trabajo fin de grado v2dspace.umh.es/bitstream/11000/4168/1/tfg pérez garcía... · 2017-10-25 ·...
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Autora:ClaudiaPérezGarcía
Tutoracadémico:FelipeHornosAdán
Co-Tutor:RocíoEsquembreTomé
DepartamentodeAgroquímicayMedioAmbiente
ÁreadeQuímicaFísica
InstitutodeBiologíaMolecularyCelular(IBMC)
GradoenBiotecnología
FacultaddeCienciasExperimentales
Curso2016/2017
TRABAJOFINDEGRADO
USODEPOLÍMEROSNEUTROSPARAREDUCIRELFENÓMENODEOPSONIZACIÓNSOBRENANOPARTÍCULASMAGNÉTICASRECUBIERTASCONUNPOLIELECTROLITOANIÓNICO
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ÍNDICE
RESUMEN..................................................................................................................................3
PALABRASCLAVE.......................................................................................................................3
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................41.1 Nanopartículasdemagnetita.................................................................................................61.2 Recubrimientodenanopartículasmagnéticasconpolielectrolitosaniónicos.......................81.3 Polímerosneutroscomotratamientodenanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolito(NP-PAA)......................................................................................................................91.4 IsotermadeLangmuir..........................................................................................................111.5 Lisozimacomoproteínamodelo..........................................................................................13
2. ANTECEDENTESYOBJETIVOS..........................................................................................15
3. MATERIALESYMÉTODOS................................................................................................173.1 Síntesisdemagnetita...........................................................................................................173.2 Cuantificacióndelasnanopartículasdemagnetitaobtenidas............................................173.3 Recubrimientodenanopartículasdemagnetitaconácidopoliacrílico...............................173.4 CuantificacióndelasNP-PAApormétodoscolorimétricos.................................................183.5 AdsorcióndelisozimaalasNP-PAA.....................................................................................203.6 TratamientodelasNP-PAAconPEGdediferentespesosmoleculares,PVPyPVA............203.7 Medicióndeltamañoycargadelasnanopartículasobtenidas...........................................213.8 InfluenciadelacantidaddepolímeroneutrosobrelasNP-PAAtratadasconPEG400......21
4. RESULTADOS...................................................................................................................214.1 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAA.................................224.2 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares...........................................................................................................234.3 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVP..264.4 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVA....26
5. DISCUSIÓN.......................................................................................................................275.1 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares............295.2 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconotrospolímerosneutros:PVPyPVA..............30
6. CONCLUSIONESYPROYECCIÓNFUTURA........................................................................30
7.BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................33
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RESUMENElusodenanopartículasmagnéticashaidocreciendodeformadesmesuradadurantelasúltimas
décadasdebidoalagranaplicabilidadquepresentan.Podemosdestacarsuusodentrodelcampode
la biomedicina, donde ya han sido usadas como agentes de contraste en imagen por resonancia
magnética. Aunque aún en desarrollo, se pretenden utilizar como sistemas transportadores de
biomoléculas,sinembargo,estaspartículasalseradministradaspodríansereliminadasdelorganismo
porelsistemainmune(opsonización).
Enestetrabajosehanobtenidonanopartículasdemagnetitarecubiertasconunpolielectrolito
aniónico y se ha caracterizado su capacidad máxima para adsorber Lisozima. Con el fin de
reducir/evitar la opsonización, proponemos el tratamiento de las nanopartículas con distintos
polímerosneutros,comopolietilienglicol(PEG)dedistintopesomolecular(400,4000y35000g/mol),
polivinilalcohol(PVA)ypolivinilpirrolidona(PVP).
Losresultadospareceríanindicarquedelospolímerosutilizados,tantoelPEG400comoelPVA
aumentan la capacidad de adsorción de la nanopartícula (un 28 % y un 144 % respectivamente)
favoreciendo laopsonización,elPEG4000noafectaríaatal fenómeno,yquesolamenteelPEGde
35000ylaPVPloreduciríanun26%.
ABSTRACT
Useofmagneticnanoparticleshasshownasignificantincreaseduringthelastdecadesduetotheir
numerousapplications.Inparticular,inthebiomedicalfield,wheretheyhavebeenusedasmagnetic
resonanceimagingcontrastagents.Theirapplicationasdrugdeliverysystemsisnowindevelopment,
butoneofthemainproblemsencounteredistheireliminationbytheimmunesystem(opsonization).
Inthiswork,wehaveobtainedmagneticnanoparticlescoatedbyananionicpolyelectrolyteand
havecharacterizedtheiradsorptioncapacitytowardsheneggwhitelysozyme,usedasamodelcationic
protein.Asaworkinghypothesis,wehavestudiedifseveralneutralpolymerscouldcompetewiththe
protein for the charged surfaceof thenanoparticle as ameans to decrease the adsorption to the
nanoparticlesofsomeoftheproteinspresentinthebiologicalmediathatinitiatestheopsonization
process.Inparticular,wehavestudiedtheeffectofpolyethyleneglycol(PEG)ofdifferentmolecular
weights(400,4000y35000g/mol),polyvinylalcohol(PVA)andpolyvinylpirrolidone(PVP).
TheresultssuggestthatPEG400andPVAincreasethenanoparticleadsorptioncapacity(28%and
144%,respectively)promotingopsonizationwhilePEG4000hasanegligibleeffectandPEG35000and
PVPreducetheproteinadsorptioncapacitybya26%.
Palabrasclave:NP-PAA,PEG,PVP,PVA,capacidaddeadsorciónmáxima,opsonización.
Keywords:NP-PAA,PEG,PVP,PVA,maximumadsorptioncapacity,opsonization.
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1. INTRODUCCIÓNDurante las últimas décadas, el desarrollo y la caracterización de nanopartículas
magnéticashanidocreciendodesmesuradamente.Graciasasuspropiedadesfísicoquímicas
y a su magnetismo, pueden ser empleadas en numerosos ámbitos: como sistemas de
refrigeración magnética, en sistemas de almacenamiento de datos, tratando aspectos
medioambientalesodentrodelcampode labiomedicina(Tongetal.,2015;Laurentetal.,
2008).Concretamente,esdegraninteréssuaplicabilidadbiomédica,yaquedemuestranser
ungranavanceencienciaconunfuturomuyprometedor.Asípues,puedenser,entreotros,
interesantes agentes de contraste en imagen por resonancia magnética, eficientes
marcadorescelularesobuenossistemasdeliberacióncontroladadefármacos(Guptaetal.,
2005).Esdeespecial importancia suempleocomovehiculizadorasde fármacoscomouna
potencialalternativa frentealusode fármacosconvencionales, sobre todo, losempleados
en el cáncer. Los agentes quimioterapéuticos y antitumorales habituales son liberados al
torrente sanguíneo y se caracterizanpor nopresentar especificidadpor el tejido tumoral.
Como consecuencia, las células y los tejidos sanos también se ven afectadosdando como
resultadounaaltatoxicidadyseverosefectossecundarios(Bekaroğluetal.,2017).Conelfin
depaliar esteproblema, el fármacoantitumoral puede ser adsorbidoa la superficiede la
nanopartículamagnética,lacualsedirigebajolaaccióndeuncampomagnéticoexternoal
tejidoespecíficodondeactuarádichofármacoevitandolosindeseadosefectossecundarios.
Sin embargo, el principal problemaasociadoa este sistemade liberación controladaes el
fenómenodeopsonización.
