TEMA 2

PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

Introducción ¿Por que se purifican las enzimas?Objetivos y estrategias Reglas básicas para la selección de un proceso de purificaciónEvaluación de la purificación

¿POR QUE SE PURIFICAN LAS ENZIMAS?

- Conocer exactamente la reacción catalizada

- Mecanismos de catálisis

- Parámetros cinéticos

- Regulación (alosterismo, modificaciones postraduccionales, etc)

- Estudios estructurales (Rayos X, RMN, Dicroismo circular óptico)

- Información escalado industrial

Estudio aplicaciones (diagnostico, quimica ambiental, industria, etc)

OBJETIVOS EN LA PURIFICACIÓN

1.- MÁXIMA CANTIDAD POSIBLE

Porcentaje de enzima purificada respecto a la cantidad original

2.- MÁXIMA ACTIVIDAD CATALÍTICA

Enzima en condiciones operativas

3.- MÁXIMA PUREZA

No contenga otras proteínas, esto condiciona el uso del enzima

EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

GRADO DE PURIFICACIÓN

Incremento de actividad específica respecto a la de partida

RENDIMIENTO

Porcentaje de enzima purificada

Parámetros que se evalúan en la purificación

Concentración de proteínas

Actividad enzimática

6006000010080Cromat

Intercam. iónico

80000

100000

Actv.

(und)

20040090Cromat. exclusión

10100001400Extracto celular

Actividad específica

Units/mg

Total Prot

(mg)

Volum.

(ml)

Tabla de Purificación

Grado de purificación

20

60

1

Rendimiento

-

-

-

UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Unidad internacional de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar

Katal, cantidad de enzima que consume un mol de sustrato por segundo

1 kcat = 60 106 UI

ACTIVIDAD ESPECÍFICAEs el resultado de dividir la actividad en UI por la cantidad de proteína presente en la fracción Pureza

REGLAS BÁSICAS PARA LA SELECCIÓN DE UN PROCESO DE PURIFICACIÓN

1. Elige procesos de separación basados en las diferentes propiedades fisico-químicas

2. Elige condiciones que exploten las mayores diferencias posibles entre las propiedades de la enzima a purificar y las proteínas contaminantes

3. En el primer paso separa las mayor parte de las proteínas contaminantes

4. Usa un paso muy selectivo tan pronto como sea posible

5. El último paso se reserva para la tecnología mas costosa

Fuente

Separación

Purificación es un procedimiento secuencial

Hay actividad?Desechar No Combinar

FraccionesSI

Control depureza

Ensayo de la cantidad de proteínas

Ensayo de la actividad enzimática

Pura?

Estudios enzimáticos/estructurales, etc

SI

No

Repetir con otra tecnica de separación

Preparación

Técnica de separación

FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓNAISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

Agentes quelantesAgentes quelantesRaro Raro cualquieracualquieraMetales pesadosMetales pesados

Separación del inhibidorSeparación del inhibidorRaroRaroPlantas y bacteriasPlantas y bacteriasInhibidores Inhibidores específicosespecíficos

Concentración rápidaConcentración rápidaBastante comúnBastante comúncualquieracualquieraDilución proteínaDilución proteína

Agentes reductoresAgentes reductorescomún común cualquieracualquieraoxidaciónoxidación

Agentes reductoresAgentes reductoresBastante comúnBastante comúnPlantas y hongosPlantas y hongosProductos Productos oxidación de oxidación de

fenolesfenoles

Inhibidores de Inhibidores de proteasas o fríoproteasas o frío

ComúnComúnmayoríamayoríaProteasaProteasa

CalentamientoCalentamientorarorarocualquieracualquieraFrioFrio

EnfriamientoEnfriamientouniversaluniversalcualquieracualquieraCalorCalor

Modo de Modo de contrarrestarlocontrarrestarlo

frecuenciafrecuenciaFuente de enzimaFuente de enzimaFactor Factor inactivanteinactivante

