UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS

CENTRO DE BIOCIENCIAS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS

CENTRO DE BIOCIENCIAS

LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

UNIDADES DE HABILITACIÓN DE TALLER EXPERIMENTAL III

CUERPOS ACADÉMICOS DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA AVANZADA

TAPACHULA, CHIAPAS, MÉXICO. 2009

CenBio

UNACH

LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

UNIDADES DE HABILITACIÓN DE TALLER EXPERIMENTAL III

PROFESOR RESPONSABLE:

MC. J. ALFREDO VÁZQUEZ OVANDO

PROFESORES PARTICIPANTES:

Dr. Pablo Jesús Montoya Gerardo

CONTENIDO

Normas de laboratorio 4

Práctica 1 Pigmentos vegetales5

Práctica 2 Reconocimiento de biomoléculas 7

Práctica 3 Fenómenos de membrana-ósmosis11

Práctica 4 Cuantificación de proteínas (métodos de Fenol-Folin o Lowry, de Bradford y espectrofotométrico)

13

Práctica 5 Construyendo un habitat 16Práctica 6 Ciclo del carbono-Fotosíntesis 18Práctica 7 Dinámica poblacional 21

El frijolarium 22Poblaciones de lombrices 25

Práctica 8 Fotosíntesis: extracción, separación y cuantificación de pigmentos vegetales

26

Práctica 9 Aislamiento y purificación de una proteína 30Práctica 10 Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de

reacción32

PRÁCTICA No. 1. Pigmentos vegetales

Los pigmentos presentes en las plantas tienen diferentes funciones biológicas como la captación de luz, protección contra procesos oxidativos o simplemente confieren una tonalidad característica al tejido u órgano de la planta. Desde el punto de vista cuantitativo, la clorofila es el pigmento más importante en las plantas superiores. La clorofila se encuentra en las membranas tilacoidales de los cloroplastos y es responsable de la captación de luz en la fotosíntesis. La clorofila presenta en su estructura un anillo tetrapirrólico que es responsable de la absorción de la luz en la zona azul y roja del espectro, por lo que los tejidos donde este pigmento es muy abundante son de color verde (Figura 1).

Figura 1. Estructura de las moléculas de clorofila a y b. El radical R1 es –CH3 en la clorifila a y –CHO en la clorofila b.

Los carotenoides representan un grupo muy importante de pigmentos vegetales que cumplen diversas funciones biológicas. Estos pigmentos derivan del isopentenil pirofosfato y son de color amarillo o naranja según el grado de oxidación de la molécula. Uno de los carotenoides más llamativos es el licopeno (Figura 2), responsable del color rojo de los frutos de tomate y que se acumula en el interior del cloroplasto durante la maduración de los frutos.

Figura 2. Estructura de la molécula de licopeno

Estos pigmentos se han empleado como marcadores del grado de maduración de los frutos, proceso en el que tiene lugar la diferenciación del cloroplasto a cromoplasto, y asociado a ella, la degradación de la clorofila y la síntesis y acumulación de licopeno en el interior del plasto.

Objetivo: que el alumno pueda extraer y cuantificar la clorofila y el licopeno de frutos de tomate, así como determinar los espectros de absorción de estas biomoléculas.

Materiales y Métodos

Tubos Nalgene® de 15 mL, Celdas de vidrio, Centrífuga de mesa, Espectrofotómetro, hexano:acetona (3:2) y Acetona

Procedimiento

1. Tomar aproximadamente 2 g de pericarpio de tomate y disgregarlo con una varilla de vidrio en el interior de un tubo Nalgene® de 15 mL. Anotar los pesos.

2. Por cada gramo de pericarpio, añadir 2 mL de la mezcla de disolventes orgánicos (hexano:acetona, 3:2). Tapar los tubos rápidamente, los disolventes son muy volátiles.

3. Agitar vigorosamente hasta completar la extracción de los pigmentos.

4. Centrifugar durante 5 minutos a 4000 rpm.

5. Recuperar la fase orgánica superior, que contiene los pigmentos, con pipeta Pasteur y pasarlo a otro tubo. Anotar los volúmenes.

5. Hacer un barrido y recoger los espectros de absorción de ambos pigmentos entre 400 y 700 nm.

6. Anotar la absorbancia a 502, 650 y 665 nm.

Después de la práctica, y para su reporte.

1. Calcular la cantidad de pigmentos extraídos de acuerdo a las siguientes expresiones:

[Licopeno µg /mL] = A502/0.32

[Clorofila µg /mL] = (6.45 × A665) + (17.72 × A650)

comentar el resultado.

2. Calcular la cantidad de pigmentos extraída por gramo de tejido.

3. Esquematizar los espectros de absorción de la clorofila y el licopeno y razonar, en base a ellos, sus propiedades.

PRÁCTICA No. 2. Reconocimiento de Biomoléculas

I.- Identificación de azucares con poder reductor

Todos los monosacáridos y los disacáridos con enlace monocarbonilo, cuando se encuentran en solución a pH alcalino, tienen la capacidad de reducir otros compuestos. Esta capacidad reside en las características del grupo carbonilo (C anomérico en formas cicladas) libre. Esta propiedad, y por tanto la presencia de un azúcar reductor, se pone de manifiesto mediante la reacción de Fehling.

Los recativos de Fehling están compuestos de:

-Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O

-Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disueltos en agua

Fundamento de la reacción: En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4. Cuando el Cu(OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma óxido cuproso (de color rojo ladrillo).

C u S O 4 C u (O H ) (a z u l)2 C u O (ro jo la d rillo )2N a O H

+ C a lo r+ R

Si hay un compuesto reductor (como los azucares), el Cu cambia su estado de oxidación de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color.

II.- Identificación de polisacáridos: identificación de almidón mediante la prueba del Lugol

En solución acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formación de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las moléculas de H2O. Si a una disolución de almidón se le añade yodo, esta toma un color azul intenso. Esta característica es específica del almidón, debido a su estructura, y se debe a la adsorción del yodo por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Por tanto no es una reacción química, sino una interacción física reversible por métodos físicos. Esto se puede comprobar fácilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y al enfriarla vuelve a aparecer.

