cordicepina: metabolito producido por Cordyceps

III. Planteamiento del problema

IV. Justificación

V. Hipótesis

VI. Objetivos

VII. Material y Método

VIII. Resultados

i. Capítulo I: Revisión del estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato

en México: primeros reportes, diversidad, estados asexuales utilizados

como control biológico y conocimiento tradicional

ii. Capítulo II: Dos nuevos registros de Cordyceps sensu stricto en el centro

de México con posible potencial medicinal

iii. Capítulo III: Cultivo in vitro y producción de cordicepina de Cordyceps aff.

submilitaris, hongo silvestre del Centro de México

IX. Conclusiones generales

X. Referencias bibliográficas

XI. Anexos


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FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos del orden Hypocreales

(Augustyniuk-Kram y Kram, 2012)……………………………………………………...16

Figura 2. Ciclo de vida polimórfico de Cordyceps militaris…………………………..16

Figura 3. Metodología general de esta investigación………………………………..28

Figura 4. Envio del articulo de revisión: Estado del conocimiento de Cordyceps

sensu lato en México, a la Revista Mexicana de Biodiversidad…………………….29

Figura 5: Dibujo de larva-ninfa. A. con ramificaciones que parten de la cabeza y terminan en punta, B. con ramificaciones que terminan en coliflor, C. larva ninfa dividida longitudinalmente a la mitad, D. extremidad anterior del artrópodo que le sirve para cavar la tierra (Tomado de: Rio de la Loza, 1864)……………………….56

Figura 6. Morfología de Cordyceps sp.1. a. estroma emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. parte externa del estroma, d. peritecios en forma de matraz, e. crecimiento hifal apical del peritecio, f. liberación de segmentos de ascas y ascosporas, g. segmentos de ascas y ascosporas………………………………………………………………………………..82

Figura 7. Morfología de Cordyceps sp.6. a. estromas emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. peritecios, d. peritecio con liberación de ascas, e. ascas con ascosporas………………………………………..83

Figura 8: a. Fotografía de la cepa de Cordyceps 1, b. Fotografía de la cepa de Cordyceps 6………………………………………………………………………………84

Figura 9. Caracterización microscópica de cepas. a. hifas a 100x con tinción rojo congo de la cepa 1, b. hifas y esporas a 100x con tinción rojo congo de la cepa 6. Ambas en medio Agar papa dextrosa (PDA) en ausencia de luz…………………..84

Figura 10. Cepa C-1 en los diferentes tratamientos. a, b, c, d y e, en presencia de

luz, a1, b1, c1, d1 y e1 en ausencia de luz. a: en AA, b: PDA, c:EMA, d:PDA+Y y e:SB.

……………………………………………………………………………………………..98



……………………………………………………………………………………………..98

Figura 12. Conidios y esporas producidos en las cepas. a: cepa jc., b: cepa 6…100

Figura 13. Interacción entre cepa, condiciones lumínicas y medios de cultivo con

respecto a la velocidad de crecimiento……………………………………………….101


11

Figura 14: Interacción entre condiciones lumínicas y medios de cultivo con respecto

a la producción de biomasa……………………………………………………………102

Figura 15. Cinética de crecimiento de la cepa C-1. Los tratamientos se observan

del lado derecho: A: agar agar; PDA: agar papa dextrosa; EMA: agar extracto de

malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura………………………104



malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura……………………..104

Figura 17: Curva de calibración de cordicepina de 1-10ppm………………………123

Figura 18: Grafica lineal y línea de tendencia de la curva de calibración de

cordicepina………………………………………………………………………………124

Figura 19: Cromatogramas de las replicas 1, 2 y 3 del tratamiento PD+O+C6….125

Figura 20: Cromatogramas de las replicas 6, 7 y 8 del tratamiento PD+L+C6….125

Figura 21: Cromatogramas de las replicas 11, 12 y 13 del tratamiento

PD+O+C1……………………………………………………………………………….126


PD+L+C1……………………………………………………………………………….126


EM+L+C1………………………………………………………………………………..127


PDY+O+C1……………………………………………………………………………...128


PDY+L+C6………………………………………………………………………………128


PDY+O+C6……………………………………………………………………………..129


12

TABLAS

Tabla 1. Principales metabolitos secundarios extraídos de cepas de diferentes

especies de Cordyceps sensu lato……………………………………………………..19

Tabla 2. Medios de cultivo empleados en el experimento, con clasificación de

acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978)………………….……………………………27

Tabla 3: Especies de la Familia Clavicipitaceae registradas en México..…………36

Tabla 4: Especies de la Familia Cordycipitaceae registradas en México................37

Tabla 5: Especies de la Familia Ophiocordycipitaceae registradas en México……44

Tabla 6: Estados asexuales de Cordyceps sensu lato utilizados como control biológico de insectos en México………………………………………………………...55

Tabla 7: Especies de Tolypocladium con uso tradicional en el Centro de México…56

Tabla 8. Porcentaje de identidad con análisis BLAST de las cepas y los estromas con los marcadores, ITS y LSU…………………………………………………………85

Tabla 9. Caracterización fenotípica de la cepa Cordyceps sp.1. y Cordyceps sp.6

en los diferentes tratamientos…………………………………………………………..96

Tabla 10. Velocidad de crecimiento y biomasa seca del cultivo in vitro en medio

sólido…………………….………………………………………………………………100

Tabla 11: Caracterización macroscópica de pellets..……………………………….105

Tabla 12. Caracterización microscópica y de pellets en cultivo sumergido……..106

Tabla 13. Biomasa y cordicepina extracelular producida en medio líquido……… 108

Tabla 14: Curva de calibración de la cordicepina con los diferentes valores de área

y altura de la curva, así como el tiempo de retención………………………………123

Tabla 15: Tiempo de retención, área y altura de las diferentes concentraciones de

cordicepina obtenidas en sistema de HPLC………………………………………….123


13

INTRODUCCIÓN GENERAL

Los hongos a través del tiempo se han considerado un recurso natural para la

población humana debido a sus propiedades nutritivas, medicinales y enteógenas,

por lo que en la actualidad su estudio y aprovechamiento tiene gran importancia

(Duvoboy, 1968; Martínez-Carrera et al., 2005; McLain, 2008). Actualmente los

hongos medicinales son una buena alternativa para su uso en la industria

farmacéutica, así como alimentos funcionales, ya que la mayoría de los

componentes bioactivos o también llamados metabolitos secundarios que producen

no tienen efectos negativos en la salud del humano en contraste con los

medicamentos sintéticos (Boa, 2005).

Cordyceps sensu lato es un grupo de ascomicetos entomopatógenos que incluye

los géneros Metarhizium, Cordyceps, Tolypocladium y Ophiocordyceps entre otros

(Sung et al., 2007a). Algunas especies de este género son ampliamente utilizadas

en la medicina Asiática tradicional, ya que presentan metabolitos secundarios con

propiedades medicinales (Ng y Wang, 2005), como cordicepina y manitol (Chun-kit

y Wing-hung, 2012). Ademas de ser una especie medicinal, tiene comestible y

ecológica, esta última se debe a que controlan la densidad poblacional de algunos

artrópodos, por lo que algunas especies pueden ser utilizadas como control

biológico (Augustyniuk-Kram y Kram, 2012).

Su cultivo in vitro tiene gran importancia, ya que los estromas colectados son muy

escasos, el tamaño de estos es muy pequeño y el costo es muy elevado, ya que

1Kg de Cordyceps silvestre colectado en la India, puede tener un costo de 4,770 a

9,500 MXN, lo que equivale a 318 a 633 dólares (Sharma, 2004).

Para México el conocimiento tradicional de Cordyceps es escaso. Guzmán (2008)

menciona que Tolypocladium ophioglossoides y T. capitatum, anteriormente

considerados Cordyceps ophioglossoides y C. capitata, respectivamente, son

utilizados en ceremonias religiosas por los nahuas en Tenango del Valle y San

Pedro Tlanixco, Estado de México, debido a que se les atribuyen propiedades

medicinales y alucinógenas. Sin embargo las condiciones óptimas de cultivo in vitro

de diferentes especies silvestres de Cordyceps, el tipo y concentración de

metabolitos secundarios que presentan es desconocido.

Por lo tanto los objetivos de esta investigación fueron conocer el estado actual del

conocimiento de Cordyceps sensu lato en México (Capítulo 1), identificar a nivel de

especie los estromas colectados (Capítulo 2) y realizar el cultivo in vitro en medio

sólido y líquido de estas especies, así como determinar la producción de cordicepina

en diferentes tratamientos (Capítulo 3) para conocer el potencial medicinal de

especies silvestres de Cordyceps en México.


14

REVISIÓN DE LITERATURA

GENERALIDADES DE Cordyceps sensu lato

Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.) es un género de hongos entomopatógenos

que parasitan insectos en los diferentes estadios del ciclo de vida y también parásita

ha hongos del género Elaphomyces (Mains, 1958; Sung et al., 2007a).

Estos hongos endoparásitos pueden tener rangos específicos de hospederos que

van desde orden pasando por familia, hasta especie (Nikoh y Fakatsu, 2000; Sasaki,

2008; Sanjuan et al., 2014). Tienen la capacidad de atravesar el exoesqueleto de

sus hospederos debido a que pueden hidrolizar la quitina. Las ascosporas o

conidios inician este proceso con la ayuda de prolongaciones de las células fúngicas

llamadas aprensorios y haustorios, luego segregan la maquinaría enzimática para

poder atravesar el exoesqueleto y llegar así a colonizar el interior del hospedero

(Evans et al., 1988).

Las principales especies de Cordyceps s.l. utilizadas como medicinales son

Ophiocordyceps sinensis que parasita larvas de la polilla Hepialus sp. y Cordyceps

militaris, que parásita pupas de Lepidóptera. Estas especies producen diferentes

componentes bioactivos tales como: cordicepina, polisacáridos, ergosterol y manitol

(Tan, 2010), siendo la cordicepina el principal componente bioactivo del hongo

(Chun-kit y Wing-hung, 2012). Los componentes bioactivos producidos por algunas

especies de Cordyceps, como por ejemplo la especie más ampliamente estudiada,

C. militaris, presenta actividades antimalarias, hipoglucémicas, antitumorales,

antidiabéticas e inmunomodulatorias (Chen et al, 1997; Kim et al., 2001; Zhao et al.,

2002; Asaduzzaman et al., 2010).

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE Cordyceps sensu lato

Este género pertenece al Phylum Ascomycota, debido a que cuando se reproducen

sexualmente forman estructuras especializadas llamadas ascas y ascosporas, a la

Clase Sordariomycetes, al orden Hypocreales y a las familias Cordycipitaceae,

Clavicipitaceae y Ophiocordycipitaceae (Eriksson et al., 2004; Sung et al., 2007a y

2007b). Presenta como características exclusivas la presencia de peritecios, estos

son una cámara con forma de matraz que contiene a las ascas y en la parte apical

presentan un ostiolo por el cual se liberan las ascosporas. Hay cuatro tipos de

peritecios de acuerdo a su posición en el estroma: superficial, medio inmerso,

verticalmente inmerso y oblicuamente inmerso. Otras características de este grupo

son: ascas cilíndricas, con una tapa apical engrosada, ascosporas filiformes que

frecuentemente están separadas pero pueden desarticularse y formar partes de

esporas (Tian et al., 2010).


15

La clasificación de las especies anteriormente se basaba en caracteres

morfológicos de acuerdo a Masse (1895), Mains (1957, 1958) y Kobayasi (1941,

1982) la cual considera, el color del estroma de la parte fértil, la forma de los

peritecios y su disposición en el estroma, la forma de ascas y de ascosporas.

Posteriormente debido a las compleja morfología macroscópica y microscópica de

las especies, la taxonomía del género de una familia se ha modificado,

Clavicipitaceae (Kobayasi, 1941, 1982; Mains, 1957, 1958) a tres familias

Clavicipitaceae, Cordycipitaceae y Ophiocordycipitaceae, con los géneros

Metacordyceps, Cordyceps sensu stricto, Ophiocordyceps y Elaphocordyceps

(Sung et al., 2007) de acuerdo a estudios filogenéticos realizados con caracteres

morfológicos y utilizando los marcadores moleculares LSU, SSU, RPB1, RPB2 Tef

y mtATP6. Gracias a ello, se ha planteado que la identificación taxonómica requiere

tanto de caracteres morfológicos y genotípicos, siendo consistentes el color y la

textura del estroma, así como el hospedero que parasitan que se define como el

nicho ecológico (Sung et al., 2007a; 2007b; Sanjuan, 2015). Ahora la clasificación

taxonómica es la siguiente (Sung et al., 2007a; 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt

et al., 2014):

Familia Clavicipitaceae: Incluye el género Metarhizium (anteriormente

Metacordyceps).

Familia Cordycipitaceae: Incluye el género Cordyceps sensu stricto

Familia Ophiocordycipitaceae: Incluye dos géneros, Ophiocordyceps y

Tolypocladium (anteriormente Elaphocordyceps).

Las especies del género Cordyceps presentan anamorfos, tales como: Beauveria

spp., Metarhizium spp. e Isaria spp., anteriormente Paecilomyces, (Sung et al.,

2007a, 2007b), los cuales han sido empleados como controladores biológicos, por

ejemplo Metarhizium ha sido utilizado en Brasil para controlar los “salivazos” que

afectan el cultivo de alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en África se han

utilizado para controlar los mosquitos vectores de malaria (Scholte et al., 2005), así

como también para el control de las “langostas” (FAO, 2009).

CICLO DE VIDA DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

El ciclo de vida de hongos entomopatógenos es complejo ya que presenta fases

asexuales y sexuales, en el estado asexual se reproduce por medio de blatosporas,

conidios y/o clamidosporas, y en el estado sexual se reproducen con la formación

de ascosporas (Augustyniuk-Kram y Kram, 2012). Este autor menciona que de

forma general los hongos entomopatógenos presentan un ciclo de vida con dos


16

fases: Fase parasítica (en la cual el hongo parasita al hospedero) y la fase saprobia

(después de la muerte del hospedero).

Figura 1. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos del orden Hypocreales (Tomado de:

Augustyniuk-Kram y Kram, 2012).

Zheng et al. (2011), secuenciaron el genoma y definieron el ciclo de vida de

Cordyceps militaris, ya que es la especie con mayor número de estudios e

importancia hasta la actualidad, por lo que es considerada modelo biológico. C.

militaris presenta un ciclo de vida polimórfico, se reproduce asexual y sexualmente,

en la reproducción asexual forma conidios o blatosporas que dan lugar a un

estroma, y en la reproducción sexual también dan lugar a estromas pero a partir de

la germinación de ascosporas, por lo tanto pueden formar estromas por

heterotalismo bipolar o pueden formar estromas por homotalismo (Zheng et al.,

2011).

Figura 2. Ciclo de vida polimórfico de Cordyceps militaris.


17

DISTRIBUCIÓN Y DIVERSIDAD DE Cordyces sensu lato EN EL MUNDO

El género Cordyceps s.l. presenta una distribución cosmopolita e incluye todas las

regiones a excepción de la Antártida, sin embargo la mayor diversidad de especies

se encuentra en las regiones tropical y subtropical, destacando en el sur y sureste

de Asia (Kobayasi 1941, 1982; Samson et al., 1988).

A nivel mundial se han reportado cerca de 450 especies de hongos

entomopatógenos (Kirk et al., 2001), sin embargo se estima que existen 750 (Sung,

1996) y para Norteamérica se han reportado 41 especies (Mains, 1958).

Del género Cordyceps sensu stricto mundialmente se han reportado 236 especies

(Index Fungorum, 2016).

DIVERSIDAD DE Cordyceps sensu lato EN MÉXICO

En México Cordyceps ha sido un ascomiceto poco estudiado a comparación del

continente oriental, su taxonomía solo ha sido estudiada más específicamente por

Pérez-Silva (1977, 1978), Rubio-Bustos et al. (1999) y Guzmán et al. (2001). Los

demás registros se han dado ocasionalmente por estudios de micoflora para ciertas

regiones de México, y hasta la actualidad no se ha vuelto a realizar un estudio

taxonómico dirigido al género Cordyceps, también es importante mencionar que en

todos estos estudios la identificación taxonómica se ha realizado de forma

tradicional utilizando solo caracteres morfológicos y excluyendo la utilización de

marcadores moleculares.

En México se han registrado 25 especies de Cordyceps sensu lato que incluye

estados asexuales y teleomorfos, de los cuales 9 especies pertenecen a

Cordcyceps sensu stricto (Ver Capítulo 1).

DIVERSIDAD DE Cordyceps sensu lato EN EL ESTADO DE MÉXICO

Para el Estado de México se tenia el registro de tres especies: Tolypocladium

capitatum, Tolypocladium ophioglossoides y Cordyceps militaris, anteriormente

considerados C. capitata y C. ophioglossoides (Heim, 1957; Trappe y Guzmán,

1971; Frutis et al., 1985; Guzmán et al., 2001). Sin embargo Pérez-Villamares et al.

(2017) realizaron un estudio en diferentes municipios del sureste del Estado de

México donde identificaron a siete especies, Cordyceps militaris, Ophiocordyceps

entomorrhiza, O. gracilioides, O. gracilis, y la fase conidial de O. stylophora,

Cordyceps takaomontana y C. scarabaeicola, con lo cual se tienen hasta el

momento nueve especies registradas para el Estado de México.


18

USOS MEDICINALES DE DIFERENTES ESPECIES DE Cordyceps sensu lato

El género Cordyceps ha sido ampliamente utilizado en el continente Asiático debido

a las propiedades anticancerígenas que presenta, principalmente en Japón, Korea

y China, tal como: Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris, C. sphecocephala,

C. oxycephala, C. elongotostromata y C. japonenesis (Nam, et al., 2006).

En México, a pesar de que no se han realizado trabajos etnomicológicos del género

Cordyceps, Guzmán (2008) menciona que los nahuas utilizaban a C. capitata y C.

ophioglossoides, con fines medicinales y alucinógenos, que actualmente

pertenecen al género Tolypocladium.

Cordyceps militaris y Ophiocordyceps sinensis son las especies más ampliamente

estudiadas. En C. militaris se han extraído diferentes metabolitos secundarios con

diversas actividades biológicas tales como: pro-sexual, anti-inflamatoria, anti-

oxidante, anti-cancerígena, anti-proliferativa, anti-metástasica, inmunomodulatoria,

anti-microbiana, anti-viral, anti-fúngica, anti-protista, insecticida, larvicida, anti-

fibrótica, hipoglucémica, hipolipídica, anti-diabética, anti-VIH, anti-malaria,

neuroprotectiva y reno-protectiva (Won y Park, 2005).

CULTIVO in vitro DE Cordyceps

Carilli y Pacioni (1977), fueron los primeros en realizar cultivo in vitro sumergido y

determinar la morfología de C. militaris, realizando estudios de control biológico de

plagas. Observaron el desarrollo de conidios con fialides y esporas llamadas

blatosporas.

Cordyceps militaris es la especie más estudiada, y recientemente el estudio in vitro

de otras especies de Cordyceps ha sido experimentado debido a la presencia de

metabolitos secundarios con propiedades medicinales (Ling et al., 2002; Wongsa

et al., 2005; Nam et al., 2006; Sung et al., 2010; Wang et al., 2012; Chiriví-Salomón

et al., 2017).

El cultivo in vitro se ha obtenido y optimizado en medio de cultivo superficial o sólido

(Masuda et al., 2007) y medio de cultivo sumergido o líquido (Mao et al., 2007), sin

embargo, la concentración de metabolitos secundarios, así como la cantidad de

biomasa producida depende de diversos factores, como las fuentes de carbono,

nitrógeno, potasio, factores de crecimiento, minerales, temperatura, pH, agitación,

luz y también de la cepa utilizada (Hung et al., 2009). Los componentes bioactivos

como cordicepina y exo-polisacáridos producidos por C. militaris, así como la

optimización del cultivo in vitro para obtener mayor concentración de estos

metabolitos han sido ampliamente estudiados (Kim y Yun, 2005; Mao y Zhong,

2006). Los trabajos de optimización del cultivo in vitro también han incluido los


19

factores luz (ausencia/presencia) (Shrestha et al., 2006), y la incidencia de

diferentes longitudes de onda en estromas (Dong et al., 2012):

CORDICEPINA: METABOLITO PRODUCIDO POR Cordyceps

La cordicepina (3´-deoxiadenosina) es un nucleósido análogo a la adenosina. Es

producida por diferentes especies de Cordyceps y es extraída debido a las

propiedades anti-virales, anti-fúngicas, anti-bacteriales, anti-leucémicas y anti-

metástasicas en algunas líneas celulares cancerígenas (Chun-kit y Wing-hung

2012). La cordicepina fue extraída por primera vez por Cunningham et al. (1950),

está puede ser sintetizada químicamente, sin embargo su rendimiento es bajo y el

proceso es complicado, alternamente su extracción en estromas colectados es muy

costosa y la obtención de estromas cultivados in vitro es más baja que la obtenida

del micelio (McDonald et al., 1996; Guo et al., 1998). Por lo tanto el micelio se cultiva

en medios sólidos o en medios líquidos para obtener la cordicepina con menor costo

económico (Hung et al., 2009), en la mayoría de los trabajos se utilizan cepas de

origen Asiático ya registradas en ceparios del extranjero.

En diferentes investigaciones se ha determinado que C. militaris es la especie que

produce mayor cantidad de cordicepina, biomasa y exopolisacáridos (EPS) a

comparación de O. sinensis (Kim y Yun, 2005). Al mismo tiempo, se ha registrado

que los medios añadidos con levadura producen una mayor concentración de EPS

y cordicepina (Shih et al., 2006) y estos se encuentran en un 98% en el medio de

cultivo, en contraste del manitol que se encuentra en mayor concentración en el

micelio (Masuda et al., 2006).

Otras especies que también se han cultivado in vitro son: O. sinensis y C.

kyushuensis, a las cuales se les ha extraído cordicepina (Ling et al., 2002), así como

también a C. cicadae (Wang et al., 2012). C. unilateralis presenta naftoquinonas con

actividad antimalaria (Wongsa, et al., 2005). C. sphecocephala y C. cardinalis solo

se han aislado y se ha determinado el medio sólido óptimo para su crecimiento

micelial (Nam et al., 2006; Sung et al., 2010). En C. nidus se ha determinado la

presencia de altas concentraciones de componentes fenólicos con propiedades

anti-microbianas y anti-oxidantes (Chivirí-Solomon et al., 2017). En la Tabla 1 se

muestran los metabolitos producidos por diferentes especies de Cordyceps.

Tabla 1. Principales metabolitos secundarios extraídos de cepas de diferentes especies de

Cordyceps sensu lato

Especie Cordicepina Manitol Componentes fenólicos

Naftoquinonas Referencia

Ophiocordyceps sinensis

* *

Ling et al., 2002


20

Cordyceps militaris

* * * Cunningham et al., 1950; Mao et al.,

2005; Masuda et al., 2005

C. cyushuensis *

Ling et al., 2002

C. cicadae *

Wang et al., 2012

C. pruinosa *

Meng et al., 2014

C. cardinalis *

Sung et al., 2010

C. unilateralis

* Wongsa et al., 2005

C. sphecocephala

Nam et al., 2006

C. nidus * *

Chiriví-Salomón et al., 2017

*Indica presencia


21

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Cordyceps sensu lato en México es un grupo escasamente estudiado, a pesar de

tener importancia agrícola, comestible y medicinal, su estudio ha sido ampliamente

enfocado a su manejo como control biológico, sin embargo, su uso como comestible

y medicinal solo se ha reportado para dos especies: Tolypocladium capitatum y T.

ophioglossoides. Sin embargo, se desconocía un estado del conocimiento general

y actual de este grupo.

Con respecto al estudio bioquímico, molecular y el cultivo in vitro de teleomorfos de

especies silvestres de Cordyceps de México no ha sido aún investigado y analizado.

En Asia han sido estudiados Cordyceps militaris y Ophiocordyceps sinensis por las

propiedades anti-bacteriales, anti-metástasicas, anti-inmunomodulatorias y anti-

virales que presentan. Se ha demostrado que estas propiedades se deben a un

metabolito secundario llamado cordicepina, que se producen a gran escala con la

utilización del cultivo in vitro de C. militaris.

En México, se desconoce si las especies silvestres producen cordicepina, y en qué

cantidad, lo cual fue el principal problema a resolver en esta investigación.

Con respecto al experimento, se planteó la pregunta: ¿Qué efecto tendrá la luz en

la producción de cordicepina en diferentes medios de cultivo líquidos a nivel de

cepa?


22

JUSTIFICACIÓN

Los recursos naturales, como los hongos son una fuente de alimento funcional que

proporciona nutrientes y metabolitos secundarios con actividad benéfica a la salud,

por lo que el estudio molecular, bioquímico y su cultivo in vitro permiten conocer las

especies, sus propiedades y su uso en la industria, respectivamente.

En México Cordyceps sensu lato es un grupo de hongos que ha sido escasamente

estudiado, destacan los estudios enfocados a la agroindustria como controladores

biológicos de plagas que afectan cultivos con importancia comercial como el maíz,

frijol y cítricos. Con respecto al enfoque biológico solo se ha estudiado su diversidad

utilizando la taxonomía clásica, excluyendo la utilización de caracteres moleculares.

En relación a la utilización tradicional de algunas especies, solo se conoce el

consumo de Tolypocladium capitatum y T. ophioglossoides por los nahuas en el

estado de México, sin embargo, no se han realizado estudios de las propiedades

bioquímicas y medicinales de las especies silvestres para México.

Por lo tanto, para México se desconoce el estado del conocimiento actual de

Cordyceps sensu lato, las propiedades medicinales y comestibles, así como

tampoco se conocen las condiciones óptimas del cultivo in vitro de especies

silvestres.

Por lo tanto, estos fueron los tres objetivos de esta investigación, ya que el conocer

el estado del conocimiento de este grupo, permitió describir la diversidad registrada

hasta el momento, el enfoque de los estudios y al mismo tiempo se visualizaron los

tópicos que faltan por investigar con el fin de priorizar investigaciones futuras.

Por último, el determinar los parámetros nutricionales para la óptima producción de

biomasa y cordicepina permitió demostrar el potencial biológico, medicinal,

biotecnológico y farmacológico de estas especies fúngicas silvestres de México, lo

que a su vez sustenta las bases para realizar ciencia aplicada de este grupo de

hongos tan complejo e interesante.


23

HIPOTESIS

Las cepas de Cordyceps silvestres de México producirán cordicepina, si pertenecen

al grupo Cordyceps sensu stricto, ya que diversas especies de este grupo, como

Cordyces militaris, especie modelo, comparten la producción de este metabolito.

La producción de cordicepina será mayor en medios de cultivo ricos en nutrientes

en presencia de luz a comparación de medios de cultivo con pocos nutrientes y

ausencia de luz., en contraste con la producción de biomasa que será mayor en

medios ricos en nutrientes y ausencia de luz.


24

OBJETIVO GENERAL

Determinar las condiciones óptimas nutricionales del cultivo in vitro a nivel de cepa

y la cantidad de cordicepina, bajo condiciones de luz y oscuridad, entre cepas

silvestres de Cordyceps del Estado de México

OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar taxonómica y molecularmente las especies estudiadas

Determinar los parámetros nutricionales que optimizan la velocidad de

crecimiento y producción de biomasa en dos cepas de Cordyceps en cultivo

superficial bajo condiciones de luz y oscuridad

Determinar los parámetros nutricionales que optimizan la producción de

biomasa y cordicepina en cultivo in vitro a nivel de cepa en medio líquido bajo

condiciones de luz y oscuridad


25

MATERIALES Y MÉTODO

Para el estado del conocimiento actual de Cordyceps sensu lato en México se

revisaron las primeras publicaciones en el Acervo histórico del Instituto de Biología

de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Se realizó un listado de

las especies de teleomorfos registradas en los diferentes estados del país, mediante

la revisión de las investigaciones publicadas desde el año 1864 al 2017. Se realizó

una visita al herbario MEXU del Instituto de Biología de la UNAM y se revisaron

todos los ejemplares depositados con el nombre de Cordyceps. El uso de estados

anamorfos como control biológico y conocimiento tradicional, se realizó en

buscadores electrónicos como Google, Scientific Electronic Library Online (SciELO),

en las bases de datos Redalyc, Elsevier, Scopus, y SpringerLink. Las palabras clave

utilizadas en las búsquedas fueron: Cordyceps, hongos entomopatógenos, control

biológico, Metarhizium, Beauveria, Isaria, Paecilomyces¸ cultivo de Cordyceps y

Tolypocladium. El nombre científico de las especies se describe de acuerdo al

nombre taxonómico actual, mediante la nomenclatura del Index Fungorum

MATERIAL RECOLECTADO

Los ejemplares fueron colectados en “Desierto del Carmen”, Tenancingo, localizado en la región sureste del Estado de México, ubicado a 18°49´ y 19°03´ latitud norte y 99°30´y 99°39´ de longitud oeste, a una altitud de 2200 a 2700 msnm (INEGI, 2009). Se realizó un muestreo dirigido de agosto a octubre de 2015, los cuales fueron colectados cuidadosamente, se limpiaron con una brocha de cerdasd delgadas y se guardaron en bolsas ziploc. Estos se llevaron al laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos para su identificación. Los ejemplares serán depositados en el herbario del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México una vez que se identifiquen completamente las especies. Los estromas fueron caracterizados microscópicamente de acuerdo a claves especializadas de Mains (1958) y Kobayasi (1941, 1982). La examinación de los ejemplares se realizó de acuerdo a Sanjuan et al. (2014). Las descripciones del color de los estromas se realizó mediante la clave de color HTML color codes (http://html-color-codes.info) .La identificación del hospedero se realizó a nivel de orden.

EXTRACCIÓN DE DNA, AMPLIFICACIÓN CON PCR, ELECTROFORESIS Y SECUENCIACIÓN

La extracción de DNA se realizó con el kit SIGMA-ALDRICH-REDExtract-N-AmpTM

Plant, con algunas modificaciones. Se amplificaron dos locus: La región transcrita interna (ITS) y la subunidad larga del ribosoma (LSU). La reacción de PCR se realizó con una mastermix de 20 µl (Vilgalys y Sun, 1994). La purificación se realizó con EXOSAP, se preparó una master mix a 1x con EXOSAP y ddH2O. Las muestras se


26

mandaron a secuenciar con el método de Sanger, al Laboratorio de Secuenciación del Instituto de Biología de la Universidad Autónoma Nacional de México.

EDICIÓN DE SECUENCIAS, ANÁLISIS DE BLAST Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO

Las secuencias obtenidas en este estudio fueron editadas en el programa Geneious R.1.5 (Drummond et al., 2009). Se realizó un análisis de BLAST dentro de Geneious R. 1.5 utilizando la plataforma de GenBank para confirmar que las secuencias pertenecían a la familia Cordycipitaceae, así como también para determinar la especie a la que pertenecían los ejemplares. Las secuencias obtenidas serán subidas a la plataforma de GenBank, una vez que se halla terminado el análisis filogenético.

El análisis filogenético se realizará utilizando las secuencias obtenidas en este estudio y las obtenidas por Sanjuan et al. (2015) que se encuentran en Gen Bank, el análisis se llevará a cabo utilizando los marcadores moleculares ITS, LSU, RPB1, RPB2 y TEF. Para el grupo externo se utilizarán especies representativas de Metarhizium y Pochonia. El alineamiento de SSU y LSU se realizará en MUSCLE (Edgar, 2004), el alineamiento para los genes que codifican proteínas RPB1, RPB2 y TEF se realizaran con MAFT (Katoh y Toh, 2010). Finalmente cada alineamiento será refinado manualmente en BioEdit versión 6.0.7 (Hall, 1999). Este análisis no se ha realizado ya que posiblemente se trata de nuevas especies, por lo que requiere un análisis cuidadoso, que realizara Sanjuan, T., investigadora experta en este grupo de hongos.

AISLAMIENTO DE CEPAS

A los estromas colectados, con un bisturí estéril se les cortó un pedazo de estroma de aproximadamente 2-3 mm, este se aisló directamente en placas de Petri en medio estéril de Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubó por 30 días a 25°C de acuerdo al método modificado de Kumar y Sagar (2006). Al término de este periodo se caracterizó la cepa macroscópica de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995) y microscópicamente de acuerdo a Mains (1958).

CULTIVO SUPERFICIAL, DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se caracterizaron las cepas 1 y 6 en cinco medios de cultivo, clasificados de

acuerdo a su contenido nutrimental. Agar Agua (AA), Agar Papa Dextrosa (PDA),

Agar Extracto de Malta (EMA), Agar Papa Dextrosa adicionado con Levadura

(PDA+Y) y Sabourad (SB) (tabla 2). La inoculación de los medios sólidos se realizó

tomando una muestra de 0.5cm de diámetro de las cepas en medio PDA, se reaisló

en placas de cultivo previamente esterilizadas y preparadas con los diferentes

medios de cultivo, se incubaron a 25°C en ausencia y presencia parcial de luz (12

hrs luz/12 hrs oscuridad). Diariamente se midió el diámetro de las cepas y se calculó

la velocidad de crecimiento de acuerdo al método modificado de Huerta et al. (2009),


27

con la siguiente formula: Velocidad de crecimiento=(Df-Di)/(Df-Di), donde, Df es el

diámetro final, Di es el diámetro inicial y Tf-Ti son los días de crecimiento micelial.

Posteriormente, se caracterizaron macroscópicamente las cepas de acuerdo a

Mains (1958), y microscópicamente de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995), también se

determinó la densidad del micelio de acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978) y

Shrestha et al. (2006), donde (-) indica extremadamente pobre, (+) pobre, (++)

moderado y (+++) abundante. La descripción de la coloración de las cepas se realizó

utilizando la clave de colores Color codes (http://html-color-codes.info, 2016).

Después se midió la producción de biomasa, se realizó un triple lavado de las cepas

con agua destilada calentada a 90-100°C, posteriormente se filtró el micelio en papel

filtro del número 4, este se dejó secar a 60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al.

(2010). Se establecio un diseño experimental multifactorial, por lo que se aplico un

análisis estadístico multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%,

posteriormente una prueba de Tukey.

Tabla 2. Medios de cultivo empleados en el experimento, con clasificación de

acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978).

Medio de cultivo Clasificación Componentes (gr/L) Marca

Agar agua (AA) Pobre Agar (15.0) Bioxon

Agar papa dextrosa (PDA)

General Almidón de papa (4.0) Dextrosa (20.0) Agar (15.0)

Bioxon

Agar extracto de malta (EMA)

General Maltosa (12.75) Dextrina (2.75) Glicerol (2.35) Peptona (0.78) Agar (15.0)

Difco

Agar papa dextrosa adicionado con levadura (PDA+Y)

Rico Almidón de papa (4.0) Dextrosa (20.0) Agar (15.0) Levadura (2.0)

Difco

Agar dextrosa Sabourad (SB)

Rico Dextrosa (40.0) Peptona de carne (5.0) Peptona de caseína (5.0) Agar (15.0)

Bioxon

CULTIVO LÍQUIDO, EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CORDICEPINA

Las cepas 1 y 6 se caracterizaron en tres medios de cultivo, clasificados de acuerdo

a su contenido nutrimental. Papa dextrosa (PD), Extracto de malta (EM), y Papa

dextrosa adicionado con levadura (PD+Y). Se inocularon frascos bacteriológicos de

500 ml con cinco pellets de 5 mm cada uno, se dejaron en agitación por 60 días a

25°C a 150 rpm, en ausencia y presencia parcial de luz (12 hrs luz/12 hrs oscuridad).

Se determinó la cantidad de biomasa de acuerdo a Shih et al., (2006). Se aplicó un

http://html-color-codes.info/


28

análisis estadístico multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%,

posteriormente una prueba de Tukey.

Después de que se midió la biomasa, se realizó un lavado de los medios líquidos

con agua destilada estéril, posteriormente se filtró el micelio en papel filtro del

número 4, este se dejó secar a 60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al. (2010).

Para la extracción de cordicepina, se centrifugó el cultivo líquido a 6000g/10min,

posteriormente se filtró el sobrenadante en papel filtro Whatman 4. Se midió el pH,

se lavó el micelio con agua destilada y se secó a 60°C por 48hrs, para obtener

biomasa seca. Posteriormente el medio de cultivo filtrado se mezcló con metanol al

15% (1:1), se centrifugó a 6000g/15min y se filtró el sobrenadante en Syringe Filter

estéril de 0.45µm/13mm de diámetro. El filtrado obtenido se analizó en

Cromatografia Liquida de Alta resolución (HPLC, High Performance Liquid

Chromatography) para la cuantificación de la cordicepina. La curva de calibración

de cordicepina (Sigma Aldrich) se realizó utilizando diferentes concentraciones

desde 1-10ppm (Figuras 16-17 y Tablas 16-17). El sistema de HPLC estuvo

conformado por un Automuestreador Waters 717 plus, bombas binarias Waters

1525, detector de absorbancia dual Waters 2487, columna C18 Kromasil® (250

mmx4.6 mm; 5 µm tamaño de partícula), la fase móvil estuvo compuesta por una

mezcla de metanol y KH2PO4 (0.02M) en concentración (15:85), la tasa de flujo fue

de 20 µl/min, se utilizó un detector de UV a 254 nm, con temperatura de 25°C, con

un tiempo de corrida de 40 min. Posteriormente los resultados fueron analizados en

el programa Breeze (Figuras 18-25).

La metodología se resume gráficamente en el siguiente diagrama (figura 3):

Figura 3. Metodología general de esta investigación.


29

RESULTADOS

CAPITULO I. Revisión del estado del conocimiento

de Cordyceps sensu lato en México: primeros

reportes, diversidad, estados asexuales utilizados

como control biológico y conocimiento tradicional

Figura 4. Envio del articulo de revisión: Estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato en México, a la Revista Mexicana de Biodiversidad.


30

RESUMEN

Cordyceps sensu lato es un grupo de hongos ascomicetos que parásita artrópodos,

plantas gramíneas y hongos del género Elaphomyces. A nivel mundial existen

especies con importancia agrícola, comestible, ecológica y medicinal. A pesar de

que México ocupa el cuarto lugar de los 12 países más megadiversos del planeta,

los hongos entomopatógenos han sido escasamente estudiados y se desconoce el

panorama actual de su diversidad y por eso se convierte en el principal objetivo de

esta revisión. En este estudio se realizó una revisión exhaustiva de los estudios

publicados en México, de especies utilizadas para control biológico y uso tradicional

así como una revisión de las bases de datos biológicas disponibles para el país. En

México se han reportado 25 especies, entre las cuales se incluyen teleomorfos y

estados asexuales. La familia Clavicipitaceae está representada por Metarhizium

anisopliae. La familia Cordycipitaceae, está representada por cinco especies del

género Cordyceps y cuatro son estados asexuales tal como Beauveria bassiana e

Isaria fumosorosea, mientras que la familia Ophiocordycipitaceae posee diez

especies del género Ophiocordyceps, dos del género Tolypocladium y tres estados

asexuales del género Hirsutella. Tolypocladium ophioglossoides y T. capitata, son

utilizadas por los Nahuas en ceremonias sagradas en el Estado de México.

PALABRAS CLAVE

Taxonomía, Etnomicología, Hypocreales, listado de especies, insectos plaga,

cordicepina

ABSTRACT


31

Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.), is a group of ascomicetes fungi parasites of

arthropods, grass plants and fungi of the genus Elaphomyces. This group presents

at a global level species of agricultural, edible, medicinal and ecological importance.

Although Mexico had the fourth place of the twelve most megadiverse countries of

the planet, whith respect to entomopathogenic fungi, there ins´t currently general

overview of the state ot its knowledge in this conuntry, so this is the main aim of this

review. In this study, a comprehensive review was carried out of the studies

published in Mexico, where diversity, species used for biological control and

traditional use are mentioned. In Mexico, 25 species have been reported, including

teleomorphs and asexual states. The family Clavicipitaceae for Metarhizium

anisopliae. Nine species belong to Cordycipitaceae family, five belong the genus

Cordyceps and four asexual states as Beauveria bassiana e Isaria fumosorosea.

The family Ophiocordycipitaceae has ten species of the genus Ophiocordyceps, two

in the genus Tolypocladium and three asexual states of the genus Hirsutella.

Tolypocladium ophioglossoides y Tolypocladium capitata are use for the Nahuas in

sacred ceremonies in Mexico.