Este fenómeno se describe comoelmecanismopor el cual el sistema inmune elimina
agentesextrañosdelorganismotalescomopatógenosopartículasexógenas.Sebasaenel
recubrimientodelagenteextrañoporunasproteínasséricasdenominadasopsoninas.Existe
unaampliavariedadynaturalezadentrodeestetipodeproteínas,pudiendoenglobardesde
componentesfundamentalesdelsistemainmunológico,comolasinmunoglobulinasyciertos
elementosdelsistemadelcomplemento,hastaproteínasséricascomunes,comoelcolágeno
tipoI,laproteínaCreactivaolafibronectina.
Elprocesodeopsonización(Fig.1)comienzaconlaunióndelaopsoninaalelementoque
sedeseaeliminar.Estauniónestámediadanormalmenteporreceptoresyligandosespecíficos
ydalugaraunafuerteseñalizaciónqueactivaalascélulasfagocíticas,lascualesdestruyenel
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material exógenomediante fagocitosis. En el caso de las nanopartículas, se ha visto que,
generalmenteno son fagocitadasporel sistema inmune sinoque son secuestradasen los
sistemasfagocíticosmononucleares(MNP)(Owensetal.,2006).
Como consecuencia de la opsonización, el sistema inmune tratará de eliminar las
nanopartículasmagnéticasmediantediversosmecanismosqueincluyenlaadsorcióndelas
proteínasplasmáticasporlasuperficiedelananopartículayposteriordesorcióndelaproteína
farmacológicaasícomoelreclutamientodelascélulasfagocíticasycomponentesdelsistema
inmune que median el reconocimiento, digestión y eliminación de compuestos extraños
dentrodeltorrentesanguíneo.
Unposibleabordajeparapoderemplearlasnanopartículasmagnéticascomosistemasde
liberacióncontroladadefármacosypoderdirigirlashacialostejidosdianadelfármacoessu
recubrimientoconpolímerosneutroscongruposhidroxilossemejantesalaguatalescomoel
polietilenglicol(PEG),lapolivinilpirrolidona(PVP)oelpolivinilalcohol(PVA).Deestemodo,el
sistema inmune no detectaría las nanopartículas como agentes exógenos que han de
eliminarseyseevitaría,deformarelativamenteeficaz,elfenómenodeopsonización(Grefet
al.,1995).
Figura 1. Esquema del proceso de opsonización en el torrente sanguíneo ante la presencia denanopartículasmagnéticassinrecubrirporpolímerosneutros(A)yrecubiertasconPEG(B).(A)Unióndelasopsoninasalananopartícula(2).Activacióndemacrófagos(3).Acumulacióndelasnanopartículasenelhígadoparadetoxificar(4).(B)LapresenciadelPEGreducelaunióndelasopsoninas(2)yelsecuestroenelhígado(3).(Jokerstetal.,2011)
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1.1 Nanopartículasdemagnetita.
Losóxidosdehierrosoncompuestoscomunesenlanaturalezayfácilmenteobteniblesen
el laboratorio pormétodos fisicoquímicos. Sus principales formas son:magnetita (Fe3O4),
maghemita(γ-Fe3O4)yhematita(α-Fe3O4)(Tejaetal.,2009).
Lamagnetita,compuestodeinterésenestetrabajo,esunmineraldehierrodecoloración
negra perteneciente al grupo de las espinelas. Este mineral se encuentra en un amplio
escenarioenlanaturaleza,siendomáscomúnenrocasígneas,metamórficasysedimentarias.
Laestructuradelamagnetita(Fig.2)fueunadelasprimerasestructurasmineralesenser
definidamediantedifracciónderayosXen1915(Bragg.,1915;Nishikawa.,1915)Estetipode
mineralpresentaunaestructuratípicacorrespondientealasespinelasinversas.Sebasaenla
disposicióndelosionesdeoxígeno(32O2-)formandounaredcúbicacentradaenlascaras
(FCC).EncuantoalosionesFe,éstosseposicionanenfuncióndesuestadodeoxidación.Los
ionesFe2+selocalizanenloshuecosoctaédricosmientrasquelosionesFe3+seencuentranen
lostetraédricos.
Laprincipalpropiedadyaplicabilidaddelamagnetitaessufuertemagnetismodebidoa
queesconsideradoelóxidometálicodetransiciónconmayormagnetismo.Estapropiedad
viene ocasionada como consecuencia del alineamiento de los momentos magnéticos de
diversos elementos. En función de estos momentos magnéticos, existen diversos
comportamientos: ferromagnético, ferrimagnéticoyantiferromagnético (Tejaetal., 2009).
Concretamente, lamagnetita es considerada comoun compuesto ferromagnético ya que,
Figura2.Estructuradelamagnetita(Okubeetal.,2014).
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todossusmomentosmagnéticosseencuentranalineadossinnecesidaddelaaplicacióndeun
campomagnético externo. Esta propiedad, junto con su alta biocompatibilidad y su baja
toxicidad, favorece el desarrollo y caracterización de nanopartículas compuestas de este
elemento(Leslie-Pelecky.,1996).
Centrandosuaplicabilidadalaliberacióncontroladadefármacos,esdevitalimportancia
conocerquécomportamientopresentanaunpHfisiológico.Dadoquesupuntoisoeléctrico
(pI) es cercano a 6.5 (Fig.3), se puede concluir que se encontrarán en su forma neutra,
careciendodecualquier tipodecarga.Comoconsecuencia, tiendena formaragregaciones
dando como resultadopartículasdeundiámetroaparentemayoral de lasnanopartículas
individualesdispersas.
Figura3.RepresentacióndelpotencialZdelamagnetitafrentealpH.Comosepuedeobservar,elpuntoisoeléctricoescercanoa6.5.(Halperetal.,1971)
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1.2 Recubrimientodenanopartículasmagnéticasconpolielectrolitosaniónicos.
Unaposiblesoluciónplanteadapornumerososautoresparaestabilizarcoloidalmentela
nanopartículademagnetitaes recubrirla conunpolielectrolito (PE) (Tombáczetal.,2006;
Mendenhall et al., 1996), el cual puede definirse como un polímero que contiene grupos
ionizablesloscualespuedenestartotaloparcialmentedisociadosendisoluciónpresentando
una elevada carga superficial, lo que nos permitirá unir fármacos con carga neta opuesta
medianteinteracciónelectrostática.
Parallevaracaboesterecubrimientohemosutilizadoelácidopoliacrílico(PAA)(Fig.4),un
polímero formado por homopolímeros de ácido acrílico entrecruzados con un alil éter
pentaeritrol. A pH fisiológico, los grupos carboxilatos que presenta pierden los protones
adquieriendo carga negativa. La principal ventaja de este polielectrolito, es la capacidad
quelantededichosgruposcarboxilatoporlosionesFequehayenlasuperficiedelapartícula,
loquesumadoalainteracciónelectrostáticalarecubrirádeformaeficaz,almismotiempo
queevitasucorrosión(Hajdúetal.,2012).
A partir de este sistema propuesto de nanopartícula-PE como sistema de liberación
controlada intentaremos reducir el fenómeno de opsonización tratándolo con polímeros
neutros.
Figura4.Estructuradelácidopoliacrílico(PAA).ObtenidadeSigmaAldrich.
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1.3 Polímerosneutroscomotratamientodenanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolito(NP-PAA).
Dadas las características fisicoquímicas que presentan este tipo de compuestos y los
estudiosquesehanrealizadosobresusefectossobrelosfluidosbiológicos,lospolímerosson
unapieza fundamentaleneldesarrolloy caracterizaciónde lasnanopartículasmagnéticas
comotransportadorasdefármacos.Laampliavariedaddematerialescandidatosarecubrir
nanopartículasmagnéticacreceenparaleloaldesarrollodenuevoscompuestospoliméricos.
