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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (VIH-1) POR

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

ELABORACION:

Ada Valverde Rojas Licenciada en Tecnología Médica

Laboratorio en "Enfermedades de Transmisión Sexual y Chlamydias Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública Instituto Nacional de Salud

Soledad Romero Ruiz Microbióloga

Laboratorio en Enfermedades de Transmisión Sexual y Chlamydias Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública

Instituto Nacional de Salud

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ISBN: 9972-857-12-3 ISSN: 1607-4904 Hecho el deposito legal: 15011052001-3199 Ministerio se salud 2001 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús Maria, Lima, Peru Telf. 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2001 Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús Maria,Lima,11, Telf: 471-9920, Fax. 471-01 e-mail: posmaster@ins.sld.pe Pagina web: www.ins.sld.pe

Esta publicación fue realizada gracias al apoyo financiero del Proyecto “Enfrentando las Amenazas de las Enfermedades Infecciosas Emergentes y Remergentes” (Convenio de Cooperación entre el Ministerio de Salud del Peru y La Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional, USAID.

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CONTENIDO

CONTENIDO 6

INTRODUCCIÓN 8 VIRUS VIH 9 SECCION 1 GENERALIDADES 10 1.1 OBJETIVO 10 1.2 CAMPO DE APLICACIÓN 10 1.3 RESPONSABILIDADES 10 1.4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 10 SECCION 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 11 2.1 DISPOSICIONES 11 2.2 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 12 2.3 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL TRANSPORTE 13 SECCION 3 OBTENCIÓN DE MUESTRAS 13 3.1 OBJETIVO 13 3.2 CAMPO DE APLICACIÓN 13 3.3 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 13 3.4 PROCEDIMIENTO 14 3.5 OBTENCIÓN DEL SUERO O PLASMA 14 SECCION 4 CONSERVACIÓN, EMBALAJE, TRANSPORTE Y REMISIÓN DE MUESTRAS 15 4.1 CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA 15 4.2 EMBALAJE 15 4.3 REMISIÓN 16 SECCION 5 ENSAYO O ANÁLISIS EN LABORATORIO 17 5.1 RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO 17 5.2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO 18 5.3 EXAMEN DE LA MUESTRA 18 SECCION 6 DETERMINACIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DEL CONJUGADO

ANTI-INMUNOGLOBULlNA HUMANA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH MEDIANTE IFI 18

6.1 OBJETIVO 18 6.2 MATERIALES 19 6.3 PROCEDIMIENTO 20 6.4 INTERPRETACION DE RESULTADOS 20 6.5 PROBLEMAS EN LA DETERMINACIÓN DE LA DILUCION ÓPTIMA 20

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6.6 PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA 22 SECCION 7 TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA LA

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH (IFI-VIH) 23 7.1 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO 23 7.2 ESQUEMA Y SIMBOLOGÍA 23 7.3 FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA 24 7.4 MATERIALES Y REACTIVOS 25 7.5 PROCEDIMIENTO 26 SECCION 8 PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS 27 8.1 PORTAOBJETOS 27 8.2 CONJUGADOS 27 8.3 PREPARACIÓN DE AZUL DE EVANS 27 8.4 PRECAUCIÓN 27 8.5 PROCEDIMIENTO 27 8.6 SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (PBS) 0,01M, pH 7,2 - 7,4 27 8.7 MEDIO DE MONTAJE 28 8.8 PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA DE IFI 30 SECCION 9 BIBLIOGRAFÍA 30 ANEXO A GUÍA TÉCNICA PARA RESOLVER PROBLEMAS 32 ANEXO B ACCIDENTES CON MATERIAL SOSPECHOSO DE CONTENER VIH 34 ANEXO C FORMULARIO PARA EL ENVIO DE MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO DE VIH 36 ANEXO D HOJA DE TRABAJO DE INMUNOFLUORESCENCIA - VIH 1 38 ANEXO E SEROTECA DE VIH 39 ANEXO F FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓN

POR VIH EN LA RED DE LABORATORIOS DE REFERENCIA NACIONAL 40 ANEXO G ALGORITMO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓN POR VIH 41 Figura 1 Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) 9 Figura 2 Sistema básico de embalaje triple 16 Figura 3 Esquema de aplicación de la técnica 21 Figura 4 Esquema de lámina IFI - VIH -1 23 Figura 5 Simbología empleada en el procedimiento 23

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INTRODUCCIÓN

El Instituto Nacional de Salud tiene como funciones promover, programar, ejecutar y evaluar las investigaciones en salud y el desarrollo de tecnologías apropiadas, a través de la red de laboratorios a nivel nacional. Asimismo, brinda capacitación y asesoramiento técnico a fin de fortalecer la calidad del diagnóstico de las enfermedades transmisibles, logrando establecer una homogeneidad en la metodología empleada por los laboratorios para garantizar resultados confiables, reproducibles y oportunos, y asegurar la vigilancia epidemiológica y las actividades de control.

Desde la aparición del SIDA en el mundo en 1981, y luego del descubrimiento del VIH, se han venido desarrollando técnicas de diagnóstico para las infecciones por VIH. En la actualidad se cuenta con técnicas de tamizaje como Dot Blot, Inmunocromatografía, y ELlSA; y para la confirmación se emplean metodologías tales como Western Blot (w'B), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Radio inmunoprecipitación (RIPA), y Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cuya aplicación es limitada en países en desarrollo debido a que las pruebas de tamizaje no están libres de resultados falsos positivos (su nivel de especificidad no alcanza el (100%)), siendo necesaria la realización de pruebas confirmatorias como W.B e IFI, que se caracterizan por una elevada sensibilidad y especificidad.

Actualmente en el Perú, los laboratorios utilizan la técnica del W,B como herramienta confirmatoria de infección por VIH. Sin embargo, el alto costo hace cada vez más difícil su utilización como técnica rutinaria de confirmación. Una técnica de sensibilidad y especificidad equivalente al W.B, es la prueba de IFI, alternativa recomendada por la OMS, y que ofrece la ventaja adicional de ser más económica que las otras pruebas confirmatorias.

En 1994, el Laboratorio de Referencia de VIH/SIDA del Instituto Nacional de Salud participó en el proyecto Latinoamericano IFI-VIH OMS-OPS y, desde 1995 hasta 1997 se realizó la confirmación de infección por VIH con láminas producidas por Chile y Argentina para 13 países latinoamericanos con el auspicio de OPS/OMS.