III.- Identificación de lípidos. Reacción de saponificación.

La presencia de un lípido se puede detectar fácilmente por su insolubilidad en agua. Además, se puede detectar si un lípido es saponificable, mediante la reacción de saponificación, o formación de jabón.

Los ésteres de ácidos grasos sufren hidrólisis en presencia de un agente alcalino (la misma reacción que para producir biodiesel, ¿RECUERDA?). Esta hidrólisis conduce a la liberación del alcohol y a la formación de sales de ácido graso o jabones, tal como lo muestra el siguiente esquema:

C H 2 O C O R 3

C H 2

C H

O C O R 1

O C O R 2 + 3 N a O H

C H 2 O H

C H 2 O H

C H O H

R C O O -N a1

R C O O -N a2

R C O O -N a3

+

Trig licérido G licerina Sales sódicas deac. grasos (JA B Ó N )

IV. Identificación de proteínas.

Reacción de la ninhidrina.

Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los aminoácidos, en general reaccionan con la ninhidrina (hidrato de hicelohidrandeno) cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, lacoloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoría de los polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en esta reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2.

Recuerde que la coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del aminoácido. La reacción entre una aminoácido y la ninhidrina es la siguiente:

Reacción de Biuret.

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de úrea con eliminación de amoníaco. Esta reacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa

alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul.

Objetivo: Que el alumno pueda en base a reacciones químicas y pruebas características, identificar la presencia de una o varias biomoléculas en una mezcla.

Materiales y métodos

Identificar cual(es) de las muestras proporcionadas contiene azucares reductores.

1. Poner en un tubo de ensayo 2 mL de cada una las muestras proporcionadas por el profesor.

2. Añadir a cada tubo 0.5 mL de Fehling A y 0.5 mL de Fehling B.

3. Calentar a la llama.

Identificar cual(es) de las soluciones proporcionadas, contiene almidón.

1. Poner en un tubo de ensayo 2 mL de cada una de las soluciones proporcionadas por el profesor.

2. Añadir a cada uno de los tubos de ensayo 1 gota de Lugol (solución acuosa de yodo y yoduro potásico). Observar el resultado. Para comprobar que se trata de una interacción física y no de una reacción química, caliente a la flama el tubo que contiene almidón (teñido de azul con yodo), hasta que desaparezca el color azul y enfríe en la llave y observar la aparición de nuevo de color azul.

Identifique cual(es) de la muestras proporcionadas por el profesor contiene lípidos saponificables.

1. Añadir aceite (sin pipetearlo) a un tubo de ensayo, hasta una altura de aproximadamente 1 cm.

2. Añadir 2 mL de NaOH al 20% (p/v) en agua.

3. Agitar enérgicamente.

4. Calentar al baño María, observar y anotar qué ocurre

Identificar en las muestras aquellas que contienen aminoácidos libres.

1. Se toman y rotulan tres tubos de ensayo.2. En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución problema.3. Añadir 5 gotas del reactivo de ninhidrina y se colocan los tubos en un baño de María a 100° C

por 1 minuto. Deje enfriar.

Identificación de muestran que contienen proteínas.

1. Se toman y rotulan tres tubos de ensayo diferentes.2. En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución problema.3. Añadir 2 mL del reactivo de Biuret.

Para todas sus pruebas incluya un tubo con agua destilada como control negativo.

Considere las siguientes cuestiones para la discusión de su reporte.

1. ¿Cúal o cúales son los azucares reductores?2. ¿Quién se oxida y quién se reduce en la reacción de azucares?3. ¿Qué resultado daría la reacción de Fehling con glucosa? ¿y con sacarosa?4. ¿Cuál de los dos soluciones contiene almidón?5. ¿El almidón daría positiva la reacción de Fehling?6. ¿La celulosa daría positiva la prueba del Lugol?7. ¿El azul que aparece tras calentar y enfriar es igual de intenso? ¿Por qué?8. ¿Dónde encontramos lípidos no saponificables?

Práctica 3. Fenómenos de membrana- Ósmosis

El transporte de sustancias entre las células y el medio que le rodea está regulado por los fenómenos de difusión a través de membranas y obedecen principalmente a la propiedad específica de permeabilidad. La osmosis es el proceso mediante el cual el agua entra en la célula desde el exterior, viajando a través de las membranas y se verifica siempre en el sentido de la tendencia a igualar las concentraciones de los componentes a ambos lados de la membrana. Las fuerzas que operan sobre la superficie de la membrana recibe el nombre de presión osmótica la que puede ser considerada: absoluta ó efectiva (tonicidad). Mediante este fenómeno, las membranas dejan entrar al agua, pero no a las sales y a los azúcares; tampoco macromoléculas, colorantes u otros, solo el agua puede realizar este proceso. Sí existe un diferencial de solutos disueltos en el interior y exterior de la célula, el agua atraviesa la membrana para poder equilibrar la concentración a ambos lados de ésta.

Si un determinado tipo celular se coloca en suspensión en un medio hipotónico, esta comienza a hincharse y a llenarse de agua hasta que alcanza un volumen crítico y estalla produciéndose la lisis de la misma. En el caso particular de los glóbulos rojos, en un medio exageradamente hipotónico (H2O destilada) experimenta la hemólisis, con la consiguiente liberación de su hemoglobina al medio externo. La misma puede deberse a una razón osmótica o a otra causa no osmótica.

Objetivo: Verificar el mecanismo de transporte osmótico en membranas artificiales y en células animales.

Materiales y Métodos

Vaso de ppdo de 500 mL3 vasos de ppdo de 250 mL2 embudos de separación de cola largaVarilla de vidrioAgitador de vidrioMarcador indelebleNaCl (traer sal de casa)Hilo para amarrar o ligasPapel celofán4 portaobjetos4 cubreobjetos1 lanceta

Procedimiento

ACTIVIDAD 1

Prepare aprox 500 mL de una solución 15% (p/v) de NaCl. Llene un embudo con esta solución tapando con un dedo, agregue unas gotas de azul de metileno hasta que el color sea notable en la solución. Ajuste al otro extremo del embudo el papel celofán, use hilo o ligas para lograr tal objetivo, asegúrese que no existan fuga de la solución. Repita este mismo procedimiento con otro embudo, solo que esta vez llénelo con agua destilada. Coloque cada uno de los embudos en forma invertida, en un recipiente que contenga: a) agua para el embudo que contiene solución salina y b)solución salina (15% p/v) para el embudo que contiene agua; hasta la parte angosta del embudo.