Losempleadosparallevaracaboelobjetivodeestetrabajofueronlosiguientes:
1.3.1 PEG
El PEG (Fig. 5-2) es un polímero helicoidal constituido por repeticiones de unidades
formadasporóxidodeetileno(Li,Jetal.,2003).
LasíntesisdelPEGseproduceporunainteracciónentreelóxidodeetilenoconelagua,
etilenglicoluoligómerosdeetilenglicolpudiendosercatalizadaporbasesoácidos.
Elpolietilenglicolpresentaunagranversatilidadypuedeunirse,de formacovalente,a
otrasmoléculascomoproteínasfarmacéuticasporunmecanismoconocidocomoPEGilación
(Fig.5-3).Graciasaestemecanismoesposiblelamodulacióndelasolubilidaddelaproteína
unidaasícomolainterferenciaeneltamañofinaldelananopartícula(Illésetal.,2015).
Lagranimportanciaquepresentaestepolímerocomorecubrimientodenanopartículas
resideensubiocompatibilidadysolubilidadenagua(Barreraetal.,2008;Yangetal.,2014).
EstosaspectossonmuyimportantesdebidoaquesehaobservadoquelaPEGilacióndelas
nanopartículas magnéticas desnudas reduce el fenómeno de opsonización y, por tanto,
aumentaeltiempodecirculaciónensangre(Grefetal.,1995).
Figura5.EstructuraquímicadelmonómerodelPEG(1)asícomodelpolímeroneutro(2).RepresentacióndeunananopartículamagnéticarecubiertaporPEGoPEGilada(3).(Jokerstetal.,2011)
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1.3.2 PVA
ElPVA(Fig.6)esunpolímerohidrofílicoquefuesintetizadoporprimeravezporHermann
yHaehnelen1924mediantelasaponificacióndelpolivinilésterenunasolucióndeNaOH.Sin
embargo, el PVA comercial es producidomediante una hidrólisis del polivinil acetato. Sus
propiedadesestructuralesdependendelamasamoleculardelpolímeroyelgradodehidrólisis
alquesehasometido(Muppalanenietal.,2013).Esteúltimoaspectoesmuyimportanteya
queestárelacionadoconlasolubilidad.Sepuedeafirmarqueloscompuestosconmayores
gradosdehidrólisis son aquellosquepresentanmenor solubilidaden agua (Hassanet al.,
2000).
Estepolímeroseempleaundiferentesáreasbiotecnológicasybiomédicasdebidoasus
propiedadesfisicoquímicas,sufácilprocesadoysubajatoxicidad(Chiellinietal.,2003).
1.3.3 PVP
La PVP (Fig.7) es un polímero que presenta una conformación de “random coil” en
solucionesacuosas.EstáconstituidoporlapolimerizacióndelaN-vinilpirrolidona,lacualda
lugarapolímeroscondiferentespesosmolecularesenfuncióndelascondicionesasícomo
copolímerosy“entrecruzamientos”(cross-linked)dePVP.
Figura6.EstructuradelPVA.ObtenidadeSigmaAldrich.
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LasíntesisdelaPVPcomienzaapartirdelacetilenoyelformaldehídoque,porunaserie
dereaccionesquímicas,dalugaralaN-vinilpirrolidona.Paraobtenerlapolivinilpirrolidona,
esteúltimocompuesto sepolimerizaendiversascondiciones.Porunaparte, la síntesis se
puede realizar en agua, tomando el peróxido de hidrógeno como compuesto iniciador.
Paralelamente, se puede realizar la polimerización en solventes orgánicos siendo, en este
caso,elradicaldelsolventeeliniciadordelareacción.
Lapresenciadegruposhidrofóbicosasícomodehidrofílicospermitequeestepolímero
sea capaz de ser soluble tanto en agua como en solventes orgánicos. Además, la alta
higroscopiaquepresentaensolucionesacuosas,conviertenlaPVPenunpolímeroadecuado
paraserempleadocomorecubrimiento.Sinembargo,hayquerecalcarqueelpesomolecular
deestepolímerojuegaunpapelimportanteensuaplicabilidadbiomédicayaque,segúnel
tamañoquepresente,tendrámayorsusceptibilidaddeserexcretadoporelorganismo(Haaf
etal.,1985).
1.4 IsotermadeLangmuir.
Para caracterizar la capacidad de adsorción de estos sistemas vehiculizadores nos
basaremosenlaisotermadeLangmuir(Langmuir,1916),elcualindicaelgradodeadsorción
delasmoléculasqueseencuentrandispersasentreunafaselíquida/gaseosayunafasesólida
cuandosealcanzaelequilibrio.
La isoterma teórica de Langmuir (Fig.8) es un ejemplo de unmodelo de isoterma de
adsorciónenmonocapa.Estemodelodefiendequelafasesólidaproporcionaunaseriede
posiciones para la adsorción, donde, únicamente se adsorberá una molécula, la cual no
interaccionaráconlasmoléculasdeposicionesvecinas.Paradefinirconmayorexactitudeste
Figura7.EstructuradelaPVP.ObtenidadeSigmaAldrich.
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tipodeadsorción,elmodeloincluyeeltérminodegradoofactorderecubrimiento,θ.Este
factorindicalafraccióndelossitiosdeadsorciónaloscuálessehaunidounamoléculadel
soluto.
LaisotermadeLangmuirsepuededefinirmediantelasiguienteecuación:
θ = 𝑞
𝑄𝑚𝑎𝑥 =𝐾 · [𝑃]
1 + 𝐾 · [𝑃]; 𝐾 =𝑘𝑎𝑑𝑠𝑘𝑑
siendoqelrecubrimientoparaunascondicionesdadas,Qmáxelrecubrimientomáximo,K,la
constantedeequilibrioyP,laconcentracióndeproteínaenelequilibrio.
Sisetrabajaencondicionessaturantesdeproteína(Ec.1.1),siendolaconcentraciónde
ésta superior a la constante de disociación, el recubrimiento obtenido será el grado de
recubrimientomáximo.Deestemodo,setrabajaenlapartefinaldelaisotermaysehallael
valorconmayorfacilidad.Lapendientedelaecuacióndelarectaresultantederepresentarla
concentracióndeproteínafrentealaconcentracióndenanopartículaseráelrecubrimiento
máximooQmáx(Ec.1).
Figura8.IsotermadeLangmuir.
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𝑞 =𝑄𝑚𝑎𝑥 · 𝑘𝑎𝑑 · [𝑃]𝑘𝑑 + 𝑘𝑎𝑑 · [𝑃] → 𝑆𝑖𝑘𝑑 <<< 𝑃 → 𝑞 = 𝑄𝑚𝑎𝑥(𝐸𝑐. 1)
q = 𝑚𝑃𝑟𝑜𝑡𝑎𝑑𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑎
𝑚𝑁𝑃𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙= 𝑄𝑚𝑎𝑥
1.5 Lisozimacomoproteínamodelo.
Parallevaracabolosdiferentesensayosdeadsorciónseempleacomoproteínamodelo
lalisozima(Lzm)(Fig.9).Estaproteína,tambiénconocidacomomuramidasa,esunaenzima
glucosidasadescubiertaporAlexanderFlemingen1922(Fleming,1922)cuandoobservóque
lassecrecionesnasalespodíanmatardiversasbacterias.Estaenzimaseencuentraentodo
tipo de fluidos corporales como las secreciones lacrimales, saliva, lechematerna o suero
sanguíneo.