En 1998 se desarrolló en el Instituto Nacional de Salud el proyecto "CULTIVO DE LlNFOCITOS PARA LA PRODUCCION DE LAMINAS IFI PARA EL DIAGNÓSTICO DE VIH"; como resultado de este proyecto se cuenta con una producción de láminas, las que han sido validadas, en el Programa de Proficiencia, del CDC - Atlanta. Además se ha logrado establecer y estandarizar una técnica IFI-VIH de alta sensibilidad, especificidad y bajo costo.

Este Manual representa un esfuerzo para difundir el diagnóstico confirmatorio de la infección por VIH-1 mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) a fin de contar con personal de laboratorio debidamente capacitado en IFI-VIH-1 en los establecimientos de salud integrantes de la red nacional de laboratorios en el Perú y los laboratorios de ESSALUD, Fuerzas Armadas, Policía Nacional y Clínicas privadas.

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VIRUS VIH

Los virus VIH (VIH-1 y VIH-2) son retrovirus de ácido ribonucleico (ARN) con envoltura, y en general infectan primariamente las células blancas de la sangre humana (Iinfocitos). Se les llama retrovirus porque tienen la particularidad de integrar su material genético (ARN del genoma) en el ADN celular del huésped (conteniendo ahora el genoma viral) albergando al provirus VIH. El virión del VIH es esférico, de aproximadamente 100 nanómetros de diámetro, su apariencia externa es la de un balón de fútbol, con una envoltura formada por pentágonos. En su interior se encuentra la nucleoproteína organizada en una estructura cónica. El virión tiene una envoltura de naturaleza lipoproteica y asociada a ella un componente de glucoproteína de peso molecular 160 000 (Gp 160), esta glucoproteína se desdobla en una de 120 000 (Gp 120), la cual corresponde al componente que permite al virión adherirse al receptor de la célula huésped; el otro componente de peso molecular 41 000 (Gp 41) es una proteína estructural, específica del virus VIH, al interior se encuentran los llamados antígenos de grupo (GAG), que corresponden a proteínas de peso molecular 17 000 (P17) Y 24 000 (P24). En el interior del núcleo se encuentran dos moléculas de ARN y un componente enzimático la polimerasa (POL), como la Transcriptasa reversa (P66) y la integrasa o endonucleasa (P51 y P31). Todas estas proteínas estructurales son parte del virión y son requeridas para su replicación. También existen proteínas no estructurales TAT, REV, VIF, VPR, NEF, VPU, que están presentes sólo en células infectadas. Generalmente estos componentes son responsables de modificar la expresión de las proteínas virales y de la replicación del virus, por lo tanto pueden también gobernar la capacidad infecciosa del virus.

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DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (VIH-1) POR

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

SECCIÓN 1

GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO

Establecer las disposiciones que se deben cumplir para realizar el diagnóstico del virus de la inmunodeficiencia humana Tipo 1 (VIH) utilizando el método de inmunofluorescencia indirecta (IFI).

1.2 CAMPO DE APLICACIÓN

Se aplica en laboratorios de establecimientos de salud que cuenten con personal calificado, instalaciones, equipos y materiales idóneos para llevar a cabo el diagnóstico del VIH a partir de muestras obtenidas de pacientes hospitalizados y ambulatorios.

1.3 RESPONSABILIDADES 1.3.1 Los Directores o Jefes de Departamento o Sección de un establecimiento de salud que

realiza el diagnóstico del VIH, son responsables de supervisar el cumplimiento de las disposiciones contenidas en el presente Manual.

1.3.2 Los Jefes de Laboratorio son responsables de mantener la competencia técnica de su

personal, la idoneidad y confiabilidad de sus equipos, materiales, sustancias, reactivos e instalaciones. Además, deben verificar la calidad de los resultados y supervisar el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Laboratorio y las Medidas de Bioseguridad.

1.3.3 Los profesionales designados para realizar el diagnóstico son responsables de controlar el

cumplimiento de las disposiciones contenidas en el presente Manual, mantener la confidencialidad de sus actividades e informar a su jefatura inmediata superior en caso de ocurrencia de desviaciones de las especificaciones de los procedimientos establecidos.

1.3.4 El personal asignado a los procesos descritos en el presente Manual debe conocer, estar

calificado en las técnicas y métodos de ensayo, aplicar las medidas de Bioseguridad y de las Buenas Prácticas de Laboratorio, y mantener la confidencialidad de las actividades que realiza.

1.4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 1.4.1 Instituto Nacional de Salud - MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA

LA OBTENCIÓN Y ENVIO DE MUESTRAS (I).. Serie de Normas Técnicas Nº 15. Diciembre de 1997.

1.4.2 Instituto Nacional de Salud - MANUAL DE NORMAS DE BIOSEGURIDAD. Serie de Normas

Técnicas Nº 18. Diciembre de 1997. 1.4.3 PRT-CNLSP-001. ENVIO DE MUESTRAS BIOLOGICAS EN LA RED NACIONAL DE

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LABORATORIOS DE REFERENCIA EN SALUD PÚBLICA. SECCION 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.1 DISPOSICIONES 2.1.1 Las disposiciones contenidas en el Manual de Normas de Bioseguridad, Serie de Normas

Técnicas Nº18, son aplicables para el cumplimiento de las disposiciones del presente Manual.

2.1.2 Para establecer niveles de bioseguridad aceptables dentro del laboratorio, se recomienda

manejar todas las muestras de sangre, suero o plasma como material potencialmente infectante, es decir, capaz de transmitir agentes patógenos.

2.1.3 Se deben aplicar las medidas de bioseguridad pertinentes especialmente las aplicables a: 2.1.3.1 El ambiente, 2.1.3.2 El personal, 2.1.3.3 El vestido, 2.1.3.4 Las muestras y su procesamiento, y 2.1.3.5 La esterilización terminal. 2.1.4 La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la

salud y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos por agentes.

2.1.5 Es responsabilidad de la dirección del laboratorio establecer una organización para garantizar

la seguridad en todas las áreas del mismo mediante la aplicación de normas y procedimientos de seguridad, claramente detalladas por escrito. Se puede optar por una estructura de personal con dedicación exclusiva a las tareas de seguridad, o bien, asignar parte del tiempo de trabajo del personal de laboratorio a estas tareas.