Marque el nivel que alcanza la solución dentro del embudo. Colóquelos en un lugar donde no se muevan, registre las posibles variaciones de la solución cada 30 min.

Haga sus anotaciones y dibujos para realizar la discusión de su informe, discute que pasaría si el embudo fuera una célula.

Reporte en el formato acostumbrado

ACTIVIDAD 2

Tome 3 portaobjetos, enumérelos y coloque en cada uno de ellos una gota de sangre, enseguida añada gotas de solución de NaCl del siguiente modo:

Portaobjeto 1 = NaCl 1.5 % Portaobjeto 2 = NaCl 0.9 % Portaobjeto 3 = agua destilada

Cubra las preparaciones, observe al microscopio lo ocurrido y haga sus anotaciones y dibujos.

ACTIVIDAD 3

Realice tres cortes muy finos de la parte interna de una papa. Coloque cada una en un portaobjetos y enumérelos para diferenciarlos.

Agregue igual que para las células animales (actividad 2) las soluciones a cada uno de los portaobjetos.

Agregue posteriormente a todos los portaobjetos lugol, deje un minuto y lave con agua abundante. Cubre las preparaciones y observe al microscopio.

Anote sus observaciones, compare y constraste con lo observado para los globulos rojos.

Reporte con una discusión fundamentada de los fenómenos observados

Práctica 4. Cuantificación de proteínas (Métodos de Fenol-Folin o Lowry, de Bradford y espectrofotométrico)

Metodo de Lowry

Basado en la formación de un complejo coloreado entre el Cu++ y los nitrógenos de los enlaces peptídicos llamada reacción de Biuret (Figura 1). Para resaltar el color formado en esta reacción y aumentar la sensibilidad, se hace reaccionar posteriormente con el reactivo de Folin que al ser reducido por los residuos de aminoácidos aromáticos tirosina y triptofano da un color azulado.

Figura 1. Reacción de Biuret implicada en el método de Lowry. Mediante la reacción de Biuret se forma un complejo entre el ion Cu++ y los nitrógenos de los enlaces peptídicos. Por otra parte los residuos aromáticos de la proteína reaccionan con el reactivo

de Folin reduciéndolo

Método espectrofotométrico

Desarrollado en múltiples variantes, aunque la más recomendada es la de Scopes. Se basa en la propiedad de las proteínas de tener un máximo de absorción a 280 nm debido al contenido en los aminoácidos tirosina y triptofano. La variabilidad en estos aminoácidos en diferentes proteínas obliga a añadir un factor de corrección aportado por la absorbancia del enlace peptídico a 205 nm. La concentración se puede obtener aplicando la siguiente expresión:

Método de Bradford

Basado en la unión directa del colorante azul de Coomasie a la estructura terciaria de las proteínas y aminoácidos específicos. El colorante cambia de color de marrón a azul al unirse a proteínas.

No existe un sistema totalmente satisfactorio para determinar la concentración proteica de una muestra. La elección de un método u otro se basa en la naturaleza de la proteína y del resto de componentes de la muestra y en la sensibilidad y precisión requeridos. Un breve resumen de las principales ventajas de los tres métodos anteriores y sus aplicaciones más recomendadas lo vemos en la siguiente tabla (para comparar con el método de Bradford ver práctica siguiente):

Material y métodos

Método del Fenol-Folin o Lowry (Sesión 1)

A partir de una disolución de albúmina de suero bovina (ASB) de 1 mg/ml en bufer PBS o agua, preparar 8 diluciones, con agua, de concentraciones: 0, 20, 40, 80, 160, 240, 320 y 400 μg/ml. A 0.25 ml de cada una de estas diluciones, añadir NaOH 1 M hasta una concentración final de 0.1 M (25 μl). Añadir a cada tubo 2 ml del reactivo 1 (10 volúmenes de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M, 0.1 volúmenes de tartrato sódico potásico al 2% (C4H4O6KNa) y 0.1 volúmenes de CuSO4 al 1%), mezclarlo bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir ahora 225 μl del reactivo 2 (1 volumen de reactivo de Folin, 1 volumen de H20 destilada), mezclarlo bien e incubarlo durante 20 min a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 750 nm, ajustando previamente el 0 del espectrofotómetro con el ensayo en blanco (tubo numero 1). El procedimiento se condensa en el cuadro 1.

Para procesar la muestra proporcionada por el profesor, pipetee 250 μl de su muestra y prosiga igual que la curva (pasos 5 a 7 en el Cuadro 1).

Cuadro 1. Procedimiento para la construcción de la recta patrón del método de Lowry.

ASB (µL)

H2O (µL)

NaOH 1M (µL)

Reactivo 1 (mL)

Reactivo 2 (µL)

Conc (µg/mL)

Abs 750 nm

1 0 250 25 2 225 02 5 245 25 2 225 203 10 240 25 2 225 404 20 230 25 2 225 805 40 210 25 2 225 1606 60 190 25 2 225 2407 80 170 25 2 225 3208 100 150 25 2 225 400

Método espectrofotométrico (Sesión 1)

Prepare la muestra y lea en el espectrofotómetro a longitudes de onda de 205 y 280 nm y aplique la corrección de Scopes para cuantificar el contenido de proteínas de la muestra problema. Realice diluciones en caso necesario.

Método de Bradford (Sesión 2)

Para realizar la curva preparar una solución de albúmina a una concentración de 0.25 mg/mL en agua destilada

Solución de albúmina 0.25 mg/mL (μL)

Agua (μL) Reactivo de Bradford (μL)

Concentración final (μg/mL)

0 800 200 08 792 200 216 784 200 440 760 200 1060 740 200 1580 720 200 20

Leer la absorbancia a 595 nm.