KEY WORDS

Taxonomy, Ethnomycology, Hypocreales, list of species, pest insects, cordycepin

INTRODUCCIÓN

Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.) es un grupo de ascomicetos parásitos de

artrópodos en sus diferentes estadios de su ciclo de vida, que pueden ser pupa,

larva o estado adulto, también parasitan gramíneas y hongos del género


32

Elaphomyces (Sung et al., 2007a). Estos hongos endoparásitos pueden tener

rangos específicos de hospederos que van desde orden, familia ó especie (Nikoh y

Fakatsu, 2000; Sasaki, 2008; Sanjuan et al., 2014). Se reproducen sexual y

asexualmente por lo que su ciclo de vida es pleomórfico y polimórfico, en la

reproducción sexual (estado teleomorfo o perfecto) con meiosis producen

ascosporas y en la reproducción asexual (estado asexual o imperfecto) por mitosis

producen blastosporas o conidios (Zheng et al., 2011). Tienen la capacidad de

atravesar el exoesqueleto de sus hospederos debido a que pueden hidrolizar la

quitina. Las ascosporas o conidios inician este proceso con la ayuda de

prolongaciones de las células fúngicas llamadas aprensorios y haustorios, los

cuales segregan enzimas específicas para poder atravesar el exoesqueleto y llegar

así a colonizar el interior del hospedero (Evans et al., 1988). Cordyceps sensu lato

es un grupo parafilético que pertenece al Phylum Ascomycota, a la Clase

Sordariomycetes, al Orden Hypocreales y se encuentra dividido en tres familias, la

Familia Cordycipitaceae, que incluye el género teleomorfo Cordyceps y estados

asexuales como Isaria y Beauveria, la familia Clavicipitaceae incluye teleomorfos

como Claviceps y estados asexuales como Balansia y Moelleriella, la Familia

Ophiocordycipitaceae que incluye a los teleomorfos Ophiocordyceps y

Tolypocladium y estados asexuales como Polycephalomyces, Purpureocillium,

Harposporium (Sung et al., 2007a; Sung et al., 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt

et al., 2014). Los caracteres más consistentes de Cordyceps s.l. son el color y

textura del estroma (Sung et al., 2007a) y el hospedero que parasita que se define

como el nicho ecológico (Sanjuan, 2015). La utilización de marcadores moleculares

también es una herramienta indispensable para determinar especies y relaciones


33

filogenéticas de este grupo, siendo los diagnósticos, la subunidad pequeña y grande

de DNA ribosomal (SSU, LSU), la primer y segunda más grande subunidad de la

RNA polimerasa II (RPB1, RPB2), el factor de elongación 1-α (Tef) (Sung et al.,

2006a; Quandt et al., 2014). La importancia de Cordyceps s.l. es agrícola,

comestible y medicinal. Estos hongos pueden controlar la densidad poblacional de

algunos insectos, por lo que algunas especies, particularmente el estado asexual

presenta importancia como control biológico. En África se ha utilizado a Metarhizium

para controlar el género Anopheles (“mosquito”), vector de malaria (Scholte et al.,

2005), así como para el control de los acrídidos (“langostas”) (FAO 2009). En

Norteamérica, Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus se han utilizado

para controlar a la mosca blanca Bemisia argentifolii y B. tabaco, consideradas por

la IUCN (International Union for Conservtion of Nature, por sus siglas en inglés)

como especies invasivas que afectan cultivos de alfalfa, brócoli, col, algodón,

tomate, calabaza, cacahuate, sandía entre otros, (Quesada-Moraga et al., 2006;

SEDECO, 2014). Para Latinoamérica, específicamente en Brasil, Metarhizium ha

sido utilizado para controlar a Aeneolamia varia (“salivazos”) que afecta el cultivo de

alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en Colombia se ha encontrado a

Lecanicillium sabanense parasitando hembras de Pulvinaria caballeroramosae que

a su vez parasitan a Ficus suatensis (Chiriví-Salomón et al., 2015), por mencionar

algunos ejemplos. Cordyceps también es muy apreciado como comestible en el

continente Asiático, ya que Ophiocordyceps sinensis parasita larvas de la polilla

Hepialus sp. presenta una larga historia en la medicina china tradicional, por lo que

es considerado un alimento funcional, a este se le atribuyen propiedades

antioxidantes, antitumorales, inmunoestimulantes, antigripales y afrodisiacas. En el


34

Tibet es llamado “hongo caterpilar” ó “gusano de invierno, hierba de verano”,

presenta alto valor cultural y económico. En 2008 estaba valorado comercialmente

en 3,000 a 18,000US un kilogramo. Su distribución geográfica está restringida a

altitudes elevadas en Asia y su sobreexplotación ha provocado la disminución de su

población (Ng y Wang, 2005; Kumar et al., 2010; Winkler, 2010; Shrestha et al.,

2011). Debido a que O. sinensis no se ha podido obtener artificialmente a nivel de

estroma, Cordyceps militaris es utilizado como sustituto de O. sinensis, y es

cultivado a nivel industrial (Shrestha et al., 2010). Ambas especies producen

componentes bioactivos (Tan, 2010). Estos metabolitos secundarios como las

naftoquinonas, exopolisacáridos, ergosterol, carotenos y cordicepina (un análogo

de la adenosina) presentan actividades antimalarias, hipoglucémicas, antidiabéticas

anticancerígenas e inmunomodulatorias (Chen et al., 1997; Kim et al., 2001; Zhao

et al., 2002; Asaduzzaman et al., 2010). También se utilizan para tratar

enfermedades respiratorias, tales como asma, bronquitis y enfermedad pulmonar

obstructiva (COPD) e infecciones virales causadas por influenza A (Kumar et al.,

2010). Para México no se tiene un listado de las especies que se han colectado en

el país, su distribución geográfica o los usos que se han dado a estas especies., por

lo que este trabajo aporta los siguientes aspectos: primeros reportes de hongos

entomopatógenos en México, diversidad, especies utilizadas para control biológico

y su uso tradicional.

MATERIALES Y MÉTODO

La revisión de los primeros reportes de hongos entomopatógenos se hizo en el

Acervo histórico del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de


35

México (UNAM). Se elaboró un listado de las especies de teleomorfos registradas

en los diferentes estados del país, mediante la revisión de las investigaciones

publicadas desde el año 1864 al 2017. Se realizó una visita al herbario MEXU del

Instituto de Biología de la UNAM y se revisaron todos los ejemplares depositados

con el nombre de Cordyceps. El uso de estados anamorfos como control biológico

y conocimiento tradicional, se llevó a cabo en buscadores electrónicos como

Google, Scientific Electronic Library Online (SciELO), en las bases de datos

Redalyc, Elsevier, Scopus, y SpringerLink. Las palabras clave utilizadas en las

búsquedas fueron: Cordyceps, hongos entomopatógenos, control biológico,

Metarhizium, Beauveria, Isaria, Paecilomyces¸ cultivo de Cordyceps y

Tolypocladium. El nombre científico de las especies se describe de acuerdo al

nombre taxonómico actual, mediante la nomenclatura del Index Fungurum.

RESULTADOS

Para México, Cordyeps sensu lato está representado por 25 especies, las cuales

incluyen estados teleomórficos y anamórficos. Están distribuidas en las tres familias

que conforman a Cordyceps sensu lato. La Familia Clavicipitaceae solo está

representada por Metharizium anisopliae (Tabla 3), la Familia Cordycipitaceae está

representada por cinco especies del género Cordyceps y cuatro estados asexuales

Tabla 4), y la Familia Ophiocordycipitaceae que presenta dos especies del género

Tolypocladium, diez del género Ophiocordyceps y tres estados asexuales del

género Hirsutella (Tabla 5).


36

Tabla 3. Especies de la Familia Clavicipitaceae registradas en México

Especie Hospedero Vegetación Altitud

(m)

Distribución geográfica y

Referencia

Localidad y Clave de

Herbario/Clave de

cepario

Metarhizium

anisopliae

(Sorokin,

1883)

Phyllophaga spp.

Brachistola magna

Melanoplus

differentialis

Agroecosistema:

Café, maíz,

frijol, cítricos

1137-2229 Chihuahua: Orranteño, Santa

Gertrudis, Las Varas (Barajas et al.,

2011).

Morelos: Tetela de Volcán (N

18.89462, WO 98.73398), Tlayca (N

18.70045, WO 98.84995), San

Andrés de la Cal (N 18.95696, WO

99.11691), Buenavista del Monte

(Hernández-Velázquez et al., 2011).

Chiapas (De la Rosa et al., 2000).

Michoacán: Sahuayo, Jiquilpan,

Zamora, Los Reyes, Cojumatlán

(García-Munguía et al., 2015).

Colima, Jalisco, Tamaulipas

(Lezama-Gutiérrez et al., 2001).

Coahuila (Sánchez-Peña et al.,

2010).

Querétaro (Uribe-González y

Santiago-Basilio, 2012).

Orranteño: Ma-001

(X-17)

Santa Gertrudis: Ma-

002 (X-31)

Las Varas: Ma-003

(X-040)


37

Tabla 4: Especies de la Familia Cordycipitaceae registradas en México


(m)

Distribución

geográfica y

Referencia

Localidad y Clave de Herbario

Cordyceps militaris

(Fr. Link 1818)

Pupas y larvas

de Lepidóptera

de la Familia

Saturniidae:

Paradirphia

lasiocampina,

Familia

Geometridae,

Noctuidae y

Sphingidae, y

adultos de

Coleóptera

Bosque:

mesófilo de

montaña, Pinus-

Quercus,

tropical

subcaducifolio,

tropical

perennifolio,

Abies, Abies

balsamea, Tsuga

y Picea con

árboles

deciduos.

Selva: baja

caducifolia

Matorral de

Juniperus

260-

3200

Hidalgo: Parque

Nacional el Chico, Las

Ventanas (Pérez-Silva,

1977).

Morelos: Tepoztlán,

camino al cerro del

Tepozteco (Pérez-Silva,

1977; Rubio-Bustos et

al., 1999).

Oaxaca: Huautla de

Jiménez., Sierra Ixtlán,

1 km antes de

Jacaltianguis (Pérez-

Silva, 1977), Sierra de

Ixtlán, Carretera

Oaxaca-Ixtlán, El punto

(Rubio-Bustos et al.,

1999).

Veracruz: Jalapa, Cerro

La Martinica (Pérez-

Silva, 1977), Xalapa,

2.5 km antigua carretera

Xalapa- Coatepec,

alrededores de la casa

asistencial

Parque Nacional el Chico: ENCB

32, Bush, 1966

Cerro del Tepozteco: ENCB 59,

24, Garnica., ENCB 91,26,

Magaña, 1968

Huautla de Jiménez: P. Heim,

1956

Sierra de Ixtlán: MEXU 9841,

Pérez-Silva, 1976

Cerro la Martinica: MEXU 9841,

Pérez-Silva, 1975

Ocosingo: XAL 1957, S. Chacón,

1984

Camino Lacanja-Rio Cedro

Lacanja: XAL 1974, S. Chacón,

1984

Barranca de Huentitán: IBUG

48, 96, 134, 319 L.S. Vázquez,

1986., IBUG 92, I. Álvarez, 1987.,

IBUG 506, L.S. Vázquez, 1987.,

IBUG 709, L.S. Vázquez, 1988


38

CONECALLI-DIF.,

Cerca del rio

Coapexpan, 2 KM al

Suroeste de Xalapa.,

Ejido Benito Juárez,

1Km al sureste del

Jardín Botánico

Francisco Javier

Clavijero (Rubio-

Bustos et al., 1999).

Chiapas: (Chacón y

Guzmán, 1984),

Ocosingo, Camino

Lacanja-Rio Cedro

Lacanja (Rubio-Bustos

et al., 1999).

Jalisco: (Mains, 1958;

Rubio-Bustos et al.,

1999), Barranca de

Huentitán., Zapopan,

parque los Colomos.,

Cuautitlán, Reserva de

la Biosfera Sierra de

Manantlán, puerto de

Escobedo., El

Tlacuache., Casimiro

Castillo, Cerro La

Petaca (Rubio-Bustos et

al., 1999; Guzmán et al.,

Zapopan: IBUG s.n., Puga, 1983.,

MEXU 9356, R. Hernández,

1983., IBUG 2064, L. Guzmán-

Dávalos, 1985., IBUG 3, N.

Carrillo, 1987., IBUG 314, 315,

316 y 317, S.Y. Rubio, 1996.

Cuautitlán: IBUG 984, M. L.

Fierros, 1995

El Tlacuache: IBUG 263, S. Y.

Rubio, 1995

Cerro la Petaca: IBUG 2, L.

Vigueras, 1988

Amecameca: ENCB 221, G.

Guzmán, 1955

Tepoztlán: ENCB 91, Magaña,

1968

Carretera Oaxaca-Ixtlán: XAL

s.n., W.S. Miller, 1961

Carretera Matamoros-

Mazatlán: IBUG 1188,

Rodríguez, 1995

Xalapa, 2.5 km: XAL 864, F.

Tapia, 1991

Cerca del rio Coapexpan: XAL

201, V.M. Bandala-Muñoz, 1985


39

2001), Tapalpa

(Gándara et al., 2014).

Estado de México: (Frutis et al., 1985;


1999), Amecameca,

Popocatépetl, Barranca

del Ameyalco (Rubio-

Bustos et al., 1999),

Ocuilan, La Haciendita.,

Tenancingo, Santo

Desierto., Villa

Guerrero, San Miguel

(Pérez-Villamares et al.,

en prensa).

Sinaloa: Carretera

Matamoros-Mazatlán,

cañada en el tramo

Durango-Mazatlán

(Rubio-Bustos et al.,

1999).

Michoacán: (Díaz-

Barriga et al., 1988;


1999).

Nuevo León: (Guzmán

et al., 2001).

Morelos: Cuernavaca,

Jardín Botánico

Ejido Benito Juárez: XAL 1149,

S. Chacón, 1983

Ocuilan: (18°58’44”N-

99°25’01”O): AMCIRB 29, 32,

61-69, 135-139, 211-223, J.C.

Pérez-Villamares, 2013

Tenancingo: 18°55’01”N –

99°33’31”O: AMCIRB 1-14, 41-

49, 52, 69, 73, 75, 101-125, 181-

203 J.C. Pérez-Villamares, 2013

Villa Guerrero: 18°59’38”N –

99°39’59”O: AMCIRB 16-27,

J.C. Pérez-Villamares 2013.,

AMCIRB 53-60, 97,98, 115, 143-

159, 161-166, 168, 224-240, 242-

245, J.C. Pérez-Villamares, 2014

Álamos: CESUES 536

Yécora: CESUES 3099


40

UAEM.,

Tlalquiltenango, Cruz

pintada., Miacatlán, 2

KM. al sur de las

pirámides de

Xochicalco (Castro et

al., 2012).

Sonora: Álamos, km 42

de la carretera Navojoa

a Alamos., Yécora, 4.8

km del camino Yécora a

Sahuaripa (Pérez-Silva

et al., 1996).

Cordyceps

polyarthra

(Möller 1901)

Pupas de

Lepidóptera

Bosque: tropical

caducifolio,

tropical con

Quercus

1300-

1650

Guadalajara: Barranca

de Huentitán., Cocula,

Sierra de Quila, El

Mirador (Rubio-Bustos,

1999).

Barranca de Huentitán: IBUG

546 L.S. Vázquez, 1987

Cocula: IBUG 271, O. Vargas,

1989

Cordyceps pruinosa

(Petch 1924)

Hospedero

desconocido

Bosque:

Tropical

Quintana Roo: Zona

Chunyaxche, cerca de

Puerto Carrillo y Puerto

Morelos (Guzmán et

al., 2001).

Zona Chunyaxche: XAL 20626,

Guzmán, 1981


41

Cordyceps

scarabaeicola

(Kobayasi y Shimizu

1976)

Adultos de la

Familia

Scarabaeidae:

Cotinus

mutabilis.,

Familia

Melolonthinae:P

hyllophaga sp.

Familia

Dynastinae:

Xyloryctes

thestalus

Bosque:

Quercus-Pinus,

Quercus

Ecotono entre

vegetación

arbustiva de

bosque

Juniperus y zona

agrícola

Estado de México:

Malinalco, carretera

Malinalco-Tenancingo.,


Tenancingo, Santo

Desierto (Pérez-

Villamares et al., en

prensa).

Malinalco (18°58’19”N-

99°29’40”O): AMCIRB 80, 206,

J.C. Pérez-Villamares, 2014.

Ocuilan: (18°58’44”N-

99°25’01”O): AMCIRB 28, 87, 88

J.C. Pérez-Villamares 2013

Tenancingo: (18°55’01”N-

99°33’31”O): AMCIRB 50, J.C.

Pérez-Villamares, 2013

Cordyceps

takaomontana

(Yakush y Kumaz

1941)

Pupas y larvas

de Lepidóptera

Bosque:

Quercus-Pinus

Vegetación

secundaria

arbustiva de

bosque de

Quercus

Ecotono entre

vegetación

secundaria

arbustiva de

bosque de

Juniperus y zona

agrícola

Estado de México:


Malinalco-Tenancingo.,


Tenancingo, Santo

Desierto del Carmen.,

Tenango del Valle, San

Pedro Tlanixco., Villa


(Pérez-Villamares et al.,

en prensa).

Malinalco:18°58’19”N-

99°29’40”O: AMCIRB 76-79, 81-

85, 126, 133, 134, J.C. Pérez-

Villamares 2014

Ocuilan:18°58’44”N-

99°25’01”O: AMCIRB 86, 89,

210, 220, J.C. Pérez-Villamares

2014

Tenancingo: AMCIRB 71, 72, 74,

J.C. Pérez-Villamares, 2014

Tenango del Valle (19°03’45”N-

99°39’07”O): AMCIRB 177-180,

100, J.C. Pérez-Villamares, 2014.,

AMCIRB 100, J.C. Pérez-

Villamares, 2013


42

Villa Guerrero (18°59’38”N-

99°39’59”O): AMCIRB 160, 167,

241, J.C. Pérez-Villamares, 2014

Paecilomyces

tenuipes (Peck 1901)

Pupa no

identificada

Bosque:

mesófilo de

montaña

Veracruz: Xalapa,

Parque ecológico “El

Haya” (López y García,

2002).

Beauveria bassiana

(Bals.-Criv) Vuill

1912

Coleóptera:

Phyllophaga

spp.,

Galleria

mellonella,

Hypothenemus

hampei.,

Orthoptera:

Brachystola

magna.,

Lepidóptera

Agroecosistema:

Café, maíz, frijol

1600 Morelos: Tetelilla

(18°66´01´´N-

98°79´21´´WO,

Buenavista del Monte

(Hernández-Velázquez

et al., 2011).

Chihuahua: General

Trías, Orranteño,

Delicias, Las Varas,

Alvareñas (Barajas et

al., 2011).

Chiapas (De la Rosa et

al. 2000).

Michoacán: Sahuayo,

Jiquilpina, Zamora, Los

Reyes, Cojumatlán

(García-Munguía et al.,

2015).

Coahuila (Sánchez-

Peña et al., 2010).

Tetelilla: Aislamientos

resguardadas en la Colección de

Hongos entomopatógenos del

Centro Nacional de Referencia de

Control Biológico SAGARPA-

SENASICA-DGSV

General Trías: Bb-001 (X-003)

Orranteño: Bb-002 (X-023)

Delicias: Bb-003 (X-024)

Las Varas: Bb-004 (X-036)

Alvareñas: Bb-005 (X-042)


43

Isaria fumosorosea

(Wize 1904)

Adultos de

Orthóptera de la

Familia

Tetigonidae,

Agroecosistema:

cítricos

Veracruz: Cerro de la

Martinica, sur de

Banderilla (Pérez-Silva,

1978).

Cerro de la Martinica: MEXU

12210, Hernández y Garrido, 1977

Isaria farinosa

(Holmsk 1832)

Pupas de

Lepidópteros

Morelos: (Guzmán et

al., 2001), Autopista

México-Cuernavaca.,

Autopista México-

Cuernavaca, Curva La

Pera, Autopista de

Cuautla 5km al oeste de

Tepoztlán (Pérez-Silva,

1977).

Oaxaca: (Guzmán et

al., 2001), Zacatepec

(Pérez-Silva, 1977).

Sin localidad (Pérez-

Silva, 1979).

Autopista México-Cuernavaca:

MEXU 3391, Miuda, 1961

Autopista México-Cuernavaca,

Curva La Pera: ENCB 88, 21,

Gimate, 1969

Autopista de Cuautla 5Km al

oeste de Tepoztlán: ENCB 6058,

Guzmán, 1967

Zacatepec: P 5850, Heim, 1959

Torrubiella spp.

(Boud. 1885)

Sobre hojas con

Sporothrix

guttuliformis

Agroecosistema:

café

150-

1700

Veracruz (Carrión y

Rico-Gray, 2002).