2.1.6 La administración del establecimiento de salud debe dar las facilidades para que las normas

de bioseguridad se cumplan. 2.1.7 El VIH ha sido aislado en sangre, semen, saliva, lágrimas, leche materna, líquido

cefaloraquídeo, vómitos, orina, secreciones cervicales, líquido amniótico y tejidos de personas infectadas. Al obtener y procesar cualquier tipo de muestra en el laboratorio se deben tomar las precauciones universales, ya que no podríamos identificar de manera confiable mediante la historia clínica a los individuos infectados por VIH.

2.1.8 Los principales peligros son las exposiciones por puntura accidental con una aguja, por

cortes con equipo contaminado, por exposición de las membranas mucosas o de la piel cortada a material contaminado, laceraciones, heridas, rasguños. Todo el equipo y material de laboratorio deberían ser usados como si estuvieran contaminados, incluidos los artículos

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de escritorio (no llevarse lápices, lapiceros y plumones a la boca). 2.2 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.2.1 Todas las muestras deben ser tratadas como altamente infecciosas para evitar el posible contagio.

2.2.2 El ingreso al laboratorio debe estar restringido.

2.2.3 Debe utilizarse siempre guardapolvo o mandilones de laboratorio en la zona de trabajo.

2.2.4 El guardapolvo no debe salir de la zona del laboratorio, salvo para enviarlo a lavar.

2.2.5 No pipetear con la boca.

2.2.6 Está prohibido comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosméticos en el laboratorio.

2.2.7 El cabello largo debe usarse recogido y cubierto.

2.2.8 Lavarse las manos luego de quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio.

2.2.9 Utilizar protección para los ojos cuando el procedimiento genere gotas o aerosoles.

2.2.10 Utilizar siempre guantes esterilizados y mascarillas.

2.2.11 Las cortaduras o rasguños en las manos y brazos deben cubrirse y protegerse bien. 2.2.12 Deben utilizarse zapatos protectores que cubran completamente los pies (no usar sandalias o

zapatos abiertos).

2.2.13 El procesamiento de las muestras debe realizarse sobre una superficie de trabajo protegida (papel absorbente plastificado o papel de filtro).

2.2.14 Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas por el operador antes y después de

cada actividad. 2.2.15 Los reactivos deben estar bien etiquetados, y ser almacenados en viales de plástico con tapa

rosca 2.2.16 Todos los laboratorios deben tener a su disposición un equipo de primeros auxilios.

2.2.17 Informar inmediatamente cualquier accidente al jefe del laboratorio. 2.2.18 Se debe disponer de un lugar para el lavado de ojos en caso de exposición accidental a

salpicaduras. 2.2.19 Todos los deshechos del laboratorio deben descontaminarse adecuadamente antes de

eliminarlos, en solución desinfectante y ser autoclavados a 121°C durante 20 minutos o incinerarse.

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2.2.20 El material infeccioso debe ser fácilmente identificado como tal y ser esterilizado lo antes

posible. 2.2.21 Si se trabaja con cultivo de linfocitos o técnicas moleculares, utilizar una cabina de flujo

laminar tipo 3. 2.2.22 Se debe limpiar a diario los pisos con un trapeador limpio y solución desinfectante. 2.3 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL TRANSPORTE 2.3.1 El envío y transporte de las muestras que no han sido cuidadosamente embaladas, genera

riesgos de infección para toda la gente que está directamente en contacto con cualquier parte del proceso.

2.3.2 El manejo descuidado y negligente de las muestras pone en peligro no sólo al personal del

laboratorio, sino también al personal administrativo y personal de apoyo. 2.3.3 El tránsito de las muestras de un lugar a otro genera un riesgo tanto para el público como

para el personal del medio de transporte, sea este por vía aérea o terrestre.

SECCIÓN 3

OBTENCIÓN DE MUESTRAS 3.1 OBJETIVO

Establecer y uniformizar el procedimiento de obtención de muestras de sangre para realizar el diagnóstico del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH -1).

3.2 CAMPO DE APLlCACION Comprende la obtención de muestras de sangre intravenosa de pacientes ambulatorios u

hospitalizados. 3.3 MATERIALES, EQUIPOS y REACTIVOS

3.3.1 Jeringas descartables de 10 mL o tubos al vacío de 10 mL, con o sin anticoagulante. 3.3:2 Agujas N. 20, N.21 ó N. 22. 3.3.3 Tubos estériles 100 x 13, con tapa de caucho o tapa rosca. 3.3.4 Compresas y torundas. 3.3.5 Alcohol de 70%. 3.3.6 Bandas o tubos flexibles de látex (ligadura). 3.3.7 Centrífuga.

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3.3.8 Recipientes de paredes rígidas. 3.4 PROCEDIMIENTO 3.4.1 Vestir con mandil y guantes

3.4.2 Escoger una vena adecuada para la punción y extracción. 3.4.3 Limpiar la zona elegida con una torunda de algodón humedecida con alcohol de 70%. 3.4.4 Dejar secar. 3.4.5 Colocar el torniquete, haciendo un nudo corredizo por encima del punto escogido para la

punción e indicar al paciente que abra y cierre la mano enérgicamente varias veces, hasta que la vena se encuentre ingurgitada, y luego que mantenga la mano cerrada.

3.4.6 Sin tocar con el dedo la vena escogida extraer de 5 mL a 10 mL de sangre. 3.4.7 Retirar la aguja de la vena escogida y colocar una torunda de algodón en el punto de

punción, indicando al paciente la flexión del brazo. 3.4.8 En la jeringa utilizada retirar la aguja con una pinza. No reinsertar el capuchón y colocar la

aguja en un recipiente de paredes rígidas y de boca ancha que contengan una solución de hipoclorito de sodio de 3 a 5% para la eliminación de agujas.

3.4.9 Abrir el tubo esterilizado y depositar la sangre, haciéndola resbalar lentamente por las

paredes. Taparlo inmediatamente. 3.4.10 Si el tubo tiene anticoagulante, mezclar suavemente con la sangre depositada. 3.4.11 Rotular con una etiqueta donde conste un código que corresponderá a los datos de la

solicitud del pedido. 3.4.12 Para extraer suero por centrifugación, dejar reposar el tubo inclinado unos 30 minutos para

permitir la formación del coágulo. 3.4.13 Para extraer plasma, centrifugar inmediatamente el tubo con la muestra. 3.5 OBTENCIÓN DEL SUERO O PLASMA

3.5.1 Colocar el tubo con la muestra de sangre debidamente rotulada en la centrífuga, y equilibrar la misma con igual peso.