Suprincipal funciónradicaencatalizar lahidrólisisdeenlaceglucosídicoß1-4entreel
ácidoN-acetilmurámicoylaN-acetilglucosaminaenelpeptidoglicano,componenteprincipal
delasparedesbacterianas.Además,apartedehidrolizarenlaces,escapazderealizarotras
funcionescooperandoconelsistemainmunológicoconelfindeeliminarmicroorganismos
patógenos del organismo. De este modo, actúa conjuntamente con anticuerpos (igA
secretadas) y los factores del sistema del complemento para lisar bacterias como E.coli.
Figura9.Representaciónencartoondelalisozima.ObtenidadeProteinDataBank.(Código:5TK0)
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También,juegaunpapelimportanteenlafagocitosis,durantelacualesliberadadelascélulas
granulocíticas(McClellandetal.,1975).
GraciasalosestudiosdePierreJollès(Jollèsetal.,1969),hoyseconocequelalisozima
presenta129residuosaminoacídicosqueformanunacadenapolipeptídicaentrecruzadapor
cuatropuentesdisulfuro intramoleculares.Elempaquetamientode la lasproteínasesvital
para definir y comprender su actividad. De estemodo, la conformación de la lisozima se
caracterizaporlapresenciadeestructurassecundariascomoalfahélicesyláminasbetacon
residuostantohidrofílicoscomohidrofóbicos.Esdeinterésresaltarelsitioactivodelaenzima,
caracterizadoporserunaespeciedegrietadondeelsustratoseuney,posteriormente,es
hidrolizado.
Lalisozimaesunaenzimaqueporsuestructura,estabilidadyempaquetamientoesdelas
másempleadasyestudiadaseninvestigaciónbioquímica.Aunqueéstaseencuentraentodos
losanimales,esdereconocerlaimportanciadelalisozimadehuevoblancodegallina,como
modelodenumerososestudios(Swaminathanetal.,2011).
En este trabajo, la cuantificación pormétodos espectrofotométricos de la lisozima se
realizamidiendosuespectrodesde400a240nm(Fig.10).Laabsorciónde luzUVdeesta
proteínaesgraciasalapresenciadeaminoácidosaromáticosensuestructura,talescomoel
triptófano (Trp), la tirosina (Tyr), ademásdepuentesdisulfuro. Concretamente la lisozima
presenta 6 Trp, 3 Tyr y 4 puentes disulfuro, donde todos contribuyen a su máximo de
absorcióna280nm(ε=2.653(mg/mL)-1cm-1).
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2. ANTECEDENTESYOBJETIVOS.
Losprimerosestudiosquedestacanlaimportanciadelasnanopartículasmagnéticascomo
transportadorasdefármacosseremontanaladécadadelos70(Senyetal.,1978;Widderet
al.,1978).Elprimerartículoquedemuestrasuusocomosistemas liberadoresde fármacos
tienesuorigenen1983,cuandoWideretal(Widderetal.,1983)probaronlaeficaciadelas
nanopartículastransportandodoxorubicinadirectamenteaunsarcomaderata.
Existennumerososartículosquedestacanlaimportanciadelabúsquedadeunasolución
alproblemadeopsonizacióndenanopartículasmagnéticas.Estosestudiospreviossecentran
enelrecubrimientodenanopartículasdemagnetitadesnudas(Owensetal.,2006).
En cuanto al PEG, son numerosos los estudios que resaltan su idoneidad como
recubrimientodadasubiocompatibilidadysucapacidaddegenerarunasuperficiehidrofílica
y,portanto,conmayorvidamediaeneltorrentesanguíneo(Moghimietal.,2001;Zhanget
al.,2002;Harrisetal.,2003).
Sin embargo, estudios más centrados en la caracterización de las nanopartículas
recubiertas de PEG buscan como objetivo el recubrimiento óptimo.Un caso es el trabajo
realizadoporIllésetal(Illésetal.,2015)enelqueseconcluyequeloscopolímerosdePEGcon
ungrannúmerodegruposfuncionalesCOOHsonlosrecubrimientosidóneos.Además,otros
aspectosestudiadossonsuabsorciónytoxicidadinvivo.Pisciottietal(Pisciottietal.,2014)
determinanque lasnanopartículasrecubiertasconPEGaumentabanconsiderablemente la
absorción en las células tumorales donde se deseaba actuar. Además, paralelamente,
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
240 260 280 300 320 340 360 380 400
Absorbancia
normaliza
da
Longitud deonda(nm)
Figura10.Espectrodeabsorcióndelalisozimaenunrangode240a400nm.
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realizaronestudiosdecitotoxicidad,demostrandoqueestoscompuestospresentabanbaja
toxicidad.
EncuantoalrecubrimientodelasnanopartículasconPVA,diversosautoresafirmanque
estetipoderecubrimientopermiteunaestabilidadcoloidalyuncomportamientomagnético
óptimo(Qiuetal.,2000).Sinembargo,estudiosmásrecientes(Nadeemetal.,2016)afirman
queunaumentoenlaconcentracióndePVAdisminuyeelmagnetismodelasnanopartículas.
Encuantoaotraspropiedades,elPVAdisminuyeeltamañodelasnanopartículasy,asuvez,
evitalaaglomeración.
LaPVP,porsuparte,tambiénmuestraevidenciasdeserunrecubrimientoprometedor
dentrodelcampodelabiomedicina.Huangetal(Huangetal.,2010)estudiaronelefectodel
tamañodelasnanopartículasrecubiertasenlaabsorcióncelularyllegaronalaconclusiónde
queeltamañodeéstasesdeterminante.Además,tambiénsehanrealizadoexperimentoscon
nanoparticulas recubiertas con PEG y PVP conjuntamente (Tu et al., 2013). Este tipo de
recubrimientoresultaenunabuenaestabilidadcoloidal.
OBJETIVOGENERAL:
Elobjetivodeestetrabajoeslabúsquedadepolímerosneutrosparaeltratamientode
nanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolitosconelfindeevitaroreducirel
fenómenodeopsonización.
OBJETIVOSESPECÍFICOS:
- Síntesisdenanopartículasdemagnetita.
- Estabilizacióndelasnanopartículasdemagnetitamedianteelrecubrimientoconun
polielectrolitoaniónicoyposteriorcaracterización(tamañoycarga).
- DeterminacióndelacapacidaddeadsorcióndeLzmsobrenanopartículas-PE.
- Tratamiento de las nanopartículas-PE con diferentes polímeros neutros y posterior
caracterización(tamañoycarga).
- DeterminacióndelacapacidaddeadsorcióndeLzmsobrenanopartículas-PEtratadas
conpolímerosneutros.
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3. MATERIALESYMÉTODOS
3.1 Síntesisdemagnetita.
La síntesis de la magnetita se da por una reacción conocida como reacción de
coprecipitación(Massart,1981).
𝐹𝑒FG 𝑎𝑐 + 2𝐹𝑒IG 𝑎𝑐 + 8𝑂𝐻M(𝑎𝑐) → 𝐹𝑒I𝑂N 𝑠 + 4𝐻F𝑂 𝑙
Paraobtenerlasnanopartículasdemagnetitaporelmétododecoprecipitación,sedebe
partirdeunasolucióndeácidoclorhídrico(HCl)0,4MmezcladaconFe3+yFe2+enunratio
2:1,respectivamente.Estasoluciónsemantieneenagitaciónyseecha,gotaagota,sobreuna
solución básica de hidróxido de sodio (NaOH) 0,5 M preparada previamente. Una vez
finalizadalasíntesis,semantienelasoluciónenagitaciónduranteunahora.Elresultadofinal
esunasolucióndecoloraciónnegracompuestaporóxidoferrosoférrico(Fe3O4)omagnetita.
Cabe destacar que un posible problema asociado a la síntesis de la magnetita es la
oxidacióndelhierro,lacualdesencadenaríaproblemasdepureza.Porestemotivo,conelfin
de evitar dicha oxidación, todo el proceso de coprecipitación se da en una atmósfera de
nitrógeno,elcualdesplazatodoeloxígenopresenteyaunatemperaturade40°C.
Tras la síntesis de lamagnetita, las nanopartículas deben seguir un proceso de varios
lavadosconaguadesgasificada.Porúltimo,paramantenerlasenunasolucióndispersa, se
realizaunúltimolavadoconetanol.
3.2 Cuantificacióndelasnanopartículasdemagnetitaobtenidas.
Conelfindeconocerlaconcentracióndemagnetitaobtenidaenlasíntesis,serealizauna
cuantificaciónmediante residuo seco. Para ello, se añaden 2ml de las nanopartículas de
magnetitaobtenidasatrestubospesadospreviamenteysedejansecarenuntermobloque.
Unavezsetieneelresiduoseco,sepesaysecalculalaconcentracióndemagnetitaenfunción
delaalícuotaquesehaañadidoinicialmente.
3.3 Recubrimientodenanopartículasdemagnetitaconácidopoliacrílico.
Para recubrir las nanopartículas demagnetita, se preparan 1000ml de PAA de 15000
g/mola2,7mg/mlajustadopreviamenteapH9,0ysemantieneenagitación.Paralelamente,
seañadendesdeunabureta100mla4mg/mldenanopartículasdemagnetitaajustadasapH
11 y sonicadas previamente durante treinta minutos en intervalos de diez segundos de
sonicación y veinte segundos sin sonicación (para evitar un calentamiento excesivo de la
18
disoluciónempleandounbañodehielo),sobre ladisolucióndePAAysedejaenagitación
todalanoche.
Unavezrecubiertas,sebajaelpHa3,0yasíseconsiguequelasnanopartículasrecubiertas
conPAA(NP-PAA)decanten.Ladecantaciónseproduceporque,aestepHpordebajodelpka
delPAA(4,35),losgruposcarboxilatoseprotonany,portanto,sepierdecarga,loqueconlleva
aunapérdidadeestabilidadcoloidal.Unavezdecantadas,lasNP-PAApuedensersometidas
aunaseriedelavadoshastaque,finalmente,sesubeelpHa7,0.Enestascondiciones,lasNP-
PAA volverán a ser sometidas a procesos de sonicación para individualizarlas y poder
cuantificarlas.
3.4 CuantificacióndelasNP-PAApormétodoscolorimétricos.
ExistendiversosmétodosparacuantificarlapresenciadeFey,portanto,demagnetitaen
unamuestra.Concretamente,mediantecolorimetría,empleandoreactivosqueinteraccionen
conelhierroyformencomplejoscoloreados,sepuedehallar,deunaformacuantitativa,el
contenidoenhierrodelassolucionesdeseadas.
Eltiocianatodepotasio(KSCN)esuncompuestoquímicoquesecaracterizaporreaccionar
con diferentes elementos dando lugar a compuestos caracterizados por su coloración.
Concretamente, con los compuestos dehierro, el ion SCN- interacciona conel ion Fe3+. El
resultadodeestainteracciónesuncomplejodecoloraciónrojiza(Fe(SCN)2+),elcualsepuede
medirmediantetécnicasespectrofotométricasaunalongituddeondade474nm.Deeste
modo,sehalladeformaprecisaycuantitativalacantidaddehierropresenteenunamuestra
a estudio. Son numerosos los estudios que emplean este tipo de cuantificación dada su
precisiónyfacilidad(Niedzielskietal.,2014).
Lareacciónmencionadaentreelcompuestodehierroyeliondeltiocianatoeslasiguiente:
𝐹𝑒IG 𝑎𝑐 + 𝑆𝐶𝑁M 𝑎𝑐 → 𝐹𝑒 𝑆𝐶𝑁 FG(𝑎𝑐)
Unproblemaadicionalquepuedesurgiralahoradecuantificarlapresenciademagnetita
endiferentesmuestraseslaproblemáticaasociadaasucarácterdivalenteytrivalente.Yaque
lamagnetitaestáformadatantoporionesdehierroFe2+comoFe3+,lacuantificaciónconKSCN
podría ser imprecisa. Por este motivo, se requiere de un agente oxidante con el fin de
desplazar todo el hierro divalente de lamagnetita a hierro trivalente. Son numerosos los
agentesoxidantesempleadosenlaliteraturaparalacuantificacióndelhierropero,losmás
19
empleados son el peróxido de hidrógeno y el permanganato, siendo el primero el más
adecuado(Martinsetal.,2005).
2𝐹𝑒FG + 𝐻F𝑂F + 2𝐻G → 2𝐹𝑒IG + 2𝐻F𝑂
Este método de cuantificación es el empleado para hallar la concentración de las
nanopartículasrecubiertasconPAA.Paraello,sedisuelvenlasnanopartículasdemagnetita
recubiertasconPAAenunasoluciónconácidoclorhídrico(HCl6M),agua(H2O)yperóxidode
hidrógeno al 0,75% (H2O2). Seguidamente, se realizan una serie de diluciones, las cuales
contienenvolúmenescrecientesdeFe3+enHCl2M.
Ladeterminacióndelaconcentracióndenanopartículaserealizamediantelamedidade
laabsorbanciaaunalongituddeondade474nmdelasmuestraspreparadasjuntoconun
volumenfijodeKSCN2M,elcualseañadejustoantesdemedir.
Acontinuación,apartirdelaleydeLambert-Beer,conociendoelcoeficientedeextinción
delcomplejo,expresadoenfuncióndeconcentracióndeFe3+enmg/ml(Fig.11)(ε=218,51
(mg/ml)-1·cm-1)sehallalaconcentracióndelasmuestrasmedidasenelespectrofotómetro.
Unavezconocidas lasconcentracionesdehierrodelasmuestrasmedidas,secalcula la
concentracióndemagnetitamedianterelacióndesusmasasmolares.
Figura11.DeterminacióndelcoeficientedeextincióndelcomplejoFe·(SCN)2+enmedioácidoaunalongituddeondade474nm.
y=218,51xR²=0,999
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
Absorbancia(@474nm)
[Fe3+](mg/mL)
20
3.5 AdsorcióndelisozimaalasNP-PAA.
ConelfindeconocercómosecomportanlasNP-PAAobtenidascomovehiculizadorasde
fármacos,seprocedearealizarunestudiotomandocomoreferencialaproteínalisozima.
ParaobservarelcomportamientodelasNP-PAAjuntoconlalisozimay,porúltimo,hallar
lacapacidaddeadsorciónmáxima, sepreparanunaseriede tubosconunaconcentración
crecientedenanopartícula(desde0hasta0,055mg/ml)yunaconcentraciónfijadeproteína
(0,3mg/ml).Además,lostubossemantienenaunpHde7,0debidoalaadicióndelbuffer
Hepes(10mMapH7,0).