FUENTES DE ENZIMAS

1. ABUNDANCIA DE LA ENZIMA Fuentes mucha riqueza enzimática

Ej Acetil-CoA carbosilasa Glándulas mamarias Fosfatasa alcalina Riñón

E. Coli Manipula genéticamente/(ambientalmente)

2. POSIBILIDAD DE OBTENCIÓN DE LA FUENTE

Glándula pituitaria (buena fuente) NO fácil disponibilidad

3. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR

Ubicación de la enzima muy importante para el diseño del sistema de purificación

Enzymea EC numberb SourceIntra/extra-cellularc

 Scale of productiond Industrial  use

Animal enzymes        Catalase 1.11.1.6 Liver I  - FoodChymotrypsin 3.4.21.1 Pancreas E  - LeatherLipasee 3.1.1.3 Pancreas E  - FoodRennetf 3.4.23.4 Abomasums E + CheeseTrypsin 3.4.21.4 Pancreas E - LeatherPlant enzymes        Actinidin 3.4.22.14 Kiwi fruit E - Fooda-Amylase 3.2.1.1 Malted barley E +++ Brewingb-Amylase 3.2.1.2 Malted barley E +++ BrewingBromelain 3.4.22.4 Pineapple latex E  - Brewingb-Glucanaseg  3.2.1.6 Malted barley E  ++ BrewingFicin 3.4.22.3 Fig latex E - FoodLipoxygenase 1.13.11.12 Soybeans I - FoodPapain 3.4.22.2 Pawpaw latex E ++ MeatBacterial enzymes        a-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starchb-Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + StarchAsparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli I - HealthGlucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrupPenicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - PharmaceuticalProteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ DetergentPullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - StarchFungal enzymes        a-Amylase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ BakingAminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus I - PharmaceuticalGlucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ StarchCatalase 1.11.1.6 Aspergillus I - FoodCellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - WasteDextranase 3.2.1.11 Penicillium E - FoodGlucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus I - FoodLactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - DairyLipasee 3.1.1.3 Rhizopus E - FoodRennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ CheesePectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ DrinksPectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - DrinksProteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + BakingRaffinaseo 3.2.1.22 Mortierella I - FoodYeast enzymes          Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E  - ConfectioneryLactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - DairyLipasee 3.1.1.3 Candida E - FoodRaffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces I - Food

Células, tejidos,etc

Rúptura

Pellet con células intactas, organulos, membranas y proteínas de membrana

Sobrenadante con proteínas solubles

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO

Enzimas intracelulares es necesario la ruptura celular

Células sin pared rígida (tejido de mamiferos) Fácil (Pistilo giratorio)

Células de pared rígida (plantas, hongos, bacterias, etc). a) Desecación b) Cizalla líquida a presión. Prensa French, Fraccionador de Sorvall-Ribi, etc c) Cizalla líquida con abrasivos. Bolas de vidrio 0,1 mm bacterias, 0,5 mm levaduras d) Sonicación (bacterias) e) Enzimas Líticas Lisozima, quitinasas, glucanasas, etc. f) Tratamientos químicos Detergentes, solventes orgánicos (tolueno,acetona, etc) agentes caotrópicos (Urea, Guanidina, etc)

ELIMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Inclusión dependerá

- De la cantidad de ácidos nucleicos - Del uso del enzima (uso terapéutico debe estar libre)

Eliminación es conveniente _ Interacciona con la enzima (agrega) Viscosidad del medio (impide manipulación, en procesos de filtración, centrifugación, etc).

METODO DE ELIMINACIÓNAdición de policationes Estreptomicina Proteína básica (protamina) Polietilamina (polímero catiónico)Enzimas (NUCLEASAS)

PROPIEDADES FISICO-QUÍMICAS UTILIZADAS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

Característica  

Procedimientos

Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifugacion 

Solubilidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH

Hidrofobicidad C. De interaccion hidrofóbica

Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque

Selectividad Cromatografia de afinidad 

Tamaño

• Diálisis (membranas semipermeables)

Tamaño

• Ultrafiltracion

• Centrifugación en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa tubo de

centrifugaLos componentes de la mezcla se separan por:• Peso• Tamaño• Densidad• Forma

Coeficiente de sedimentaciónS = M (1-V)

N fM: peso molecularV: Volumen espécifico: densidad de la soluciónN : numero de avogadroF: coeficiente de fricción

Las proteinas migran de forma proporcional a este coeficiente

Cromatografía de filtración

• Las columnas rellenas polimeros inertes

Sephadex: polimeros de dextranoSepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzadaSephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

Tamaño

.

        

               

     

               

   

             

        

                

     

               

    

                           

 

                           

 

                           

 

                            

                            

1.La columna se equilibra con el buffer de corrido2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)3. Elución.