Para realizar las muestras se coloca 20 μL de muestra completando a 800 μL con agua destilada y 200 μL de reactivo de Bradford, leer a 595 nm.

Para la presentación de su informa tome en cuenta los siguientes puntos:

Presente el promedio ± desviación estándar de cada uno de sus resultados Realice una prueba t de medias con los valores obtenidos para la misma muestra con el

equipo de al lado y entre muestras proporcionadas

Práctica 5. Construyendo un habitat

Las interacciones que ocurren en un ecosistema son tan diversas y complejas que la mera revisión teórica supone obstáculos de comprensión. Esta actividad está diseñada para que los estudiantes puedan de forma vivencial concientizarse y analizar los elementos que intervienen en un medio. Mediante la creación de un hábitat en el aula y la observación a lo largo de de seis semanas los estudiantes mostrarán su capacidad de construcción y esfuerzo para adquirir su propio conocimiento.

Esta actividad hará que los estudiantes tomen conciencia de lo importante que son los hábitats de ciertas especies. Mediante el uso de actividades realizadas por el mismo alumno, en este caso se propone la creación de un ecosistema acuático, donde observará y vigilará los procesos a medida que se producen. El alumno podrá utilizar muchos otros modelos ecológicos para desarrollar bajo este esquema.

Objetivo: que los estudiantes puedan desarrollar un ecosistema, además de entender y conocer las interacciones y efectos sobre sus componentes.

Actividades a evaluar:

los estudiantes crearán un ecosistema y lo presentarán ante la clase los estudiantes llevarán un diario de las observaciones de su ecosistema, con énfasis en los

componentes bióticos los estudiantes deberán revisar una serie de artículos para complementar su actividad

Ecosistema acuático

Materiales y Métodos:

5 o 6 botellas vacías de 2 L, marcador, tijeras, tape

Caracoles, peces y arena

Alimento para peces

Plantas acuáticas (Elodea)

Forme grupos de tres integrantes

Corte la parte superior de una botella y la parte inferior de otra, en esta ultima haga unos agujeros con su perforadora (será empleada como tapa). Deposite en su botella de tres a cinco centímetros de tierra o arena, enseguida introduzca agua y vegetación característica de su ecosistema (Elodea para acuático), complete con los peces (1 macho y 1 hembra) y caracoles.

Coloque la tapa de su sistema, asegure con tape y deposite su hábitat en un lugar seguro. Realice observaciones cada tercer día, anote todos los cambios que pueda detectar. Complemente sus observaciones con la revisión de artículos

Después de completar sus observaciones y para elaborar su reporte considere las siguientes preguntas

¿Qué paso con la Elodea en el sistema, que con los caracoles, peces?¿Que cambios ocurrieron en su ecosistema?En su caso, ¿Qué puede hacer para mejorar su ecosistema?

Práctica 6. Ciclo del carbono-Fotosíntesis y eficiencia fotosintética a diferentes longitudes de onda.

Las plantas verdes realizan mediante la fotosíntesis la conversión dióxido de carbono, el agua y la energía lumínica (proveniente del sol) en azucares y oxígeno.

6CO2 + 12H2O + energía lumínica → C6H12O6 + 6O2 + 6H2O

Por tanto para producir el oxigeno que respiramos y que interviene en tantos procesos, las plantas necesitan la luz del sol y el agua. El azul de bromotimol es un indicador acido-base. Por cierto, el CO2 es un gas acido. Por lo tanto el consumo de dióxido de carbono durante la fotosíntesis realizada por células vegetales resultará en un ambiente cada vez menos acido.

En esta sesión se podrá observar el efecto de la luz solar sobre el progreso en el ciclo del carbono.

Objetivo: Los estudiantes crearán un microambiente y observarán el ciclo del carbono en acción. También aprenderán la importancia de la energía luminosa en la respiración celular.

Materiales: (por equipo)

2 bolsas ziploc® pequeñas1 popote20 mL de solución de azul de bromotimolVaso de precipitado 1000 mlTubo de ensaye de 10mlEmbudo de vidrioPapel celofán (amarillo, azul, verde, rojo)Planta acuática Elodea sp (15 g)Bicarbonato de sodio (6 g/l)Papel milimétrico enceradoPirex, masking tapeLibreta de notas, lápiz, Cronómetro1 vaso de ppdo de 50 mL

ACTIVIDAD 1

1) Etiquetar una bolsa "LUZ" y la otra "OSCURA"

2) Medir 10 mL de solución de azul de bromotimol y verter en la bolsa, sellando la bolsa de inmediata

3) Abrir en una esquina de la bolsa "LUZ" e introducir el popote, sople a través del popote hasta que haya un cambio de coloración a amarillo-verde (lo cual indicará un ambiente ácido). Esto puede tardar algunos minutos (no desespere).

4) Selle la bolsa, y cerciórese que se conserve la coloración amarillo-verdosa.

5) Repita este mismo proceso para la bolsa “OSCURA”.

¿Por qué soplar en la solución? ______________________________

¿Que está soplando en la solución? ___________________________

¿Por que la solución cambia de color? _____________________________

6) Rápidamente introduzca una ramita en cada una de las bolsas, cierre INMEDIATAMENTE y selle la bolsa.

7) Ponga la bolsa “LUZ” en un lugar iluminado y la “OSCURIDAD” en un lugar cerrado y oscuro.

8) Permita a las células vegetales realizar el proceso y compruebe el color de la solución 24 horas después.

Cuadro de datos

Anote sus observaciones, marque acido o básico y el color de la solución.

ACTIVIDAD 2

Observacion “LUZ” “OSCURIDAD”Color de la solución antes

de soplar en la bolsa _________________ácido / basico

_________________acido / basico

Color de la solución después de soplar _________________

ácido / basico_________________

ácido / basicoColor de la solución antes

de introducir la planta _________________ácido / basico

_________________ácido / basico

Color de la solución transcurridas 24 horas _________________

ácido / basico_________________

ácido / basico

Procedimiento

1. Disolver el bicarbonato en el agua (1 L) y colocar la planta dentro del embudo. Debe evitarse que la planta obstruya la salida de las burbujas de oxígeno por el embudo.