3.5.2 Centrifugar durante 5 minutos a una velocidad entre 1 500 r.p.m. a 2 500 r.p.m.

3.5.3 Trasvasar los sueros a tubos plásticos estériles con tapa rosca utilizando una pipeta Pasteur, micropipetas o pipetas serológicas descartables.

3.5.4 Rotular debidamel1te los tubos con plumón indeleble o lápiz de grafito, identificándolos cuidadosamente con el número correlativo y verificando que coincidan con el número de ficha que acompañan las muestras.

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SECCIÓN 4

CONSERVACIÓN, EMBALAJE, TRANSPORTE Y REMISIÓN DE MUESTRAS 4.1 CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA

4.1.1 Si la ejecución de la prueba se programa antes del término de una semana, conservar las muestras de suero o plasma entre 2°C a 8°C (refrigeración). Antes de la prueba, se debe esperar 30 minutos para que las muestras alcancen la temperatura ambiente del laboratorio.

4.1.2 Si la ejecución de la prueba se programa después de una semana, congelar las muestras a

20°C. En este caso, las muestras congeladas se deben descongelar totalmente, homogenizar y centrifugar antes de realizar el ensayo.

4.1.3 Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, ya que el título de anticuerpos disminuye

por ese procedimiento. Las muestras no deben ser sometidas a congelación y descongelación más de una o dos veces.

4.2 EMBALAJE

4.2.1 Los contenedores individuales de las muestras deben ser resistentes a fisuras, golpes y rupturas, y deben tener tapa de rosca

4.2.2 Sus tapas deben estar selladas con cinta de seguridad, deben estar envueltas en papel toalla

o material absorbente e introducidas preferentemente en una funda plástica resistente. 4.2.3 La muestra así envuelta debe ser colocada en otro envase metálico o de plástico, igualmente

resistente a las fisuras y rupturas. Colocar suficiente material absorbente a su alrededor para que resista y amortigüe los golpes.

4.2.4 Este segundo envase debe empacarse con suficiente seguridad, para protegerlo contra

daños físicos y agua. Se coloca en un paquete de envío que lo protege de los elementos externos, tales como daño físico mientras se encuentra en tránsito (Véase Figura 2).

4.2.5 Después de cerrarlas, limpiar por fuera con un desinfectante con una concentración de

solución de cloro al 0,1% (1 gl L), y luego secarlas completamente. 4.2.6 Al recibir y antes de abrir los envases, estos deben limpiarse con solución de cloro, y luego

colocarse en gradillas de metal o plástico resistentes a fisuras.

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4.3 REMISIÓN

4.3.1 Las muestras no deben enviarse, si antes no se han hecho los arreglos entre el servicio de transporte y la persona que ha de recibirlas, indicando la fecha de envío, el número de guía, el itinerario, y el número de vuelo.

4.3.2 Debe elegirse el itinerario más directo, con el menor número de transbordos y esperas de

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tránsito. Se procurará que el envío no llegue sábado, domingo o días feriados.

4.3.3 Todas las muestras deben enviarse rotuladas, indicando el código del paciente, la fecha de la toma de muestra escrito con lápiz en la cinta adhesiva o esparadrapo. No se debe emplearse tinta ni cinta de papel, pues son vulnerables a la humedad. Esta información deberá protegerse de todo daño o humedad y deberá colocarse en la parte exterior de la caja de embalaje protegida, preferiblemente, por una envoltura plástica.

4.3.4 Si el tránsito va a demorar más de 2 horas deben enviarse en una caja térmica con

refrigerante.

4.3.5 La caja debe poseer exteriormente flechas y una leyenda acerca de la posición en que debe manejarse, y con las indicaciones de "URGENTE, FRAGlL, MATERIAL MÉDICO, MANTÉNGASE FRIO, POSICIÓN VERTICAL, ENTREGA INMEDIATA, TELÉFONO Y DIRECCIÓN DEL DESTINATARIO. NO ABRIR SIN AUTORIZACIÓN, MATERIAL CONTAMINANTE, PELIGROSO.

SECCION 5

ENSAYO O ANÁLISIS EN LABORATORIO

5.1 RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO

5.1.1 El VIH-1 es el agente causal del síndrome De inmunodeficiencia adquirida (SI DA). Datos actuales indican que el virus del SIDA se transmite a través del contacto sexual, de la exposición a sangre (incluyendo compartir jeringas y agujas contaminadas) y otros fluidos contaminados. El kit IFI-VIH1 está diseñado para detectar la presencia de anticuerpos específicos para VIH-1.

5.1.2 Este ensayo emplea como fuente de antígeno viral las proteínas de VIH-1 expresadas en

células T infectadas crónica mente.

5.1.3 Las células linfoblastoideas de origen humano (H9-HTLV 111-8 que son células infectadas y K-562 que son células de control), son fijadas a la superficie de un portaobjeto de vidrio para inmunofluorescencia. Cuando una muestra de suero o plasma con anticuerpos para VIH-1 entra en contacto con los antígenos de VIH-1 presentes en el citoplasma y la membrana de las células infectadas, se produce el reconocimiento de los antígenos virales por los anticuerpos de la muestra, generándose un complejo antígeno-anticuerpo. Este complejo es detectado mediante una segunda incubación con anti-gamma-globulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína, la que reconoce los anticuerpos humanos y fluoresce cuando se expone a la luz ultravioleta (LUV).

5.1.4 La intensidad y ubicación de la fluorescencia en las células infectadas y no infectadas

evaluadas comparativamente son los criterios determinantes para establecer la presencia o ausencia de anticuerpos virales.

