UNIVERSIDAD DE SONORA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICOS

*AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE ENTEROBACTERIAS: E. COLI Y

ENTEROBACTER.*

ALUMNO:

GRIJALVA MATUS JESÚS ADAN

LUNES 14 DE MARZO DEL 2005.

E.M.B. Agar

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Fórmula (en gramos por litro)

  Peptona  10.0

  Lactosa 5.0

  Sacarosa 5.0

  Fosfato dipotásico 2.0

  Agar 13.5

  Eosina 0.4

  Azul de metileno 0.065

  pH final: 7.2 ± 0.2

Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.

Incubación De 24 a 48 horas a 35°C

Interpretación de resultados

   Microorganismos  Tipo de Colonia

  Escherichia coli Verdosas con brillo metálico y

centro negro azulado

  Enterobacter, Klebsiella spp.

Mucosas, rosadas, confluentes

  Proteus, Salmonella, Shigella

Incoloras

 EnterococcusIncoloras, pequeñas, puntiformes

 Candida spp.

Incoloras o rosadas, secas, puntiformes

 Acinetobacter sppAzul lavanda, pequeñas a medianas.

Características del medioMedio preparado: verde con matiz naranja, puede tener un ligero precipitado. Placas preparadas: púrpura anaranjado verdoso.

Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento

La mezcla de sales biliares y el cristal violeta inhiben gran parte de la flora Gram positiva. Las colonias lactosa positivas son rojas debido a la caída de pH que produce la absorción del rojo neutro con un halo turbio debido al precipitado de las sales biliares. Las colonias lactosa negativas son incoloras. Este medio corresponde a la fórmula recomendada por la APHA para la siembra directa en placas de muestras de agua para el recuento de coliformes. Además es usado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella en variedad de muestras clínicas. La siembra en medio Mac Conkey permite además, diferenciar bacilos Gram negativos facultativos u oxidativos de difícil desarrollo (Haemophilus, Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, etc.).

Fórmula (en gramos por litro)

  Peptona 17.0

  Pluripeptona 3.0

  Lactosa 10.0

  Mezcla de sales biliares 1.5

  Cloruro de sodio 5.0

  Agar 13.5

  Rojo neutro 0.03

  Cristal violeta 0.001

  pH final: 7.1 ± 0.2Instrucciones Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Interpretación de resultados

Microorganismos Colonias

Escherichia coliRojas con halo turbio

Klebsiella spp., Enterobacter spp.

Rosadas mucosas

Salmonella spp., Shigella spp.

Incoloras, transparentes

Proteus spp. Enterococcus spp.

Diminutas, opacas

Características del medio Medio preparado: rojo púrpura

AGAR ENDO

USOSe utiliza para la comprobación de la prueba presuntiva para organismos miembros del grupo coniforme.

FUNDAMENTOEndo en un tiempo describió un medio utilizando un indicador de sulfito de fucsina para diferenciar organismos fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa del aparato intestinal. En las placas de este medio en la que se a decolorado la fucsina mediante sulfito de sodio, salmonellas y otros organismos no fermentadores aparecen como gotas, trasparentes, incoloras y brillantes contra el fondo de color rosa pálido del medio. Los organismos coniformes proporcionan colonias rijas y colorean el medio circundante. las reacciones típicas de este medio no ocasionadas por la producción de ácido sino por el producto intermedio.

Formula:

Peptona 10gLactosa 10gFosfato di potásico 3.5gAgar 15gFucsina básica .5gSulfito sodico 2.5g

PH final 7.5 +/- 0.2 a 25 °c.

ALMACENAMIENTO

Por debajo de 30°c.Medio preparado de 2 a 8 °c.

RESULTADO

Después de 24 hr +/- 2hr a 35°c.

Organismos Recuperación Color de la coloniaEnterobacter aerogenes De buena a excelente RojaE. coli De buena a excelente Rojo con brillo metálicoSalmonella tifis De buena a excelente IncoloraShigella De buena a excelente incolora

PRUEBAS DEL IMVIC

INDOL

Principio

Se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehido de p-dimetilaminobenzaldehido, esta es la sustancia activa en los reactivos de kovac y Ehrlich , debe usarse un medio rico en triptofano.

Medio y reactivos

Caldo de triptofano (1%)Peptona o tripticasa 2gCloruro de sodio 0.5g Agua destilada 100mlREACTIVO DE KOVACAlcohol amilico o isoamilico puro 150mlP-dimetilaminobenzaldehido 10gHCl conc. 50mlREACTIVO DE EHRLICHP-dimetilaminobenzaldehido 2gAlcohol etilico absoluto 190mlHCl conc. 40ml

PROCEDIMIENTO

Se inocula caldo de triptofano con el organismo en estudio y se incuba 35°c durante 18 a 24 hr. Después se agregan 15 gotas del reactivo y se dejan resbalar por la pared interna del tubo. Si se usa el reactivo de EHRLICH este paso debe ser precedido por el agregado de un ml de cloroformo.

INTERPRETACION

La aparición del color rosa fucsia en la interfase del reactivo y el caldo pocos segundos después de haber agregado el reactivo es indicativa de la presencia de indol y constituye una prueba positiva

PRECAUCIONES

*no debe emplearse para la detección del indol un medio de peptona que contenga glucosa. La fermentación del indol se produce solo en aquellos organismos de fermentar hidratos de carbono. Los organismos que utilizan hidratos de carbono por un proceso oxidativo son incapaces de producir indol, la elevada acidez producida por la fermentación de la glucosa puede inhibir el crecimiento del organismo y de la enzima.

*algunos microorganismos producen indol pero lo descomponen con la misma rapidez con la que es producido, por lo que puede producirse una reacción falsamente negativa.

* el ph optimo para la triptofanasa es ligeramente alcalino(PH 7.4 a 7.8) la disminución de ph provoca una reducción en la producción de indol. Y un posible falso negativo.

*los cultivos que se van a someter alas pruebas de producción de indol deben ser incubados aeróbicamente, el descenso de la tensión del oxigeno disminuye la producción de indol

ROJO DE METILO

PRINCIPIOEsta prueba es una prueba cuantitativa de la producción de ácidos que requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, formico) a partir de la glucosa a través de la vía de fermentación de ácidos mixtos.

MEDIOS Y REACTIVOS

El medio que se emplea con más frecuencia es el caldo rojo de metilo-voges proskauer

Peptona 7gGlucosa 5gFosfato dipotasico 5gAgua destilada 1li

Ph final 6.9

Indicador de ph rojo de metiloRojo de metilo, 0.1 g en 300ml de alcohol etilico 95%Agua destilada, 200 ml.

PROCEDIMIENTOSe inocula el caldo MR/VP con un cultivo puro de microorganismo en estudio, se incuba en caldo a 35°c durante 48 a 52 HR (no menos de 48 hr), al terminar ese lapso se agregan 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.

INTERPRETACIONLa aparición de un color rojo estable en la superficie del medio indica suficiente producción de ácido para reducir el ph a 4.4 y constituye una prueba positiva. Lado que otros microorganismos pueden producir menores cantidades de ácido a partir del sustrato de la prueba, es posible que aparezca un color anaranjado intermedio entre amarillo y rojo. Esto indica prueba positiva.

PRECAUCIONES

*la peptona que se encuentra en el medio puede afectar los resultados del rojo de metilo

* la reacción del rojo de metilo no puede acelerarse aumentando la concentración de glucosa en el medio*no debe intentarse interpretar un resultado de rojo de metilo después de 48 hr de incubación. Si se realiza la prueba demasiado pronto los resultados pueden ser equívocos o falsamente positivo dado que los organismos RM negativos no habrán tenido suficiente tiempo para metabolizar por completo los productos ácidos iniciales acumulados por la fermentación de la glucosa. Después de solo 18 a 24 horas son los resultados positivos de la prueba.

*evitar la prueba con una mezcla caldo inoculo demasiado turbia; el crecimiento bacteriano es inhibido si el inoculo excede la concentración celular máxima de alrededor de 10 a la 9 células viables por ml. Con cada disminución logarítmica del tamaño del inoculo hay un aumento en el tiempo necesario para que los organismos RM positivos acumulen suficientes productos ácidos como para superar el sistema amortiguador.