2. Colocar una tira de papel milimétrico marcado en la base exterior del tubo para que sirva de escala.

3. Colocar el tubo en forma inversa sobre el cono del vidrio, con la mayor cantidad de agua posible en su interior.

4. Cubrir el sistema con un color (e.g., azul) de papel celofán usando el sol como fuente de luz. Dejar que el sistema se estabilice por 3 min. Medir el volumen desplazado en el tubo de ensayo por el oxigeno producido por un periodo de 5 min (otra opción es contar el numero de burbujas que se desprenden). Repetir la medición tres veces.

5. Con cada color de papel se debe hacer lo mismo, cambiando la solución de bicarbonato en cada cambio de papel.

Tratamiento e q u i p o s1 2 3 4 5

Azul x x xVerde x x xRojo x x xAmarillo x x xLuz natural x x x

6. Reportar los resultados obtenidos de las repeticiones por equipo (X+DS), en un cuadro y en una grafica de volumen desplazado vs longitud de onda

Práctica 7. Dinámica poblacional (dos sesiones)

La dinámica de una población puede entenderse como su desarrollo en el tiempo y en el espacio, y está determinada por factores que actúan en el organismo, en la población y en el medio que les rodea. Se refiere a la dispersión, a la densidad y al crecimiento.

1. Dinámica de dispersión: Está caracterizada por los movimientos dentro de la población y la migración.

Los movimientos dentro de la población se realizan en el espacio ocupado por ella. Un típico movimiento de tal tipo es, por ejemplo, la expulsión de las crías de del grupo familiar a partir de cierta edad, integrándose a otros grupos de la misma edad, dependiendo de la especie.

La migración se produce cuando una población o parte de ella abandona o coloniza un espacio, distinguiéndose varias formas: (1) La emigración o el abandono definitivo del área para ocupar otra donde existen condiciones adecuadas; (2) La inmigración o la ocupación de otra parte del área, donde ya existe la especie, generalmente por el aumento de densidad; (3) La permigración cuando sólo pasan por el área sin ocuparla; (4) La invasión o la ocupación de una nueva área donde antes no se encontraba; y (5) La traslocación o el abandono total de un área.

2. Dinámica de densidad: Es la oscilación en la concentración de los individuos de una población en el área. Los cambios de densidad en el espacio pueden ser graduales (mayor densidad en una zona y disminución gradual hacia la periferia) u ofrecer determinadas zonas de fluctuación causadas por el clima, la orografía (laderas, planicies), el suelo, la vegetación, el equilibrio trófico, etc.

3. Dinámica del crecimiento poblacional: Es el aumento de la población en el tiempo, descontando la mortalidad.

La tasa de crecimiento es la diferencia entre la tasa de natalidad y la tasa de mortalidad. Por ejemplo, en la actualidad la humanidad tiene una tasa de natalidad de 3,4% y una tasa de mortalidad de 1,5%, lo que da un incremento anual de 1,9% en promedio mundial.

Ciertas poblaciones tienden a una autolimitación de acuerdo a la densidad, en que la tasa de crecimiento decrece al mismo tiempo que la densidad aumenta. Estas poblaciones tienden a nivelar su población en dependencia inversa a la densidad en el área. Otras poblaciones no limitan su crecimiento y crecen en progresión geométrica (2, 4, 8, 16, 32, ...). Su crecimiento sólo puede ser detenido por fuerzas externas a la población (como factores ambientales, otras poblaciones, alimentos, enfermedades, etc.).

Una población puede desarrollarse en cuatro direcciones diferentes:

Mantenerse en el mismo nivel por un largo periodo, porque ha logrado un equilibrio entre la oferta de alimentos y su crecimiento. Es típico de poblaciones no perturbadas.

Aumentar lentamente como una adaptación progresiva al medio. Declinar y hasta extinguirse por falla de alimentos, contaminación o destrucción del

hábitat. Fluctuar regular o irregularmente, o sea, aumentar y disminuir en periodos constantes o

no, por ejemplo cuando se producen lluvias intensas, la población de grillos crece en forma explosiva.

(Sesión 1) El Frijolarium

Materiales y métodos

En esta sesión construirá un "frijolarium", el cual es un dispositivo muy simple para simular muchos de los tipos de crecimiento poblacional y que fue popularizado por Luis Bojórquez.

Se trata, básicamente, de construir en parejas un tablero de unos 60 por 60 cm, subdividido en 64 casillas, como tablero de ajedrez. En algunas versiones se usan casillas blancas y negras, pero basta con distinguir cuadros pares y nones. Se añade al tablero, por los cuatro costados, una pared de unos 10 cm de alto, con lo cual se obtiene una especie de charola de las dimensiones descritas y con una cuadrícula interna. Este tablero representa el hábitat donde interactúan las poblaciones, las cuales pueden simbolizarse con frijoles de dos colores, por ejemplo: negros para las presas y bayos para los depredadores.

Los frijoles se mezclan en una lata y luego se arrojan al tablero. Aquellos que caigan en la línea entre dos cuadros se asignan al cuadro del cual ocupen

más espacio. Se tiene entonces que en cada uno de los 64 espacios puede haber una cantidad de frijoles

de una u otra clase. Por ejemplo, un cuadro con dos frijoles negros, otro con uno bayo y uno negro, otro vacío, etc.

Efectuar la contabilidad por cuadro, de acuerdo con reglas que son un modelo de la interacción que se trata de representar.

Terminada la contabilidad se colocan en la lata los números obtenidos de cada "especie" de frijol y se repite la operación.

Con este sencillo método se pueden simular interacciones bastante complicadas.

MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL

Se trata del crecimiento con tasa constante. Se arrojan los frijoles al tablero y la contabilidad tiene las siguientes reglas:

1. Los frijoles que caigan en cuadrado par se descartan. Suponemos que el medio en estos cuadros no era favorable a los frijoles, que, por lo tanto, mueren.