44

Tabla 5: Especies de la Familia Ophiocordycipitaceae registradas en México


(m)

Distribución geográfica y

Referencia

Localidad y Clave de

Herbario

Tolypocladium

capitatum (Holmsk)

(Quandt, Kepler y

Spatafora, 2014)

Ascomicetos:

Elaphomyces

granulatus y

E. variegatus

Bosque:

Pinus y

Pinus-

Quercus

1800-

3500

Durango: (Quintos et al., 1984;

Rubio-Bustos et al., 1999), Región

del Salto, Municipio de pueblo

Nuevo, Las Bayas, (Raymundo et al.,

2005).

Estado de México: Tenango del

Valle, San Pedro Tlanixco (Heim y

Wason, 1958; Guzmán, 1958, 1977;

Pérez-Silva, 1977; Guzmán et al.,

2001; Guzmán, 2008). San Cayetano,

Rio Frio, Suroeste del Nevado de

Toluca, Zoquiapan (Pérez-Silva,

1977).

Hidalgo: (Heim 1958; García-

Romero et al., 1970; Rubio-Bustos et

al., 1999), Sierra del Chico (Pérez-

Silva, 1977).

Jalisco: San Andrés Ixtlán (Pérez-

Silva et al., 1977), Tapalpa (Gándara

et al., 2014).

Puebla: (Martínez et al., 1983;

Rubio-Bustos et al., 1999).

Tenango del Valle: MEXU 3929, Herrera y

Sánchez, 1957., MEXU

3153, T. Herrera, 1956.,

MEXU 3929, Herrera et

al., 1996., MEXU 11523,

T. Herrera, 1956., P. Heim,

1956., ENCB 832,

Guzmán, 1957., ENCB

5094, Guzmán, 1963.

San Cayetano: ENCB

5094, Guzmán, 1963.

Rio Frio: ENCB 87, 28,

Montaud, 1967

SO del Nevado de Toluca: ENCB 103, Muñoz, 1967

Zoquiapan, Llano

grande: ENCB 5,

Hernández, 1972., ENCB

13-Z, Padilla, 1974

Sierra del Chico: ENCB

98, Varela, 1975


45

Morelos: Lagunas de Zempoala, San

José Tlacotenco, Faldas de Tepozteco


Michoacán: (Díaz-Barriga et al.,

1988; Rubio-Bustos et al., 1999).

Tamaulipas: (Heredia, 1989; Rubio-


Oaxaca: Huautla de Jiménez,

Juquilla, Carretera Oaxaca-Tuxtepec

(Pérez-Silva et al., 1977).

Veracruz: (Guzmán y Villareal,

1984; Heredia, 1989; Rubio-Bustos et

al., 1999).

San Luis Potosí: (Rubio-Bustos et

al., 1999), Puerto a Hurta (Pérez-

Silva, 1977).

Sonora: Yécora, km 258 de la

carretera Hermosillo a Yécora (Pérez-

Silva et al., 1996).

San Andrés: ENCB

11926, Guzmán, 1974

Lagunas de Zempoala: ENCB 8376, Guzmán,

1970.

San Juan Tlacotenco: MEXU 9635, Pérez-Silva,

1974.

Faldas de Tepozteco: MEXU 11569, Martínez,

1976

Huautla de Jiménez: P.

5540, Heim, 1959.

Juquilla: P. 92, Heim,

1956

Carretera Oaxaca-

Tuxtepec: MEXU 10583,

Pérez-Silva, 1976

Puerto a Huerta: ENCB

s.n, Medellín, 1968

Yécora: CESUES 3068

Tolypocladium

ophioglossoides (J.F. Gmel.)

(Quandt, Kepler y

Spatafora, 2014)

Ascomicetos:

Elaphomyces

granulatus y E.

reticulatus

Bosque:

Pinus y

Quercus

Durango: Región del Salto, Arroyo

Santo Domingo (Pérez-Silva, 1977).

Estado de México: (Trappe y

Guzmán, 1971; Guzmán et al., 2001),

Tenango del Valle (Heim y Wason,

Región del Salto, Arroyo

Santo Domingo: ENCB

1628, Guzmán, 1961

Tenango del Valle: ENCB

1628, Guzmán, 1958.,


46

1958; Pérez-Silva, 1977). Zona este

del Nevado de Toluca “Barranca del

Diablo”, Cerca de San Pedro Tlanixco


Hidalgo: Sierra el Chico “Las

ventanas” (Pérez-Silva, 1977).

Michoacán: (Díaz-Barriga et al.,

1988).

Oaxaca: Huautla de Jiménez, Cerro

Clarín (Pérez-Silva, 1977).

Sonora: Álamos, Rancho Las

Uvalamas (Pérez-Silva et al., 1996).

San Luis Potosí: (Guzmán, 1958;

Guzmán et al., 2001).

MEXU 11685, Herrera y

Sánchez, 1956

Nevado de Toluca

“Barranca del Diablo”:

ENCB 1736, Guzmán,

1958

Cerca de San Pedro

Tlanixco: ENCB 1642,

Guzmán, 1958

Sierra el Chico “Las

ventanas”: ENCB 120,

Varela, 1975

Huautla de Jiménez: P.

92-bis, Heim, 1958

Álamos: CESUES 1796a

Ophiocordyceps

melolonthae

(Tul y Tul) (Sung,

Sung, Hywel-

Jones y Spatafora,

2007)

Larvas y

adultos de

Coleóptera de

la Familia

Melolonthidae:

Enema

endymion,

Strategus

aloeus y

Phyllophaga

sp.

Bosque:

Pinus-

Quercus,

húmedo

subtropical

(Calophyllu

m, Tapirira,

Laplacea,

Terminalia,

Mosquitoxyl

um,

Vochysia,

150-

1925

Chiapas: (Chacón y

Guzmán, 1983), Tuxtla

Gutiérrez (Pérez-Silva,

1977), Tenejapa, Villa Las

Rosas (Guzmán et al., 2001).

San Pedro Chenalho

(16°55´04.2´´lat. N,

92°30´57.6´´ long. O;

16°55´22.2´´ lat. N,

92°38´02.5 long. O),

Tenejapa (16°55´20.2´´ lat

Tuxtla Gutiérrez: MEXU 11524,

Palacios, 1959., P Heim, 1959

Tenejapa: Colección entomológica

del IE, Robles, 1999

Villa Las Rosas: Colección

entomológica del IE y en ECOSUR

en San Cristóbal de las Casas,

Alcazar, 1999

Cuautitlán: IBUG 292, Rubio, 1995

Oaxaca: XAL Wolf, 1998: 2559-1,


47

Enterolobiu

m, Quercus,

Podocarpus

y Pinus

chiapensis)

Selva alta

perennifolia

Agroecosist

ema: cafetal

N, 92°29´05.3´´ long. O)

(Robles et al., 2006).

Jalisco: (Chacón y Guzmán,

1983; Guzmán et al., 2001),

“Cuautitlán, Reserva de la

Biosfera Sierra Manantlán,

predio las Joyas, cuatro

caminos” (Rubio-Bustos et

al., 1999).

Oaxaca: Al oeste de la

Sierra Madre del Sur, al este

del Itsmo de Tehuantepec,

31 Km al noreste de Lázaro

Cárdenas y Escuilapa, a los

alrededores de Santa María

Chimalapa, al oeste de Cerro

Azul (Guzmán et al., 2001).

Veracruz: Catemaco, ejido

López Mateos (Guzmán et

al., 2001).

Morelos: Cuernavaca,

Jardín Botánico UAEM

(Castro-Bustos et al., 2012).

2559-3, 2559-4, 2559-5, 2559-6,

2559-10, 2559-11 2559-12, 2559-14,

2559-1., ECOSUR: 2559-8, 2559-9,

2559-13., K: 2559-2., NY: 2559-7

Catemaco: XAL 4001, Chacón,

1987.

San Pedro Chenalho: ECOSUR L.

Robles, 1999: 201, 202, 245, 424,

426.

Ophiocordyceps

dipterigena (Berk

y Broome) (Sung,

Sung, Hywel-

Díptero:

Eucalliphora y

Phaenicia

sericata

Bosque:

húmedo

subtropical

Veracruz: Xalapa, Parque

Ecológico “El Haya”

(López-García, 2009).,

Jardín Botánico del Instituto

de Ecología Xalapa

Jardín Botánico del Instituto de

Ecología Xalapa: XAL 15 Ramírez-

Guillén, 1997., XAL 456, Jarvio,

2000


48

Jones y Spatafora,

2007)

(Guzmán et al., 2001; Medel,

2013).

Ophiocordyceps

entomorrhiza

(Dicks) (Sung,

Sung, Hywel-

Jones y Spatafora,

2007)

Larvas de

Lepidóptera de

la Familia

Noctuidae

Bosque:

mesófilo de

montaña

Agroecosist

ema: cafetal

1460 Veracruz: (Chacón y

Guzmán, 1983, 1995;

Chacón et al., 1995; Rubio-

Bustos et al., 1999), Xalapa,

Jardín Botánico Francisco

Javier Clavijero, Parque

Ecológico “El Haya”

(López y García, 2002),

Xalapa km.2.5 antigua

carretera Xalapa-Coatepec,

alrededores de la casa

Asistencial CONECALLI-

DIF., Jardín Botánico

Francisco Javier Clavijero.,

Xico, Barranca del Techolo

(Rubio- Bustos et al., 1999).

Xalapa a 1.5 a Pacho

(Pérez-Silva, 1978; Medel,

2013).

Estado de México: Villa


(Pérez-Villamares et al., en

prensa).

Xalapa Km. 2.5 antigua carretera

Xalapa-Coatepec: XAL 326, Tapia,

1990

Jardín Botánico Francisco Javier

Clavijero: XAL 112, 171, 172, 184,

187, 207, 214, 215, 225, 244, D.

Brown, 1981., XAL 4215, S.

Chacón, 1989., XAL 461, R. Medel,

1981., XAL 770,734, 751, D.

Brown, 1982.

Xico, Barranca del Techolo: XAL

2768, s. Chacón, 1984., XAL 13400,

F. Ventura 1976.

Xalapa a 1 ½ a Pacho: MEXU

12209, 12211 M.A. Flores 1977.

Villa Guerrero (18°59’38”N-

99°39’59”O): AMCIRB 91-96, 99,

169-176, J.C. Pérez-Villamares,

2014

Ophiocordyceps

humbertii

(C.P. Robin)

(Sung, Sung,

Oaxaca (Ulloa y Benavides,

1991; Rubio-Bustos et al.,

1999).


49

Hywel-Jones y

Spatafora, 2007)

Ophiocordyceps

gracilis (Grev.)

(Sung, Sung,

Hywel-Jones y

Spatafora, 2007)

Larvas de

Lepidóptera de

la Familia

Noctuidae

Bosque:

tropical

caducifolio,

mesófilo de

montaña

Vegetación

inducida

Ecotono

entre

vegetación

secundaria

de bosque

Juniperus y

una zona

agrícola

1300-

1640

Jalisco: Barranca de

Huentitán, Zapopan, Las

Agujas, Nextipac, Centro

Universitario de Ciencias

Biológicas y Agropecuarias,

Universidad de Guadalajara

(Rodríguez et al., 1993;

Rubio-Bustos et al., 1999;

Medel et al., 1999; Medel,

2013).

Veracruz: Xico, Cofre de

Perote, Los Gallos (Chacón

y Guzmán, 1983, 1995;

Chacón et al., 1995;

Guzmán et al., 2001),

Banderilla, Cerro la

Martinica., Xalapa, Rio

Coapexpan (Rubio-Bustos

et al., 1999).

Estado de México:


Malinalco- Tenancingo


prensa).

Barranca de Huentitán: IBUG 127,

L.S. Vázquez, 1986.

Zapopan: IBUG 45, I. Álvarez,

1987., IBUG 4857, L. Guzmán-

Dávalos, 1989., IBUG 14, Torres, s.f.

Xico: XAL 661, Bandala

Banderilla: XAL 1357 Bandala

Malinalco: AMCIRB 34, 35, J.C.

Pérez-Villamares, 2013., AMCIRB

128-132, J.C. Pérez-Villamares, 2014

Ophiocordyceps

gracilioides

(Kobayasi) (Sung,

Larvas de

Coleóptero

Selva baja

caducifolia

1104-

1200 Estado de México:


Malinalco-Tenancingo

Malinalco (18°58’19”N-

99°29’40”O): AMCIRB 36-40, 127,



50

Sung, Hywel-

Jones y Spatafora

2007)

Ecotono

entre

vegetación

secundaria

arbustiva de

bosque de

Juniperus y

zona

agrícola


prensa).

Morelos: Miacatlán, 2 km

al sur de las pirámides de

Xochicalco., Coatlán del

Rio, Michapa (Castro-


Ophiocordyceps

sphecocephala

(Klotzsch ex

Berk) (Sung,

Sung, Hywel-

Jones y Spatafora,

2007)

Adulto de

Himenóptera

del género

Polistes

Bosque de

Quercus,

tropical

caducifolio

Selva:

tropical

perturbada,

baja

caducifolia

1000 Jalisco: (Chacón y Guzmán,

1983; Rodríguez et al.,

1993; Guzmán et al., 2001),

Carretera Guadalajara-La

Piedad, Barranca del Río

Santiago (Pérez-Silva,

1977), Pihuamo entre el

Vallecito y Las Encinas

(Rubio-Bustos et al., 1999).

Oaxaca: (Ulloa y

Benavides, 1991).

Morelos: Tlalquiltenango,

Cruz pintada., Miacatlán, 2

km al sur de las pirámides

de Xochicalco (Castro-


Carretera Guadalajara-La Piedad: ENCB 12352, Guzmán, 1975

Pihuamo: IBUG 7021, L. Guzmán-

Dávalos, 1997.


51

Ophiocordyceps

stylophora (Berk

y Broome) (Sung,

Sung, Hywel-

Jones y Spatafora,

2007)

Adulto de

Himenóptera:

Polistes

instabilis

Larvas de

Coleóptera

Bosque:

Quercus-

Pinus

El ejemplar

no

concuerda

porque C.

stylophora

parasita

Coleópteros

, y el tamaño

de los

estromas

difiere, por

lo que tal

vez es una

nueva

especie

(Rubio-

Bustos

1999)

10 Jalisco: Sin localidad

(Herrera y Ulloa, 1998),

Chamela (Pérez-Silva,

1978; Rubio-Bustos et al.,

1999).

Estado de México: Tenancingo, Santo Desierto

El Carmen (Pérez-

Villamares et al., en prensa)

La Huerta, Estación Biológica

Chamela: MEXU 12212, Pérez-

Jiménez 1977

Tenancingo (18°55’01”N-

99°33’31”O): AMCIRB 12, 15, 51,


Ophiocordyceps

sobolifera

(Hill y Watson)

(Sung, Sung,

Hywel-Jones y

Spatafora, 2007)

Ninfas de

Homóptera de

la Familia

Cicadidae

Bosque:

Xerófilo

con

Quercus

Guanajuato: (Guzmán et

al., 2001).

Coahuila: Faldas del Cerro

del Mercado, cerca de

Monclova (Rubio-Bustos et

al., 1999).

Faldas del Cerro del Mercado: ENCB 1279, R. Valenzuela, 1981


52

Sonora (Méndez-Mayboca

et al., 2007).

Sin Localidad: (Mains,

1951, 1955, 1958; Pérez-

Silva, 1979; Petch (1933-

1934; Urbina, 1881).

Ophiocordyceps

octospora (M.

Blackw. Y Gilb)

(Sung, Sung,

Hywel-Jones y

Spatafora, 2007)

Jalisco (Blackwell y

Gilbertson, 1984; Guzmán

et al., 2001).

Hirsutella

stylophora

(Mains 1952)

Adultos del

orden

Himenóptera

Jalisco: Chamela (Pérez-

Silva, 1978).

Chamela: MEXU 12212, Pérez-

Jiménez, 1977

Hirsutella

thompsonii (F.E.

Fisher 1950)

Tetranychus

urticae, Aceria

guerreronis,

Phyllocoptruta

oleivora,

Brevipálpidos

phoenicics

Cultivo de

cítricos

Sin Localidad (Mier et al.,

1989, 1992; Sampedro y

Rosas, 1989; Guzmán et al.,

2001).

Colima: Llanura costera de

Tecomán (Boca de Apiza,

Tecomán, El Real, El

Paraíso), Llanura costera de

Cuyutlán (Playa de Oro,

Cuyutlán) y Valle del río

Armería (Los Amiales)

Colima: Clave en el cepario:

HtM130, 131, 135, 137,138, 150,

152, 155,160, 164.


53

(Rosas-Acevedo y

Sampedro-Rosas, 2006).

Hirsutella

citriformis

(Speare 1920)

Hemíptera:

Diaphorina

citri

Tabasco, Yucatán,

Quintana Roo, Campeche,

Chiapas, Veracruz,

Colima

(Pérez-González et al.,

2015).

Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Por. Lorena López Rodríguez

54

Familia Clavicipitaceae. Es la menos representada, solo con Metarhizium anisopliae, se

ha registrado de siete estados con diferentes tipos de climas, de cultivos de café, maíz,

cítricos y frijol.

Familia Cordycipitaceae. Presenta cinco reportes de teleomorfos, siendo Cordyceps

militaris la especie con mayor número de reportes y mayor distribución geográfica.

Familia Ophiocordcycipitaceae. Es la más diversa y colectada ya que Tolypocladium

capitatum ha sido registrada de 12 estados del país, siguiendo T. ophioglossoides. El

género Ophiocordyceps está representado en siete estados, siendo Veracruz, Oaxaca y

Jalisco donde se registran más de tres especies, los cuales presentan una compleja

geografía ya que son atravesados por distintos sistemas montañosos y presentan climas

tropicales y templados.

Investigaciones de Ciencia Aplicada con entomopatógenos: Se ha estudiado el

porcentaje de infección in vitro e in situ de cuatro estados asexuales de aislados

obtenidos en diferentes estados de México, de cultivos de maíz, frijol, café y cítricos

(Tabla 6). También se ha utilizado para controlar insectos que transmiten enfermedades

por lo tanto presentan potencial para ser utilizados como control biológico de insectos

plaga de cultivos con importancia alimenticia-económica y de insectos transmisores de

enfermedades.

.

55

Tabla 6: Estados asexuales de Cordyceps sensu lato utilizados como control biológico de insectos en México

Controlador

biológico

Hospedero Cultivo

afectado/enfermedad

controlada

Referencia

Metarhizium

anisopliae

Diaphorina citri

Brachystola

magna

Phyllophaga

spp.

Spodoptera

frugiperda

Aedes aegypti

Citrus sp. (lima persica)

Phaseolus vulgaris (frijol)

Zea mays (maíz)

Zea mays (maíz)

Dengue

Lezama-Gutiérrez et

al. (2012)

Barajas et al. (2011)

Hernández-Velázquez

et al. (2011)

Lezama et al. (2005)

García-Munguía et al.

(2015)

Beauveria

bassiana

Phyllophaga spp

Brachystola

magna

Aedes aegypti

Zea mays (maíz)

Phaseolus vulgaris (frijol)

Dengue

Hernández-Velázquez

et al. (2011)

Barajas et al. (2011)

García-Munguía et al.

(2015)

Isaria

fumosorosea

Diaphorina citri Citrus sp. (lima persica) Lezama-Gutiérrez et al.

(2012)

Hirsutella spp. Diaphorina citri Citrus spp. Pérez-González et al.

(2015)

Uso tradicional. El uso tradicional de especies de Cordyceps sensu lato solo se ha

reportado para dos especies, Tolypocladium capitata y T. ophioglossoides en el Centro

de México (Tabla 7).

.

56

Tabla 7: Especies de Tolypocladium con uso tradicional en el Centro de México.

Especie Nombre

común

Uso Lugar Observaciones Referencias

Tolypocladium

capitata

T.

ophioglossoides

Hombrecitos Efectos

curativos

(mezclados

con

Psilocybe)

Alucinógeno

Sagrado

Tenango del

Valle y San

Pedro

Tlanixco,

Estado de

México

Es utilizado por los

nahuas en ceremonias

sagradas cuando

también consumen a

Psilocybe muliercula

o P. sanctorum y

Elaphomyces

granulatus conocido

como gran mundo.

Heim y Wason

(1958),

Guzmán (1958,

1977)

Pérez-Silva

(1977)

Guzmán (2008)

DISCUSIONES

El primer mexicano interesado en conocer lo que en su tiempo nombraban “animal-

planta” fue Rio de la Loza (1864), quien fue un médico cirujano farmacéutico. En ese

tiempo se creía que en la naturaleza habitaba un animal herbívoro que cavaba la tierra y

al lado o dentro de él germinaba una semilla que posteriormente implantaba en este sus

radículas lo cual causaba su muerte. A partir de esta premisa Rio de la Loza identificó al

“animal” (hospedero) y cuantificó cenizas de la “planta” que emergía de este (estroma),

con lo que concluyó que el animal era un insecto hemíptero de la Familia Cicadidae

(Cicada communis) y la planta era una excrecencia de naturaleza animal (figura 5).

