TEMA 2
PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
Introducción ¿Por que se purifican las enzimas?Objetivos y estrategias Reglas básicas para la selección de un proceso de purificaciónEvaluación de la purificación
¿POR QUE SE PURIFICAN LAS ENZIMAS?
- Conocer exactamente la reacción catalizada
- Mecanismos de catálisis
- Parámetros cinéticos
- Regulación (alosterismo, modificaciones postraduccionales, etc)
- Estudios estructurales (Rayos X, RMN, Dicroismo circular óptico)
- Información escalado industrial
Estudio aplicaciones (diagnostico, quimica ambiental, industria, etc)
OBJETIVOS EN LA PURIFICACIÓN
1.- MÁXIMA CANTIDAD POSIBLE
Porcentaje de enzima purificada respecto a la cantidad original
2.- MÁXIMA ACTIVIDAD CATALÍTICA
Enzima en condiciones operativas
3.- MÁXIMA PUREZA
No contenga otras proteínas, esto condiciona el uso del enzima
EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA
GRADO DE PURIFICACIÓN
Incremento de actividad específica respecto a la de partida
RENDIMIENTO
Porcentaje de enzima purificada
Parámetros que se evalúan en la purificación
Concentración de proteínas
Actividad enzimática
6006000010080Cromat
Intercam. iónico
80000
100000
Actv.
(und)
20040090Cromat. exclusión
10100001400Extracto celular
Actividad específica
Units/mg
Total Prot
(mg)
Volum.
(ml)
Tabla de Purificación
Grado de purificación
20
60
1
Rendimiento
-
-
-
UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Unidad internacional de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar
Katal, cantidad de enzima que consume un mol de sustrato por segundo
1 kcat = 60 106 UI
ACTIVIDAD ESPECÍFICAEs el resultado de dividir la actividad en UI por la cantidad de proteína presente en la fracción Pureza
REGLAS BÁSICAS PARA LA SELECCIÓN DE UN PROCESO DE PURIFICACIÓN
1. Elige procesos de separación basados en las diferentes propiedades fisico-químicas
2. Elige condiciones que exploten las mayores diferencias posibles entre las propiedades de la enzima a purificar y las proteínas contaminantes
3. En el primer paso separa las mayor parte de las proteínas contaminantes
4. Usa un paso muy selectivo tan pronto como sea posible
5. El último paso se reserva para la tecnología mas costosa
Fuente
Separación
Purificación es un procedimiento secuencial
Hay actividad?Desechar No Combinar
FraccionesSI
Control depureza
Ensayo de la cantidad de proteínas
Ensayo de la actividad enzimática
Pura?
Estudios enzimáticos/estructurales, etc
SI
No
Repetir con otra tecnica de separación
Preparación
Técnica de separación
FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓNAISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
Agentes quelantesAgentes quelantesRaro Raro cualquieracualquieraMetales pesadosMetales pesados
Separación del inhibidorSeparación del inhibidorRaroRaroPlantas y bacteriasPlantas y bacteriasInhibidores Inhibidores específicosespecíficos
Concentración rápidaConcentración rápidaBastante comúnBastante comúncualquieracualquieraDilución proteínaDilución proteína
Agentes reductoresAgentes reductorescomún común cualquieracualquieraoxidaciónoxidación
Agentes reductoresAgentes reductoresBastante comúnBastante comúnPlantas y hongosPlantas y hongosProductos Productos oxidación de oxidación de
fenolesfenoles
Inhibidores de Inhibidores de proteasas o fríoproteasas o frío
ComúnComúnmayoríamayoríaProteasaProteasa
CalentamientoCalentamientorarorarocualquieracualquieraFrioFrio
EnfriamientoEnfriamientouniversaluniversalcualquieracualquieraCalorCalor
Modo de Modo de contrarrestarlocontrarrestarlo
frecuenciafrecuenciaFuente de enzimaFuente de enzimaFactor Factor inactivanteinactivante
FUENTES DE ENZIMAS
1. ABUNDANCIA DE LA ENZIMA Fuentes mucha riqueza enzimática
Ej Acetil-CoA carbosilasa Glándulas mamarias Fosfatasa alcalina Riñón
E. Coli Manipula genéticamente/(ambientalmente)
2. POSIBILIDAD DE OBTENCIÓN DE LA FUENTE
Glándula pituitaria (buena fuente) NO fácil disponibilidad
3. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR
Ubicación de la enzima muy importante para el diseño del sistema de purificación
Enzymea EC numberb SourceIntra/extra-cellularc
Scale of productiond Industrial use