5.1.5 Algunos individuos infectados con VIH-2 pueden presentar anticuerpos que reconocen y se

unen a los antígenos presentes en los pocillos de células infectadas de IFI-VIH-1. Esto sucede porque algunos antígenos presentan epitopes similares en ambos virus. Este kit de

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IFI-VIH-1 está diseñado para identificar exclusivamente infecciones por VIH-1. 5.2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO

5.2.1 El ensayo de IFI para la detección de anticuerpos anti-VIH-1 se basa en la unión de los anticuerpos específicos a los antígenos de VIH-1 (HTLV 11I-8) expresados en la superficie y citoplasma de células linfoblastoideas T humanas fijadas a un portaobjeto. Las células no infectadas que no expresan antígeno de VIH-1 sirven como control para cada muestra. Las láminas son procesadas para bloquear cualquier actividad viral en las células infectadas mediante la desecación al aire o por fijación con acetona, la cual ejerce un efecto deshidratante por evaporación y a la vez disuelve los componentes lipídicos del virus. Este proceso de inactivación permite también la fijación de las células infectadas y no infectadas a sus respectivos pocillos, a saber: las células infectadas en los pocillos superiores y las no infectadas en los pocillos inferiores.

5.2.2 Para realizar el ensayo se incuba una muestra de suero o plasma diluido en los pocillos

superiores e inferiores (con células infectadas y células no infectadas como control de la reacción, respectivamente) a 37°C por 30 minutos. Si la muestra presenta anticuerpos contra el VIH-1, éstos se unen a 19S antígenos virales presentes en el citoplasma y la membrana de las células infectadas. El material no unido a los antígenos es removido mediante sucesivos lavados. Posteriormente, se añade un antisuero antigamma-globulina humana conjugado con isotiocianato de fluoresceína WITC) a las células infectadas y no infectadas del portaobjeto y nuevamente se incuban a 37°C. El material no unido es eliminado mediante lavado. Finalmente, se procede a preparar la lámina para su observación en un microscopio con luz ultravioleta.

5.2.3 Si se encuentran presentes los anticuerpos en el suero estudiado aparecerá una

fluorescencia característica de localización específica y visible con luz ultravioleta. La interpretación de la lectura se establece comparando la fluorescencia observada en las células infectadas y no infectadas para cada muestra.

5.3 EXAMEN DE LA MUESTRA 5.3.1 Examinar la muestra cuidadosamente para observar si hay contaminación microbiana,

hemólisis grosera, lipemia o si el plasma está gelificado antes de realizar el ensayo, ya que estos factores pueden interferir negativamente en el procesamiento o la interpretación de resultados.

5.3.2 De ser este el caso, debe obtenerse - en lo posible - una nueva muestra que reúna las

condiciones indicadas. Cuando sea necesario se debe retirar el material particulado por medio de una breve centrifugación previa al ensayo.

SECCION 6

DETERMINACIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DEL CONJUGADO ANTI-INMUNOGLOBULlNA HUMANA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH MEDIANTE IFI

6.1 OBJETIVO

Determinar experimentalmente la dilución óptima de trabajo.

Nota: El kit IFI-VIH indica la dilución ideal del conjugado provisto

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6.2 MATERIALES 6.2.1 Suero humano, positivo para VIH con un título (punto final) de anticuerpos determinado

mediante la prueba de IFI. 6.2.2 Portaobjetos, con 12 pocillos. Los 6 pocillos superiores, con 30% de células de cultivo

infectadas H9-HTLV III-B y 70% de células no infectadas; y en los 6 pocillos inferiores, con 100% de células no infectadas como control.

6.2.3 Suero de Cabra anti-lgG humano conjugado con fluoresceína, Fragmento F(AB')2 molécula

completa Cappell , catálogo No 55201 (01180). 6.2.4 PBS: solución amortiguadora de fosfatos, pH 7,2 - 7,4. 6.2.5 Solución de contraste: Solución de Azul de Evans 100X. 6.2.6 Medio de montaje: Glicerina al 90% en PBS (9 partes de glicerol +1 parte de PBS). 6.2.7 Cubre objetos de 60 mm x 22 mm. 6.2.8 Micropipetas de O uL a 20 uL. 6.2.9 Tubos para dilución. 6.2.10 Koplin. 6.2.11 Incubador de 37C. 6.2.12 Fosfato de sodio monobásico monohidratado, Fosfato de sodio dibásico anhidro, Cloruro de

sodio, para la preparación de PBS.

6.2.13 Cámara húmeda. 6.2.14 Reloj. 6.2.15 Agua destilada. 6.2.16 Centrífuga. 6.2.17 Microscopio de Inmunofluorescencia. 6.2.18 Kit IFI-VIH-1 para 60 determinaciones: 6.2.18.1 Frotis de IFI-VIH 10 laminas 6.2.18.2 Conjugado FITC 100uL 6.2.18.3 Azul de Evans 2 mL 6.2.18.4 Medio de montaje 5 mL

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6.2.18.5 Control negativo 200 uL 6.2.18.6 Control positivo 200 uL 6.2.18.7 Cubre objetos 10 unidades 6.2.18.8 Guía de Procedimientos 1unidad 6.3 PROCEDIMIENTO 6.3.1 Retirar dos portaobjetos del estuche (2°C - 8°C).

6.3.2 Secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C).

6.3.3 Diluir los sueros controles 1/10 con PBS (pH 7,2 - 7,4).

6.3.4 Colocar 20 uL de los sueros diluidos en cada uno de los pocillos superiores e inferiores.

6.3.5 Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

6.3.6 Enjuagar los portaobjetos en PBS rápidamente, descartar el PBS y repetir el lavado con PBS durante 5 minutos, usando un koplin.

6.3.7 Dejar secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C) durante 8 a10 minutos.

6.3.8 Titular el conjugado anti-lgG humano mediante 5 diluciones desde 1/20 hasta 1/320,

utilizando diluciones 1:2. En la Figura 3, se describe el esquema de aplicación de la técnica.

6.3.9 Añadir solución de azul de Evans 100X (1X dilución final).

6.3.10 Agregar 20 uL de cada dilución del conjugado a cada pocillo superior e inferior del

portaobjetos correspondiente.

6.3.11 Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

6.3.12 Lavar los portaobjetos con PBS por 5 minutos, descartar el PBS, repetir el lavado con PBS

durante 5 minutos, y enjuagar con agua destilada.

6.3.13 Dejar secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C) durante 8 a10 minutos.

6.3.14 Colocar el medio de montaje y la laminilla cubreobjeto.

6.3.15 Leer en microscopio de IFI, con aumento de 40X.

6.4 INTERPRETACION DE RESULTADOS

La dilución óptima del conjugado será la más alta dilución que revele la fluorescencia más brillante, con la más alta dilución del suero positivo.