VOGES-PROSKAUER

PRINCIPIOEl ácido piruvico , un compuesto fundamental formado por la degradación de la glucosa, es metabolizado aun mas a través de cierto numero de vías metabólicas, según los sistemas enzimáticos de las diferentes bacterias.una de estas vías da como resultado la producción de acetoina (acetil metil- carbinol) un producto final

de reacción neutra. En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40% , la acetoina es convertida en diacetilo y el alfa-naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.

MEDIOS Y REACTIVOS

El medio es un caldo MR/PV

Reactivos Alfa naftol (5%) 5gAlcohol etílico absoluto 100mlHidróxido de potasio 40gAgua destilada 100ml

PROCEDIMIENTO

Se inocula un caldo MR/VP Con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Se incuba durante 24 horas a 35°c . Luego de este lapso se pasa una alicota de un ml del caldo a un tubo de prueba limpio. Se agregan 0.6 ml de alfa-naftol al 5%, seguidos por 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos que se agreguen en este orden. el tubo se sacude suavemente para exponer el medio a oxigeno atmosférico; luego se deja quieto durante 10 a 15 minutos.

INTERPRETACIONUna prueba positiva esta representada por la aparicion de un color rojo 15min o mas después del agregado de los reactivos,lo que indica la presencia de diacetil, el producto de oxidación de acetoina. La prueba no debe leerse después de una hora porque cultivos negativos deben producir un color simil cobre, lo que daria como resultados una interpretación falso positivo.

PRECAUCIONES

A veces un organismo acetoina positivo conocido no da una reacción no da una reacción de vp negativo. Para superar esta posibilidad, calentar suavemente el cultivo que contiene los reactivos vp. un reactivo vp positivo mostrara una reacción positiva (color rojo) mientras que los que no producen acetoina se mantendrán negativos (color amarillo).

Todos lo miembros de la familia enterobacteriaceae son capaces de producir acetoina partir de glucosa. Pero no todas las cepas son capaces de fermentar acetoina.

Las pruebas del rojo de metilo y de vp no ofrecen confianza como único medio necesario para diferenciar la E. coli de los grupos klepsiella- enterobacter en la identificación de rutina o en el análisis de agua. Deben realizarse pruebas de citrato y del indol junto con las reacciones RM/VP. Existe la posibilidad de que se destruya la acetoina. Invalidando así estas dos reacciones para fin de identificarlos.

Muchas personas tienen la errónea impresión de que un organismo que es vp positivo es automáticamente RM positivo o viceversa. Es cierto que la mayoría de los miembros de las enterobacteriaceae dan reacciones opuestas(un aumento en la alcalinidad produce un resultado RM negativo y VP positivo con producción de acetoina) pero algunos organismos como el enterobacter hafniae y el proteus mirabilis pueden dar tanto una reacción RM positiva como VP positiva, aunque esta ultima es retardada.

PRUEBA DEL CITRATO

Principio

La utilización de citrato se detecta en un medio con citrato por la producción de intermediarios alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anion , como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que utilizan citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio con la producción de amoniaco llevando a la alcalinización del medio a partir de la conversión de amoniaco en hidróxido de amonio. El indicador es azul de bromotimol, que es amarillo y con un ph menor de 6 y azul con un ph arriba de 7.6.

Medios y reactivos

El medio con citrato que se utiliza con mas frecuencia es la formula de simmons. El medio se vuelca en un tubo formando un pico de flauta, la formula del medio Simmons es:

Fosfatomonoamonico 1g

Fosfato dipotasico 1g

Cloruro de sodio 5g

Citrato de sodio 2g

Sulfato de magnesio 0.20g

Agar 15g

Azul de bromotimol 0.80g

Agua destilada 1lt

pH final 6.9

Procedimiento

Se toma una colonia bien aislada de la superficie del medio de aislamiento primario y se inocula con una estría única en al superficie de pico de flauta. El tubo se incuba a 35°c durante 24 a 48 hr.

Precauciones

Interpretación

Una prueba positiva esta presentada por la aparición de un color azul oscuro en 24 a 48 hr, lo que indica que el microorganismo en estudio a sido capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, con la producción de productos alcalinos. Una prueba también puede ser positiva en ausencia del color azul si hay un crecimiento de colonias visible a lo largo de la línea de inoculación. Esto es posible, por que para que el crecimiento sea visible, el microorganismo debe de ingresar a la base de crecimiento exponencial posible solo si ha asimilado carbono e hidrogeno.