2. Los frijoles que cayeron en un cuadrado non se reproducen, multiplicándose por un factor constante.

Si el factor de reproducción es de tres o más, esperaríamos un crecimiento irrestricto (puesto que aproximadamente la mitad de los frijoles se descartan al caer en cuadro par, hay que compensar esta mortalidad con una natalidad mayor que dos). Si la tasa es de dos, se esperaría que los números fluctuaran sin tendencia definida hasta que por pura suerte se extinguiera la población.

MODELACION DEL CRECIMIENTO LOGÍSTICO ASINTÓTICO

Es un crecimiento regulado de acuerdo con un modelo muy simple. A cada cuadro se le asigna el número máximo de individuos que puede sostener. Por arriba de este número los organismos adicionales mueren. Corresponde a situaciones en las que el recurso limitante tiene un número fijo (agujeros para anidar, territorios, etcétera). Las reglas son:

1. En aquellos cuadros con un número de frijoles igual o menor al valor máximo sostenible por cuadro, los frijoles se reproducen multiplicándose por una tasa fija.

2. Los cuadros con más frijoles que el máximo sostenible aportan una cantidad de nuevos individuos que es constante e igual al máximo.

Una tasa mayor de uno produce un crecimiento rápido que se suaviza al acercarse la población al máximo total del tablero (64, multiplicado por el máximo sostenible de cada cuadro).

MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO LOGÍSTICO OSCILATORIO

Es un crecimiento en el que la intensidad de la mortalidad a altas densidades es muy grande, dando como resultado fluctuaciones bruscas alrededor de un valor medio. Las reglas son:

1. Los frijoles en cuadros con menos que el máximo sostenible se reproducen.

2. Los frijoles en cuadros a la densidad máxima, solamente sobreviven, sin multiplicarse.

3. Los frijoles en todos los demás cuadros se descartan.

MODELACIÓN DE UN CRECIMIENTO CAÓTICO

Cuando las tasas reproductivas son muy altas y la mortalidad a altas densidades es muy intensa, es posible que se generen fluctuaciones muy irregulares y violentas del tamaño de la población. Las reglas son idénticas a las de la simulación anterior, pero la tasa de multiplicación debe ser mayor. Las oscilaciones en este juego pueden ser tan bruscas que la población se extinga completamente.

MODELACIÓN DE LA COMPETENCIA INTERESPECÍFICA

Esto representa un caso más complicado, en el que dos especies interactúan competitivamente. Las reglas son las siguientes:

1. En aquellos cuadros en los que haya una sola especie de frijoles, éstos siguen las reglas correspondientes a la logística oscilatoria, pero con parámetros propios para cada especie.

2. Los frijoles de la especie A de aquellos cuadros donde haya más de A que de B, sobreviven sin reproducirse. Los de la especie B se descartan. Esto se interpreta como que la especie A venció en la competencia. Lo recíproco ocurre para cuadros donde haya más de B que de A.

3. Los cuadros donde haya iguales cantidades de A y de B no contribuyen con ningún sobreviviente a la contabilidad: ambas especies pierden en estos cuadros.

MODELACIÓN DE LA RELACIÓN DEPREDADOR-PRESA

Aquí se supone que una de las especies de frijoles necesita alimentarse de la otra para reproducirse. Las reglas son las siguientes:

1. Los cuadros que contienen sólo frijoles presas se contabilizan de acuerdo con las reglas del crecimiento logístico oscilatorio.

2. En los cuadros con un solo frijol depredador, éste sobrevive. Si en el cuadro hay más de un frijol depredador y no hay presas, todos los depredadores se descartan.

3 En los cuadros en que haya más presas que depredadores, todas las presas se descartan y todos los depredadores se reproducen de acuerdo con una tasa constante.

4. En los cuadros donde haya más depredadores que presas, todas las presas se descartan y solamente se reproduce un depredador por cada presa que haya estado en el cuadro. El resto de los depredadores se descarta.

Estas reglas producen una dinámica oscilatoria típica de las interacciones depredador-presa.

MODELAClÓN DE UN DEPREDADOR PRUDENTE

Este juego es idéntico al anterior, salvo en lo que se refiere a las reglas tres y cuatro, que se modifican para simular un depredador menos agresivo y presas más resistentes. Las reglas modificadas son:

3. En los cuadros donde haya más presas que depredadores, todos los depredadores se reproducen.

En estos cuadros las presas excedentes no son atacadas y también se reproducen a su propia velocidad

4. En los cuadros donde haya más depredadores que presas, los depredadores solamente sobreviven sin reproducirse. Las presas se descartan.

Este juego produce una dinámica de oscilaciones amortiguadas que contrastan con las fluctuaciones del juego anterior.

Para presentar su informe grafique y compare con datos reales de crecimiento poblacional, emplee todas las herramientas estadísticas que considere convenientes.

(Sesión 2) Poblaciones de lombrices

Objetivo: que el alumno pueda analizar la dinámica poblacional de lombrices crecidas bajo dos sistemas y pueda correlacionar los factores que afectan dicha dinámica.

Materiales y métodos:

1. En 2 cajas de 30x50x15 llenar con aproximadamente 1 Kg de sustrato (pulpa de café y un sustrato poco favorable).

2. Contar 100 lombrices, pesar en una balanza y registrar el peso inicial. Repetir para la caja 2.

3. Posteriormente sembrar en cada caja 100 lombrices adultas.4. Etiquetar cada caja con el nombre del sustrato5. Revisar cada tercer día y ajustar las condiciones de humedad según sea necesario.

Registrar las variaciones y soportarlos teóricamente para su informe.6. Transcurridas tres semanas, contar el número de lombrices, registrar peso de biomasa

final, número de cocones.

Para escribir su informe:

Describir la dinámica de la poblacional, mediante el empleo de histogramas y otras herramientas estadísticas. Justificar y discutir sus resultados en función de lo observado.

Práctica 8. Fotosíntesis: extracción, separación y cuantificación de pigmentos vegetales (dos sesiones)

El estudio de los compuestos biológicos implica su extracción y separación del material (célula, tejido, órgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes más utilizados para este propósito consiste en el uso de técnicas de cromatografía (proceso de separación de mezclas complejas mediante particiones entre una fase fluida móvil y una fase estacionaria). Otra técnica es la de separación por reparto entre disolventes inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en función de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles.