Animal enzymes Catalase 1.11.1.6 Liver I - FoodChymotrypsin 3.4.21.1 Pancreas E - LeatherLipasee 3.1.1.3 Pancreas E - FoodRennetf 3.4.23.4 Abomasums E + CheeseTrypsin 3.4.21.4 Pancreas E - LeatherPlant enzymes Actinidin 3.4.22.14 Kiwi fruit E - Fooda-Amylase 3.2.1.1 Malted barley E +++ Brewingb-Amylase 3.2.1.2 Malted barley E +++ BrewingBromelain 3.4.22.4 Pineapple latex E - Brewingb-Glucanaseg 3.2.1.6 Malted barley E ++ BrewingFicin 3.4.22.3 Fig latex E - FoodLipoxygenase 1.13.11.12 Soybeans I - FoodPapain 3.4.22.2 Pawpaw latex E ++ MeatBacterial enzymes a-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starchb-Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + StarchAsparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli I - HealthGlucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrupPenicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - PharmaceuticalProteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ DetergentPullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - StarchFungal enzymes a-Amylase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ BakingAminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus I - PharmaceuticalGlucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ StarchCatalase 1.11.1.6 Aspergillus I - FoodCellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - WasteDextranase 3.2.1.11 Penicillium E - FoodGlucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus I - FoodLactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - DairyLipasee 3.1.1.3 Rhizopus E - FoodRennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ CheesePectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ DrinksPectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - DrinksProteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + BakingRaffinaseo 3.2.1.22 Mortierella I - FoodYeast enzymes Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - ConfectioneryLactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - DairyLipasee 3.1.1.3 Candida E - FoodRaffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces I - Food
Células, tejidos,etc
Rúptura
Pellet con células intactas, organulos, membranas y proteínas de membrana
Sobrenadante con proteínas solubles
OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO
Enzimas intracelulares es necesario la ruptura celular
Células sin pared rígida (tejido de mamiferos) Fácil (Pistilo giratorio)
Células de pared rígida (plantas, hongos, bacterias, etc). a) Desecación b) Cizalla líquida a presión. Prensa French, Fraccionador de Sorvall-Ribi, etc c) Cizalla líquida con abrasivos. Bolas de vidrio 0,1 mm bacterias, 0,5 mm levaduras d) Sonicación (bacterias) e) Enzimas Líticas Lisozima, quitinasas, glucanasas, etc. f) Tratamientos químicos Detergentes, solventes orgánicos (tolueno,acetona, etc) agentes caotrópicos (Urea, Guanidina, etc)
ELIMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Inclusión dependerá
- De la cantidad de ácidos nucleicos - Del uso del enzima (uso terapéutico debe estar libre)
Eliminación es conveniente _ Interacciona con la enzima (agrega) Viscosidad del medio (impide manipulación, en procesos de filtración, centrifugación, etc).
METODO DE ELIMINACIÓNAdición de policationes Estreptomicina Proteína básica (protamina) Polietilamina (polímero catiónico)Enzimas (NUCLEASAS)
PROPIEDADES FISICO-QUÍMICAS UTILIZADAS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
Característica
Procedimientos
Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifugacion
Solubilidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH
Hidrofobicidad C. De interaccion hidrofóbica
Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad
Tamaño
• Diálisis (membranas semipermeables)
Tamaño
• Ultrafiltracion
• Centrifugación en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa tubo de
centrifugaLos componentes de la mezcla se separan por:• Peso• Tamaño• Densidad• Forma
Coeficiente de sedimentaciónS = M (1-V)
N fM: peso molecularV: Volumen espécifico: densidad de la soluciónN : numero de avogadroF: coeficiente de fricción
Las proteinas migran de forma proporcional a este coeficiente
Cromatografía de filtración
• Las columnas rellenas polimeros inertes
Sephadex: polimeros de dextranoSepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzadaSephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano
Tamaño
.
1.La columna se equilibra con el buffer de corrido2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)3. Elución.
Exclusión molecularSepara mezclas de proteínas por tamaño
Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo
Kav
Log Mw
Tarea
• La enzima pepsina y grupo de marcadores fueron eluidos de una columna de sephadex. Los volumenes de elución junto con los marcadores moleculares son los siguientes. Determina el peso molecular de la pepsina
?127Pepsina
13000158Citocromo C
17000150Mioglobina
23000139Chimiotripsinogeno
45000121Ovoalbumina
66000 107Albúmina
PESO MOLECULARVOLUMEN ELUCION ml
Proteína
Solubilidad
• Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación
• Mantiene nativa a la proteina
• Redisolucion sin perdida de actividad
• Proteina composicion de aa le otorga un comportamiento
La solubilidad de la proteína depende:
Interacción intraproteina
Interaccíon proteína-proteína
Interacción proteína- disolvente
Interacciones mencionadas dependen de:
• pH
• Fuerza iónica
• Disolvente
• Temperatura
Solubilidad
Solubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos
Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero pI
Solubilidad es minina
Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)
Solubilidad-pH
Solubilidad-Fuerza iónica• Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting in
• La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting out
La alta [sal] elimina la esfera de solvatación de la proteína
Las proteínas en H2O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos precipitan
Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contraiones más soluble por > interacción prot-solv
Capturan el H2O y > interacción prot-prot.
Solubilidad-Disolventes
• Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL)
• Se usan en distintas proporciones
• Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas
Solubilidad- Temperatura
• 0-40 oC >T > solubilidad.
• 40-50oC aumenta la inestab y DESNATURALIZAN ( solubilidad)
CargaCarga y signo depende de las proteínas
Cromatografía de intercambio iónico
Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7
Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta.
Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7
Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan carga positiva neta.
+
+
+
+
++
+
+
+
---
-
----
--
-
+
+
+
+
++
+
+
+
-
--
-
---
---
- -- -
-
-
--
-
+
+
+
+
++
+
+
+
-
-
--
-
-
---
-
-
---
-
- -
--
-
Proteínas adsorbidasal intercambiador
iónico
A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos
electronegativas
A mayor concentración
de sal se desprenden las proteínas máselectronegativas
Intercambio iónico
O
OH
HOCH2
OHH
H
HOO
O
OH
HOCH2
OH
O
H
H
H
H
nCelulosa
O
O
H
H
OH
CH2
O
H
O
O
OH
OH
HOCH2
H
O
H
H
n
Agarosa
O
OH
CH2
OH
H
HOH
O
OH
OH
H
H
CH2
O
H
O
H
H
OH
H
O
n
Dextrano
Soportes cromatográficos
CH2 CH2 NH+CH2
CH2 CH3
CH3
Dietilaminoetil (DEAE)
CH2 CH2 N+ CH2 CH3
CH2
CH3
CH2
CH3
Trietilaminoetil (TEAE)
CH2 CH2 N+ CH2
CH2
CH3
CH2
CH3
CHOH CH3
Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)
CH2 COO-
Carboximetil (CM)
CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfoetil (SE)
CH2 CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfopropil (SP)
O P
O
O-
O-
Fosfo (P)
ISOELECTROENFOQUE
Carga
Carga
Hidrofobicidad
Cromatografía de hidrofobicidad fracciona a las proteínas explotando los diferentes grados de hidrofobicidad superficial de las proteínas.
Las muestras se cargan con una alta fuerza iónica
La elución se produce con un gradiente de fuerza iónica negativa, se pueden incluir detergentes o sustancias orgánicas
Tipo de resina, consiste en partes hidrofóbicas unidas a una matriz inerte
Fenil-Sefarosa, octil sefarosa
Selectividad Cromatografía afinidad
Método más poderoso y selectivo
Ligando: Sustrato, Cofactor, Inhibidor, Anticuerpo, etc
Elución: Bajando el pH, aumentando fuerza iónica, incluir ligando soluble, etc
Problemas:No se puede anclar el ligandoEl anclaje produce un cambio conformacionalFuerza de unión debe ser mediaInespecificidad
TEST JUZGAR EL ÉXITO DE UNA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA
Test de pureza
- Electroforesis en gel de acrilamida. 1D ó 2D
Tinción? Plata, Comassie, Fluerescencia, etc
- Isoelectroenfoque.
-Espectrometria de masas
Test de actividad
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓNTÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
• Diseño de enzimas:
La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese.
Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula.
Adición de colas de afinidad.
Tarea
• Después de la extracción y purificación de una enzima microbiana, esta es muy poco estable para su uso industrial.
• ¿Qué piensas que se puede hacer para aumentar la estabilidad?