Figura 5: Dibujo de larva-ninfa. A. con ramificaciones que parten de la cabeza y terminan en punta, B. con

ramificaciones que terminan en coliflor, C. larva ninfa dividida longitudinalmente a la mitad, D. extremidad

anterior del artrópodo que le sirve para cavar la tierra (Tomado de: Rio de la Loza, 1864).

.

57

Posteriormente Urbina (1881) y Sánchez (1886) fueron los primeros en determinar a

estos “animal-planta raro” en hongos entomopatógenos de insectos.

Urbina (1881) determinó que la excrecencia presente en la parte anterior de larvas de

cicada (hemíptero) era un hongo llamado Sphaeria sobolifera (actualmente

Ophiocordyceps sobolifera). Posteriormente, Sánchez (1886) discutió acerca de los

“tlalomites”, nombre designado a una larva de insecto parasitado por hongos del género

Cordyceps que consumían los indios aztecas. La especie descrita por Sánchez (1886)

fue posteriormente identificada por Pérez-Silva (1979) como Cordyceps cosmopsaltria.

Los primeros reportes de hongos micopatógenos de Cordyceps s.l. los dió Mains (1957,

1958) quién describió a Tolypocladium capitatum como Cordyceps canadiensis en

Hidalgo y a Ophiocordyceps sobolifera como C. sobolifera en Jalisco. Al mismo tiempo,

Heim y Wasson (1958) registraron a T. capitatum como C. capitata y a T. ophioglossoides

como C. ophioglossoides para el Estado de México.

Por otra parte los estudios pioneros de diversidad de Cordyceps en México los realizaron

principalmente Pérez-Silva (1977), Pérez-Silva et al. (1978, 1996), Rubio-Bustos (2000)

y Guzmán et al. (2001), los demás registros se han dado por investigaciones de

diversidad general de ascomicetos.

Hasta ahora todos los estudios de diversidad han utilizado caracteres morfológicos, sin

integrar caracteres ecológicos y moleculares, así como tampoco se han realizado

estudios sobre las relaciones evolutivas de estos organismos. Por su parte Almaraz-

Sánchez et al. (2012) han utilizado marcadores moleculares ITS, excluyendo los

marcadores LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF, los cuales de acuerdo a Sung et al. (2006),

.

58

Quandt et al. (2015) y Sanjuan et al. (2014) son los caracteres moleculares diagnósticos

de hongos entomopatógenos.

Con respecto a la diversidad, México se encuentra ubicado entre la zona neártica y

neotropical lo que implica una topografía, orografía y climas diferentes, lo que está

directamente relacionado con la diversidad que presenta y por lo tanto la zona

biogeográfica neotropical es considerada una zona “hot spot”(Sanjuan et al., 2015), por

lo que México ocupa el cuarto lugar como país megadiverso (Pérez-Silva, 1977), por lo

tanto las 24 especies registradas del complejo Cordyceps sensu lato podrían aumentar,

si se realizaran estudios dirigidos específicamente a conocer la diversidad y relaciones

filogenéticas de este grupo.

La Familia Clavicipitaceae está representada por Metarhizium anisopliae. Ésta es

frecuentemente aislada de suelos, un amplio rango de insectos y es encontrada en

regiones tropicales y templadas, por lo que es considerada una especie generalista

(Bischoff et al., 2009). Las especies de este género son usadas como control biológico y

agentes para manejo y prevención de infestaciones principalmente de la Familia

Acridoidea. Otros estudios también han demostrado que reduce en un 75% la intensidad

de infección de malaria (Scholte et al., 2005). En México la utilización de estados

asexuales de Metarhizium sp. y Beauveria sp. prevalecen como control biológico en

cultivos de maíz y frijol que forman parte de la canasta básica para la población mexicana

(Barajas et al., 2011; Hernández-Velázquez et al., 2011), por lo que su estudio se ha

basado en su importancia agrícola y por lo tanto económica.

La Familia Cordycipitaceae, está representada principalmente por el género Cordyceps

y algunos anamorfos. Cordyceps es considerado el género más diverso en número de

.

59

especies y de hospederos (Sung et al., 2007a).Cordyceps militaris, ha sido registrada en

doce estados del país y puede ser considerada como especie cosmopolita (Rubio-Bustos

et al., 1999), Mains (1958) y Pérez-Silva (1977) la cito con amplia distribución en

Norteamérica, Europa y Asia. Guzmán (1977) la cito por primera vez para el Estado de

México. Cordyceps militaris se ha registrado en pupas y larvas de la Familia Noctuidae,

Shingidae y Geometridae en México en diferentes tipos de bosques desde templados

hasta tropicales y en vegetación inducida (Rubio-Bustos et al., 1999), lo cual indica que

su distribución no está determinada en primera instancia por la vegetación o clima, si no

por el hospedero, aunque la mayoría de las veces se ha registrado en climas húmedos

tropicales (Shrestha et al., 2016). Su importancia es comestible, medicinal y económica

ya que en Korea, Japón y Asia es consumida debido a las propiedades medicinales que

se le atribuyen y por la producción de metabolitos secundarios como la cordicepina con

actividad anticancerígena, antibiótica y antifúngica (Ng y Wang, 2005; Shrestha et al.,

2016).

La Familia Ophiocordycipitaceae está representada con el mayor número de especies de

Cordyceps s.l. en México, con registros en 12 estados del país, siendo Ophiocordyceps

el género con diez especies registradas, es considerado el género más diverso de

Hypocreales (Sung et al., 2007a). A nivel mundial la Familia Ophiocordycipitaceae

comprende cerca de 160 especies, estas infectan un amplio número de insectos,

parasitan a once ordenes: Coleóptera, Blattaria, Dermáptera, Díptera, Hymenotera,

Hemíptera, Isóptera, Lepidóptera, Mantodea, Orthoptera y Odonata (Evans et al., 2011;

Araújo y Hughes, 2014). Ophiocordyceps melolonthae se ha encontrado en diferentes

tipos de vegetación como, selva perennifolia, bosque de pino-encino, bosques húmedos

.

60

subtropicales y agroecosistemas como cafetales, siempre se encuentra parasitando

larvas y adultos de coleópteros de la Familia Melolonthidae (Perez-Silva, 1977; Rubio-

Bustos et al., 1999), por lo que su distribución también está relacionada con el hospedero.

Ophiocordyceps dipterigena, se ha registrado solo para el estado de Veracruz en bosque

húmedo subtropical sobre dípteros (Guzmán et al, 2001; Medel, 2013) esta especie

presenta importancia biotecnológica ya que produce un exobiopolímero que induce la

producción de interleucinas IL-8 por fibroblastos, lo cual es útil en la aplicación como

material de curación, también debido a sus propiedades de alta viscosidad y humectante

se puede utilizar como sustituto del ácido hialurónico en la industria farmacéutica

(Kocharin et al., 2010). Ophiocordyceps entomorrhiza, solo ha sido reportada para

Veracruz y para el Estado de México, es una especie similar a Ophiocordyceps gracilis

por lo que puede ser confundida (Guzmán et al., 2001). Pérez-Villamares et al. (en

prensa), menciona que O. gracilis parasita larvas de Lepidóptera y O. entomorrhiza solo

se ha encontrado parasitando larvas de Coleóptera, por lo que probablemente está

restringida a este orden. Ophiocordyceps gracilioides solo se ha reportado en larvas de

Coleópteros en dos estados del país (Kobayasi, 1941; Li et al., 2002; Castro et al., 2012;

Pérez-Villamares et al., en prensa), es una especie muy rara de encontrar y especialista

de Coleópteros. En México, se ha registrado ha Ophiocordyceps sphecocephala como

parasito de Polistes, en Japón, China, Korea y Nepal se ha encontrado sobre avispas del

género Aphrophora spp. (Shrestha, 2011). Ophiocordyceps stylophora, se ha descrito

sobre larvas de Coleóptero (Pérez-Villamares et al., en prensa) y sobre Hymenópteros,

en México se ha descrito el teleomorfo y la fase asexual como Hirsutella stylophora

.

61

(Pérez-Silva, 1978). Ophiocordyceps sobolifera se ha descrito sobre ninfas de cicada, y

su anamorfo se ha descrito como Beauveria sobolifera (Liu et al., 2001).

Tolypocladium parasita hongos hipógeos del género Elaphomyces y ninfas de la familia

Cicadidae. Se tiene la hipótesis de que al ser el mismo hábitat subterráneo en raíces y

cerca de árboles de Cicadas y Elaphomyces, Tolypocladium realizó un salto de

hospedero (Nikoh y Fukatsu, 2000). Tolypocladium capitatum y T. ophioglossoides son

las especies con mayor número de registros en diferentes lugares de México, siendo

ampliamente recolectado con Elaphomyces spp. en bosques de pino-encino, ya que es

el hábitat de su hospedero. En el Estado de México se ha obtenido con Elaphomyces

spp. y Psilocybe muliercula, lo que está directamente relacionado a su uso tradicional por

el grupo indígena nahua del Estado de México, donde dichas especies presentan un

nombre común y son consumidos en rituales (Guzmán, 2008). T. capitatum y T.

ophioglossoides fueron citadas por Heim y Wason (1958) por primera vez para México

y posteriormente se siguieron registrando con el nombre común de “hombrecitos”

(Guzman, 2008). T. ophioglossoides se ha reportado con amplia distribución para el

hemisferio norte: E.U.A., Rusia y Japón (Mains, 1957; Pérez-Silva, 1977), y por lo tanto

también para México. Es importante mencionar que los nahuas les atribuyen

propiedades medicinales a ambas especies (Heim y Wason, 1958). Por otra parte T.

ophioglossoides produce ophiocordin, con propiedades antibióticas y antifúngicas

(Kneifel et al., 1997) y ophiosetin con propiedades antibióticas (Putri et al., 2010). Sin

embargo, en México se desconoce el aprovechamiento tradicional y tradicional-comercial

de Cordyceps sensu stricto y del género Ophiocordyceps.

.

62

El uso de Tolypocladium ha sido escasamente reportado y el lapso de tiempo entre los

reportes deja un vacío de información que indica la importancia de investigar el

conocimiento tradicional de Cordyceps s.l. en más lugares del país, en asentamientos

nahuas y también de otros grupos indígenas, así como analizar las propiedades

bioquímicas y medicinales de las diferentes especies que forman parte de este grupo tan

complejo e interesante. A pesar de que en el continente oriental se ha estudiado

ampliamente la taxonomía, cultivo in vitro y bioquímica de ascomicetos

entomopatógenos, en México el estudio en general de Cordyceps sensu lato es escaso.

Es importante mencionar que los hongos entomopatógenos generalistas presentan una

diversidad de hospederos y pueden ser encontrados en un amplio rango geográfico como

Metarhizium, o especies especialistas, como por ejemplo Cordyceps unilateralis que

parasita adultos de Hymenoptera: Formicidae del género Camponotus rufipes, C. balzani,

C. melanoticusand, C. novogranadensis (Evans et al., 2011). En México no se ha

registrado a Cordyceps unilateralis, especie pleomórfica (Sanjuan et al., 2001). Aunque

Evans y Samson, (1984) propusieron que la asociación Camponotus-C. unilateralis es la

dominante entre hongos y hormigas en el trópico, la diversidad y abundancia de las

hormigas está determinado por la temperatura y la altitud, siendo escasas en bosques de

coníferas o bosques tropicales densos que se encuentran por arriba de los 2500msnm,

en contraste, son diversas y abundantes en los bosques subtropicales de baja altitud y

en los desiertos cálidos de todo el mundo (Brown, 1973; Fernández, 2001), aunado a que

probablemente el sistema montañoso en México tiene un papel como barrera geográfica

que no ha permitido la distribución de C. unilateralis de América del sur hacia México.

.

63

Por último consideramos sería importante iniciar un estudio de diversidad utilizando

caracteres morfológicos, moleculares y ecológicos, para determinar las relaciones

ecológicas y evolutivas de las especies. Así como también determinar los mecanismos

de infección, investigar su uso tradicional, analizar los componentes con actividad

medicinal que presentan, y determinar las condiciones óptimas de su cultivo in vitro a

nivel de cepa y estroma, ya que son tópicos parcialmente o totalmente desconocidos para

especies silvestres de México.

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CAPITULO II. Nuevos registros de Cordyceps en el Centro de México con posible potencial medicinal

RESUMEN

Cordyceps sensu stricto es un grupo de hongos entomopatógenos que pertenecen a la Familia Cordycipitaceae. En México, son escasos los estudios enfocados a este grupo y solo se tiene el registro de cinco teleomorfos y cuatro estados asexuales. En esta investigación se registran por primera vez para México dos especies de Cordyceps, de acuerdo a análisis genéticos, Cordyceps sp. 1. y Cordyceps sp. 6. El análisis genético para Cordyceps sp. 1 presentó afinidad en la región LSU del 99.1% a Cordyceps submilitaris y Cordyceps ningxiaensis y en la región ITS 96.3% de afinidad con Cordyceps submilitaris. Cordyceps sp. 6 presentó afinidad en la región LSU del 99.1% a Cordyceps submilitaris y Cordyceps ningxiaensis, y con ITS un 98.8% de afinidad con Cordyceps submilitaris. Estas son las primeras secuencias obtenidas de ITS y LSU de dos teleomorfos de Cordyceps para México. Además se obtuvo el estado anamorfo por aislamiento vegetativo, las cepas aisladas producen conidiosporas y presentan características similares a Cordyceps militaris, lo que indica su potencial para cultivo in vitro. A pesar de ello, se desconoce su potencial medicinal y de control biológico en insectos plaga. Se presenta información de las primeras cepas obtenidas de teleomorfos de Cordyceps en México.

ABSTRACT

Cordyceps sensu stricto (Cordyceps s.s.) is a complex group of ascomicetes fungi parasites of arthropods. In Mexico are little the studies these group and only there are the report of five teleomorphs and four asexual states of Cordyceps sensu stricto. In this research, are registered for first time for Mexico, two species of entomopathogenic fungus, Cordyceps sp. 1 and Cordceps sp. 6. In genetic analyzes, Cordyceps sp. 1 showed affinity in the LSU región of 99.1% to Cordyceps submilitaris and Cordyceps ningxiaensis, and in the ITS region showed 96.3% affinity to Cordyceps submilitaris. Cordyceps sp. 6 showed affinity in the LSU region of 99.1% to Cordyceps submilitaris and Cordyceps ningxiaensis and with ITS region a 98.8% affinity to Cordyceps submilitaris. These are the first sequences obtained from ITS and LSU of two teleomorphs of Cordyceps in Mexico. In addition, the anamorph state was obtained by vegetative isolation. The strains obtained produced spores and presented characteristics similar to Cordyceps militaris, which indicates potential for its in vitro culture. However its medicinal potential and biological control of insects pests is unknown. It is also important to mention that these are the first strains obtained from Cordyceps teleomorphs in Mexico.

Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno

Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.

78

PALABRAS CLAVE

hongos entomopatógenos, Hypocreales, Cordyceps militaris, Cordyceps submilitaris, aislamiento vegetativo

KEY WORDS

Entomopathogenic fungi, Hypocreales, Cordyceps militaris, Cordyceps submilitaris,

vegetative isolation

INTRODUCCIÓN

Cordyceps sensu lato es un grupo de ascomicetos entomopatógenos que parasita a artrópodos en sus diferentes estadíos del ciclo de vida y también parásita otros hongos del género Elaphomyces (Mains, 1958; Sung et al., 2007a; 2007b). Este grupo parafilético presenta teleomorfos con importancia comestible y medicinal como Ophiocordyceps sinensis y Cordyceps militaris, y estados asexuales con importancia biológica, ya que se utilizan como controladores biológicos. Por ejemplo, Metarhizium se usa en Brasil para controlar Aeneolamia spp. que afecta el cultivo de alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en África se utiliza para controlar los mosquitos del género Anopheles, vectores de malaria (Scholte et al., 2005), así como también para el control de diferentes especies de la familia Acrididae (FAO, 2009).

A nivel mundial se han reportado cerca de 450 especies de hongos entomopatógenos (Kirk et al., 2001), sin embargo se estima que existen 750 especies (Sung, 1996).

La clasificación taxonómica de Cordyceps s.l. se ha modificado a través del tiempo, ya que en un principio se utilizaban caracteres morfológicos (Masse, 1895; Mains, 1957, 1958; Kobayasi, 1941, 1982). Sin embargo debido a su complejo polimorfismo intra-específico, actualmente se utilizan caracteres moleculares mediante los marcadores moleculares, ITS, LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF1 (Sanjuan et al., 2015). Ademas, se utilizan caracteres morfológicos diagnósticos, como el color y la textura del estroma, así como el nicho ecológico, en este caso el hospedero (Sung et al., 2007a, 2007b; Sanjuan, 2015).

Actualmente la clasificación taxonómica es la siguiente (Sung et al., 2007a; 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt et al., 2014): Familia Clavicipitaceae: incluye el género Metarhizium (anteriormente Metacordyceps), Familia Cordycipitaceae: incluye a Cordyceps sensu stricto y la Familia Ophiocordycipitaceae: incluye a Ophiocordyceps y Tolypocladium (anteriormente Elaphocordyceps).



79

En México, la identificación de entomopatógenos pertenecientes a Cordyceps sensu lato y Cordyceps sensu stricto se ha realizado mediante el uso de caracteres morfológicos. Hasta el momento se han descrito 25 especies que incluyen teleomorfos y estados asexuales para México (ver capítulo 1).

En el presente estudio se realizó la identificación molecular de dos especies de Cordyceps presentes en el centro de México, se identificó el estado teleomorfo y se obtuvo el estado anamorfo mediante aislamiento vegetativo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material recolectado

Los ejemplares fueron colectados en el “Desierto del Carmen”, Tenancingo, localizado en la región sureste del Estado de México, ubicado a 18°49´ y 19°03´ latitud norte y 99°30´y 99°39´ de longitud oeste, a una altitud de 2200 a 2700 msnm (INEGI, 2009). Se realizó un muestreo dirigido, ya que es la zona donde Pérez-Villamares (2015) reportó la mayor diversidad de Cordyceps sensu lato para el sur del Estado de México. El muestreo se realizó de agosto a octubre de 2015, dando un total de siete ejemplares, los cuales fueron colectados cuidadosamente, se limpió la tierra de los hospederos con un cepillo de cerdas delgadas y se colocó el estroma con el hospedero en bolsas de plástico ziplocMR, solo se colectaron los ejemplares en los cuales el estroma emergía del hospedero. Estos se llevaron al laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos para su identificación, donde fueron secados con sílica gel. Los ejemplares serán depositados en el herbario del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México, cuando se culmine la identificación con un análisis filogenético y el artículo este por enviarse. La colecta de los ejemplares se realizó de acuerdo a Sanjuan (2015). Las descripciones del color de los estromas se llevó a cabo mediante la clave de color HTML color codes (http://html-color-codes.info).Los estromas fueron caracterizados microscópicamente de acuerdo a claves especializadas Mains (1958) y Kobayasi (1941, 1982) y con apoyo de artículos especializados, tal como: Carilli y Pacioni (1977), Pérez-Silva, (1977), Rubio-Bustos et al. (2000), Guzmán et al. (2001), Shrestha et al. (2005), Tian et al. (2010), Wen-Jing et al. (2012), Zi-Hong et al. (2013), Sanjuan et al. (2014); con fotografías tomadas en un Microscopio óptico modelo Motic Digital Microscope DMB3-223, NTSC Systemy.La identificación del hospedero se realizó a nivel de Orden.

Extracción de DNA, amplificación con PCR, electroforesis y secuenciación

La extracción de DNA se realizó con el kit SIGMA-ALDRICH-REDExtract-N-AmpTM

Plant, con algunas modificaciones. Se tomó de 1-2 mm de tejido seco del contexto de los ejemplares. Para las cepas se tomó un trozo del micelio más externo y cada muestra se colocó en un tubo de 2 ml. Se añadieron 100 µl de solución de extracción, se tapó el tubo y se colocó en el vortex por 5-10 segundos. Posteriormente se incubaron a 95°C por 10 min, después se añadieron 100 µl de



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dilución, se mezcló y se dejó por 30 min a temperatura ambiente; por último, las muestras se guardaron a 2°C.