Como aplicación de estas dos técnicas, en el desarrollo de esta práctica se extraerán 4 tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas. Todos ellos tienen carácter apolar, aunque su grado de polaridad varía en función de su composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el más apolar al menos apolar.

Esta propiedad permite su separación, y su distinto color su identificación. Su color permite también su cuantificación por técnicas espectrofotométricas.

Objetivo: extraer y separar pigmentos vegetales (biomoléculas) por técnicas basadas en su afinidad y polaridad

Sesión I. Actividad 1. Separación por reparto en disolventes inmiscibles

Método:

Extracción: trocear una hoja de espinaca u otra. Introducir los trozos (aprox 1 g) en un tubo de ensayo de calibre grueso y añadir 10 mL de etanol. Anotar peso de muestra y volumen de solvente exacto. Taparlo con algodón y calentarlo

al baño ‘María’ durante aproximadamente 5 min (retirarlo cuando el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol con los pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo.

Separación:

Añadir al embudo de separación (con la llave cerrada) 5 mL de gasolina.

Tomar 5 mL de extracto de pigmentos y añadirlos sobre el embudo de separación. Se formarán dos fases (A y B)

Añadir 2 mL de agua (o más, hasta que la fase inferior quede sin pigmentos).

Desechar la fase inferior (B).

Añadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarán dos fases (C y D).

Recoger ambas fases en tubos de ensayo.

Añadir al tubo con la fase C 2 mL de KOH-metanólica 30% (p/v) y agitar bien durante 2 min. Se formarán dos fases (E y F).

Cuestiones para su reporte

¿Qué contiene cada una de las fases?¿Por qué esa distribución?

¿Cómo se separarían los pigmentos de la fase D?

Actividad 2. Cuantificación de clorofila a (Recordatorio de práctica 1)

Los pigmentos fotosintéticos tienen capacidad de absorber distintas longitudes de onda dentro del espectro de luz blanca. Cada pigmento tendrá un máximo de absorbancia característico en una λ determinada. Midiendo en una mezcla la DO a la λ correspondiente a un pigmento determinado, se podrá calcular la cantidad del mismo en dicha mezcla.

Práctica

La clorofila a presenta un máximo de absorbancia a 665 nm. Utilizando técnicas espectrofotométricas, se cuantificará la cantidad de clorofila a presente en el extracto de pigmentos de hoja de espinaca en etanol obtenido en la primera parte de la práctica.

Para ello, se aplicará la fórmula de Marker.

[Clorofila a (µg.mL-1)] = A665 nm x 13.14

Método

Tomar 0.3 mL del extracto etanólico de pigmentos y añadir 2.7 mL de etanol

Medir la DO a 665 nm utilizando etanol como blanco

Cuestiones para considerar en los resultados y la discusión de su informe

Calcular la concentración de clorofila a en el extracto inicial de la hoja de espinaca.¿Cuántos mg de clorofila a se han extraído de la hoja de espinaca?¿Se han extraído todos los pigmentos?¿Qué es 13.14 en la fórmula de Marker?¿Interfieren el resto de pigmentos en la determinación de clorofila a?Continuación… Fotosíntesis: extracción, separación y cuantificación de pigmentos vegetales

Sesión II. Cromatografía en papel

Los pigmentos se separarán en base al mismo principio utilizado en la práctica anterior, con la diferencia de que en este caso, uno de los disolventes utilizados se mueve sobre un soporte sólido (papel).

La fase móvil será un disolvente apolar (mezcla de éter de petróleo/acetona/benceno en proporción 85/10/5). La fase estacionaria, de naturaleza polar, será el agua adsorbida en el papel de celulosa utilizado como soporte.

La fase móvil ascenderá por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irán separando en función de su polaridad. Los pigmentos más polares se retendrán más en la fase estacionaria, mientras que los más apolares avanzarán más rápido junto con la fase móvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor característico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficiente o factor de reparto (Rf).

Objetivo: Separar biomoléculas en función de su polaridad empleando una fase móvil formada de una mezcla de solventes.

Rf = Xp/Xd

Xp= distancia alcanzada por el pigmento

Xd= distancia alcanzada por el disolvente

Materiales y Métodos

1. Extracción: en el papel de celulosa se dibujan 2 líneas con lápiz. Una a 2 cm de uno de los extremos y otra a 1 cm del otro extremo. Cortar una hoja en tiras estrechas, posteriormente machacar en un mortero hasta obtener extracto. Sobre la línea situada a 2 cm del papel de celulosa, colocar una gota de extracto, dejar que seque y repetir n veces, hasta tener una mancha oscura de pigmentos en el papel.

2. Separación: Tomar un tubo de ensayo seco de calibre grueso y añadir 3 mL de disolvente.

Tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos y colgarla del tapón de orcho por el extremo opuesto a la muestra (por encima de la marca de 1 cm).

Introducir la tira de papel en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente moje el extremo de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra.

Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente la marca superior del papel.

Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de cada mancha de pigmento que aparezca.

Cuestiones para considerar en la discusión de su reporte

¿A qué pigmento corresponde cada mancha y cuáles son sus Rf?

¿Qué factores pueden afectar al Rf?

Práctica 9. Aislamiento y purificación de una proteína

Introducción: las proteínas de la leche se clasifican en dos grandes grupos: caseínas y proteínas del suero. Las caseínas precipitan a un pH de 4.6 a 20ºC y en el sobrenadante permanecen las proteínas del suero

Objetivo: Precipitar y aislar la caseína de la leche basado en la precipitación en su punto isoeléctrico.

Materiales y Métodos

a)aislamiento y purificación de la caseína de la leche

1. Preparar 200 mL de una dilución de leche descremada con agua destilada 1:4

2. precipitar la caseína de la leche ajustando a su punto isoeléctrico (4.8) con HCl al 2%. Una vez alcanzado el pH esperar de 10 a 15 min.

3. decantar el sobrenadante (medir el volumen), guardarlo para cuantificar proteínas.