6.5 PROBLEMAS EN LA DETERMINACION DE LA DILUCION ÓPTIMA

6.5.1 No se observa fluorescencia específica con el nuevo conjugado. Recomendación: No usar conjugado poco sensible.

6.5.2 No hay disminución de fluorescencia con la más alta dilución del conjugado. Recomendación: Titular nuevamente el conjugado con diluciones más altas hasta que se observe una caída de la fluorescencia.

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22

6.6 PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA 6.6.1 No utilizar el kit o alguno de sus componentes pasada la fecha de vencimiento. 6.6.2 No intercambiar reactivos de distintos kits ni tapas de los viales. 6.6.3 Llevar el kit a temperatura ambiente (20C – 30C) antes de aplicar la técnica 6.6.4 Mantener el kit refrigerado ( 2C –8C) cuando no este en uso. 6.6.5 Utilizar una técnica aséptica (puntas o tips y viales estériles) al abrir y retirar materiales de los

viales del kit. Evitar la contaminación de los reactivos. 6.6.6 No utilizar reactivos que estén turbios y revelen crecimiento microbiano. Cualquier elemento

que conspire contra la transparencia de la imagen dará malos resultados y el porta objeto resultara dificultoso para leer.

6.6.7 Es indispensable utilizar una punta o tips para la micropipeta para cada muestra y control. 6.6.8 La contaminación del control negativo o de cualquier muestra con trazas de un suero positivo

pueden dar resultados falsos positivos. 6.6.9 La contaminación del conjugado por cualquier muestra o control causara la neutralización

parcial o completa y puede llevar a resultados falsos positivos. 6.6.10 No intercambiar las tapas de los viales para evitar la contaminación cruzada. Para ello, los

viales han sido provistos con tapas de distinto color. 6.6.11 Coger los portaobjetos por su extremo translucido (área para colocar el numero de orden). Al

abrir el estuche plástico, no presionar ni tocar los pocillos de las células. 6.6.12 Utilizar agua destilada en la preparación de los reactivos. 6.6.13 No sacudir los portaobjetos para evitar la contaminación cruzada entre los pocillos. 6.6.14 Al dispensar la muestra, no tocar los pocillos ni rayar con la punta de la micropipeta. 6.6.15 La prolongada observación microscópica de la muestra disminuye la fluorescencia. Tener

cuidado de no exponer cada campo mas de 15-30 segundos. 6.6.16 Asegurar que el microscopio de inmunofluorescencia, filtros y lámpara, estén en óptimas

condiciones. Para probar la lámpara conviene usar diluciones del control positivo periódicamente para constatar si se mantiene el mismo titulo.

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SECCION 7

TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH (IFI-VIH)

7.1 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO

Si en el suero del paciente existen anticuerpos VIH, estos se unirán al antígeno viral que está en las células adheridas al portaobjeto. Este complejo es detectado mediante la adición de antiinmunoglobulina humana conjugada con fluoresceína, siendo esta reacción observada mediante microscopio de fluorescencia.

7.2 ESQUEMA Y SIMBOLOGÍA

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7.3 FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA

Las células humanas H9 expresando antígenos de VIH -1 (H9 HTLV 11I - B) están firmemente adheridas a los pocillos 1 - 6 del portaobjeto. El antígeno está fijado y permeabilizado por acetona.

7.3.1 Se añaden 20 mL de la muestra de suero diluida a un pocillo de células infectadas (1 - 6) Y a un pocillo de células no infectadas (7 - 12) Y se incuba el portaobjeto a 37°C . Si la muestra tiene anticuerpos contra el VIH - 1 se forma un complejo antígeno - anticuerpo sobre las células infectadas. En el pocillo de células no infectadas no habrá unión de anticuerpos. Se retiran los anticuerpos no unidos durante los lavados.

7.3.2 Luego del proceso de lavado, se colocan 20 mL de una dilución apropiada del conjugado antiIgG- humana con FITC a ambas hileras de pocillos con células infectadas (1 - 6) Y no infectadas (7-12) se incuba a 37 C.

25

7.3.3 Si en la primera incubación se unieron los anticuerpos específicos de la muestra al antígeno

VIH -1, entonces en la segunda incubación estos anticuerpos son a su vez acoplados con el conjugado FITC, formando una estructura de tipo "sandwich". Los restos del conjugado son retirados por lavados.

7.3.4 La unión del conjugado FITC al complejo antígeno - anticuerpo demuestra la presencia de

anticuerpos en la muestra problema. La presencia de Ia estructura "sandwich" formada por: conjugado FITC I anticuerpo anti VIH - 1 I antígeno VIH -1 es detectada por la fluorescencia emitida por el fluorocromo (FITC) bajo la excitación de la luz ultravioleta. Si no se observa fluorescencia es porque la muestra no contiene anticuerpos.

7 .4 MATERIALES Y REACTIVOS 7.4.1 Portaobjetos con 12 pocillos de células de cultivo (25% de células infectadas H9 HTLV-IIIB

mezcladas con 75% de células no infectadas; 30000 células en total en cada uno de los pocillos).

7.4.2 Suero Humano reactivo para VIH mediante la técnica de IFI (suero control positivo).

7.4.3 Suero Humano no reactivo para VIH mediante la técnica de IFI (suero control negativo).

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7.4.4 Suero de Cabra anti-lgG humano conjugado con fluoresceína Fragmento F(AB')2 molécula completa.

7.4.5 PBS: solución amortiguadora de fosfatos, pH 7,2 a 7,4.

7.4.6 Solución de contraste: Solución de Azul de Evans 100X.

7.4.7 Medio de montaje: glicerina al 90% en PBS (9 partes de glicerol + 1 parte de PBS).

7.4.8 Laminillas cubreobjetos de 60 x 22 mm. 7.5 PROCEDIMIENTO

7.5.1 Retirar los portaobjetos del congelador. Se requiere un portaobjeto (6 determinaciones) para

3 muestras problemas, 1 control PBS, 1 control negativo y 1 control positivo.

7.5.2 Anotar en la hoja de trabajo, el orden de la ubicación de cada muestra que se colocará en los pocillos de los portaobjetos.

7.5.3 Secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C), durante 5 a 10 minutos.

7.5.4 Centrifugar las muestras durante .5 minutos a 1000 rpm. Cuidar de mover el sedimento y trabajar con el sobrenadante.