Se amplificaron dos locus: La región transcrita interna (ITS) y la subunidad larga del ribosoma (LSU). La reacción de PCR se realizó con una mastermix de 20 µl: se añadieron 10 µl de RuviTaq, 0.2 µl de cada primer: ITS1f/ITS4 (10mM) (White et al., 1990), LROR/LR5 (10mM) (Vilgalys y Sun, 1994), 2 µl del extracto de DNA en concentración 1:1 para ITS y 1:10 para LSU. Se añadió ddH2O hasta completar los 20 µl. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en el termociclador BIO RAD DNA Engine®. Los ciclos de PCR fueron los siguientes: para la amplificación de ITS, 35 ciclos: 94°C por 2 min y 94°C por 1 min para la desnaturalización de DNA, 51°C por 1 min para la alineación, y 72°C por 1 min y 72°C por 8 min para la extensión, y 4°C por 15 min para detener la reacción. Para la amplificación de LSU, 35 ciclos: 94°C por 3 min y 94°C por 1 min, para la desnaturalización de DNA, 54°C por 1 min para la alineación, y 72°C por 2 min y 72°C por 7 min para la extensión, por último se detuvo la reacción a 4°C por 15 min.

El gel para electroforesis se preparó con 50 ml de buffer TBE, 1 gr de agarosa (Molecular Biology Grade) Vivantis, y 1 µl de REDGEL (0.1x) Biotium ©. Se mezcló el buffer TBE con la agarosa por 30 seg, se disolvió hasta que no se observaron grumos, se dejó enfriar por 10 min y se añadió el REDGEL, este se disolvió en el matraz por 3 minutos, posteriormente se vacio el gel en una placa de vidrio, y se dejó enfriar. Este se corrió en una cámara de electroforesis a 90 vol por 50 min. Posteriormente el gel se reveló en una cámara de UV Kodak-Eastman ©.

La purificación se realizó con EXOSAP. Se preparó una master mix a 1x con EXOSAP y ddH2O. En un tubo de PCR (2 ml) se colocaron 2 µl de la master mix y se añadieron 3.5 µl de producto de PCR, se tapó el tubo y se colocó en el termociclador Programable Thermal Controler, MS Research, Inc. a 37°C por 45 min, 80°C por 15 min y 4°C por 10min.

Las muestras se mandaron a secuenciar con el método de Sanger, al Laboratorio de Secuenciación del Instituto de Biología de la Universidad Autónoma Nacional de México.

Edición de secuencias, análisis de BLAST y análisis filogenético

Las secuencias obtenidas en este estudio fueron editadas en el programa Geneious R.1.5 (Drummond et al., 2009). Se realizó un análisis de BLAST dentro de Geneious R. 1.5 utilizando la plataforma de GenBank para confirmar que las secuencias pertenecían a la Familia Cordycipitaceae, para determinar la especie a la que pertenecían los ejemplares. Las secuencias obtenidas serán subidas a la plataforma de GenBank cuando se hallá finalizada la identificación y este por enviarse este capitulo como artículo.

El análisis filogenético se realizará utilizando las secuencias obtenidas en este estudio y las obtenidas por Sanjuan et al. (2015) que se encuentran en Gen Bank.



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El análisis se realizará utilizando los marcadores moleculares ITS, LSU, RPB1, RPB2 y TEF. Para el grupo externo se utilizarán especies representativas de Metarhizium y Pochonia. El alineamiento de SSU y LSU se realizara en MUSCLE (Edgar, 2004), el alineamiento para los genes que codifican proteínas RPB1, RPB2 y TEF se realizaran con MAFT (Katoh y Toh, 2010). Finalmente cada alineamiento será refinado manualmente en BioEdit versión 6.0.7 (Hall, 1999). Este análisis no ha sido concluido ya que se realizará con la base de datos de Sanjuan (2015), con secuencias que provengan de especimenes voucher y por lo tanto no halla error en el análisis y la interpretación del resultado.

Aislamiento de cepas

Los estromas colectados se llevaron al Laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos de la UAEM. Se realizó el aislamiento vegetativo. Para esto, los estromas se lavaron con agua destilada y con un bisturí estéril se les cortó un pedazo de estroma de aproximadamente 2-3 mm, este se aisló directamente en placas de Petri en medio estéril Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubó por 30 días a 25°C de acuerdo al método modificado de Kumar y Sagar (2006). Al término de este período se caracterizó la cepa macroscópicamente de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995) y microscópicamente de acuerdo a Mains (1958). Estas cepas fueron secuenciadas, tal como se menciona en la parte de extracción de ADN.

RESULTADOS

Se recolectaron siete ejemplares, los cuales corresponden a dos especies de Cordyceps.

Caracterización macróscopica y microscópica:

Cordyceps sp.1 presenta de uno a dos estromas color amarillo (#FFFF00), forma clavada, estípite amarillo claro (#F3F781) alargado en posición vertical de 1.9-1.0 cm de largo, contexto compacto de color amarillo (#FFFF00), emergiendo de Lepidóptero, el micelio no se observa en la parte externa del hospedero, solo en la parte interna, peritecios inmersos en el estroma con forma de matraz de 473.6 µm de largo con un rango de 238.0-612.3 µm y 200.5 µm de ancho con un rango de 95.0-306.9 µm, ascosporas con forma irregular de látigo de 23.5 µm de largo con un rango de 13.0-37.2 µm y 5.08 µm de ancho con un rango de 2.8-9.4 µm, hifas de 3.8 µm de ancho y un rango de 1.5-3.8 µm (figura 6).



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Figura 6. Morfología de Cordyceps sp. 1. a. estroma emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. parte externa del estroma, d. peritecios en forma de matraz, 10X., e. crecimiento hifal apical del peritecio, 40X., f. liberación de segmentos de ascas y ascosporas, 100X., g. segmentos de ascas y ascosporas, 100X. Tinción Rojo Congo.

Cordyceps sp 6., presenta de uno a cuatro estromas, color amarillo (#FFFF00), de forma clavada, estípite amarillo claro (#F3F781) alargado en posición vertical de 0.7-1.9 cm de largo, emergiendo de pupa de Lepidóptero. Contexto cavernoso de color amarillo claro (#F3F781), peritecios inmersos en el estroma con forma subovoide de 331.7µm de largo con un rango de 216.8-627.1µm y 148.5µm de ancho con un rango de 112.0-257.1µm, ascas cilíndricas, filiformes con tapa apical bifurcada conteniendo las ascosporas con forma rectangular multiseptadas de 12.2



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µm de largo con un rango de 5.6-18.8 µm y 5.1 µm de ancho con un rango de 1.5-7.9 µm, hifas acomodadas longitudinalmente en el peritecio con 3.2 µm de ancho y un rango de 1.5-4.4 µm (figura 7).

Figura 7. Morfología de Cordyceps sp. 6. a. estromas emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, 4X., c. peritecios, 10X., d. peritecio con liberación de ascas, 40X., e. ascas con ascosporas, 100X. Tinción de Rojp Congo.

Caracterización de cepas

Se obtuvieron dos cepas en medio PDA, una de Cordyceps sp. 1. y otra de Cordyceps sp.6. La cepa C-1 presentó dos morfotipos, forma regular e irregular, convexa, borde fimbrado, algodonosa, color blanca en la superficie (#FFFFFF) y amarilla en la parte basal (#F3F781, #FFFF00). La cepa C-6 presentó forma circular, convexa, borde fimbrado, crecimiento micelial algodonoso y color blanca-crema (#F5F6CE) en la parte superficial y en la parte basal amarilla (#F3F781, #FFFF00) (Figura 8). Las dos cepas mostraron reproducción asexual, ya que produjeron conidios (Figura 9).



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Figura 8: a. Cepa de Cordyceps C-1, b. Cepa de Cordyceps C-6, en medio Agar Papa Dextrosa (PDA).

Figura 9. Caracterización microscópica de las cepas. a. hifas a 100x con tinción rojo congo de la cepa C-1, b. hifas y esporas a 100x con tinción rojo congo de la cepa C-6. Ambas en medio Agar Papa Dextrosa (PDA) en ausencia de luz.

Análisis genético de cepas y estromas

En total se obtuvieron 14 secuencias de ITS y LSU de dos especímenes y sus correspondientes cepas, se corroboró la identidad de las cepas al secuenciarlas, donde se encontró una similitud nucleotídica del 100% entre las secuencias de los esporomas y las cepas, se obtuvó el estado asexual de Cordyceps sp.6 como Isaria farinosa, y el estado asexual de Cordyceps sp.1. como Isaria cateniannulata, en la tabla 8 se muestra el porcentaje de identidad obtenido con el análisis de BLAST.

5 µm 5 µm

a

b



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Tabla 8. Porcentaje de identidad con análisis BLAST de las cepas y los estromas con los marcadores, ITS y LSU.

Especimen/Cepa Marcador molecular ITS Marcador molecular LSU

Cordyceps sp. 1 96% -Cordyceps submilitaris

95.3%-Isaria catennianulata

no amplifico

Cepa C-1 95.9%-Cordyceps submilitaris

95%- Isaria catennianulata

99.1%-Cordyceps submilitaris

99.1%-Cordyceps ningxiaensis

Cordyceps sp. 6 98.8%-Cordyceps submilitaris LSU- no amplifico

Cepa C-6 95.7%-Cordyceps submilitaris

94.5%-Isaria farinosa

99.1% Cordyceps submilitaris

99.1%-Cordyceps ningxiaensis

98.9%-Isaria farinosa

DISCUSIÓN

La caracterización e identificación de los ejemplares se realizó con caracteres morfológicos de acuerdo a la clave taxonómica de Mains (1958), Se confirma el género Cordyceps, debido a que las dos especies presentan un estroma y contexto color amarillo. Sin embargo hasta el momento no se ha descrito ninguna especie con características morfológicas similares a las reportadas en la presente investigación. Por otra parte Kepler et al. (2014), Quandt et al. (2014) y Sanjuan et al. (2015) mencionan que la identificación de hongos entomopatógenos utilizando solo caracteres morfológicos no es suficiente, se requiere la utilización de marcadores moleculares codificantes y no codificantes, siendo ITS, LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF los diagnósticos. Por lo tanto se integro el análisis genético.

La identificación de Cordyceps sp. 1 con el análisis de BLAST utilizando el marcador LSU corresponde a los teleomorfos Cordyceps submilitaris y a C. ningxiaensis con un 99.1% de identidad, y con ITS presenta una identidad de 96.3% con C. submilitaris, sin embargo las características morfológicas son contrastantes con estas dos especies, ya que C. submilitaris se ha registrado parasitando larvas de coleóptero y una característica exclusiva de esta especie es el color naranja del estroma con rizomorfos color rojo (Moller 1901; Petch 1933), los cuáles no se observan en las dos especies tratadas en este estudio y el hospedero que se encuentran parasitando es lepidóptero. C. ningxiaensis se ha descrito en pupas de Díptera (Cyclorrhapha), la cual presenta la parte fértil color naranja y las partes de esporas son filiformes, multiseptadas en partes de esporas de 3.6-7.8 x 1-1.4 µm, contrastando con Cordyceps sp.1 que presenta la parte fértil color amarilla y las partes de esporas son de forma irregular con un tamaño de 13-37.2 x 2.8-9.4 µm.



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Cordyceps sp. 6 a pesar de que presenta el 99.1% de afinidad con C. submilitaris y con C. ningxiaensis, sus características morfológicas también son contrastantes, ya que presenta las partes de esporas filiformes multiseptadas (Jun-Qing y Tolgor 2015), tal como C. ningxiaensis el tamaño de estas es mayor, 1.5-7.9 µm de ancho.

Por lo tanto Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6 corresponden probablemente a dos nuevas especies, a pesar de que las dos especies presentaron un 99.1% de identidad con el marcador LSU con C. submilitaris y C. ningxiaensis, los caracteres morfológicos y el hospedero no corresponden a estas especies, ambas se encuentran parasitando larvas de Lepidóptera y las características de la forma de las esporas es totalmente contrastante entre ambos ejemplares Cordyceps sp. 1 presenta esporas con forma irregular y de látigo, así como un contexto compacto y Cordyceps sp.6 presenta esporas simétricas con forma regular y contexto cavernoso, lo cual indica que se trata de dos especies diferentes, por lo que se considera crucial secuenciar y analizar los marcadores codificantes, así como realizar la filogenia para poder determinar las dos especies.

Para México se han reportado cinco especies de teleomorfos de Cordyceps sensu stricto (Cordyceps s.s.). Cordyceps scarabaeicola, C. takaomontana, Cordyceps militaris, Cordyceps polyarthra y C. pruinosa (ver capítulo 1). Por lo tanto el número de especies de teleomorfos de Cordyceps s.s aumentaría a seis si se considera que las especies aquí presentadas pertenecieran ha Cordyceps submilitaris

Sin embargo ésta cifra contrasta con la mencionada para Norteamérica debido a la enorme riqueza topográfica y biológica con que cuenta el país (Pérez-Silva 1977), cabe mencionar que la zona muestreada en el presente estudio corresponde a sólo una parte de un municipio del Estado de México (529ha) (INEGI 2009), en la cual se encontraron posiblemente dos nuevas especies para el país, lo cual indica que México presenta un carente número de estudios dirigidos a hongos entomopatógenos.

Las cepas de las dos especies se obtuvieron de teleomorfos. Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6, estas presentan reproducción asexual ya que producen conidios con conidiosporas. Con el análisis de BLAST presentan afinidad con Isaria, el anamorfo de Cordyceps. Las cepas presentan características macroscópicas compartidas con las cepas de Cordyceps militaris (Kumar y Sagar 2006; Sherestha et al. 2006), como textura algodonosa, borde fimbrado, crecimiento aéreo y convexo, así como coloración blanca-amarilla. Es importante mencionar que no se han obtenido cepas de Cordyceps ningxiaensis y tampoco de Cordyceps submilitaris, por lo que se desconoce su potencial biotecnológico en la producción de metabolitos secundarios, así como también en la utilización como controladores biológicos de insectos plaga.

Diferentes especies de hongos entomopatógenos presentan importancia medicinal biotecnológica, tal como: Ophiocordyceps sinensis, C. militaris, C. cyushuensis, C. cicadae, C. pruinosa, C. cardinalis y C. bassiana debido a que se les ha extraído un metabolito secundario llamado cordicepina (Sung et al. 2010; Ling et al. 2002;



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Wang et al. 2001) que presenta propiedades anticancerígenas ya que inhibe la replicación de ADN en células cancerígenas (Chun-kit y Wing-hung 2012), por lo tanto las cepas obtenidas de Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6 podrían presentar este potencial medicinal; sin embargo, para confirmarlo es necesario llevar a cabo estudios biotecnológicos.

CONCLUSIONES

Se registran dos especies de teleomorfos del grupo Cordyceps sensu stricto en México, posiblemente nuevas especies, las cuales no se han determinado a nivel de especie, pero presentan afinidad molecular con Cordyceps submilitaris y C. ningxiaensis. Por otra parte se obtuvieron las cepas de ambas especies por aislamiento vegetativo, lo que indic su potencial para cultivo.

Es indispensable emprender investigaciones dirigidas a la taxonomía, biología y ecología de este grupo poco conocido para México, para conocer la función de las especies en las poblaciones y comunidades, y detectar especies con importancia medicinal y como controladores biológicos.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el financiamiento de la secuenciación de DNA a la Red MEXBOL CONACYT proyecto 280896.

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CAPITULO III. Cultivo in vitro y producción de cordicepina en Cordyceps aff. submilitaris, hongo silvestre del centro de México

RESUMEN

Actualmente se ha investigado la producción de metabolitos secundarios de

diferentes especies de Cordyceps, ya que presentan potencial medicinal.

Cordyceps militaris es una especie comercializada y cultivada in vitro ya que

presenta alto valor farmacéutico, sin embargo se sugiere la utilización de otras

especies con el mismo potencial y por lo tanto medicinal. En esta investigación se

determinaron las condiciones óptimas del cultivo in vitro a nivel de cepa en medio

sólido y sumergido, para la mayor producción de biomasa, cordicepina y velocidad

de crecimiento en Cordyceps aff. submilitaris, así como también se caracterizó la

morfología de las cepas y del micelio en medio líquido. Las cepas presentaron

pigmentaciones amarillentas en condiciones lumínicas y blanquecinas en

condiciones de oscuridad en todos los medios de cultivo (PDA, EMA, PDA+Y, SB)

a excepción del medio AA, donde en ambas condiciones se observó una coloración

blanquecina. En todos los tratamientos se observó una textura algodonosa y la

densidad del micelio fue diferente de acuerdo a los medios de cultivo, siendo mas

denso en los medios PDA+Y. La mayor producción de biomasa seca (0.28gr/caja

petri) se produjo en la cepa C1, en el medio SB. La máxima velocidad de crecimiento

(0.22cm/día) se observó en la cepa C1 en PDA+Y, sin ser significativas las

condiciones lumínicas. La menor velocidad de crecimiento se observó en la cepa

C6 en PDA en oscuridad (0.11cm/día). En el cultivo líquido, la producción de

biomasa fue diferente de acuerdo al medio de cultivo, no a la cepa ni las condiciones

lumínicas, siendo el medio EM en el que se obtuvó la mayor biomasa (9.5gr/L). La

máxima producción extracelular de cordicepina (12.37 gr/L) se observó en la cepa

C6, en el medio de cultivo PD+Y. Por lo tanto la producción de cordicepina no está

directamente relacionado con la máxima producción de biomasa y velocidad de

crecimiento, si no que esta relacionada con el medio de cultivo y a cepa, siendo el

medio adicionado con nitrógeno orgánico en el que se obtuvo la mayor cantidad.



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Estos resultados indican el potencial farmacéutico y biotecnológico que presenta

C. aff.submilitaris.

ABSTRACT

Currently, the production of secondary metabolites of different Cordyceps species

has been investigated, because they present medicinal potential. Cordyceps militaris

is a species marketed and cultivated in vitro because present high pharmaceutical

value, however it is suggested the use of other species with the same

pharmaceutical and medicinal potential. In this research, the optimal conditions of in

vitro cultivation at strain in solid and submerged medium were determined, with the

objetive the have high production of biomass, cordycepin and growth rate in

Cordyceps aff. Submilitaris. As well as strains and liquid culture media were

characterized. The strains showed yellow pigmentation in light conditions, and

whitish in dark conditions in all culture media (PDA, EMA, PDA + Y, SB) except for

the AA medium, where in both conditions a whitish coloration was observed. In all

the treatments a cottony texture was observed and the density of the mycelium was

different according to the culture media, being more dense in the PDA + Y media.

The highest production of dry biomass (0.28gr/caja) occurred in strain C1, in the

medio SB. The maximum growth rate (0.22cm/día) was observed in strain C1 in PDA

+ Y, without being significant light conditions. The slowest growth rate (0.11cm/día)

was observed in strain C6 in PDA. In the liquid culture, the production of biomass

was different according to the culture medium, not to the strain or the light conditions,

being the EM medium in which the highest biomass (9.5gr/L) was obtained. The

maximum extracellular production of cordycepin (12.37 gr / L) was observed in the

C6 strain, in the PD + Y culture medium. Therefore, the production of cordycepin is

not directly related to the maximum biomass production and growth rate, it is directly

related to the culture medium and to the strain, the medium being added with organic

nitrogen in which the greatest quantity was obtained. These results indicate the

pharmaceutical and biotechnological potential of C. aff. submilitaris.

PALABRAS CLAVE

Metabolitos secundarios, Cromatografia Líquida de Alta Resolución, Cordyceps

militaris, Cordyceps sensu stricto



93

KEY WORDS

Secondary metabolites, High-performance liquid chromatography, Cordyceps

militaris, Cordyceps sensu stricto

INTRODUCCIÓN

El interés por especies de Cordyceps sensu lato se debe en primer instancia, a que

varias de ellas producen biomoléculas con efecto benéfico en la salud del humano,

por ejemplo la cordicepina, que es empleada como anticancerígena debido a que

inhibe las enzimas pirofosfocinasas y amidotransferasas que participan en la

biosíntesis de novo de purinas (Rottman et al., 1964). En segundo lugar son

controladores naturales de poblaciones de artrópodos (Sanjuan et al., 2002) y por

lo tanto son utilizados para su control biológico en cultivos con importancia comercial

(Carr et al., 2003), así como para el control de vectores que transmiten

enfermedades a humano, por ejemplo Metarhizium ha sido utilizado en África para

controlar a mosquitos del género Anopheles que transmiten malaria (Alves et al.,

2008).