Trasdejarlostubostodalanocheenagitaciónenunanoria,seseparanlasNP-PAAconun
imán y se cuantifica la lisozimaque queda en el sobrenadantemediante lamedida de su
espectro y cogiendo el valor de absorbancia a 280 nm. De este modo, mediante la
aproximacióndelaisotermadeLangmuir,sepuedehallarlacapacidadmáximadeadsorción
delaproteína(Qmáx),lacualsirvecomoreferenciaalahoraderealizarlosestudiosconlos
polímeros.
3.6 TratamientodelasNP-PAAconPEGdediferentespesosmoleculares,PVPyPVA.
UnavezrealizadoslosestudiosdeadsorcióndelasNP-PAAjuntoconlaproteínamodelo,
seprocedeacaracterizarlasNP-PAAquehansidotratadascondiferentespolímerosneutros
candidatosaevitarelfenómenodeopsonización.
Para ello, se preparan una serie de tubos en las que la concentración de NP-PAA y
polímeroescrecienteyconuna relaciónenmasa1:10, respectivamente (desde0a0,055
mg/mldenanopartícula).Porsuparte,laconcentracióndelisozimasemantieneconstanteen
0,5mg/mldurantetodoelexperimento.Además,graciasalaadicióndelbufferHepes(10mM
pH7.0),lostubosseencuentranencondicionesfisiológicas.
Para la realización del experimento, primeramente, se añaden todos los volúmenes
requeridosaexcepcióndelalisozima.Unavezpreparadoslostubossemantienendurante
unahoraenlanoriaparafavorecerlainteracciónentrelasNP-PAAyelpolímero.Pasadala
hora,seañadeelvolumenfaltantedelisozimaysemantienendurantetodalanocheenla
noriapara,finalmente,separarlostubosenelimánymedirelespectrodelalisozimapresente
enelsobrenadante,esdecir,lacantidaddeproteínanoadsorbidaporlasnanopartículas.
21
3.7 Medicióndeltamañoycargadelasnanopartículasobtenidas.
EltamañodelasNP-PAAsedeterminómediantedispersióndeluzdinámica(DLS,Dynamic
Light Scattering) en el instrumento Brookhaven Mod 90 Plus (New York, EE.UU.). Este
instrumento mide el diámetro hidrodinámico de las partículas esféricas a partir de la
dispersióndeluzyteniendoencuentalavelocidadalaquesedifundensegúnelmovimiento
browniano,movimientoaleatoriodelaspartículasdebidoalsolventeenelqueseencuentran.
Concretamente, para medir el tamaño de las partículas se requiere el coeficiente de
difusióntraslacional,halladoapartirdelaecuacióndeStokes-Einstein:
𝑑 𝐻 = 𝑘𝑇
3 · 𝜋 · η · D
dondedeseldiámetrohidrodinámico,Delcoeficientededifusióntranslacional,klaconstante
deBoltzmann,Tlatemperaturaabsolutayη,laviscosidad(DLStechnicalnote).
Conelmismoinstrumentotambiénsehallalacargadelasuperficiedelasnanopartículas,
apartirdelpotencialZ,elcualesunamedidadelamagnituddelarepulsiónoatracciónentre
partículas. La magnitud del potencial Z informa sobre la estabilidad del sistema coloidal.
Partículasensuspensiónconungranvalor (negativoopositivo)depotencialZ tenderána
repelersemientrasquepartículasconvaloresbajosdepotencialZacabaránagregando.
ExistendiversosfactoresqueafectanalpotencialZcomoeselpH,laconductividadyla
concentracióndeloscomponentesaestudio(DLStechnicalnote).
TantolamedidadeltamañocomodelacargaporDLSrequierequelasmuestrasestén
diluidas,locualesunadesventajadelatécnica(BhattacharjeeS.,2016).
3.8 InfluenciadelacantidaddepolímeroneutrosobrelasNP-PAAtratadasconPEG400.
Elexperimentopartedelapreparacióndeunstockconconcentracionesde0,1mg/mly
100mMdeNaClconstantesmientrasquesevaríalaconcentracióndelPEG400(desde0hasta
1 mg/ml). A continuación, se disponen los tubos preparados en el imán y se mide el
sobrenadantecadacincominutosaunalongituddeondade440nm.
4. RESULTADOS
Tras emplear el método de coprecipitación para sintetizar magnetita, se obtiene una
concentraciónde14,86mg/mldeterminadamedianteresiduoseco.Estamagnetita,comose
22
ha comentado, apH cercanosa supI (6,5)noesestable coloidalmente y tiendea formar
agregadosporloquelacaracterizaciónporDLSnoesposible.LapresenciadelPAAdotade
cargaalasnanopartículasy,deestemodo,semantienenestablescoloidalmente,obteniendo
unaconcentraciónparanuestrostockde5,5mg/mldeterminadamediantelaformacióndel
complejoFe(SCN)2+.LaposteriorcaracterizaciónmedianteDLSindicaqueapH7presentan
untamañode92,3±0,9nmyunacargade-17,0±1,9mV,confirmandoqueelrecubrimiento
hasidoeficazdadoeltamañoquepresentanylacarga(apH7lasnanopartículassinrecubrir
poseenuntamañomicrométricodebidoalaagregación).
4.1 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAA.
Medianteelempleode laaproximaciónde la isotermadeLangmuiren lascondiciones
descritasenmaterialesymétodosesposibledeterminarlacapacidadmáximadeadsorción
de la lisozima. En la Fig.12 se representa la concentración de lisozima que queda en el
sobrenadantetrashaberdecantadomagnéticamentelasnanopartículasmedianteuncampo
magnéticoexternofrentealaconcentracióndenanopartículaquehabíainicialmenteenel
medio. A medida que aumenta la concentración de nanopartícula, la concentración de
lisozima disminuye en el sobrenadante, obteniendo una recta cuya pendiente podemos
relacionarconlacapacidadmáximadeadsorción.
ElvalordeQmáxobtenidoparalasNP-PAAdeesde2,10mgdelisozima/mgdenanopartícula.
ObtenidalacapacidadmáximadeadsorcióndeLzmporpartedelasNP-PAA,tratamoslas
nanopartículascondistintospolímerosneutros,ydeterminamossucapacidaddeadsorción.
y= -2,10x+0,30R²=0,970
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
Figura12.Determinaciónde lacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAA.
23
A partir de estemomento, en todas las gráficas siguientes donde se estudia la capacidad
máxima de adsorción se representa la concentración de lisozima que queda en el
sobrenadantetrashaberdecantadomagnéticamentelasnanopartículasmedianteuncampo
magnético externo frente a la concentración de nanopartícula (NP-PAA tratadas con el
polímeroneutroqueseindica)quehabíainicialmenteenelmedio.
4.2 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares.
ConelusodePEGdediferentespesosmolecularessepretendeestudiarsiseproducen
cambios, tanto positivos como negativos en cuanto a su capacidad para disminuir la
opsonización,ydehaberlossiexisteunacorrelaciónconlavariacióndesupesomolecular.
- PEG400g/mol
UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde400obtenemosuntamañode94,1±1,9nmy
unacargade-21,9±1,6mVmediantemedidasdeDLSyPZ.
Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de
adsorciónesde2,68mg/ml(Fig.13).
ParaconocersiunaumentodeconcentracióndePEG400conllevaunaagregacióny,por
tanto,unefectoenlaestabilidadcoloidal,serealizaunexperimentoconcantidadescrecientes
deéste,enpresenciade100mMdeNaCl,condicionesenlascualeslasNPtiendenaagregar
debidoalapantallamientodelascargasquepresenta(Fig.14).Enestagráficaserepresentala
densidadópticadelsobrenadantetrashaberincubadolasnanopartículasenlascondiciones
y=-2,68x+0,50R²=0,940
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
Figura13.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde400g/mol.