Exclusión molecularSepara mezclas de proteínas por tamaño

Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula r 2 x h

Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

Kav

Log Mw

Tarea

• La enzima pepsina y grupo de marcadores fueron eluidos de una columna de sephadex. Los volumenes de elución junto con los marcadores moleculares son los siguientes. Determina el peso molecular de la pepsina

?127Pepsina

13000158Citocromo C

17000150Mioglobina

23000139Chimiotripsinogeno

45000121Ovoalbumina

66000 107Albúmina

PESO MOLECULARVOLUMEN ELUCION ml

Proteína

Solubilidad

• Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación

• Mantiene nativa a la proteina

• Redisolucion sin perdida de actividad

• Proteina composicion de aa le otorga un comportamiento

La solubilidad de la proteína depende:

Interacción intraproteina

Interaccíon proteína-proteína

Interacción proteína- disolvente

Interacciones mencionadas dependen de:

• pH

• Fuerza iónica

• Disolvente

• Temperatura

Solubilidad

Solubilidad-pH

La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos

Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero pI

Solubilidad es minina

Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)

Solubilidad-pH

Solubilidad-Fuerza iónica• Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)

aumenta con la [ sales] Salting in

• La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting out

La alta [sal] elimina la esfera de solvatación de la proteína

Las proteínas en H2O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos precipitan

Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contraiones más soluble por > interacción prot-solv

Capturan el H2O y > interacción prot-prot.

Solubilidad-Disolventes

• Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL)

• Se usan en distintas proporciones

•  Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas

Solubilidad- Temperatura

• 0-40 oC >T > solubilidad.

• 40-50oC aumenta la inestab y DESNATURALIZAN ( solubilidad)

CargaCarga y signo depende de las proteínas

Cromatografía de intercambio iónico

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7

Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta.

Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7

Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan carga positiva neta.

+

+

+

+

++

+

+

+

---

-

----

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

--

-

---

---

- -- -

-

-

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

-

--

-

-

---

-

-

---

-

- -

--

-

Proteínas adsorbidasal intercambiador

iónico

A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos

electronegativas

A mayor concentración

de sal se desprenden las proteínas máselectronegativas

Intercambio iónico

O

OH

HOCH2

OHH

H

HOO

O

OH

HOCH2

OH

O

H

H

H

H

nCelulosa

O

O

H

H

OH

CH2

O

H

O

O

OH

OH

HOCH2

H

O

H

H

n

Agarosa

O

OH

CH2

OH

H

HOH

O

OH

OH

H

H

CH2

O

H

O

H

H

OH

H

O

n

Dextrano

Soportes cromatográficos

CH2 CH2 NH+CH2

CH2 CH3

CH3

Dietilaminoetil (DEAE)

CH2 CH2 N+ CH2 CH3

CH2

CH3

CH2

CH3

Trietilaminoetil (TEAE)

CH2 CH2 N+ CH2

CH2

CH3

CH2

CH3

CHOH CH3

Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)

CH2 COO-

Carboximetil (CM)

CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfoetil (SE)

CH2 CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfopropil (SP)

O P

O

O-

O-

Fosfo (P)

ISOELECTROENFOQUE

Carga

Carga

Hidrofobicidad

Cromatografía de hidrofobicidad fracciona a las proteínas explotando los diferentes grados de hidrofobicidad superficial de las proteínas.

Las muestras se cargan con una alta fuerza iónica

La elución se produce con un gradiente de fuerza iónica negativa, se pueden incluir detergentes o sustancias orgánicas

Tipo de resina, consiste en partes hidrofóbicas unidas a una matriz inerte

Fenil-Sefarosa, octil sefarosa

Selectividad Cromatografía afinidad

Método más poderoso y selectivo

Ligando: Sustrato, Cofactor, Inhibidor, Anticuerpo, etc

Elución: Bajando el pH, aumentando fuerza iónica, incluir ligando soluble, etc

Problemas:No se puede anclar el ligandoEl anclaje produce un cambio conformacionalFuerza de unión debe ser mediaInespecificidad

TEST JUZGAR EL ÉXITO DE UNA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

Test de pureza

- Electroforesis en gel de acrilamida. 1D ó 2D

Tinción? Plata, Comassie, Fluerescencia, etc

- Isoelectroenfoque.

-Espectrometria de masas

Test de actividad

TÉCNICAS DE PURIFICACIÓNTÉCNICAS DE PURIFICACIÓN

• Diseño de enzimas:

La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese.

Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula.

Adición de colas de afinidad.

Tarea

• Después de la extracción y purificación de una enzima microbiana, esta es muy poco estable para su uso industrial.

• ¿Qué piensas que se puede hacer para aumentar la estabilidad?