El cultivo in vitro de diferentes especies de Cordyceps sensu lato como, C. militaris,

Ophiocordyceps sinensis, Isaria tenuipes, C. cardinalis, C. sphecocephala C. nidus

entre otros, se ha estudiado a nivel de cepa en medio superficial y líquido, hasta

nivel de estroma (Ling et al., 2002; Nam et al., 2006; Sung et al., 2006; Sung et al.,

2010; Dong et al., 2012; Chivirí et al., 2017). Su cultivo permite obtener biomasa,

estromas y/o metabolitos en menor tiempo y a menor costo, ya que estos son

hongos muy escasos en su hábitat natural, su tamaño es muy pequeño y el costo

económico es muy elevado, por ejemplo el costo de 1kg de Cordyceps colectados

en la India va de 318 a 633 dólares (Sharma, 2004), aunado a que en la actualidad

existe una problemática con respecto a la abundancia de especies de

Ophiocordyceps sinensis en el Tibet, debido a la sobreexplotación que realizan los

pobladores cada año (Shrestha et al., 2011).

El cultivo de Cordyceps militaris, la especie más ampliamente estudiada, atrajo la

atención de Bary (1867) desde hace 150 años. El estudio del cultivo superficial de

Cordyceps se ha optimizado implementando medios de cultivo con diferentes

fuentes de nitrógeno, carbono, minerales; cambiando variables físicas como el pH

y temperatura, estas modificaciones se han realizado para incrementar la

producción de biomasa y la velocidad de crecimiento de los aislados o las cepas

(Kumar y Sagar, 2006; Masuda et al., 2007; Shrestha et al., 2010; Chivirí et al.,

2017). El medio sólido en contraste con el medio líquido, permite caracterizar



94

macroscópicamente los aislados y observar patrones de crecimiento, textura, forma

y pigmentación de acuerdo a condiciones con presencia y ausencia de luz (Shrestha

et al., 2006), las cuales son características propias de géneros o especies.

Por otra parte, el cultivo sumergido se ha estudiado con el objetivo de optimizar la

producción de biomasa y metabolitos secundarios como la cordicepina, manitol y

exopolisacáridos (Shih et al., 2006: Masuda et al., 2007; Hung et al., 2009; Kwon et

al., 2009). Los factores que más influyen para la óptima producción de metabolitos

y biomasa son los medios de cultivo adicionados con fuentes orgánicas de nitrógeno

y carbono (Shih et al., 2006) y la luz ultravioleta ha sido utilizada en el crecimiento

de estromas para optimizar la producción de cordicepina y polisacáridos (Dong et

al., 2012).

Para México, el estudio del cultivo in vitro superficial y sumergido de hongos

entomopatógenos es escaso, la obtención de aislados se ha realizado de estados

anamorfos como Beauveria (Hernández-Velázquez et al., 2011), sin embargo no se

ha estudiado el cultivo de teleomorfos, por lo que el principal objetivo de esta

investigación es caracterizar macroscópica y microscópicamente dos cepas de

Cordyceps silvestres de México, realizar su cultivo in vitro en medio sólido y

determinar los parámetros nutricionales que optimizan la producción de biomasa y

la velocidad de crecimiento en cultivo sólido, así como determinar los parámetros

nutricionales que optimizan la producción de biomasa y cordicepina en medio de

cultivo líquido bajo condiciones de luz y oscuridad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo sólido y caracterización de cepas

Se caracterizó el fenotipo de las cepas 1 y 6, utilizando como variables, la forma,

margen, crecimiento, textura, superficie, coloración y densidad del micelio, en cinco

medios de cultivo, clasificados de acuerdo a su contenido nutrimental. Agar agua

(AA), agar papa dextrosa (PDA), agar extracto de malta (EMA), agar papa dextrosa

adicionado con levadura (PDA+Y) y sabourad (SB). La inoculación de los medios

sólidos se realizó tomando una muestra de 0.5cm de diámetro de las cepas en

medio PDA, se reaisló en placas de cultivo previamente esterilizadas y preparadas

con los diferentes medios de cultivo, se incubaron a 25°C en ausencia y presencia

parcial de luz (12 hrs luz/12 hrs oscuridad). Diariamente se midió el diámetro de las

cepas y se calculó la velocidad de crecimiento de acuerdo al método modificado de

Huerta et al. (2009), con la siguiente formula: Velocidad de crecimiento=(Df-Di)/(Df-

Di), donde, Df es el diámetro final, Di es el diámetro inicial y Tf-Ti son los días de

crecimiento micelial. Posteriormente se caracterizaron las cepas



95

macroscópicamente de acuerdo a Mains (1958), y microscópicamente de acuerdo

a Cruz-Ulloa (1995), también se determinó la densidad del micelio de acuerdo a

Kornerup y Wanscher (1978) y Shrestha et al. (2006), donde (-) indica

extremadamente pobre, (+) pobre, (++) moderado y (+++) abundante. La

descripción de la coloración de las cepas se realizó mediante la clave de colores

(http://html-color-codes.info, 2016). Después se midió la producción de biomasa, se

hizó un triple lavado de las cepas con agua destilada calentada a 90-100°C,

posteriormente se filtró el micelio en papel filtro del número 4, este se dejó secar a

60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al. (2010). Se aplicó un análisis estadístico

multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%, posteriormente una

prueba de Tukey y por último una correlación simple entre la velocidad de

crecimiento y la biomasa con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI.

Extracción y cuantificación de cordicepina en cultivo líquido

Para la extracción de cordicepina, se siguió el método de Shih et al. (2006), se

centrifugó el cultivo a 6000g/10min, posteriormente se filtró el sobrenadante en

papel filtro Whatman 4. Se midió el pH, se lavó el micelio con agua destilada y se

secó a 60°C por 48hrs, para obtener biomasa seca. Después el medio de cultivo

filtrado se mezcló con metanol al 15% (1:1), se centrifugó a 6000g/15min y se filtró

el sobrenadante en Syringe Filter estéril de 0.45µm/13mm de diámetro. El filtrado

obtenido se analizó en sistema HPLC para la cuantificación de la cordicepina. La

curva de calibración de cordicepina (Sigma Aldrich) se realizó utilizando diferentes

concentraciones desde 1-10ppm. El sistema de HPLC estuvo conformado por un

Automuestreador Waters 717 plus, bombas binarias Waters 1525, detector de

absorbancia dual Waters 2487, columna C18 Kromasil® (250mmx4.6mm; 5µm

tamaño de partícula), la fase móvil estuvo compuesta por una mezcla de metanol y

KH2PO4 (0.02M) en concentración (15:85), la tasa de flujo fue de 20µl/min, se utilizó

un detector de UV a 254nm, con temperatura de 25°C, con un tiempo de corrida de

40min. Posteriormente los resultados fueron analizados en el programa Breeze.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Caracterización fenotípica de las cepas

Las cepas de Cordycpes aff. submilitaris en condiciones de luz y oscuridad en los

diferentes medios de cultivo (EMA, PDA y PDA+Y) mostraron un crecimiento regular

e irregular, con un margen la mayoría de las veces fimbrado, con crecimiento aéreo,

algodonoso y convexo, y solo en AA se observó un crecimiento postrado,

algodonoso y plano (Tabla 9). El medio sólido ayudó ha conocer y observar las

características de crecimiento de estas cepas. Shrestha et al. (2006) menciona que




96

recomienda el medio sólido para caracterizar cepas de Cordyceps ya que estas no

son acuáticas en su hábitat natural y por lo tanto el medio líquido no permite

observar las características fenotípicas de las cepas. Las características

observadas son similares a cepas de Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2006;

Kumar y Sagar, 2006), Cordyceps cicadae (Wang et al., 2012), en contraste con

cepas de crecimiento irregular, convexo y margen lobulado de Cordyceps

sphecocephala (Nam et al., 2006).

La densidad del micelio en ambas cepas en condiciones de luz fueron menor en el

medio AA, poco en PDA y EMA, y moderado en PDA+Y y SB. En condiciones de

oscuridad, menor en AA, moderado en PDA y EMA, y abundante en PDA+Y y SB

(Tabla 9). Estos resultados concuerdan con lo reportado por Shrestha et al. (2006)

para C. militaris y Sung et al. (2010) para C. cardinalis, ellos mencionan que el

contenido nutricional de los medios de cultivo influye directamente en la densidad

del micelio. Para Shrestha et al. (2006), la luz es un factor inhibitorio de la densidad

micelial en Cordyceps militaris. En esta investigación también se observa una mayor

densidad del micelio en medios ricos en nitrogeno en condiciones de oscuridad a

comparación de los medios en presencia de luz.

Las dos cepas crecieron en todos los medios de cultivo, incluyendo AA, tal como se

ha reportado para Cordyceps militaris, ya que este es considerado un hongo

fagotrófico facultativo en hábito nutritivo, por lo tanto es común encontrar especies

de entomopatógenos en suelo, sin parasitar por un lapso largo de tiempo (Kamata,

2000: Shrestha et al., 2006), como es el caso de Metharizhium y Beauveria.

Tabla 9. Caracterización fenotípica de las cepas Cordyceps sp.1. y Cordyceps sp.6

en los diferentes tratamientos.

C MC Luz Características macroscópicas

Forma Margen Crecimiento Textura Superficie DM

C-1 AA L Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -

C-1 EMA L irregular-

circular

Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa +

C-1 PDA L Irregular-

circular

Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa +

C-1 PDA+Y L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa ++



97

C-1 SB L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-1 AA O Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -

C-1 EMA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-1 PDA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-1 PDA+Y O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +++

C-1 SB O circular-

irregular

fimbrado-

lobulado

Aéreo Algodonosa convexa +++

C-6 AA L Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -

C-6 EMA L circular-

irregular

Fimbrado postrado-aéreo Algodonosa convexa +

C-6 PDA L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +

C-6 PDA+Y L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-6 SB L Circular-

irregular

Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-6 AA O Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -

C-6 EMA O circular-

irregular

lobulado-

fimbrado

Aéreo Algodonosa convexa ++

C-6 PDA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-6 PDA+Y O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++

C-6 SB O circular-

irregular

Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +++

C-JC1: cepa de Cordyceps sp.jc; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; C: cepa; MC: Medio de cultivo; AA: Agar agua;

PDA: Agar papa dextrosa; EMA: Agar extracto de malta; PDA-Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura;

L: luz; O: oscuridad; DM: densidad del micelio; -: extremadamente poco denso; +: poco denso; ++:

moderadamente denso; +++: abundante.

Con respecto a la coloración de las cepas, esta fue diferente de acuerdo a la

presencia y ausencia de luz, a excepción del medio AA, en la que en ambas

condiciones el micelio se observó blanquecino. En los medios PDA, EMA, PDA+Y



98

y SB, se visualizaron pigmentaciones amarillentas en condiciones lumínicas y

blanquecinas en condiciones ausentes de luz (figura 10 y 11), esto indica la

producción de pigmentos inducidos por la luz. Shrestha et al. (2006) menciona que

que también se observan diferencias entre medios de cultivo; sin embargo, en este

estudio no se observó dicha diferencia. Por otra parte, la pigmentación amarilla se

debe a que Cordyceps produce carotenoides en los estromas (Harding y

Sphropshire, 1980). Ademas, también se observa la producción de pigmentos en

las cepas de C. militaris, C. cardinalis, C. unilateralis y C. nidus por mencionar

algunos ejemplos (Wongsa et al., 2005; Shrestha et al., 2006; Sung et al., 2010;

Chiriví et al., 2017).





a b c

a1

d e

c1

e1 d1 b1

a1 c1 d1 b1 e1

e d c b a



99

Los hongos en general producen pigmentos y estos se han asociado a la

patogenicidad de las especies; sin embargo, no se han realizado estudios con

respecto a la patogenicidad de los carotenoides (Geis y Szaniszlo, 1984), los

pigmentos son sustancias químicas que dan color a otros materiales, y son

importantes ya que pueden ser utilizados en la industria alimentaria, farmacéutica y

textil, desde hace tiempo se han utilizado hongos filamentosos como por ejemplo

Penicillium purpurogenum para la producción de pigmentos, para sustituir los

colorantes sintéticos (Méndez-Zavala et al., 2007). Los carotenos son provitaminas

A con propiedades antioxidantes, y se ha demostrado que previenen enfermedades

en el humano como aterosclerosis y cáncer (Nishino, 1995; Meléndez-Martínez et

al., 2004).

Caracterización microscópica de las cepas

Las dos cepas crecidas en los cinco medios de cultivo en ausencia y presencia

parcial de luz presentaron hifas filamentosas, ramificadas, septadas, sinuosas con

gútulas y terminación apical redondeada. Las cepas se reproducieron asexualmente

ya que se observó la formación de conidios (figura 12). Las hifas presentaron

diferencias en el grosor de acuerdo al medio de cultivo. La conidiogénesis es

conocida para diferentes especies de Cordyceps y se ha observado que difiere entre

especies (Sung et al., 2010). Desde hace más de 40 años, Carilli y Pacioni (1977)

describieron el crecimiento hifal y la producción de esporas en cultivo sumergido de

C. militaris. Tal como C. militaris, C. aff. submilitaris produce hifas ramificadas,

septas y la terminación hifal de las ramificaciones se vuelve globosa y

posteriormente se diferencía y produce las esporas.

Figura 12. Conidios y esporas producidos en las cepas. a: cepa 1., b: cepa 6.

Medición de velocidad de crecimiento y producción de biomasa en cultivo

sólido

a 5µm 5µm b



100

La velocidad de crecimiento fue diferente respecto a los medios de cultivo F4,99

56.15; P<0.05, la cepa utilizada F1,99 472.45; P<0.05, y a la ausencia y presencia

parcial de luz F1,99 8.10; P>0.05. Siendo mayor en la cepa C-1 (0.23cm/día y

0.22cm/día), en ausencia y presencia de luz con PDA+Y. La menor velocidad de

crecimiento se observó en la cepa C-6 en condiciones de oscuridad en PDA (tabla

10).

Tabla 10. Velocidad de crecimiento, biomasa seca y densidad del micelio del cultivo

in vitro en medio sólido.

Cepa Medio

de

cultivo

Luz Velocidad de

crecimiento en

medio sólido

Biomasa seca de

medio sólido

Densidad del

micelio

C-1 AA L 0.17b 0.028def -

C-1 EMA L 0.18b 0.123cde +

C-1 PDA L 0.18b 0.132cde +

C-1 PDA+Y L 0.22a 0.143bcd ++

C-1 SB L 0.14dc 0.261ab ++

C-1 AA O 0.17b 0.017ef -

C-1 EMA O 0.18b 0.156cb ++

C-1 PDA O 0.17b 0.161abc ++

C-1 PDA+Y O 0.23a 0.184abc +++

C-1 SB O 0.12cde 0.278a +++

C-6 AA L 0.13cd 0.001f -

C-6 EMA L 0.12cde 0.131cde +

C-6 PDA L 0.13cde 0.2545ab +

C-6 PDA+Y L 0.14c 0.205abc ++

C-6 SB L 0.14cd 0.204abc ++

C-6 AA O 0.12cde 0.001f -

C-6 EMA O 0.11de 0.228abc ++

C-6 PDA O 0.11e 0.202abc ++



101

C-6 PDA+Y O 0.14c 0.241abc ++

C-6 SB O 0.13cde 0.185abc +++

C-1: cepa de Cordyceps sp 1; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; AA: agar agua; EMA: Agar extracto de malta;

PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad.

Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05).

Se encontró interacción significativa entre cepa y luz F1,99 6.47; P<0.05, entre cepa

y medio de cultivo F4,99 43.59; P<0.05 y entre luz y medio de cultivo F4,99 2.95;

P<0.05, para una mayor velocidad de crecimiento. Sin embargo, no se encontró

interacción entre la cepa, los medios de cultivo y el factor luz, F4,99 1.24; P>0.05

(Figura 13).

En el grupo de Cordyceps s.l. a pesar de que se estudian los medios que optimizan

la velocidad de crecimiento de los aislados y la producción de biomasa, se ha

observado que la velocidad de crecimiento difiere entre especies en los mismos

medios de cultivo, por ejemplo C. militaris, C. bassiana son especies con rápido

crecimiento y C. martialis presenta un crecimiento muy lento (Sung et al., 2010).

Con respecto a la producción de biomasa seca, ésta mostró diferencias estadísticas

de acuerdo al medio de cultivo (AA, PDA, EMA, PDA+Y y SB) F4,99 54.19; P<0.05.

Sin embargo, no hubo diferencias significativas de acuerdo a la cepa F1,99 2,70;

P<0.05 y a las condiciones lumínicas F1,99 2.70; P<0.05 (Tabla 10). Aunque se

presentó interacción entre el medio de cultivo y el factor luz F4,99 7.67; P<0.05 para

la mayor producción de biomasa (Figura 14). La mayor producción de biomasa

(0.28gr/caja) se obtuvó en la cepa C1 en condiciones de oscuridad en el medio SB.

Y la menor producción de biomasa se presentó en el medio AA (0.001gr/caja). Ya

que el medio agar agua no presenta nutrientes, sería interesante conocer como

puede crecer el hongo en un medio sin nutrientes sin mostrar diferencias

estadísticas con el medio PDA, con respecto a la velocidad de crecimiento.

Relacionando los resultados de velocidad de crecimiento, producción de biomasa y

densidad del micelio, se observa que la cepa C-1 presenta los valores más altos en

las tres variables. Al parecer está relacionada la mayor producción de biomasa con

la mayor densidad del micelio observada y con medios ricos en nutrientes,

presentándose la mayoría de las veces en condiciones de oscuridad. Shih et al.

(2006), menciona que la máxima producción de biomasa en hongos

entomopatógenos está correlacionada con la fuente orgánica de nitrógeno. Y

aunque se ha observado que la mayor densidad de micelio está relacionada con la

máxima velocidad de crecimiento (Wongsa et al., 2005; Shrestha et al., 2006; Sung et

al., 2006), también se ha observado que en medios carentes de nutrientes el micelio



102

crece rápidamente por la búsqueda de nutrientes, y en medios ricos en nutrientes

se observan colonias con diámetro menor y una densidad mayor (Sung et al., 2010).

Figura 13. Interacción entre cepa, condiciones lumínicas y medios de cultivo con

respecto a la velocidad de crecimiento (cepa a: cepa 1; cepa b: cepa 6)

Gráfico de Interacciones

CEPA

0.12

0.13

0.14

0.15

0.16

0.17

0.18

velo

cid

ad d

e c

recim

iento

a b

luz

0

1


CEPA

0.11

0.13

0.15

0.17

0.19

0.21

0.23

velo

cid

ad d

e c

recim

iento

a b

medio de cultivo

AA

EMA

PDA

PDAY

SB


luz

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

velo

cid

ad d

e c

recim

iento

0 1

medio de cultivo

AA

EMA

PDA

PDAY

SB



103

Figura 14: Interacción entre condiciones lumínicas y medios de cultivo con respecto

a la producción de biomasa.

Cinética de crecimiento de las cepas

La cinética de crecimiento micelial de la cepa C-1 y C-6 se observan en la figura 15

y 16. Las dos cepas presentan tres fases: fase inicial, fase de crecimiento y fase de

latencia. La cepa C-1 cubrió un diámetro de 9.0 cm en 45 días y la cepa 6 presentó

un diámetro de 9.0 cm en 60 días. Se ha observado que el tiempo de crecimiento

en medio sólido de hongos entomopatógenos depende de diferentes variables,

como son los nutrientes, pH, temperatura, cepa y especie (Sangdee y Sangdee,

2013). Por ejemplo, el tiempo que tarda en cubrir una caja petri Cordyceps

unilateralis es de 90 días (Wongsa et al., 2005), de 60 días Cordyceps

sphecocephala (Sung et al., 2006), de 15-20 días Cordyceps militaris (Shrestha et

al., 2006) y hasta de 7 días Cordyceps cardinalis (Sung et al., 2006).


luz

0

0.04

0.08

0.12

0.16

0.2

0.24

Bio

ma

sa

se

ca

0 1

medio de cultivo

AA

EMA

PDA

PDAY

SB


medio de cultivo

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Bio

ma

sa

se

ca

AA EMA PDA PDAY SB

CEPA

a

b



104



malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura.



malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

55.5

66.5

77.5

88.5

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45

diá

met

ro(c

m)

Tiempo (días)

Cinética de crecimiento de Cordyceps aff. submilitaris (cepa C1)

A/luz

A/oscuridad

PDA/luz

PDA/oscuridad

PDAY/luz

PDAY/oscuridad

EMA/luz

EMA/oscuridad

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60

diá

met

ro

(cm

)

Tiempo (días)

Cinética de crecimiento de Cordyceps aff. submilitaris (cepa C6)

AA/ L

AA/O

PDA/L

PDA/O

EMA/L

EMA/O

PDAY/L

PDAY/O



105

Caracterización macroscópica de pellets en medio de cultivo sumergido

Los pellets se desarrollaron de manera general, esponjosos y redondeados (Tabla

11). No se observan diferencias de acuerdo a las condiciones lumínicas. Se observa

que los medios adicionados con levadura presentan un mayor número de pellets, y

esto se relaciona con la mayor producción de cordicepina, aunque no con la mayor

producción de biomasa (tabla 12).