Puede haber variaciones en el color de una prueba citrato positiva, debido a la diferencia de los lotes indicadores de ph que se encuentran en el mercado.

Si se usa un inoculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta, puede obtenerse en este un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de mas abajo. Sin embargo esto no significa una reacción positiva, también un inoculo espeso puede dar una reacción falsa positiva.

Después de 24hr de incubación, un organismo citrato positivo puede mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en el pico de flauta, si se tienen dudas en la interpretación, compararlo con un tubo de citrato no inoculado. Algunos organismos citrato positivos necesitan la incubación durante 48 hr o mas para que se produzca el cambio de ph

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DEL IMVIC.

PRUEBA DEL ONPG

Principio

Las bacterias que fermentan lactosa poseen lactosa permeasa y b-galactosidasa, dos enzimas necesarias para la producción de ácidos en la prueba de fermentación de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la célula bacteriana, donde la b galactosidasa puede clivar la unión galactosido, produciendo glucosa y galactosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de permeasa pero si poseen beta galactosidasaY dan la prueba ONPG positiva. Los denominados fermentadores tardíos de lactosa pueden demorarse en producir ácidos a partir de lactosa debido a una actividad de permeasa lenta.

Medio y reactivos

Fosfato de sodio, buffer 1M. ph 7O-fenil-b-galactosido (ONPG), 0.75 MSolución fisiológicaTolueno

Procedimiento

Las bacterias que han crecido en un medio con lactosa, como agar hierro de klinger (KIA) o agar hierro triple azúcar (TSI), producen resultados óptimos en la prueba de ONPG. Un asa de crecimiento bacteriano que emulsiona en 0.5 ml de solución fisiológica y se mezcla enérgicamente durante unos segundos para liberar la enzima. Se agrega una cantidad igual de de solución de ONPG amortiguada a la suspensión y la mezcla se coloca en el baño de agua a 37°c..

Precauciones

En cualquiera de los métodos es necesario un inoculo espeso para obtener una alta concentración de enzima, si esta se encuentra presente y aumentar la velocidad de una reacción positiva.

Antes de su empleo, deben colocarse la solución o caldo de ONPG en un baño de agua de 37°c para redisolver el fosfato que se crea durante su conservación.

Interpretación

la tasa de hidrólisis de ONPG a ortonitrofenol puede ser rápida para algunos microorganismos, produciendo un color amarillo visible en 5 a 10 minutos, muchas pruebas son positivas en una hora; sin embargo las reacciones no deben interpretarse como negativas hasta después de 24 hr de incubación. El color amarillo por lo común es evidente e indica que el microorganismo ha producido orto nitrofenol partir de ONPG a través de la acción de la betagalactosidasa.

Si la solución de ONPG no esta convenientemente amortiguada puede producirse resultados falsamente negativos o falsamente positivos. Pueden producirse un resultado falsamente negativo (incoloro) si la solución es ácida. El ortonitrofenol liberado es un ácido débil y su tautomero bencenoide ácido casi incoloro. Por lo tanto la determinación de ortonitrofenil liberado debe hacerse en alguna de estas dos condiciones:1) una solución bien amortiguada , ph 7 a 7.5 con lo cual se disocia una proporción fija produciendo un color amarillo, o 2) con un ph fuertemente alcalino, de 10 o mas , en el cual una porción insignificante queda sin disociarse e incolora.

La solución de ONPG, preparada debe ser incolora antes de su empleo para la determinación de la actividad enzimatica. en el caldo de ONPG, la misma peptona debe impartir un color amarillo a la suspensión célula caldo cuando solo se encuentra en una concentración de 1 %. Una reacción es capaz de variar en la intensidad del color amarillo producido, por lo tanto se aconseja efectuar simultáneamente un control negativo cuando se usa la suspensión célula caldo ONPG.

BIBLIOGRAFIA

www.britanialab.com _agar EMB y Mac Conkey

Diagnostico Microbiológicos; texto y atlas, Elmer Koneman, 3ra edición, paginas 257-261.

Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, J. F. Mac Faddin , paginas: 45,78,104,134,190.

Manual Difco , pagina: 337-339

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