24
anteriormente indicadas (materiales ymétodos) y ser sometidas a una fuerzamagnética
externa,frentealtiempo.
Tras una hora de incubación, se observa que la cantidad de PEG no afecta
significativamente a la estabilidad coloidal de las nanopartículas, recuperando
aproximadamenteel80%delasnanopartículasiniciales.
- PEG4000g/mol
UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde4000obtenemosuntamañode95,5±0,5nmy
unacargade-22,6±1,1mVmediantemedidasdeDLSyPZ.
Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de
adsorciónesde2,27mg/ml(Fig.15).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40 50 60 70
Abs(@440nm
)
Tiempo(min)
NP-PAA
NP-PEG400:0,55mg/ml
NP-PEG400:1mg/ml
Figura 14. Variación de la estabilidad coloidal de las NP-PAA tratadas con PEG 400mediantemedidadedispersiónópticaa440nmfrentealtiempo.
25
- PEG35000g/mol
UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde35000obtenemosuntamañode98,5±0,2nm,y
unacargade-17,9±0,2mV.
Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de
adsorciónesde1,56mg/ml(Fig.16).
y=-2,27x+0,50R²=0,980
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
y= -1,56x+0,50R²=0,840
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
Figura15.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde4000g/mol.
Figura16.Determinaciónde lacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde35000g/mol.
26
4.3 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVP.
TrastratarlasNP-PAAconPVPobtenemosuntamañode100,7±1,1nm,yunacargade-
12,1±1,2mVmediantemedidasdeDLSyPZ.
Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de
adsorciónesde1,55mg/ml(Fig.17).
4.4 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVA.
TrastratarlasNP-PAAconPVAobtenemosuntamañode101,7±0,5nm,yunacargade-
18,8±1,3mVmediantemedidasdeDLSyPZ.
Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de
adsorciónesde5,13mg/ml(Fig.18).
y= -1,55x+0,50R²=0,800
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
Figura17.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPVP.
27
5. DISCUSIÓN
Lasíntesisdenanopartículasdemagnetitamedianteelmétododecoprecipitaciónesun
buenmétodopara suobtenciónyaqueel comportamientoquepresentanesel esperado
(magnetismo,bajaestabilidadapHfisiológico…).
TrasrecubrirlasnanopartículasdemagnetitaconunpolielectrolitoaniónicocomoelPAA,
lasnanopartículasaumentansuestabilidadcoloidal(vertamañoycargaenTabla1),siendo
unbuencandidatoparaestabilizarlas,yaqueademásdepresentaraltadensidaddecarga,sus
gruposcarboxilatoseunendeformamuyefectivaalasuperficiedelananopartículadadosu
capacidadquelantehacialosmetales,enestecasohaciaelhierro.
UnavezcaracterizadaslasNP-PAAdeterminamoslacapacidaddeadsorciónquetienen
cuandoenelmedioenelqueseencuentranhaypresenteunaproteína,comoeslalisozima,
la cual a pH 7 posee carga neta positiva. Debido a la alta densidad de carga que el
polielectrolitoexponehaciaelmedio,esperamosquelacapacidaddeadsorciónseaelevada,
yaqueelnúmerodecontactosconrespectoalapartículadesnuda(inestable)haaumentado.
Trasrealizarelestudiodesucapacidaddeadsorciónmediantelaaproximacióndelaisoterma
deLangmuir,obtenemosunacapacidaddeadsorciónde2,10mgLzm/mgNP-PAA,loquenos
indicaquelaNP-PAAescapazdeadsorbereldobledesumasa.
Sintetizarunasnanopartículasconaltacapacidaddeadsorción,puedesercontradictorio
paraelobjetivoqueplanteamos,yaquesilacapacidaddeadsorcióneselevada,elfenómeno
deopsonización se verá favorecido, pero a su vez, permitiría administrar una cantidadde
y= -5,13x+0,50R²=0,900
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
[Liso
zima](m
g/ml)
[NPs](mg/ml)
Figura18.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPVA.
28
nanopartículamásreducidatransportandolamismacantidaddefármaco,siempreycuando
hayamossidocapacesdereducirdichofenómeno.
Paraintentarreducirlohacemosusodepolímerosneutros,deloscualesalgunosdeellos
yahansidoutilizadospararecubrirNPdemagnetita“desnudas”ysehavistoquereducenla
opsonización(Owensetal.,2006).
Los polímeros elegidos para tratar nuestras partículas recubiertas de PAA e intentar
reducirlaopsonizaciónhansido;polietilenglicol(PEG)dedistintopesomolecular(400,4000y
35000g/mol),polivinilalcohol(PVA),ypolivinilpirrolidona(PVP).Lacaracterizaciónobtenida
medianteDLSdelasdiferentesNP-PAAtratadascondiferentespolímerosneutrosrevelanlos
siguientesresultados(Tabla1).
Muestra Tamaño(nm) PotencialZ(mV)
NP-PAA(Control) 92,3±0,9 -17,0±1,9
NP-PEG400 94,1±1,9 -21,9±1,6
NP-PEG4000 95,5±0,5 -22,6±1,1
NP-PEG35000 98,5±0,20 -17,9±0,9
NP-PVP 100,7±1,1 -12,1±1,2
NP-PVA 101,7±0,5 -18,8±1,3
Una posible consecuencia del recubrimiento de las nanopartículas magnéticas con
polímeroseslaalteracióndeltamañoysuscaracterísticas(pérdidadelacapacidadmagnética,
aumentodelcomportamientocoloidal,agregación…).Sinembargo,comosepuedeobservar,
eltamañodelasNP-PAAtratadasconlosdiferentespolímerosneutrossemantienecercano
alos90-100nm,pudiendoatribuirestadiferenciadetamañoalposible“recubrimiento”de
lasNP-PAAporpartedelospolímerosneutros.Sinembargo,lacargadelasNP-PAAtratadas,
no parece tener una tendencia, siendo todas negativas, lo que parecería indicar que si el
polímeroneutroestá “recubriendo” lapartícula lopodríahacerde forma localizada sobre
distintospuntosdelasuperficie,perodejandoexpuestaslamayoríadesuscargasnegativas.
Tabla1.ComparativadetamañosycargadeNP-PAAyNP-PAAtratadascondistintospolímerosneutros.
29
TomandocomoreferenciaelvalordeQmáxparalasNP-PAA(2,10mgLzm/mgNP-PAA),y
tratandoestasNP-PAAconpolímerosneutrosveremossicambialacapacidaddeadsorción
sobrelaproteínaindicandoportantosielpolímeroeseficazparadisminuirelfenómenode
opsonización,osiporelcontrarioloaumenta.
5.1 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares.
Encuantoa sucomportamientoenpresenciadeconcentracionesaltasdePEG400, se
puede observar que la estabilidad de la nanopartícula es prácticamente la misma que el
control(NP-PAA).Portanto,a100mMdeNaCl,lasNP-PAAtratadascondistintascantidades
dePEG400mantienensuestabilidadcoloidal.
ParadiscutirsobrelacapacidaddeadsorcióndecadaNP-PAAtratadasconestepolímero
recogemoslasQmáxenunatabla(Tabla2).