4. centrifugar el precipitado a 3000 rpm durante 5 min al cabo de los cuales invertir rápidamente el tubo para eliminar el sobrenadante

5. lavar el precipitado con 20 mL de agua destilada, agitando perfectamente con un agitador para permitir que todas las partículas de caseína se pongan en contacto con el disolvente. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min y eliminar el sobrenadante.

6. repetir el paso anterior.

7. lavar el precipitado una vez con etanol.

8. lavar el precipitado una vez con acetona

9. lavar el precipitado una vez con éter etílico

10. vaciar la caseína sobre un papel filtro extendiéndola y pulverizándola con un agitador

11. secar en una estufa a 40ºC.

12. Pesar en la balanza analítica.

b)determinación cuantitativa de caseína y otras proteínas presentes en la leche (método de Biuret)

1. Preparar 50 mL de una solución de la caseína obtenida a una concentración de 4 mg/mL. Disuelva 200 mg de caseína en 30 mL de una disolución NaCl al 1%, agregue gotas de NaOH concentrado si es requerido para disolver la proteína. Afore a 50 mL.

2. complete las muestras problema y la recta patrón como se muestra en el cuadro siguiente.

Reactivo No. de tubo1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mL de solución de caseína 10 mg/mL

0 0.25 0.5 0.75 1 1.25

mL de solución de NaCl al 1%

6 5.75 5.5 5.25 5 4.75 5.5 5 5 5

mL de solución de caseína obtenida

0.5 1

mL de solución sobrenadante

1

mL de leche diluida 1:4 1mL de reactivo de Biuret 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4Nota: agitar bien después de la adición de cada reactivo

3. deje reposar para el desarrollo de color (aprox 30 min)

4. Leer la absorbancia a 540 nm.

Para su reporte

Trazar la curva patrón y a partir de ésta, interpolando los valores para las muestras problema calcule la concentración en mg de proteína, tome en cuenta alícuotas y diluciones.

Calcular la cantidad de proteína en el volumen de leche inicialmente empleado

Calcule la cantidad de caseína otenida en los g totales de materia seca aislada.

Analizar los datos y resultados obtenidos, confrontando con lo teórico espedado.

Práctica 10. Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción

La catálisis enzimática es sin duda, el fenómeno que mayor importancia tiene para la existencia de la vida tal como la conocemos. Es evidente que en ausencia de una enzima apropiada, una gran cantidad de reacciones químicas no sólo ocurren muy despacio, como se observa para la hidrólisis de grupos fosfato, si no que pueden no ocurrir del todo. Esto indica de alguna forma que la presencia de la enzima es capaz de acelerar la velocidad de la reacción en un sistema químico. Naturalmente, la concentración del catalizador es un factor importante, ya que al aumentar la cantidad, también aumenta la probabilidad de que los reactantes se encuentren con la enzima y así ocurra el evento catalítico. La forma en que la concentración de un reactante afecta a la velocidad de la reacción se expresa a través de lo que se conoce como orden de reacción.

Objetivo: que el estudiante pueda comprender la influencia que tiene la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción.

Materiales y Métodos.

Preparación de la fuente de enzima (suero de leche)

Dejar en reposos durante una noche 1 L de leche no pasteurizada para separar la fase lipídica. A la mañana siguiente separar con ayuda de un sifón.

Posteriormente llevar la leche a 30ºC y agregar unas gotas de cuajo. Se deja cuajar con agitación ocasional y se separa el suero. Se centrifuga a 6000 rpm durante 45 min y se añaden 0.2 g de azida de sodio por litro de suero obtenido (cuidado, esta sustancia es altamente tóxica).

Prepare a continuación una curva patrón de p-nitrofenol como se indica en el siguiente cuadro:

Tubo numero 1 2 3 4 5 6 7

p-nitrofenol 2mM (mL) ----- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

H2O (mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

Glicina 0.06 M pH=10 (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

NaOH 0.25M (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Agitar vigorosamente e inmediatamente después leer en el espectrofotómetro a 415 nm

Para comprobar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción prepare a continuación como se muestra en el siguiente cuadro:

1 1b 2 2b 3 3b 4 4b 5 5b

Glicina 0.06 M pH=10 (mL)

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

p-nitrofenilfosfato de sodio 4.5 mM (mL)

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

H2O (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0

NaOH 0.25M (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0

Preincubar a 37ºC durante 3 min, después agregar la enzima a intervalos de 30 seg por cada tubo.

Enzima 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Incubar a 37ºC durante 30 min, adicionar el NAOH a intervalos de tiempo como en la enzima

NaOH 0.25M (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Agitar vigorosamente y medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 415 nm.

Preguntas para responder durante la sesión y de apoyo para elaborar su informe.

¿Por qué hacer una curva de p-nitrofenol?¿Qué se intenta medir?¿Podría haberse hecho una curva patrón de fosfatos, mediante algún método colorimétrico?¿Qué ocurre al añadir el NaOH?¿Por qué en la segunda preparación se añade la sosa a los blancos antes de preincubar?¿Por qué hay que realizar la operación en orden y a intervalos de tiempo regulares?¿Por qué se requiere un blanco por cada ensayo?¿Cuál es la concentración de sustrato en el ensayo, deben considerarse los 3 mL qu había durante la incubación o los 6 mL de volumen final después de añadir el NaOH?

DIRECTORIO

Dr. Ángel René Estrada ArévaloRECTOR

Mtro. Hugo Armando Aguilar AguilarSECRETARIO GENERAL

Dr. Carlos Eugenio Ruiz HernándezSECRETARIO ACADÉMICO

C.P. Juan Guillermo GutiérrezSECRETARIO ADMINISTRATIVO

Dr. Roberto Villers AispuroDIRECTOR GENERAL DE PLANEACIÓN

Dr. Fernando Álvarez SimánDIRECTOR GENERAL DE EXTENSIÓN UNIVERSITARIA

Mtro. Lorenzo Franco Escamirosa MontalvoDIRECTOR GENERAL DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

Dr. Miguel Salvador FigueroaDIRECTOR DEL CENTRO DE BIOCIENCIAS