7.5.5 Diluir las muestras centrifugadas y los controles a 1:10 en PBS.

7.5.6 Añadir 20 uL de control positivo, control negativo y control PBS a cada uno de los pocillos

indicados, utilizar un solo control positivo, control negativo y control PBS por corrida.

7.5.7 Colocar 20 uL de cada muestra diluida tanto en el pocillo superior como en el inferior. En esta etapa tenga extremo cuidado en no dañar las células fijadas y no contaminar otros pocillos.

7.5.8 Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos. 7.5.9 Enjuagarlos en PBS rápidamente, descartar el PBS y sumergir nuevamente en PBS durante 5

minutos con agitación suave. Repetir el lavado por 5 minutos (se recomienda usar un Koplin).

7.5.10 Secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C) durante 5 a 10 minutos.

7.5.11 Diluir el conjugado anti-lgG humano a su dilución óptima de trabajo, y añadir la solución de azul de Evans 100X (1X dilución final). Ver Sección 6.

7.5.12 Agregar 20 uL de conjugado diluido a todos los pocillos.

7.5.13 Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

7.5.14 Enjuagarlos en PBS rápidamente, descartar el PBS y sumergir nuevamente en PBS durante

5 minutos con agitación suave. Repetir el lavado por 5 minutos (se recomienda usar un Koplin).

7.5.15 Secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C), durante 5 a 10 minutos.

7.5.16 Agregar 5 uL de medio de montaje a cada pocillo y colocar una laminilla cubreobjeto sobre el

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porta objeto. Leer en microscopio de inmunofluorescencia. Los portaobjetos montados se pueden mantener hasta 24 h a 4°C en la oscuridad.

SECCIÓN 8

PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

8.1 PORTAOBJETOS

Se deben almacenar congelados preferentemente a -70°C, de no ser posible a -20°C. Se recomienda no utilizar los portaobjetos con más de 12 meses de antigüedad.

8.2 CONJUGADO 8.2.1 La conservación óptima es a 4°C.

8.2.2 No se debe usar conjugados con fecha de vencimiento expirada.

8.2.3 Se recomienda fraccionar el conjugado en alícuotas (ej. 100 mL) para evitar que la solución

stock de conjugado sufra cambios de temperatura excesivos, al sacarlo del refrigerador y trabajar con él.

8.2.4 Utilizar siempre tips estériles con el conjugado para evitar cualquier tipo de contaminación

que lo deteriore irreversiblemente.

8.2.5 Eliminar el sobrante de conjugado diluido en PBS utilizado en la técnica de IFI-VIH. 8.3 PREPARACIÓN DE AZUL DE EVANS 8.3.1 Fórmula solución stock Azul de Evans 100X: 8.3.1.1 Azul de Evans 1,0 g. 8.3.1.2 Agua destilada 100 mL. 8.4 PRECAUCIÓN

8.4.1 Este colorante es mutagénico y cancerígeno, por lo que al pesar el polvo se debe usar

guantes y mascarilla. El procedimiento debería realizarse en una campana. 8.5 PROCEDIMIENTO

8.5.1 Diluir el Azul de Evans en el agua destilada hasta su completa disolución.

8.5.2 Guardar la solución en un frasco oscuro, etiquetándolo como Azul de Evans 100X.

Nota: El Azul de Evans se añade al conjugado como colorante de contraste para reducir la fluorescencia inespecífica o transfondo. Se recomienda mantener este reactivo refrigerado. La solución concentrada se puede mantener hasta 2 meses en refrigeración.

8.6 SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (PBS) O,01M, pH 7,2-7,4 .6.1 Fórmula

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NaCI 85g Na2HP04 11,77g NaH2P04 H2O 2,23g Agua destilada 10L

8.6.2 Preparación

8.6.2.1 Pesar los reactivos y colocarlos en un frasco o matraz volumétrico de 2 L.

8.6.2.2 Agregar agua destilada hasta completar los 2 L. 8.6.2.3 Disolver completamente. 8.6.2.4 Colocar la solución en un recipiente de 10 L Y completar hasta el volumen final de 10 L,

agregando agua destilada; mezclar vigorosamente. 8.6.2.5 Tomar una alícuota y medir el pH que debe estar dentro del rango 7,2 - 7,4. 8.6.2.6 Se recomienda guardar el PBS en el refrigerador a 4°C. Estabilidad 6 meses. 8.7 MEDIO DE MONTAJE 8.7.1 Fórmula Tris base O,4M: Tris-(hidroximetil )-aminometano 4,8 g. Agua destilada 100 mL

HCI O,2N: HCI concentrado 1,6 mL. Agua destilada 100 mL 8.7.2 Preparación 8.7.2.1 Para 10 mL de Tris base O,4M, adicionar HCI O,2N hasta alcanzar un pH 8,5.

8.7.2.2 Adicionar 10 mL de esta mezcla a 90 mL de glicerol.

8.7.2.3 Controlar el pH. No usar glicerol envejecido e hidrolizado porque acidifica el medio de

montaje.

8.7.3 Interpretación de Resultados 8.7.3.1 El suero control positivo deberá presentar fluorescencia en el 30% de las células con el

patrón típico para este antígeno. El suero control negativo y el control de PBS no deberán presentar fluorescencia.

8.7.3.2 Reacción Positiva: Esta deberá presentar fluorescencia típica de membrana en el número

correcto de células según lo determinado por el control positivo. Los sueros positivos con bajo título de anticuerpos pueden dar una reacción más tenue aunque típica en un porcentaje menor de células infectadas.

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8.7.3.3 Reacción negativa: Esta deberá presentar ausencia de fluorescencia

8.7.3.4 Reacción Inespecífica: Esta presenta igual fluorescencia en las células infectadas y no

infectadas que impide la interpretación correcta.