Muestra Qmáx(mgLzm/mgNP-PAA)
NP-PAA(Control) 2,10
NP-PEG400 2,68
NP-PEG4000 2,27
NP-PEG35000 1,56
LosresultadosobtenidosindicaríanqueelPEGde400g/molpareceríaaumentarun28%
lacapacidaddeadsorciónde lananopartícula,con locualnoseríaelmejorpolímeropara
tratarlasuperficie,yevitarlaopsonización.Amedidaqueaumentamoselpesomoleculardel
PEG vemos que la capacidad de adsorción con respecto al de menor peso molecular
disminuye,siendoprácticamentelamismaquelasNP-PAAsintratarcuandousamoselPEG
de4000,peroalrededordeun26%menorconelusodePEGde35000.Estopodríadebersea
que a medida que aumenta el número de monómeros de polímero la NP-PAA podría
encontrarse más “solvatada” por estos, haciendo disminuir su capacidad de adsorber la
lisozima.
LosresultadosobtenidostrasrealizarlacaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEG
dediferentespesosmolecularespareceríanindicarqueelpolímeroquemayorefectotendría
Tabla2.ComparativadelacapacidaddeadsorcióndeLzmparaNP-PAAyNP-PAAtratadasconPEGdedistintopesomolecular.
30
sobrelainhibicióndelaopsonizaciónseríaelPEGde35000g/mol.Estodeberíaestudiarse
másafondoutilizandocantidadesmayoresdePEGparaconfirmarsisupresenciaevitacasi,
oporcompleto,laadsorcióndelaLzm.
5.2 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconotrospolímerosneutros:PVPyPVA.
EmpleandootrospolímerosneutroscomolaPVPoelPVA,losresultadosindicanquela
presenciadeestospolímerosafectadeformadiferentealaQmáx(Tabla3).
Muestra Qmáx(mgLzm/mgNP-PAA)
NP-PAA(Control) 2,10
NP-PVP 1,55
NP-PVA 5,13
Encuantoa los resultadosobtenidoscon laPVP, seobtienenvalores semejantesa los
obtenidosconelPEGdemayorpesomolecular.Estosresultadosindicaríanqueestetipode
polímero,inhibiríaelfenómenodeopsonizaciónalrededordeun26%,porloqueseríaotro
candidatoparahacerunestudiomásexhaustivoempleandocantidadesmayoresdepolímero
yversilareduccióndelacapacidaddeadsorciónescasitotaloprácticamentetotal.
Por otro lado los resultados obtenidos con el recubrimiento con PVA indican que la
capacidad de adsorción aumenta un 144% con respecto a laNP-PAA, por lo que sería un
polímeroinadecuadoparaelobjetivoquesehaplanteadoenestetrabajo.Porotrolado,se
abriríalaposibilidaddeutilizarlasNP-PAAtratadasparaotrasaplicacionesdondeserequiera
deunamayorcapacidaddeadsorción.
6. CONCLUSIONESYPROYECCIÓNFUTURA
CONCLUSIONES:
Lasíntesisdenanopartículasdemagnetitamedianteelmétododecoprecipitaciónysu
posteriorrecubrimientoconPAAenlascondicionesanteriormentedescritas,resultaseruna
buena estrategia para obtener nanopartículas con una elevada estabilidad coloidal y un
diámetrodealrededorde100nm.
Tabla3.ComparativadelacapacidaddeadsorcióndeLzmparaNP-PAAyNP-PAAtratadasconPVPyPVA.
31
LasNP-PAAdemuestran tenerunaelevada capacidaddeadsorción, siendocapacesde
adsorberalrededorde2gdelisozimaporgramodemagnetita.
LasNP-PAAtratadascondistintospolímerosneutros(PEG,PVA,PVP)noparecenafectar
aldiámetrohidrodinámicoycargadelananopartículay,comoconsecuencia,presentanuna
estabilidadcoloidalsimilaralaqueescaracterísticadelasnanopartículasnotratadas.
La presencia en la disolución de polímeros neutros como el PEG 400 o el PVA parece
aumentar lacapacidaddeadsorciónde lasnanopartículasrecubiertasconPAA,por loque
tienenunefectocontrarioalbuscado(inhibiciónparcialdelaadsorciónproteica)aumentando
portantoelfenómenodeopsonización.
Porsuparte,lapresenciadePEG4000parecetenerunefectoneutroenloqueserefiere
alacapacidaddeadsorcióndelasnanopartículasrecubiertas,NP-PAA.
Porúltimo,tantoelPEG35000comoelPVPdemuestrantenerunciertoefectoinhibitorio
delaadsorcióndelisozimaalasnanopartículasrecubiertas,reduciendoalrededordeun26%
la cantidad de proteína adsorbida por lo que ambos polímeros neutros podrían ser dos
candidatosparareducirelfenómenodeopsonización.
PROYECCIÓNFUTURA:
Traslarealizaciónyconclusióndeestetrabajo,surgeunabanicodeposiblesproyecciones
futurasaabordar.
- EncontramosresultadospositivostantoconlaPVPcomoconPEGde35000cuando
trabajamos en relaciones 1:10 en masa de NP-PAA:polímero neutro. Podríamos
plantearsistemasenelque larelacióndepolímero/nanopartícula fuesemayora la
estudiadaenestetrabajo,paraconfirmarquesepuedereduciraúnmáslacapacidad
deadsorcióndelananopartículatratada.
- Dado que con el PEG se han obtenido resultados positivos, la búsqueda y
caracterizacióndelPEGdepesomolecularóptimopodríaserunfuturoabordajepara
nuevosestudios.Eneste trabajo sehaestudiadoelPEGde trespesosmoleculares
diferentes (400, 4000 y 35000 g/mol, respectivamente) obteniendo resultados con
sutiles diferencias, siendo el PEG 35000 el recubrimiento con el que se obtienen
resultadosmásprometedores.Portanto,estudiosmáscentradosenestetipodePEG
podríanserclavesalahoradeobtenerunrecubrimientoóptimodeNP-PAAconfines
32
biomédicos.También,tomandocomobaselaidoneidaddelPEG,sepodríanrealizar
estudios con copolímeros de PEG como los polisorbatos, los poloxámeros o las
poloxaminas.
- Otra posibilidad que surge tras la finalización de este trabajo es la realización de
estudios similares empleando otro tipo de polímeros neutros como agentes de
recubrimiento encontrados en la literatura tales como el ficol, la poliacrilamida o
diversospolisacáridos.UnejemploquedareflejadoenlareviewrealizadaporColeet
al(Coleetal.,2011)(Fig.19).
- Otra propuesta interesante es lamodificación de la superficie de la nanopartícula
empleandootrotipodeestrategia.LosestudiosrealizadosporVeisehetal(Veisehet
al.,2010)recopilanlasprincipalesestrategiasparamodificarlasuperficiedelasNP-
PAA incluyendo la conjugación directa o mediada por un “linker” así como la
modificación de la superficiemediante interacciones físicas como las hidrofóbicas,
electrostáticas o de afinidad por ligando. Por tanto, siguiendo elmismo protocolo
realizadoenestetrabajooempleandootratécnicaparamodificarlasnanopartículas,
se pueden ampliar los resultados y las posibilidades de obtener un recubrimiento
acordealobjetivoplanteado.
Figura 19. Posibles recubrimientos poliméricos de nanopartículas magnéticas.(Coleetal.,2011)
33
Es de destacar la posible futura aplicabilidad de las NP-PAA tratadas con PVA, ya que
podríasermuyútilparaaplicacionesdondelacapacidaddeadsorcióndeproteína,partiendo
delamismaNP-PAAfuesenmayores.
Por último, los resultados obtenidos en la realización de este trabajo refuerzan la
necesidadderealizarestudiosposterioresconelfindeobtenerresultadostotalmenteacordes
alobjetivopreviamenteplanteado.
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