Tabla 11. Caracterización macroscópica de pellets

Cepa Medio de

cultivo

Condiciones luminicas

Número de pellets

Masa Tipo de pellets

Forma Color

C1 PD L ≥100 * Compactos Redondos e irregulares o aplanados

Crema (#F2F5A9)

C1 PD O ≥100 * Esponjosos Redondos, globosos

Crema (#F2F5A9)y café claro

(#F5ECCE)

C1 EM L ≥100 * Esponjosos y compactos

Irregulares y alargados

Crema (#F2F5A9)

C1 EM O ≥100 * Compactos Redondos Café claro (#F5ECCE)

C1 PD+Y L ≥500 - Compactos Irregulares Crema (#F2F5A9) y

café claro (#F5ECCE)

C1 PD+Y O ≥500 - Esponjosos Redondos Crema (#F2F5A9) y


C6 PD L ≥100 - Esponjosos Redondos e irregulares

Crema (#F2F5A9)

C6 PD O ≥100 - Esponjosos Redondos, globosos con abundantes

pelos

Crema (#F2F5A9) y


C6 EM L 22-30 * Esponjosos Redondos, globoso y con

pelos

Café (#F3E2A9-#F5DA81)

C6 EM O 23-150 * Esponjosos Redondos, globosos y con pelos

Crema (#F2F5A9) y



106

café (#F3E2A9-#F5DA81)

C6 PD+Y L ≥100 - Esponjosos Redondos, globosos y con pelos

Crema (#F2F5A9) y

café claro

C6 PD+Y O ≥500 - Esponjosos Redondos, globosos y con pelos

Crema (#F2F5A9) y



PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad.

*:Presencia; -;Ausencia

Los pellets presentaron hifas con prolongaciones parietales, con presencia de

gútulas, terminación hifal algunas veces cuadrada y otras redondeada, así como la

presencia de esporas (Tabla 12). Cordyceps militaris en cultivo sumergido produce

esporas por mitosis y el grosor de las hifas difiere, ya que hay ramificaciones que

se diferencían para producir esporas y son más gruesas (Carilli y Pacini, 1977), en

esta investigación se observó un promedio de grosor de hifas diferente entre

tratamientos, pero no se observa un patrón general relacionado al medio de cultivo,

la cepa o las condiciones lumínicas.

Tabla 12. Caracterización microscópica de pellets en cultivo sumergido

Cepa

Medio

de

cultivo

CL Tipo de hifas Septos Terminación

hifal

G Grosor

de hifas

(x/

rango)

Esporas

(x)

C1 PD L Ramificadas

con

prolongaciones

parietales

* Alanoidea y

redondeada

* 1.9

1.0-3.1

3.0-6.1 x

3.4-5.1

C1 PD O Ramificadas

con

prolongaciones

parietales

* Redondeada * 2.2

1.1-3.5

6.0-12.6 x

2.0-4.0

C1 EM L Ramificadas * Cuadrada y

redonda

* 1.7

1.0-2.8

2.9-6.3 x

2.0-5.9

C1 EM O Irregulares * Redondeada * 1.7

1.0-2.4

4.1-7.3 x

1.4-3.8



107

C1 PD+

Y

L Ramificadas * Cuadrada * 2.0

1.0-3.1

2.5-5.0 x

1.0-4.4

C1 PD+

Y

O Ramificadas * Redondeada

y globosa

* 1.7

1.0-2.4

Sin

esporas

C6 PD L Ramificadas * Redondeada - 2.1

1.0-3.1

4.5-6.6 x

4.4-5,9

C6 PD O Lisas * Globosa y en

punta

- 3.2

1.8-4.4

1.9-5.7 x

1.5-4.4

C6 EM L Ramificadas,

tortuosas,

rizadas con

prolongaciones

parietales

* Alanoidea y

redondeada

- 1.4

1.0-2.1

2.9-6.0 x

2.5-4.9

C6 EM O Ramificadas

con

prolongaciones

parietales

- Redondeada * 3.1

1.0-4.8

3.4-10.9 x

2.9-11.3

C6 PD+

Y

L Ramificadas y

prolongaciones

parietales

* Redondeada * 1.9

1.0-3.4

2.9-4.9 x

2.4-4.9

C6 PD+

Y

O Ramificadas e

hifas

modificadas

* Cuadrada * 1.8

1.0-2.4

2.8-9.7 x

2.2-4.0


PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad. G:

gútulas; C.L.: condiciones lumínicas. * Indica presencia. – Indica ausencia.

Producción de biomasa y cordicepina en cultivo sumergido

Con respecto al cultivo líquido, la biomasa fue diferente de acuerdo al medio de

cultivo F2,59 15.0, P<0.05, no ha la cepa F1,59 0.13 P>0.05, ni ha las condiciones

lumínicas F1,59 0.96 P>0.05, siendo el medio EM donde se produjo la mayor cantidad

de biomasa (P<0.05) en comparación con el medio PD y PD+Y. La producción

extracelular de cordicepina se observó mayor en la cepa C-6 en el medio de cultivo

PD+Y, sin haber diferencias de acuerdo a las condiciones lumínicas (Tabla 13). No

se observó producción de cordicepina en los tratamientos C1+PD+L, C1+PD+O,

C6+PD+L y C6+EM+O. Es interesante observar que la mayor producción de

cordicepina no está directamente relacionada con la mayor producción de biomasa,

así como tampoco con las condiciones lumínicas, por lo que la luz no es un factor

que induzca la producción de cordicepina en medios de cultivo sumergidos. Se ha



108

observado que ha nivel de estroma se observa una diferencia en producción de

adenosina y cordicepina de acuerdo a diferentes longitudes de onda (Dong et al.,

2012).

Tabla 13: Biomasa y cordicepina extracelular producida en medio líquido.

Cepa Medio de

cultivo

Condiciones

luminicas

Biomasa

Seca (gr/L)

Producción

de

cordicepina

(mg/L)

pH final

C1 PD L 2.4e 0 5.1

C1 PD O 5.9bcd 0 4.3

C1 EM L 8.3ab 7.2 4.3

C1 EM O 5.2cd 1.7 3.5

C1 PD+Y L 3.8de 1.7 8.8

C1 PD+Y O 6.7bc 5.5 6.1

C6 PD L 5.9bcd 0 7.8

C6 PD O 4.6cde 1.6 8.4

C6 EM L 6.6bc 1.7 6.0

C6 EM O 9.5ª 0 5.1

C6 PD+Y L 4.4cde 12.1 7.6

C6 PD+Y O 2.5e 12.4 7.7

PD: papa dextrosa; EM: extracto de malta; PDY: papa dextrosa adicionada con levadura; L: luz; O:

oscuridad; C6: cepa 6; C1: cepa 1. Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a

la prueba de tuckey P<0.05

Por lo tanto, la producción de cordicepina en Cordyceps aff. submilitaris en esta

investigación es dependiente al tipo de medio, siendo el medio papa dextrosa

adicionado con levadura el que presenta la mayor producción de cordicepina. En

Cordyceps militaris, el extracto de levadura permite la mayor producción de

cordicepina, por lo que el nitrógeno orgánico es primordial para la producción de

este metabolito (Shih et al., 2006). Chiriví et al. (2017), encontraron que la intensidad

del valor de los metabolitos en Cordyceps nidus esta relacionada con el sustrato

utilizado, siendo mayor en medios de cultivo naturales a comparación de medios de

cultivo artificiales como SDAY. Los tratamientos de PD no produjeron cordicepina



109

debido posiblemente a que es considerado un medio artificial pobre en nutrientes y

no está adicionado con nitrógeno.

Con respecto al pH, éste no es un indicador relacionado con la cantidad de biomasa

ni de cordicepina producida, sin embargo, fue diferente en cada tratamiento, por lo

que se induce que es indicador de otro u otros metabolitos secundarios. Por otra

parte, el pH, temperatura y medio de cultivo son variables que regulan la cantidad

de cordicepina (Chíviri et al., 2017). Por lo que se sugiere seguir investigaciones

con Cordyceps aff. submilitaris modificando estas variables, así como también la

utilización de medios de cultivo naturales. Chíviri et al. (2017), mencionan que la

cordicepina, adenosina, inosina y guanosina son marcadores de calidad de

Cordyceps s.l, por lo tanto, ya que Cordyceps aff. submilitaris presenta cordicepina,

indica ser una especie con potencial medicinal, farmacéutica y biotecnológica.

La cordicepina (3´deoxiadenosina) al ser un análogo a la adenosina que inhibe la

actividad de enzimas pirofosfocinasas y amidotransferasas que participan en la

síntesis de novo de purinas (Legraverend y Robert, 1978; Müller et al., 1977; Wong

et al., 2010), interfiere en la replicación de DNA de células tumorosas, la cual es

reducida en células normales, ya que los mecanismos de reparación están activos,

el cual es ausente en células tumorosas (Holliday y Cleaver, 2008). Se ha

determinado su actividad antiprofilerativa de células cancerosas de pulmón

(Aramwit et al., 2015), en leucemia, melanoma, carcinoma cervico epiteloide y

cáncer de seno (Foss, 2000; Thomadaki et al., 2005).

En esta investigación, la producción máxima de cordicepina extracelular obtenida

por Cordyceps aff. submilitaris fue de 12.37 gr/L. Cordyceps militaris es la especie

más ampliamente analizada para la producción de cordicepina y se ha registrado

que puede producir de 2.2 gr/L (Shih et al., 2006) hasta 38.8gr/L (Kim y Yun, 2005).

En Ophiocordyceps sinensis se ha reportado una producción de 18.2mg/L (Shih et

al., 2006), por que que a pesar de que C. aff. submilitaris produce baja cantidad a

comparación de Cordyceps militaris, su cultivo es inicialmente estudiado en esta

investigación, y la producción de cordicepina se podría optimizar utilizando

diferentes tipos y cantidades de nutrientes.

Actualmente, Ophiocordyceps sinensis es la especie más valorada en el Tibet, sin

embargo no se ha podido realizar su cultivo in vitro a nivel de estroma, por lo tanto

se ha implementado el cultivo de Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2012), el cual

ha sido exitoso debido a que se puede cultivar en laboratorio desde nivel de cepa

en medio sólido y sumergido hasta nivel de estroma y produce altas cantidades de

metabolitos secundarios, destacando la cordicepina y exopolisacaridos.



110

A pesar de que se han reportado mas de 400 especies de Cordyceps s.l.; 36 de

ellas se han cultivado artificialmente para la producción de cuerpos fructíferos, solo

Cordyceps militaris ha sido cultivada comercialmente, debido a su efecto

farmacéutico en un perído corto de tiempo (Shrestha et al., 2012).

En los últimos años, se han estudiado diferentes especies de entomopatógenos a

los cuales se les ha extraído cordicepina, tal como C. cicadae (Wang et al., 2012),

Ophiocordyceps aff. longissima (Sangdee y Sangdee), C. nidus (Chivirí et al., 2017),

entre otros, así como también se ha extraído de Antrodia camphorata, poliporal con

distribución en Taiwan (Chang et al., 2005). En esta investigación se incorpora a

Cordyceps aff. submilitaris, por lo que se considera que un amplio número de

especies del grupo Cordyceps sensu lato son una alternativa para su uso en la

farmacéutica.

CONCLUSIONES

Esta es la primer investigación en registrar la producción de cordicepina de un

teleomorfo silvestre de Cordyceps en México, así como también es el primer estudio

en reportar condiciones adecuadas del cultivo in vitro sumergido para la producción

de biomasa y cordicepina de Cordyceps aff. submilitaris.

Las cepas en medio sólido presentaron características morfológicas y

pigmentaciones amarillentas-blanquecinas, similares a C. militaris. Se obtuvó el

estado asexual, ya que en cultivo sólido y sumergido se observó la presencia de

esporas.

La velocidad de crecimiento fue mayor en la cepa C1, en condiciones de luz y

oscuridad en el medio PDA+Y, siendo la cepa 6 la que presentó la menor velocidad

de crecimiento. La biomasa en cultivo sólido fue mayor en la cepa C1 en condiciones

de oscuridad en medio SB, y en cultivo sumergido en el medio EM. La mayor

producción de cordicepina se observó en la cepa C6, en el medio PD+Y. Por lo

tanto, la mayor producción de biomasa en medio sólido y líquido, así como la mayor

velocidad de crecimiento no está directamente relacionada a la máxima producción

de cordicepina.

La óptima producción de cordicepina está directamente relacionada con el medio

adicionado con nitrogeno orgánico y a la cepa, no ha las condiciones lumínicas. Por

lo tanto, se sugiere continuar con la investigación del cultivo in vitro de C. aff.

submilitaris para optimizar la producción de cordicepina en medios de cultivo

suplementados, en diferentes condiciones físicas de pH y temperatura desde nivel

cepa hasta estroma, ya que esta investigación es la base para futuros trabajos de

esta y de otras especies de entomopatógenos de México. Debido a que C. aff.



111

submilitaris produce cordicepina, se destaca su potencial farmacéutico y

biotecnológico.



112

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116

CONCLUSIONES GENERALES

Actualmente, el estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato en México esta

representado por 25 especies, distribuidas en las tres Familias que conforman el

grupo. La Familia Clavicipitaceae está representada por una sola especie, la Familia

Cordycipitaceae por cinco especies del género Cordyceps y cuatro estados

asexuales, y la Familia Ophiocordycipitaceae presenta dos especies del género

Tolypocladium, diez del género Ophiocordyceps y tres estados asexuales del

género Hirsutella. De estas especies, solo Metarhizium anisopliae y Beauveria

bassiana han sido utilizadas como agentes de control biológico de insectos plaga,

y con respecto al conocimiento tradicional solo se conoce el uso antrópico

comestible de Tolypocladium capitatum y Tolypocladium ophioglosoides por nahuas

del centro de México, por lo que el conocimiento con respecto a la distribución

geográfica, uso medicinal y comestible, asi como aspectos bioquímicos,

farmacéuticos y biotecnológicos de Cordyceps son parcialmente desconocidos.

En el presente, se caracterizaron morfológica y genéticamente dos teleomorfos de

Cordyceps sensu stricto, que corresponden a Cordyceps aff. submilitaris, el cual es

nuevo registro para México.

Las características fenotípicas de las cepas obtenidas, incluida la pigmentación

amarilla en condiciones lumínicas y blanquecina en condiciones de oscuridad, así

como la producción de esporas por mitosis en cultivo muestran similitud a

Cordyceps militaris.

En el cultivo sólido de Cordyceps aff. submilitaris, se observó que la densidad del

micelio y la biomasa fue significativamente mayor en medios ricos en nutrientes

como PDA+Y y SB en condiciones de oscuridad en la cepa C1, y la máxima

velocidad de crecimiento se observó en el medio PDA+Y en la cepa C1.

En el cultivo sumergido se observó que la mayor producción de biomasa depende

del medio de cultivo, siendo el medio EM donde se obtuvó la mayor cantidad. Con

respecto a la producción de cordicepina ésta es dependiente al medio de cultivo y

la cepa, no a las condiciones lumínicas, siendo el medio adicionado con levadura y

la cepa C6 en la que se produce la mayor cantidad.

Por lo tanto, está investigación permite visualizar el potencial farmacéutico y

medicinal de Cordyceps aff. submilitaris.

Por último es conveniente continuar con la investigación de metabolitos secundarios

de esta especie, así como la optimización de su cultivo evaluando otras variables

físicas como el pH y la temperatura, incorporando nuevos medios de cultivo.

Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México

117

Por otra parte, es importante iniciar el estudio etnomicologico, bioquímico y

biotecnológico de más especies de entomopatógenos silvestres de México al ser su

estudio incipiente, a pesar de que a nivel mundial los hongos entomopatógenos del

grupo Cordyceps sensu lato presentan importancia ecológica, agrícola, medicinal,

comestible y farmacéutica.


118

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123

ANEXOS

Figura 17: Curva de calibración de cordicepina de 1-10ppm

Tabla 14: Curva de calibración de la cordicepina con los diferentes valores de

área y altura de la curva, así como el tiempo de retención

Concentración de cordicepina (ppm)

Área de la curva Altura de la curva Tiempo de retención

100 3908034 145266 6.453

90 1225376 46266 6.462

70 1370330 35159 6.471

50 698646 26078 6.488

40 525416 19722 6.510

30 1367980 34467 6.524

20 331920 8367 6.532

10 97097 2651 6.514

Tabla 15: Tiempo de retención, área y altura de las diferentes concentraciones de

cordicepina obtenidas en sistema de HPLC.

Injección Concentración

(ppm)

Tiempo de

retención

Área % Área Altura % Altura

1 0.3 6.76537757 8939.64769 95.3701728 824.813549 87.5796178

2 0.3 6.75802242 8806.06178 95.0766573 816.479387 86.9936034

2 0.5 6.75188539 12201.8336 94.0496377 1093.5349 85.8712716

1 0.5 6.74389409 11820.7932 94.3039489 1069.28415 85.8634538

2 1 6.74147093 19704.1274 93.7615989 1739.6607 85.5457227

1 1 6.7427081 19711.7329 93.9516706 1744.20559 85.3646598

2 2 6.74152423 35864.6396 94.5432977 3053.81768 87.4320069

1 2 6.73235366 35519.5043 94.4731103 3047.4359 87.4067699

AU

0.000

0.002

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0.006

Minutes

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00


124

2 3 6.72848758 52835.9893 93.84558 4294.54412 87.6888526

1 3 6.7250014 52207.708 94.9046554 4292.533 88.66171

2 4 6.71652733 69432.3423 93.6839691 5350.46515 88.5468388

1 4 6.72336537 69122.9105 93.9809653 5321.97584 88.5671493

2 5 6.71212002 85260.8676 94.458416 6062.6772 89.0569918

1 5 6.70664215 85243.8679 93.7602429 6071.62232 88.9149217

2 6 6.69467318 100999.893 94.3228831 6646.27698 88.8027793

1 6 6.69269163 101151.514 94.3485277 6641.80376 89.0467891

2 7 6.68667066 118720.272 93.5901175 7075.0032 87.8336437

1 7 6.67450747 118410.683 93.3038634 7026.91282 87.7278402

2 8 6.66876435 133981.29 92.8836848 7288.6023 89.8656146

1 8 6.67423379 133600.155 93.4318004 7291.45672 90.5939364

2 9 6.67494897 148611.431 92.7954592 7406.7265 89.2409639

1 9 6.68411743 149938.652 93.3553742 7389.63058 89.4456548

2 10 6.69547196 167850.973 92.3750454 7452.04671 87.7118644

1 10 6.71375653 165975.45 92.6396222 7421.9339 88.0218216

Figura 17: Gráfica lineal y línea de tendencia de la curva de calibración de cordicepina.

y = 15923x - 25512r2 = 0.998

0

50000

100000

150000

200000

250000

are

a b

ajo

la c

urv

a

Concentracion de cordicepina (ppm)

Curva de calibración de cordicepina Donde:

y=15923x-25512

y= área

x= concentración de cordicepina

m=pendiente=15923

b=ordenada al origen= 25512

Para conocer la concentración de cordicepina,

despejamos:

x= y/15923+25512


125

Figura 19: Cromatogramas de las replicas 1, 2 y 3 del tratamiento PD+O+C6.

Figura 20: Cromatogramas de las replicas 6, 7 y 8 del tratamiento PD+L+C6

AU

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0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00

AU

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AU

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AU

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cordicepina


126

Figura 21: Cromatogramas de las replicas 11, 12 y 13 del tratamiento PD+O+C1.

Figura 22: Cromatogramas de las replicas 16, 17 y 18 del tratamiento PD+L+C1.

AU

-0.00002

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AU

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127

Figura 23: Cromatogramas de las replicas 21, 22 y 23 del tratamiento EM+L+C1.

AU

-0.00015

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Minutes

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AU

0.00

0.10

0.20

0.30

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Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00

AU

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Minutes

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128

Figura 24: Cromatogramas de las replicas 26, 27 y 28 del tratamiento PDY+O+C1

Figura 25: Cromatogramas de las replicas 31, 32 y 33 del tratamiento PDY+L+C6

AU

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Minutes

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AU

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Minutes

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AU

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Minutes

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129

Figura 26: Cromatogramas de las replicas 36, 37 y 38 del tratamiento PDY+O+C6

AU

0.00

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Minutes

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AU

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Minutes

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AU

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Minutes

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universidad autÓnoma del estado de mÉxico maestrÍa...

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