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8.8 PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA DE IFI 8.8 El suero control positivo no presenta fluorescencia. 8.8.1.1 Acciones Correctivas: a Buscar la presencia de antígeno en otros sueros positivos. b Revisar la identificación y dilución del suero control utilizado. c Ensayar el conjugado anti-humano con antígeno y suero control distinto. d Repetir la prueba. 8.8.2 El suero control negativo presenta fluorescencia. 8.8.2.1 Acciones Correctivas: a Analizar la fluorescencia observada en el control negativo, comparándola con la detectada

con el control positivo. b No usar el conjugado si la fluorescencia en el control negativo es similar a la observada con

el antígeno en el control positivo. c No usar el conjugado si se detecta fluorescencia con algún contaminante en las células con

el antígeno, por ejemplo: micoplasmas, bacterias, levaduras, etc 8.8.3 El suero muestra presenta fluorescencia inespecífica. 8.8.3.1 Acciones Correctivas: a Diluir la muestra a 1:100 (dilución final) y volver a realizar la prueba. Si en este caso se.

observa fluorescencia específica en el 30% de la células, se puede diagnosticar como positivo.

Nota: En el Anexo A se presenta una Guía para resolver problemas en la Fluorescencia de las

muestras

SECCION 9

BIBLIOGRAFIA 9.1 Ascher MS, Wilber JC.lnmunofluorescence for diagnosis of retrovirus infection. Arch Pathol Lab

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9.2 Constantine NT, Farag MM, Watts QM. Evaluations of a synthetic peptide-based assay and a pid dot-blot recombinant test for the detection of antibodies to HIV-1 and HIV-2. J Egypt Pub Health Assoc 1990; 115: 1-10.

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9.4 OMS. Guía para el transporte Seguro de Sustancias Infecciosas y Especímenes Diagnósticos. División para la Vigilancia y el control de Enfermedades Emergentes y otras Enfermedades Transmisibles. Ginebra, 1997.

31

9.5 Guillén A, Beltrán M, Quispe N, Valverde A, Zavaleta A. Manual de Normas de Bioseguridad.

Instituto Nacional de Salud. Serie Técnica N18. Lima - Perú, 1996.

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9.8 Ministerio de Salud Pública. Manual de Normas y Procedimientos para el Diagnostico de

Laboratorios del Virus de Inmunodeficiencia Humana. Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Pérez. Ecuador, 1992.

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9.15 Organización Panamericana de la Salud. Manual de Procedimientos de Control de Calidad para los Laboratorios de los Bancos de Sangre. Washington, 1994.

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9.18 Valverde A, Romero S, Cabezas C. Inmunofluorescencia Indirecta como prueba alternativa para la confirmación diagnóstica de infección por VIH en el Perú Rev Med Exp INS 1997; XIV (1): 19-21.

9.19 Valverde A, Romero S. Cultivo de Linfocitos para la producción de láminas

Inmunofluorescencia Indirecta para la confirmación del diagnóstico de VIH-1. 111 Reunión de sistemas nacionales de laboratorio en salud pública. I Congreso de la Red Nacional de laboratorios en salud pública, Libro de resúmenes 1999.

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ANEXO A

GUIA TÉCNICA PARA RESOLVER PROBLEMAS

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ANEXO B

ACCIDENTES CON MATERIAL SOSPECHOSO DE CONTENER VIH

B.1 PRIMEROS AUXILIOS

En caso de salpicaduras, sacar la ropa contaminada. Permitir el sangrado inmediato de la herida. Lavar la zona afectada con agua y jabón, aplicar un antiséptico disponible, si es necesario se cubre la herida con un apósito. Si están afectados los ojos, nariz o boca, lavarlos bien con grandes cantidades de agua.

B.2 REPORTE Y EVALUACIÓN

Informar inmediatamente al médico de turno y otras personas designadas (jefe del laboratorio, investigador principal, comité de bioseguridad). Anotar los detalles del accidente y evaluar la gravedad del accidente. Es importante que el trabajador de salud sea asesorado lo más rápido posible. Si se va a utilizar quimioprofilaxis, ésta debe comenzar lo más pronto posible, preferentemente dentro de las primeras 2 horas de la exposición (se sabe que el VIH está circulando en la sangre de 4 a 6 horas antes de penetrar al linfocito T4).

B.3 EVALUACIÓN DEL ACCIDENTE

Determinar si la herida y algún fluido corporal están involucrados a fin de establecer si la exposición del trabajador de salud es significativa.

B.4 TIPO DE FLUIDO CORPORAL

Sangre, suero, plasma o cualquier liquido biológico contaminado con sangre. Muestras de laboratorio o cultivos que pueden tener grandes cantidades de VIH, VHB o VHC (virus de la hepatitis B y C respectivamente). Órganos o tejidos transplantados. Líquido pleural, amniótico, pericardio, peritoneal, sinovial o cefaloraquídeo. Las heces, secreciones nasales, esputo, lágrimas, orina o vómito no han sido implicados en la transmisión de VIH, VHB o VHC, si es que éstos no estuviesen visiblemente contaminados con sangre.

B.5 VÍAS DE ENTRADA

Heridas superficiales (por Ej. cortes, abrasiones, magulladuras) o profundas (percutánea, mordeduras, etc.) a través de las cuales puede penetrar material infectado. Membranas mucosas (ojos, nariz, boca). Nota:

Se debe determinar el área de piel expuesta y el tiempo de exposición. Por lo tanto, es necesario saber si el tipo de fluido corporal y herida indican que ha sucedido una

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exposición significativa. Se debe tener un consentimiento estricto del trabajador de salud y mantener una estricta confidencialidad de toda la información que se ha obtenido.

B.6 LESIÓN SIGNIFICATIVA

Tomar una muestra de sangre basal del trabajador para serología de VIH. Examinar de la misma manera, la muestra del paciente con la que se contaminó el personal de salud. Se aconseja administrar zidovudina (AZT) al accidentado a una dosis de ataque de 400 mg. lo antes posible y luego 200 mg. cada 8 horas por 6 semanas como mínimo. Si la serología de VIH del trabajador es negativa, esta prueba debe repetirse a los 3 y 6 meses. Si al cabo de este tiempo la serología para VIH se mantiene negativa, se concluirá que no existe infección. Mientras tanto se deben tomar las precauciones necesarias (evitar el embarazo, no donar sangre, proteger a la pareja en las relaciones sexuales usando preservativos, etc.). El trabajador tiene derecho a que se proteja su confidencialidad. Si el resultado de la muestra basal es positiva la infección no puede ser atribuída al accidente.

B.7 DESINFECTANTES SUGERIDOS

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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD SEDE CENTRAL

Cápac Yupanqui N° 1400, Jesús María

Lima ll, Apartado N. 451

Telf.: 4719920. Fax: 471 0179 e-mail: postmaster@ins.sld.pe Página Web: www.ins.sld.pe