PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASASPURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASASMEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA MEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA

A LIPASAS INMOVILIZADASA LIPASAS INMOVILIZADAS

Ortiz, C.;Palomo, Ortiz, C.;Palomo, J.MJ.M .;Fernández.;Fernández––Lorente, G.; Fuentes, M.; Lorente, G.; Fuentes, M.; Torres, RTorres, R; ; Guisán, J.M.;FernándezGuisán, J.M.;Fernández--Lafuente, R.Lafuente, R.

LABORATORIO DE BIOCATÁLISISLABORATORIO DE BIOCATÁLISISINSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICAINSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA--CSICCSIC

PURIFICACION DE ENZIMASPurificación de EnzimasPurificación de Enzimas

Alta actividad volumétricaAlta actividad volumétrica

EE11

R CO

NH

R' COO R''

EE22 EE33

ReacciónReaccióna evitara evitar

ReacciónReaccióna evitara evitarReacciónReacción

deseadadeseada

Reacciones indeseablesReacciones indeseables

Oxidaciones…Oxidaciones…Hidrólisis…Hidrólisis…

Purificación de EnzimasPurificación de Enzimas

PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO

UV280

Ve

Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/mlml))Desorción selectiva de nuestra enzimaDesorción selectiva de nuestra enzimaVarios procesos cromatográficos…Varios procesos cromatográficos…No importa tiempo ni dineroNo importa tiempo ni dinero

PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMASPurificación de EnzimasPurificación de Enzimas

Métodos sencillos, rápidos y baratosMétodos sencillos, rápidos y baratosPocos pasos cromatográficosPocos pasos cromatográficosColumnas cromatograficas pequeñasColumnas cromatograficas pequeñas

UV280

Ve

Adsorción selectiva Adsorción selectiva 100 mg/ml columna100 mg/ml columnaConocer mucho mejor los mecanismos de interacciConocer mucho mejor los mecanismos de interaccióónn

Activación interfacial en presencia de interfases

Purificación de LipasasPurificación de Lipasas

Conformación cerrada

Cara Cara externaexterna del Liddel Lid

Conformación abierta

LIPASAS

Interfase hidrofóbica

Conformación abierta

SitioSitio activoactivo

Cara Cara internainterna del Liddel Lidzonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica

LipasasLipasas

LIPASAS

Diferentes conformaciones de lipasas

INACCESIBLE A SUSTRATOSINACCESIBLE A SUSTRATOS

Medios acuosos Medios acuosos Conformación cerradaConformación cerrada

ACCESIBLE A SUSTRATOS ACCESIBLE A SUSTRATOS

Interfases hidrofóbicasInterfases hidrofóbicasConformación abiertaConformación abierta

LipasasLipasas

LIPASAS

Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases

zonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica

HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos

Purificación de LipasasPurificación de Lipasas

LIPASAS Adsorción interfacial sobre soportes a baja fuerza iónica

Soporte Hidrofóbico

Conformación cerrada

Conformación abierta

Pequeños bolsillo hidrofóbicos…Pequeños bolsillo hidrofóbicos…

Solo se absorben a Solo se absorben a Fuerza IFuerza Ióónicanica

PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA, A BAJA FUERZA IONICA, SOBRE A SOPORTES HIDROFOBICOS

Purificación de LipasasPurificación de Lipasas

0

500

1000

1500

2000

0 30 60 90Tiempo (minutos)

Act

ividad

Res

idua

l (%

)

HLL

0

200

400

600

800

0 20 40 60Tiempo (minutos)

Act

ividad

Res

idua

l (%

)

PFL

0

200

400

600

800

0 30 60 90

Tiempo (minutos)

Act

ivid

ad R

esid

ual (

%)

RNL

Mecanismo de activación interfacial yPurificación de lipasas

Purificación de LipasasPurificación de Lipasas

Las Las lipasaslipasas se se adsorbenadsorben específicamenteespecíficamente a superficies a superficies hidrofóbicas (a hidrofóbicas (a bajabaja fuerzafuerza iónicaiónica))

CadaCada lipasalipasa se se adsorbeadsorbe de de unauna forma forma diferentediferente a a soportessoportes hidrofóbicos hidrofóbicos diferentesdiferentes

AumentoAumento de de actividadactividad haciahacia sustratossustratos solublessolubles pequeñospequeños y y alteraciónalteración de de susu enantioselectividadenantioselectividad

Purificación de lipasas de otras proteínas(Adsorción selectiva sobre matrices hidrofóbicas)

Purificación de lipasas entre sí(Desorción selectiva con detergentes o co-disolventes)

LipasasLipasas

LIPASAS

Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases

zonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica

HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos

Purificación de LipasasPurificación de Lipasas

Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa

Lipasa1 Inmovilizada Lipasa2 Soluble

Dimero Lipasa Inmovilizada- Lipasa

LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS Y SOPORTES GLIOXILY SOPORTES GLIOXIL

pH 8.0 (NO)pH 8.0 (NO)

NHNH22

pH 10.0 (SI)pH 10.0 (SI)

NHNH22

HH22NN

HH22NN

HH22NN

HH22NN

pH 10.0 (NO)pH 10.0 (NO)

NHNH22

HH22NN

HH22NN

HH22NN

HH22NN

Regiones muy ricasRegiones muy ricasen grupos aminosen grupos aminos

Desarrollo del Soporte Desarrollo del Soporte

Desarrollo del SoporteDesarrollo del Soporte

PUNTO FINAL DE LA MULTIPUNTO FINAL DE LA MULTI--INTERACCION ENZIMAINTERACCION ENZIMA--SOPORTESOPORTE

NaBH4

1mg/ml

O CH2 C

O

H

O CH2 C

O

H

NO CH2 CH

NO CH2 CH

NO CH2 CH NHO CH2 CH2

O CH2 CH2OH

NHO CH2 CH2

NHO CH2 CH2

O CH2 CH2OH

Metodología ExperimentalMetodología Experimental

Selección de la enzima adsorbente

CARA FRONTALCARA FRONTAL CARA OPUESTACARA OPUESTA

LYS

LYS

LYS

LYSLYS

LIPASA DE LIPASA DE PseudomonasPseudomonas fluorescensfluorescens (PFL)(PFL)

lipasa estable y capaz de formar dímeroslipasa con las lisinas en la cara opuesta a su centro activo

Metodología ExperimentalMetodología Experimental

Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa

Glioxil-Agarosa-lipasa 1-Lipasa 2GlioxilGlioxil--AgarosaAgarosa--lipasa 1lipasa 1

(Soporte)(Soporte)

Lavado con Lavado con aguaagua

Lipasa 1 estabilizadaLipasa 1 estabilizadaSoporte inerteSoporte inerteGlioxilGlioxil--agarosaagarosa

H

O

H

O

H

O

Tritón XTritón X--100100

H2N

H2N

H2N

(pH 10, NaBH4))

LipasaLipasa--SolubleSoluble

ResultadosResultados

Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa

SDS-PAGEde PFL purificada

20.120.1

94946767

3030

4343

11 3322

Línea 1. Marcadores de peso molecular1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial de PFLLínea 2. Extracto comercial de PFLLínea 3. PFL adsorbida sobre Línea 3. PFL adsorbida sobre glioxil agarosaglioxil agarosa--PFLPFL

Inmovilización de PFL sobre glioxil-agarosa

BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadanteSuspensiónSuspensión

0

20

40

60

80

100

0 6 12 18 24Tiempo (h)

Act

ivid

ad R

esid

ual (

%)

Adsorción de PFLsobre glioxil-agarosa-PFL

BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadante

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4Tiempo (h)

Act

ivid

ad R

esid

ual (

%)

ResultadosResultados

Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa

B

94

67

43

30

Mr (kDa)

20.1

1 2 3

Línea 1. Marcadores de peso molecularLínea 1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial BTLLínea 2. Extracto comercial BTLLínea 3. Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 3. Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFL

A

0

25

50

75

100

0 20 40 60

Tiempo (min)

Act

ivid

ad R

esid

ual (

%)

Adsorción de BTLsobre glioxil-agarosa-PFL

BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadante

Adsorción del extracto enzimático de Bacillus thermocatenulatus (BTL)

ResultadosResultados

Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa

Línea 1. Marcadores de peso molecularLínea 1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial RMLLínea 2. Extracto comercial RMLLínea 3. Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 3. Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 4. Extracto comercial HLLLínea 4. Extracto comercial HLLLínea 5. Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 5. Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 6. Extracto comercial ROLLínea 6. Extracto comercial ROLLínea 7. Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 7. Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFL

9494

6767

4343

3030

MrMr ((kDakDa))

20.120.1

11 22 33 44 55 66 77

Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de ••RhizomucorRhizomucor mieheimiehei (RML)(RML)••HumicolaHumicola lanuginosalanuginosa (HLL)(HLL)••RhizopusRhizopus oryzaeoryzae (ROL)(ROL)

ResultadosResultados

Desarrollo de Biocatalizador de lipasa 2 Inmovilizada sobreSoporte glioxil-agarosa-lipasa1

Glioxil-Agarosa-lipasa 1

SerSer

(D(D--pNPpNP))

Glioxil-Agarosa- Lipasa 1-Lipasa 2

Lipasa 2Lipasa 2

Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa

ResultadosResultados

Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa

DerivadoPFL

ActividadEspecífica

(U/g)

Conversión(%)

ee E

Octil-agarosa-PFL 23 14.6 97 76 SGlioxil-agarosa-PFL 0.019 15 81 9.6 S

Glioxil-agarosa-PFL*-PFL 0.077 9.4 99 >100 S

Hidrólisis enantioselectiva del (R,S) HPBEt 10 mMcon derivados de PFL, a pH 5 y 25 ºC

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

CONCLUSIONES

La lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada covalentemente sobre soportes glioxil-agarosa resultó ser un excelente soportehidrofóbico para la adsorción selectiva de otras lipasas.

Es posible obtener dímeros glioxil-agarosa-PFL-Lipasa, pudiéndose utilizar este método como estrategia de purificación e inmovilización de diferentes extractos crudos de lipasas.

Diferentes derivados de una misma lipasa presentaron distintaspropiedades catalíticas (Actividad y Enantioselectividad) en lasmismas condiciones de reacción.

MUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIAS