revencyt-redidiciencia.cuantificación de la enzima
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Maya Vetencourt José Fernando
Cuantificación de la enzima acetilcolinesterasa a nivel de la sinapsis neuromuscular
Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biología Celular. 2004. p. 82
Venezuela
Disponible en:
http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33576&type=ArchivoDocumento
&view=pdf&docu=26861&col=5
¿Cómo citar?
Universidad de Los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
CUANTIFICACIÓN DE LA ENZIMA
ACETILCOLINESTERASA A NIVEL DE LA
SINÁPSIS NEUROMUSCULAR
Lic. José Fernando Maya Vetencourt
Mérida, Noviembre de 2004
Laboratorio de Fisiología de la Conducta
Facultad de Medicina
Trabajo Especial de Post-Grado
presentado por et
Lic. José Fernando Maya Vetencourt
Requ1s1to para optar af Grado de
Magíster Scientiae en Biotogia Celular
Facultad de Ciencias. Uníversidad de Los Andes. Mérida-Venezuefa.
Este proyecto de investigación fue realizado en el
Lab. de fisk>Jogia de la Conducta, Universidad de los Andes,
Mérida-Venezuela.
Lab. de Neurobiotogie CeHu.taire et Motéc:ufaire,
École No.nnafe Sopérieure~ CNRS UMR 8544~ Paris..francia.
bajo la tutorfa de
Dr. Césare Colasante,
Y la cotutoria de Dr. Eric Krejci y Dr. Luis Hemández.
RESUMEN
La unión neuromuscufar (UNM) es una unidad funcional única que
asegura ta contracción muscular inducida por ~a Acetiteolina (ACh}. La enzima
Acetilcofinesterasa (AChE) es la principal enzima responsable de la hidrólisis
del neurotransmisor ACh y se caracteriza por poseer un complejo pofimorftSmo
que resutta en la existencia de distintas isoformas moleculares. La importancia
de fa AChE ha sido demostrada a través de la inhibición de su actividad
catalitica. la ausencia de actividad AChE en ta unión neuromuscutar, contleva
a alteraciones caracteristicas de patotogfas conocidas como "Sfndromes de
Miastenia CongénUa". En esta investigación se reporta el desarrollo de técnicas
anatfticas de afta resolución que permiten resolver bajas concentraciones de la
AChE y en consecuencia estudiar variaciones en los niveles de tal enzima en la
UNM, contribuyendo con e{ análisis de tales patologías. La expresión in vitro de
las distintas isoformas de ta AChE fue obtenida microinyectando transcritos
{ARNm), codificando para cada una, en oocitos de Xenopus sp. La purificación
e identificación de cada isoforma fue obtenida utilizando técnicas de bioquímica
clásica. Posteriormente, una metodofogfa de análisis de proteínas, utitizando
Electroforesis Capilar acoplada a un sistema de Detección por Fluorescencia
Láser Inducida, fue desarrollada. Esta investigación reporta ta resolución y
análisis de las 2 principales isoformas AChE presentes en la UNM y a nivel
nervioso central, AChf=-CoJQ y AChE-PRJMA.
Palabras Clave: Acetilcotinesterasa, Electroforesis Capilar, Fasiculina,
protefna, adsorción cromatográfica.
ABSTRACT
The neuromuscutar junction (NMJ) is a unique functionaJ unit that
achieves the muscular contraction induced by acetylcholine (ACh). The
acetytchoJinesterase, the main responsible enzyme of the hydroJysis of Ach, is
characterized by a complex polymorphism that leads to the exístence of severat
hetero-oligomeric forms of the enzyme. The importance of the AChE has been
observed through inhtbition of its catafytic activity. The absence of AChE activity
in the NMJ leads to pathologies known as "Congenital Myasthenia Syndromes".
Thts paper reports the devefopment of a high resoJution analytical tech-nique
that atlows the study of sma1t AChE concentrations thus leading to the analysis
of subtle enzyme variations at the NMJ. 1t represents an important contribution
to the analysis of the pathologies above mentioned. The in vitro expression of
several AChE oligomers was carried out by micro-injecting transcripts codifying
for each of them into Xenopus oocytes. Jdentification and purification of each
AChE olfgomer was obtained through classical biochemical techniques.
Following, a protein analysis technique was devefoped using Capillary
Electrophoresis coupted to Laser lnduced Fluorescence Detection. This
research project reports the resolution and anatysis of the two main AChE
ofigomers located in the NMJ and at the nervous central system, AChE-CofQ
and AChE-PRIMA
Key words: Acetylcholinesterase, CapiUary Electrophoresis, Fasciculin,
protein, chromatographic adsorption.
AGRADt:CIMIENTOS
A mis viejos, quienes siempre me han apoyado ... quienes me siguen
apoyando en todas las decisiones importantes que tomo ... en e1 curso que
quiero darle a mi vida ...
A ti Cesare, por brindarme tu amistad y compartir esa confianza que
tienen verdaderos amigos ... por darme la oportunidad de acceder a un mundo
lleno de oportunidades ...
A Eñe, tutor que fue una guía en la parte experimental. .. hombre que
tendió sus manos a un joven tleno de ansiedad en París-Francia ...
A ti Luis, ser insigne con quien he compartido ya tantas
experiencias ... quien me ha ensenado tantas cosas de vida ... mostrando
siempre la humildad que solo tienen caballeros nobles de buen corazón ...
A Miguel, Andreay Elizabeth, amigos con quienes durante todo este
tiempo he compartido cosas tan lindas ... apoyándonos en todo momento ...
solidaridad que espero siempre este presente ...
A Ernesto y James, amigos sinceros de quienes aprendí que un espíritu
inquebrantable de investigación contteva a grandes logros ...
A ECOS-NORD-FONACtT -ULA, programa que subvencionó et
desarrollo de esta investigación a través del proyecto # 2000000902 (VOOS01
código francés), enmarcado en el programa binacionaf entre Francia y
Venezuela.
Y finalmente a la vida, que me ha dado y me sigue dando bellas
oportunidades para seguir adefante .••••• GRACIAS .••••. sinceramente
GRACIASUI
INDICE GENERAL Página
1.- INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 01
2.- OBJETIVOS ................................................................................................ 12
3.- MATERIALES YMÉTODOS ...................................................................... 13
3.1 - Reactivos ...................................................................................... 13
3.2- Soluciones ................................................................................... 14
3.3- Equipos ........................................................................................ 15
3.4- Material Biológico· ....................................................................... 16
3.5- Expresión de lsoformas de la enzima Acetilcolinesterasa (AChE)
in vitro ............................................................................ 16
3.5.1- Preparación y selección de oocitos ............................... 16
3.5.2- Inyección de ARN en oocitos de Xenopus sp .. ............... 16
3.5.3- Extracción de isoformas AChE. Medición de actividad
enzimática ....................................................................... 17
3.5.4- Expresión temporal de la AChE en oocitos de Xenopus ... 18
3.6- Purificación de las lsoformas AChE. ..................................... 18
3.6.1-Cromatografía de afmidad en gel de Sefarosa-Procainamida
..................................................................................... 19
3. 7- Identificación de las tsoformas AChE. ................................... 19
3.7.1- Centrifugación en gradientes de Sacarosa ..................... 19
3. 7.2- Análisis de sedtmentación de las isoformas AChE. .......... 20
3.8- Estandarización del análisis de proteínas con el sistema
EC-DFLI .......................................................................... 21
3.8.1- Estandarización EC-DFU. Cond1ciones ácidas ............... 22
3.8.2- Estandarización EC-DFLI. Condiciones alcalinas ............ 22
3.9- Anájisis de las isoformas AChE con el sistema EC-DFU ........... 25
3.1 O- Análisis in situ de la AChE mediante Microscopia Confocal ........ 26
5.- RESUlTADOS Y DISCUS1ÓN .................................................................. 27
6.- CONCLUSIÓN ........................................................................................... 67
7.- REFERENCIAS ......................................................................................... 68
ÍNDICE DE FIGURAS Página
Figura #1. Superftcie interna de capilares de sílice desnudos .......................... 4
Figura #2. Esquematización de la interacción iones-grupos silanol ............... 6
Figura #3. Flujo electrosmótico .............................................................. 7
Figura #4. Migración de analitos en electroforesis capilar de zona ................ 8
Figura #5. Marcaje in situde la AChE en la unión neuromuscutar ................ 65
ÍNDICE DE GRÁFICOS Página
Gráfico #1. Expresión temporal de la AChE en el sistema celular de oocitos de
Xenopus sp ....................................................................... 29
GráfiCO #2. Purificación de la AChE por cromatografía de afinidad en gel de
Sefarosa-Procainamida ......................................................... 31
Gráfico #3. Pérfiles de sedimentación obtenidos para las isofonnas AChE
expresdas in vitro ........... ..................................................... 32
Gráfico #4. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones ácidas. HPC 0.05% ....... 35
Gráfteo #5. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones ácidas. HPC 0.025% ..... 36
Gráfico#6. Detalte del gráfico #S ........................................................... 37
Gráfico #7. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones ácidas. HPC 0.0025% ... 38
Gráfico #8. Análisis proteinas EC-DFU. Condiciones ácidas. HPC 0.025%.
Análisis AChE obtenida del músculo gastrocnemio .................... 39
Gráfico#9. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones ácidas. CMC 0.025% .... 41
Gráfico #10. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas. SOS 60 mM;
Tween 20 3% p/v. Inyección electrocinética ............................ .42
Gráfico #11. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcaUnas. SOS 60 mM;
Tween 20 3% p/v. Inyección por presión negativa ..................... 44
Gráfico #12. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones alcaJjnas. Sal K20~8•
Capilar diámetro interno 76l-Jm ............................................. 45
Gráfico #13. Análisis proteinas EC-DFLI. Condiciones alcalinas. Saf K202Sa.
CapUar diámetro interno 99 JJm ............................................. 47
Gráfico #14. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas.
Sal CuS03 0.1 M ............................................................... 48
Gráfico #15. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones aJcalinas.
Sal CuSO:! 0.15 M ............................................................. 49
Gráfico #16. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones alcalinas.
Sal Cu~ 0.20 M ............................................................. 49
Gráfico #17. Anátisis protefnas EC-DFLI. Condiciones alcalinas.
SalCuS~0.25M ............................................................. 60
Gráfico #18. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas.
Sal CuS03 0.20 M. Acetonitrtlo 10% ......................................... 51
Gráfico #19. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas.
Análisis isoforma AChE-PRAD .............................................. 52
Gráfico #20. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas.
Análisis ísoforma AChE-PR~MA. ........................................... 54
Gráfico #21. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones atcatinas.
Detalle del gráfico #20 ........................................................ 55
Gráfico #22. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones alcalinas.
Análisis isoforma AChE-CotQ ............................................... 57
Gráfteo #23. Anál-isis proteínas EC-DFU. Condiciones atcalinas.
Detalle det gráfiCO #22 ........................................................ 58
Gráfico #24. Análisis proteínas EC-DFLI. Condiciones alcalinas.
Análisis isoforma AChE-G1 ................................................... 60
Gráfico #25. Análisis proteínas EC-DFU. Condiciones alcalinas.
Análisis isoforma AChE-CoiQ y AChE-PRlMA. ......................... 62
Gráfico #26. Marcaje in situ de la AChE en la unión neuromuscufar .............. 66
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla #1. Actividad enzimática de las isoformas AChE expresadas in vitro .... . 27
Tabla #2. Tablas de purificación de las isoformas AChE purificadas .............. 63
1
INTRODUCCIÓN
1.- Unión Neuromuscular
La unión neuromuscular (UNM) es una unidad funcional única que asegura
la contracción muscular inducida por la Acetilcolina (ACh) liberada por el terminal
nervioso en la placa motora. La UNM está constituida por regiones especializadas
del terminal nervioso, la fibra muscular, la célula de Schwann y la lámina basal
interpuesta entre las membranas pre y postsinápticas. Una gran cantidad de
mitocondrias, presentes en el terminal nervioso, son las responsables de la
generación de energía necesaria para la liberación de la ACh desde las vesículas
sinápticas. Las vesículas sinápticas se concentran cercanamente a las "zonas
activas" en la membrana presináptica que incluye canales de calcio dependientes
de voltaje y componentes necesarios para el anclaje de tales vesículas a la
membrana presináptica. La membrana postsináptica presenta pliegues que
enfrentan las "zonas activas" en cuyas crestas se concentran receptores
nicotinicos de la ACh (AChRs) asegurando así la transmisión nerviosa.
La duración de la activación de AChRs post-sinápticos depende de la
difusión de la ACh e hidrólisis de tal neurotransmisor mediada por las enzimas
Acetilcolinesterasa (AChE) y Butirilcolinesterasa (BChE), siendo así la actividad
este rasa un modulador importante de la neurotransmisión colinérgica. La
existencia de distintas isoformas mo1eculares de la AChE, ocurre como resultado
de un mecanismo de "spticing alteARNtivo" del único gen que la codifica en
vertebrados y de su asociación con distintas proteínas no-catalíticas. Las variantes
del mecanismo de "splicing" poseen el mismo dominio catalítico pero difieren en
pequeños dominios del extremo e-terminal (Massoulié et al, 1993; 1998). Tal
polimorfismo permite a su vez un variado patrón de distribución de la enzima. La
variante AChER (por readthrough) da lugar a monómeros solubles que están
reguladas positivamente, durante el "stress" (Kaufer et al, 1998); la variante
AChEH (por hydrophobic) produce dímeros, con un dominio Glico Fosfatidil lnositol
(GPI), asociados a membranas de células sanguíneas en mamíferos (Li et al,
1991); y la variante AChEr (por Tailed), la ánica subunidad catalítica expresada en
2
el cerebro y músculos de mamfferos adultos (legay et al, 1995) , da fugar a varios
homo-oligómeros: monómeros, dímeros , tetrámeros, así como también, hetero
oligómeros unidos a distintas proteínas. De uno a tres homo~tetrámeros de
subunidades catalíticas son organizados por la proteína Colágeno Q (CoiQ) (Krejci
et al, 1997) a través de la interacción 4 dominios WAT (tetramerización anfifflica de
triptofano) en el extremo C·terminal de las subunidades cataHticas AChE y un
dominio PRAD (dominio de anclaje rico en prolina) presente en el extremo N
terminal de la proteína CoiQ (Bon et al, 1997; Simon et al, 1998), dando origen a
las formas ~. A8 y A12 presentes en la UNM. Tales hetero~oligómeros pueden
también asociarse a una proteína conocida como "PRIMA" (Perrier et al, 2000).
Esta es una proteína integral de membrana (20 Kda) que posee un dominio N
terminal extracelular, una única región transmembranal y un dominio
citoplasmáUco e-terminal, que organiza tetrámeros de AChE anclándolos a
membranas plasmáticas a nivel del sistema nervioso central y a nivel periférico. El
dominio PRAD de tal proteína interacciona con las subunidades catalíticas de la
AChE de forma simtlar a las interacciones establecidas con el dominio PRAD de la
protefna colagenosa CotQ (Perrier et al, 2002).
2.- Patofógias relacionadas a la alteración de la señal cofinérgica
La importancia de la AChE ha sido demostrada a través de la inhibición de
su actividad catatftica. Una observación clásica es que tal inhibición causa una
desensibilización de los receptores de acetilcolina (AChRs), conllevando así a
parálisis respiratorias. El estudio de las funciones de la ACh en la unión
neuromuscutar con manipulación genética de las cotinesterasas, ha mostrado que
la ausencia de AChE, como en el caso de eliminación de subunidades catalíticas
de AChE o en el caso de mutaciones del gen que codifica para CoiQ (Ohno et al,
1998), induce una activación prolongada de receptores nicotínicos postsinápticos,
debido al exceso de la ACh. Esto origina contracciones repetidas que producen
debilidad en el músculo por una alta frecuencia de estimulación. En ausencia de
actividad de la AChE, la estimulación repetida del músculo resulta en una eventual
disminución de la amplitud de los potenciales de acción generados, no
3
a;Jcanzándose posteriormente el umbral de los canales de (Na2+) necesario para
originar el potencial de acción responsable de 'a contracción muscular (Engef et al,
2003). Tates alteraciones pudiesen también estar relacionadas a una
desensibilización de receptores cofinérgicos nicotinicos.
Los sindromes de miastenia congénitos son un grupo de desórdenes
neurológ·icos heterogéneos. Estos pueden ocurrir por diferentes razones: factores
que afecten el número de moléculas de acetifcolrna por vesícula, en el terminal
presináptico; mutaciones en ta enzima colina acetfl transferasa que resintetiza ta
ACh a partir de colina y acetil coenzima A en el terminal axónico, mutaciones que
afecten el mecanismo de liberación de la ACh; y deficiencias en la actividad de la
enzima AChE a nivel de la hendidura sináptica (Engel et al, 2003). Estudios en
pacientes con el síndrome "miastenia congénita" reportan una reducción en fa
actividad AChE, a consecuencra de mutaciones en el gen de la proteína -de matriz
extracefufar, CofQ, que organiza los tetrámeros de AChE (Ohno et al, 1996), ó a
consecuencia de anormaf.idades presentes en varias subunidades de los
receptores coHnérgicos a nivel postsináptico (Ohno et al, 1996)., mostrando así las
patologías anteriormente descritas. De esta manera se evidencia claramente que
afteracrones, por exceso ó ausencra. del nivel de la ACh originan múftiptes efectos
que son particuJarmente ilustrados -en la intoxicación con pesticidas ó gases
lacrimógenos (ambos inhibidores de-la AChE}.
Actuatme.nte el análisis del polimorfismo de la AChE es nevado a cabo
mediante técnicas clásicas de centrifugación en gradientes de sacarosa.
metodologia que a pesar de ser efectiva y tener una resolución moderada.
necesita de una gran cantidad de muestra y de una gran cantidad de horas para
ser ttevada a cabo. Et desarrollo de técnicas analfticas de alta resolución que
permitan cuantificar muy pequeñas cantidades (en el orden de picomolar) de fa
AChE y en consecuencia estudiar sutiles variaciones de la concentración de
esterasas (AChE) a nivel de ta sinápsis neuromuscular, en diferentes músculos en
un mismo individuo, contribuirían con el análisis de tales patologlas, teniendo así
una gran importancia bromédica.
4
Desarroltar técnicas anatiticas de esta naturateza, ·requerirla de sistemas de
detección con una gran sensibitidad. Adicionalmente. un método de marcaje del
anafito en estudio, que permita et reconocimiento específico de la enzima AChE,
sería necesario. Actualmente se conoce la existencia de una gran variedad de
toxinas de serpientes, que muestran una afta especificidad por sus moléculas
bfanco. Esp:ecmcamente, ta toxina "FascicutiRa''. proteiRa.con una masa motecutar
de ·6. 7 Kda, pl 9.22 upH y Kd 0.4 pM. que mediante 3 tugares de anclaje su une
sinérgicamente a la AChE cerca del •ugar de entrada del sustrato ACh en la
enzima, y muestra una muy alta especificidad en el reconocimiento de tal esterasa
{Radie et al, 1994~ Harel et al, 1995; Boume et al, 1995; Marchot et al, 1993). Una
detecctón indirecta de ta proteína en estudio (AChE), podria ser llevada a cabo
utifizando tal toxina marcada, valiéndose de tas características antes
mencionadas. Ello a su vez permitiría, obtener un sistema de detección que
discrimine en ef reconocimiento de ta AChE en presencia de otras enzimas con
actividad esterasa.
3.- Anáfrsis de AChE a nivel de la unión neuromuscular.
E1ectroforesis Capilar J Detección po.r Fluorescencia Láser :Inducida
la efectroforesis capilar (EC) es una técnica de separación analítica cuyas
bases teóricas fueron descubiertas por SteHa Hjerten en 1967 y que se hizo
práctica por primera vez en 1981 gracias a los trabajos de Jorgenson y Luckaes.
Esta técnica está basada en ta separación de moléculas cargadas bajo la
apticación de un campo eléctrico. A diferencia de las modalidades de
efectroforesis en gel, las cuales representan un método efectivo para separar
moléculas cargadas, la Eleetroforesis Capilar es una técnica con una resolución
remarcabtemente alta, reqmriendo tiempos de anáfiSfs de sofo unos minutos en
comparación a varias horas de análisis en electrofoFeSrs convencionafes. Af
realizar la etectroforesis en capilares de pequeño diámetro {10-100 J.tm) en los que
el calor producido es rápídamente disipado, se consigue la apffcaclón de attos
campos eléctricos que reducen los tiempos de análisis (Voet and Voe~ 1996).
5
Adicionalmente, la b~ja temperatura producida disminuye el coeficiente de
difusión, en la migración de los analitos, dando como resultado un incremento
extraordinario en la resolución.
En la Electroforesis Capilar son utilizados campos eléctricos cuya fuerza
está usualmente en exceso de 300/400 V/cm, mientras que la corriente generada
está limitada a rangos de pocos microamperios. En la técnica se utilizan capilares
de vidrio cuya pared interna está cargada negativamente, primariamente por
ionización de grupos silanol (Figura #1 ).
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Figura #1. Superficie interna de capilares de Sílice desnudos. La amplificación de la estructura de la pared interna del capilar muestra átomos de silicio ubicados en el centro de un tetraedro y átomos de oxígeno ubicados en cada vértice de la figura geométrica. Todos los átomos de oxígeno, en el interior del vidrio, se enlazan con dos átomos de silicio, pero los átomos ubicados en la periferia del vidrio tienen un solo enlace con un átomo de silicio, y de esta forma los electrones covalentes del oxígeno que· no se enlazan con ningún átomo de silicio confieren una carga negativa a la superficie interna del capilar.
6
La superficie negativa en el capilar es inamovible y atrae las cargas
positivas que estén presentes en el interior del capilar. Cuando el capilar esta lleno
de agua, los hidrogeniones provenientes de la disociación del agua se unen a
átomos de oxígeno en la superficie de vidrio y forman radicales hidroxilo. El grupo
que forman un hidroxilo y un átomo de silicio es conocido como "grupo silanol". Si
en el agua hay otros cationes estos desplazan a los hidrogeniones y permanecen
unidos a la pared interna del capilar. Así se forman dos capas de polaridad
opuesta denominada "doble capa", la cual tiene un espesor de unos pocos
amstrongs y una diferencia de potencial muy elevada.
Durante la aplicación de un campo eléctrico los iones de carga contraria e
hidratados (cationes) presentes en el tampón de corrida, interactuando
electrostáticamente con la paredes internas del capifar (F'igura # 2), tienden a
desplazarse desde el extremo anódico al extremo catódico del capilar.
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Figura #2. Esquematización de la interacción iones-grupos Silanol. La figura muestra la interacción electrostática entre iones de carga positiva (cationes) presentes en un tampón de corrida y las cargas negativas de lóS "grupós silanol" en la pared interna del capilar.
7
Así, los cationes se mueven hacia el cátodo y arrastran con ellos el resto de
la solución, originando un flujo de masa conocido como "flujo electrosmótico"
(Figura # 3). El flujo electrosmótico arrastra a todas las partículas que se
encuentran en la solución hacia el extremo catódico del capilar, pero al mismo
tiempo dichas partículas están sometidas a la acción del campo eléctrico que las
separa según su carga. Esta última movilidad se conoce como "electroforética"
mientras que la movilidad dada por el arrastre del flujo electrosmótico es conocida
como "electrosmótica".
+ Cationes presert.es en sotución = Grupos si/ano/ bnizac!os
Figura #3. Flujo Electrosmótico. En esta figura se evidencia la dirección del flujo electrosmótico, originada por el movimiento de los cationes, en sentido ánodo-cátodo. Tal flujo da lugar a un movimiento en masa de toda la solución presente en el interior del capilar.
La Electroforesis Capilar de Zona es una de las variantes de Electroforesis
Capilar más utilizadas y permite separar solutos iónicos y catiónicos (Dalhoeven et
al., 1995). Las moléculas diluidas en un capilar lleno de un tampón, y al cual se
aplica un campo eléctrico, estarán sometidas a dos_ fuerzas principales: la fuerza
electrosmótica y la fuerza electroforética. La fuerza electrosmótica hace que todas
las moléculas fluyan en un solo sentido, mientras que la fuerzcr electroforética
tiene efectos distintos según la carga de la molécula.
La velocidad y sentido de migración de una molécula estarán determinados
por un balance de los vectores electroforético y electrosmótico. Así, en análisis
individuales, los vectores electroforético y electrosmótico operan en el mismo
sentido sobre los cationes y por lo tanto estos migrarán rápidamente hacia el
8
cátodo. Las moléculas neutras, al no tener movilidad electroforética, estarían
sometidas únicamente a la fuerza electrosmótica y por consiguiente migrarán
hacia el cátodo, al igual que los cationes, pero más lentamente. Finalmente, el
vector electroforético opera en sentido contrario al vector electrosmótico en los
aniones, y así la dirección de migración de éstos será la resultante de los dos
vectores, Si el vector electrosmótico es mayor que el electroforétíco los aniones
migrarán hacia el cátodo y en caso contrario migrarán hacia el ánodo (Figura# 4).
Grupos silanol ionizados Capilar de Vidrio
O Aniones e Neutros A, cationes
Figura # 4. Migración de analitos en la Electroforesis Capilar de Zona. La figura muestra la-separación de analitos cargados y neutros, tras la aplicación de-un campo eléctrico. Los vectores en cada analito muestran su sentido de migración, dado por la fuerza electroforética y electrosmótica ejercida sobre cada uno. El vector del flujo electrosmótico muestra la migración de todos los analítos en un solo sentido.
La separación de péptidos y proteínas a través de la EC ha llegado a ser un
instrumento de gran utilidad, ampliamente aceptado por la comunidad científica en
los últimos años, siendo así una posible herramienta en la separación de las
distintas isoformas de la AChE. No obstante, el principal obstáculo que enfrenta la
técnica es la gran afinidad de grupos silanol ionizados, en la superficie interna de
capilares de vidrio, por superficies proteicas. Las proteínas son macromoléculas
9
de estructuras complejas capaces de interaccionar ~lectrostáticamenfe, por
interacciones htdrofóbicas y/6 fuerzas de 'Van der Waals" con tates superficies. La
superficie de silice del capilar tiene aproximadamente 8.31 JLmollff12 de grupos
SJlanot {Rodríguez & li, 1999) y la ion~zacién de tales grupos ocurre a cuafquier
vator de pH superior a 3, ocasionando con elfo un fenómeno de "adsorción
crematográfica" que afecta seriamente fa ,resolución de la técnica, ensanchando y
distorsionando los picos, además de una irreproducibilidad en tos tiempos de
migración.
Diversas estrategias han sido propuestas para evitar ,eJ fenómeno de
adsorción al 'trabajar con capilares de sUice desnudos. Una de ellas es utif(zar pHs
cercanos al punto de neutralización de la pared de sílice, cuyo vator es 2.3. Dado
que el pK de los grupos silanol es igual a 6.3, a un pH 2.3, todos fos grupos sifanol
estarían esenciatmente protonados, srendo así incapaces de adsorber superficies
proteicas por un mecanismo de intercambio i6níco (Righetti et al, 2001}; no
obstante. tal estrategia tendrra la limitación de trabajar en condrciones
desnaturafizantes para una gran variedad proteinas.
Diversas metodologías, que consideran la adición de pollmeros líquidos en
las soluciones etectrotíticas utilizadas, efectivos en formar una cubierta dinámica
en la superficie de s:Uice minimizando así su afinidad por analitos proteicos, han
sido reportadas {Rodríguez & ti, 1999). Otras estrategias han sido el uso de
sofucrones efectrofiticas con valores extremos de pH; acidico, para evitar fa
ionización de 1os grupos sifanoJ ó pHs superiores at ,punto isoefécrico de las
proteínas y at pKa de tos grupos sitanol, para condicionar ambas superficies.
proteica e interna del capilar, a .un estado de carga negativa que provoque una
repulsión electrostática (Righetti et al., 2001).
Un grupo de tampones anfotéricos, isoetéctricos y acidicos ha sido también
utilizado para obtener la ,protonación (inactivación) de los grupos sifanot y a su vez
reducir la afta conductividad asociada a los tampones convencionalmente
utilizados para estos propósitos (Stoyanov & Righetti., 1997). la baja conductividad
en tates soluciones, permite la aplicación de altos voltajes {hasta 800 V 1 cm)
obteniendo tiempos de análisis menores y un aJto poder de resolución debido a fa
10
minima difusión del analito en migración; una gran variedad de metodologías han
sido utilizadas exitosamente para un amplio número de aplicaciones.
Además, han sido desarrolladas estrategias que involucran una
modificación química de las paredes internas del capilar por unión covalente de
polímeros, ó la adición de surfactantes a las soluciones electrolíticas empleadas
en la EC, para disminuir el fenómeno de adsorción.
Igualmente, la utilización de capilares previamente sometidos a tratamientos
que inactivan su superficie han sido estudiados; sin embargo, su utilización es
limitada debido a altos costos de los mismos.
La introducción de la detección por fluorescencia láser inducida en la
técnica antes mencionada proporciona una gran ventaja para el análisis de
pequeñas cantidades de muestra. Este es el método de detección más sensible
para la Electroforesis Capilar. Sus límites de detección se aproximan al nivel de
conteo molecular. Nuevas denominaciones han sido creadas (zepto = 10-21;
yocto = 1 o-24) para referirse a pequeñas cantidades de sustancias que han podido
ser detectadas. Debido a su alta sensibilidad esta técnica tiene un gran potencial
para llegar a ser una herramienta analítica estándar en áreas de investigación
biomédi.ca (Hernández et al., 1993; 1990; Tucci et al., 1997).
De esta manera, el estandarizar una metodología adecuada para la
detección y cuantificación de la AChE utilizando el sistema EC-DFLI, permitiría
contar con una técnica lo suficientemente sensible para llevar a cabo el análisis de
variaciones en la concentración de AChE a nivel de la sinápsis neuromuscular.
Esto conllevaría al estudio de variaciones en el nivel de la enzima AChE que
pudiesen ocurrir en sinápsis neuromusculares con alteraciones de la señal
colinérgica, proporcionando así una herramienta clave para el entendimiento de
tales patologías.
11
Microscopía Confocal
Diversas técnicas !te microscopía convencional y electrónica han tenido un
rot clave en el desarrollo de fa investigación en sistemas biológicos. la
-microscopía electrónica provee una excelente resolución de detalles u'traestructurates, sin embargo -el daño ocasionado a las muestras con tratamrentos
que secctonan y fijan el especimen, adicionalmente al hecho de que las imágenes
bidimensionales obtenidas con taf metodología no permiten reconstruir imágenes
en 3 dimensiones, representan desventajas importantes en eJ uso de la técnica.
Igualmente, aunque la microscopía de luz pe.rmite el estudio de procesos
dinámicos en sistemas fijados ,ó in vivo~ su baja resotucrón rmprde la obtención de
detaffes ultra-estructurales.
Tales limitaciones son superadas con el uso de la microscopia confocal,
técnica en la cual información acerca de secciones ópticas bien definidas, a
diferencia de imágenes obtenidas a partir de todo el espécimen en la microscopía
convencional, pueden ser obtenidas debido a la profundidad de campo de lbs
microscopios confocales. La microscopia confocal secciona la muestra en
imágenes ópticas de forma 1al que tos artefactos observados con la microscopia
-electrónica y convencron·al son eliminados (Wilson & Sheppard, 1984). Secciones
ópticas del espécimen pueden obtenerse no solo en el plano XY (perpendicular al
eje óptico del micr()Scopio), sino también verticalmente en el plano XZ ó yz
(paralelo al eje óptico del microscopio). Además, agrupaciones de secciones
ópticas en planos focales sucesivos pueden ser reconstruidas para p'roducir una
imagen tridimensional del espécimen. De esta forma, fa microscopia confocal
.provee un medio para la observación de componentes estructurales bajo
fluctuaciones temporales, en 3 dimensiones, sin artefactos a causa de la fijación ó
el hecho de seccionar fas muestras en análisis (Matsumuto, 1993).
El desarrollo de un anátisis in sítu de ta enzima AChE presente en la unión
neuromuscular. utilizando Microscopia Confocal, permitiría comparar k>s análisis
realizados con el sistema de Etectroforesis Capilar acoplado a una :Detección por
Fluorescencia láser inducida, en la cuantificación de muy pequeftas variaciones
en el nivel de fa enzima en estudio.
12
2.- Objetivos
El objetivo principal del proyecto es evaluar la posibilidad de resolver y
cuantificar los distintos oligómeros de la AChE utilizando el sistema EC-DFLI.
Para detectar la enzima AChE se utiliza la toxina Fasciculina marcada
(Aiexa 488), proteína que inhibe la actividad de la AChE (Kd 0,4 pM) con una muy
alta especificidad de- reconocimiento.
Para identificar cada oligómero de la AChE, la expresión in vitro de cada
isoforma, es llevada a cabo en un sistema celular de oocitos de Xenopus sp., asi
como la selección de tejidos en donde solo uno de los oligómeros es encontrado.
Posteriores purificaciones decada una de-las proteínas son realizadas.
Para resolver las distintas isoformas de la AChE en el sistema EC-DFU,
nos confrontamos con el fenómeno de adsorción de los anafitos a la superficie
interna del capilar: Se reportan diferentes estrategias que intentan inhibir tal
fenómeno, permitiendo asi obtener señales de fluorescencia reproducibles en
cada experiencia ..
- Los resultados obtenidos con el sistema EC-DFLI, son comparados con un
sistema de análisis in situ utilizando Microscopía Confocal.
13
3.- MATERIALES Y MÉTODOS
3.1- Reactivos
-Toxina Fasciculina (laxotan, Francia).
- Ácido carboxílico succinimidiJ ester Alexa 488
(Molecular Probes, Oregon USA).
Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO. EEUU):
Acido 5,5'-ditio bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB), ácido caproico, ácido N
(2-hidroxietil) piperazina N'-2-etanosulfónico (HEPES), bacitracina,
benzamidina, Brij-96/97, fosfatasá alcalina de E. co/i, o-nitrofenil
galactopiranósido (ONPG), persulfato de amonio (PSA), p-nitrofenilfosfato
disódico (PNPP), Tris, TritonX-100, yoduro de acetiltiocolina.
Merck (Darmstadt, Alemania):
Acido acético glacial, ácido clorhídrico (HCI), ácido maleico, ácido
ortofosfórico, bicarbonato de sodio (NaHC03), carbonato de sodio (Na2C03),
citrato de sodio (C6H5Na30 7}, cloroformo, cloruro de calcio (CaCI2), cloruro
de magnesio (MgCI2), cloruro de manganeso (MnCI2), cloruro de sodio
(NaCI), eter, fenol, ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]), fosfato disódico
monohidrógeno (Na2HP04), fosfato monosódico dihidrógeno (NaH2P04),
glicerol, hldrocloruro de guanidinio (GdnHCI), hidróxido de sodio (NaOH),
isopropanot, metano!, sacarosa, sulfato de cobre (CuS04).
DeAmresco (SoJon. Ohio. EEUU):
Acido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), acrilamida, bisacrilamida,
duodecil sulfato de sodio (SOS), Tween-20.
14
Gibco BRL, Lite Technologies lnc. (Grand lsland. NY, EEUU):
Colagenasa de tipo 11 de C/ostridium histolyticum, estreptomicina.
Boeringer Manheim Corp. (lndianapolis. IN. EEUU):
Fosfatasa alcalina de P. borea/is.
3.2- Soluciones
-Medio OR2: Tampón HEPES 5 mM 1 pH 9,7/ NaCI 85 mM 1 MgCI21 mM
-Medio BARTH: Tampón HEPES 5 mM 1 pH 7,6/ NaCI 98 mM 1
CaCI2 1.8 mM 1 MgCI2 1 mM 1 Gentamicina 50 Jlg 1 mi
-Tampón de Lisis (1): Tampón Tris 50 mM 1 pH 7,0 1 MgCI210 mM 1
Triton X-100 1%
-Tampón de Lisis (2): Tampón Tris 50 mM 1 pH 7,01 MgCI210 mM 1
Triton X-100 1% 1 NaCI 0,8 M
-:Tampón de Lisis (3):
Hepes 25 mM, EDTA 10 mM, Triton x-100 (1%), pH 7,0
- Solución de Ellman: 1 mi Stock Acetylchocolina
2 mi Stock DNTB
20 mi Tampón Fosfato potassium 0,5 M 1 pH 7,4
Se agregó H20 a.s.a. hasta alcanzar un volumen final de 200 mi.
Stock Acetylchocolina: 1 O mg 1 25 mi H20 o.s.a.
Stock DNTB: 400 mg /20 mi Tampón Fosfato 0.25 M 1 pH 7,4
- Solución reveladora Fosfatasa Alcalina:
1/3 Stock PNPP
1/10 Tampón Tris 10 mM 1 pH 8,0
Completar 75 mi con H20
Stock Nitro-4-Fenil Fosfatasa (PNPP): (140 mg /100 mi H20)
- Solución reveladora B-Galactosidasa:
1/3 Stock ONPG
2/3 Stock r++ Stock Ortonitropfenigalactopiranosa (ONPG}:
0,3 g /100 mi Tampón Fosfato 1 O, 1M 1 pH 7,0
Stock {l·++):
15
0,75 mi MgCh 2 M + 0,3 mi MriC12 1 M + 900 mi f3-mercaptoetanol/1 L H20
3.3- Equipos
- Sistema de Electroforesis Capilar: Aparato Monocapilar Modelo: R2D2.1,
Meridiálisis, Mérida-Venezuela, acoplado a un sistema de Detección por
fluorescenCia láser 1nducida.
- Microscopio de ftuorescencia invertido: Olympus tX-70 (Oiympus Optical
Co, ltd, Japan} acoplado a un sistema Confocal Láser de Barrido Olympus.
-:Sistema de Microinyección:
Sutter lnstrument. Model p-77 Brown-Fiamin.g Micropipatte Puller.
Drummond Nanoject. Model 10791. Orummond Sclentific Company. USA
-l-upa Estereoscópica~ Zeiss. Stemi SV-6. USA.
... .Máquina Centrifuga: Hettich Zentrifugen. Model EBA-12R.
- Máquina Ultracentrifuga Beckman L80: rotor SW41.
- ~~isómetro: Ultra Microplate Reader.
ELX 808. Biotech fnstruments, tNC. USA.
- Aparato Celector de Fracciones: Wilson. Modelo FC-205.
-- Criostato laica: Laica lnstruments. Austria.
-Columnas de Níquel- ácido nitriloacético (Ni-NTA). QUIAGEN Company.
-Placas de microtitulación, Cámara de inyección.
16
3.4- Material Biológico.
los ARNm sintetizados in vitro codificando para horno y hetera oligómeros
de la AChE, así como para los dominios: PRAD y CoiQ, fueron amablemente
cedidos por el lab. de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire, École Normale
Supérieure (E.N.S.), París-Francia. Estos fueron:
- ARNm 1 subunidad catalítica de AChET.
- ARNm 1 dominio PRAD.
- ARNm 1 dominio CoiQ.
El sistema celular utilizado para ia expresión de las isoformas de ia AChE
fueron células {oocitos) extraídas del saco ovárico de hembras de Xenopus sp.
-Tales animales fueron obtenidos en el Bioterio de la E,N.S.,- París-Francia.
3.5 .. Expresión de lsoformas de la enzima Aceti1co1inesterasa (AChE} in vitro
3.5.1- Preparación y selección de oocitos
los oocitos fueróli éxtraídós rriééániéaménté déJ sáéó _ovárico de la hémbra
de Xenopus sp., y resuspendidos en una cápsula de petri con medio OR2. lue_go
de lavados sucesivos, 5-10 min. C/U, con agitación constante en medio OR2 y 2
mg/ml de colagenasa tipo 11 para remover et corion externo, estos fueron
guardados a 20 oc durante 24 h. en medio BARTH. Oocitos en buen estado (nítido
límite _entre Jos polos y colóraeión homogénea) fuerorf se1eceionados, utmzando
una -lupa binocular, para ser inyectados posteriormente con ARNm.
3.5.2- 1nyección de ARNm en oocitos de Xenopus sp
Una vez preparado el sistema de inyección, se procedió a inyectar 50 ni de
ARNm en cada uno de los oocitos previamente seleccionados y colocados en una
cámara de inyección con medio BARTH. Para la expresión de monómeros (G1) de
1a ACht, ARNm codificando para ta1 homo-olígómero fue inyectado. En la
expresión de tetrámeros (G4) de la AChE se inyectó una mezcla de ARNm
codificando para la AChET y para el dominio PRAD. En la expresión de las formas
asimétricas de la AChE (~. Aa. A12), inyecciones del ARNm AChET junto con el
17
ARNm del tallo colagenoso CoiQ, fueron realizadas. Cada isoforma fue expresada
individualmente (100 cel./isoforma), en condiciones óptimas para evitar
degradación por ARNsas, y en grupos de oocitos distintos, obtenidos a partir de
una misma hembra de Xenopus sp.
3.5.3- Extracción de isoformas AChE. Medición de actividad enzimática. ---- ·- --- -···-·
Cada grupo de oocitos (100 cel./isoforma) fue homogeneizado en tampón
de Lisis (1): Tris 50 mM, pH 7,0, MgCI2 1d mM, fritan X-100 (1%), at 4 oc (10 ~1
Tampón/cel.), 48 h posteriores a la inyección del ARNm. Tal protocolo fue
realizado para extraer monómeros (G1), y el tetrámero AChE-PRAD (G4). Para
extraer las formas asimétricas AChE-CoiQ (~. Aa. A12) fue necesario utilizar el
tampón de Lisis (2): Tampón Tris 50 mM, pH 7,0, MgCI2 to mM, Triton x .. too (1%),
NaCI 0,8 M, con una mayor fuerza iónica. En el caso de la isoforma AChE-PRIMA,
obten¡da a partir de cerebros de ratones, el tejido nervioso fue homogeneizado en
el tampón de lisis (3): Hepes 25 mM, EDTA 10 mM, Triton x-100 (1%), pH 7,0.
Las muestras se centrifugaron a 4 oc, 15.000 g, durante 10 min. y los
sobrenadarttés fueron transferidos a tubós de "epertdorfs" previamente enfriados.
Alícuotas de 1 a 50 ~1 de cada muestra fueron tomadas y depositadas en una
placa de microtitulación para ensayar luego la actividad enzimática de cada
isoforma, agregando 200 ~~ de sotüción Elfr'nan én cada una, utilizf:fndo el
programa de análisis: "AADeltaSoft". La actividad enzimática (AChE) fue obtenida
mediante el método calorimétrico de Blman et al. (1961), el cuat se basa en el
cambió de coloración, incoloro-amarillo, dadó por la fórrrtación de un complejo en
la reacción entre la Tiocolina, liberada por la AChE tras la degradación de la
acetiltiocolina, y el DNTB (Solución Ellman). Valores de absorbancia (mDO/min) a
414 nm, e intervalos de tiempo de 15 seg. durante 3 min. fueron obtenidos para
cada una de las isoformas, en un espectofotómetro Shimadzu UV-150-02. Las
unidades enzimáticas fueron obtenidas a partir de la siguiente ecuación:
U/mi = (0.0735 • ~DO) 1 (t ·vol)
18
Donde ADO = DO muestra - DO control. t es el tiempo de incubación de la
muestra a 37 oc y vol es el volumen de muestra agregado a la mezcla de reacción
(Deprez et al. 2000).
3.5.4- Expresión temporal de la AChE en oocitos de Xenopus sp.
Dos (2) grupos de oocitos, 20 cel. C/U, fueron inyectados con 50 ni de una
mezcla de ARNm codificando para AChET y el dominio PRAD-6xHis, y
posteriormente incubados en medio 8ARTH (10 J!llcel.) a 20 oc. El hetero
oligómero maduro, que corresponde a la enzima secretada al medio de
incubación, fue utilizado en estos ensayos. En una prueba inicial (A), alícuotas de
50~ del medio de incubación del grupo #1 fueron tomadas, cada 5 h., 3 veces al
día, durante 3 días, para medir luego actividad enzimática. Los volúmenes de
muestra tomados fueron posteriormente renovados añadiendo 50 J!l de BARTH
fresco al medio de incubación. Una segunda prueba (8) fue realizada, y en ella,
alícuotas de 50 ¡ .. d det medio de incubación del grupo #2 fueron tomadas para
medir actividad enzimática, siguiendo las indicaciones anteriormente descritas, e
inmediatamente a e!lo, un recambio tota! del medio de incubación con medio
BARTH fresco fue llevado a cabo. Gráficos de la actividad enzimática obtenida en
ra prueba (A) y de la sumación de la actividad enzimática obtenida en la prueba
(8) fueron realizados para evaluar la producción temporal de la enzima, en el
sistema celular.
3.6- Purificación de las isoformas AChE.
La isoforma AChE (G1) no fue purificada posteriormente a su expresión
in vitro en el sistema celular de oocitos de Xenopus sp. Ello se hizo tomando en
cuenta que el transcrito inyectado en las células correspondía únicamente al
ARNm de fa AChET. Contrario a elfo, las isoformas AChE-CofQ, AChE-PRIMA y
AChE PRAD fueron purificadas de acuerdo a lo descrito en a continuación.
19
3.6.1- Cromatografía de afinidad en gel de Sefarosa-Procainamida.
Las isoformas obtenidas (AChE-CoiQ; AChE-PRIMA) fueron mezcladas
individual y continuamente durante 3 h. a 4 oc , en pequeñas columnas con 1 mi
de gel de Sefarosa-Procainamida (Dhasakumar et al., 2000). Previamente, el gel
fue equilibrado lavando con 10 mi de tampón HEPES 25 mM; pH 7,4.
Posteriormente, se realizó un segundo y tercer lavado con el mismo tampón pero
incrementando su fuerza iónica 0,25 M NaCI (10 mi) y 0,5 M NaCI (20 mi),
respectivamente. Cada isoforma fue obtenida eluyendo con 3 mi de tampón
HE PES 25 mM; pH 7,4; 1 O mM Procainamida.
Distintas fracciones, aproximadamente 100 J.tl C/U, fueron colectadas en
placas de microtitulación. Una vez finalizada la purificación, el gel fue lavado con
1 O mi de Cloruro de Guanidinio 4 M y reequilibrado lavando con 1 O mi de tampón
HEPES 25 mM; pH 7,4.
3.7-ldentificación de las isoformas de la AChE.
3.7.1- Centrifugación en gradientes de sacarosa.
1 DO de cada una de las isoformas AChE obtenidas, tanto la AChE G1
expresada in vitro y las isoformas purificadas, fueron depositados suavemente en
gradientes lineales de Sacarosa (5-20%) en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, Brij-35
12 mM, MgCI2 10 mM. Igualmente, las enzimas p-Gal y Fosfatasa Alcalina (3 J.tl
C/U), fueron añadidos como marcadores de coeficiente de sedimentación (S).
La centrifugación fue llevada a cabo a 40.000 rpm con el rotor Beckman
SW41 a r C durante 17 h., identificando así cada una de las isoformas A ChE de
acuerdo a su coeficiente de sedimentación.
Luego las muestras fueron colectadas usando un aparato extractor de
fracciones. Cada gradiente fue colectado, desde el fondo del tubo, en una placa de
microtitulación a una velocidad constante de O, 15 m in. 1 fracción, obteniendo así
48 fracciones de aproximadamente 200 J.tl.
20
Para determinar la presencia de AChE, se tomaron alícuotas de 100 J.ll, de
cada fracción, ensayando actividad enzimática en cada una. Dos cientos (200) J.ll
de solución Ellman fueron agregados a cada alícuota, en una nueva placa, y la
actividad AChE fue obtenida tomando en cuenta lo expuesto anteriormente en el
punto 3.5.3. la presencia de los marcadores del coeficiente de sedimentación (S),
13-Gal y Fosfatasa Alcalina, fue ensayada tomando alícuotas de 50 f.tl, midiendo
absorbancia a 414 nm tras la adición de 200 f.tl de las soluciones reveladoras en
cada una, en un elisómetro.
3.7.2- Análisis de Sedimentacion de las isoformas AChE.
los análisis de sedimentación de cada isoforma AChE fueron obtenidos
estableciendo una relación lineal a partir de la posición de las enzimas marcadoras
de coeficiente de sedimentación en el gradiente. Una vez obtenida la ubicación de
los marcadores, ¡3-Gal y Fosfatasa Alcalina, en cada gradiente y de manera
individual para cada isoforma, utilizando el programa de análisis: "Kaleida
graphics", la ecuación de la recta (Y= a.x + b) para el cálculo del coefiCiente de
sedimentación (S) de las muestras fue obtenida con la utilización de un programa
especialmente diseñado, que toma en cuenta los valores conocidos de (S) de
ambos marcadores:
Marcador Interno Coeficiente de Sedimentación (S) __ ... ___ --·-·~- -- ·---- - "--
13-Gal
Fosfatasa Alcalina
Así, se obtienen las siguientes ecuaciones:
16 = a.x (¡3-Gal) + b (Ec. 1)
- 6.1 = a.x (P.A.)+ b (Ec. 2)
----~ ----- ~ ·- - . - . ---
16 S
6.1 S
1 9.9 = a.x {¡3-Gal) + a.x (P.A.) 1 (Ec. 3)
---- ---
21
A partir de Ec.3:
1 a = 9.9/ x (p-Gal) + x (P A) 1 (Ec. 4)
Sustituyendo el valor de "a" en Ec. 1 puede calcularse el valor de "b":
1 b = 16- [ 9.9/ X (p-Gal) +X (P A)]. X (p-Gal) 1 (Ec. 5)
Ahora, conociendo el valor "x" de ubicación de la muestra en el gradiente,
obtenido utilizando el programa de análisis: "Ka leida graphics", el coeficiente de
sedimentación (S) para las muestras es calculado utilizando la E:c.1.
3.8- Estandarización der análisis de proteínas con er sistema EC-DFLI.
Las condiciones óptimas para análisis de las isoformas de la proteína
AChE, con EC-DFLI, fueron obtenidas utilizando un aparato monocapilar modelo
R202.1, MeridiálisiS Méridá-Vériézuelá, érisáyándó féCriicás de cubrimiento
dinámico de la superficie interna de capilares de sflice utilizados, basadas en la
adición de compuestos químicos con una fuerte afinidad por tal superfteie, al
tampón de corrida: polimeros neutros (Lindner et al., 1995; Gilges et al, 1997),
surfactantes (Castelleti et al., 2000), y sales que compiten con los analitos por los
posibles sitios de interacción en el capilar(Jorgénson et al., 1981}.
Distintos ensayos fueron realizados utilizando el láser de Argon [Ciass 111-B
Laser Product. National Laser Company, USA. (20 mW 1 max. 160 mW. 488 nm 1
(450-515) nm}] y la fuente de poder [Laser Dríve. 9500 series power supply. Input:
115-230 VAC. 20/15 to 50/60Hz. Output: 70-110 VDC. 3.5-9 A.]
La estandarización de la metodologia de análisis de proteínas con el
sistema EC-DFLI se realizó utilizando la proteína Fasciculina acoplada al agente
fluorescente Alexa 488. Esta toxina fue marcada por incubación (30 min.) a
temperatura ambiente, con el ácido carboxílico succinimidil ester Alexa-Fiuor 488,
tal y como ha sido previamente reportado (Peng & Rotundo, 1999).
22
Una vez obtenidas condiciones experimentales óptimas para el estudio de
analitos proteicos, el análisis de las isoformas de la proteína AChE acopladas a
Fasciculina-Aiexa 488 fue llevado a cabo.
3.8.1- Estandarización del análisis EC-DFLI en condiciones ácidas.
3.8.1.1- Ensayo# 1.
El tampón de corrida (GLU 20 mM) fue ajustado a un pH 4,0, por debajo del
punto isoeléctrico (pi) de la proteína AChE, y pruebas añadiendo el polímero
Hidroxy Propyl Celulosa (HPC) en concentraciones de 0,05%, 0,025%, 0,0025%
p/v fúeron realizadas. Un lavado de las paredes internas del capilar con tal tampón
fue realizado por presión negativa durante 5 min. Las muestras fueron
posteriormente inyectadas por presión negativa en el ánodo a 12 p.s.i. durante 1
seg. La corrida electroforética fue realizada bajo la aplicación de 26 Kv durante
20 min. El capilar utilizado con 76 f.lm de diámetro interno tenía una distancia
efectiva de 34 cm. y el volumen de muestra fue de aprox. 6 ni.
3.8.1.2- Ensayo# 2.
Condicion~s similares a las anteriormente descritas fueron utilizadas al
trabajar con el polímero Carboxi-Metii-Celulosa (CMC) en concentraciones de
0,025% p/v. Las muestras fueron inyectadas por presión negativa en el ánodo a 12
p.s.i. durante 1 seg. La corrida electroforética fue realizada bajo la aplicación de
26 Kv durante 20 min. El capilar utilizado con 76 f.lm de diámetro interno tenía una
distancia efectiva de 34 cm. y el volumen de muestra fue de aprox. 6 ni.
3.8.2- Estandarización del análisis EC-DFLI en condiciones alcalinas.
23
3.8.2.1- Ensayo# 1.
En tales condiciones, se trabajó con tampón Ches 50 mM, cuyo pH fue
ajustado, por encima del pi de la proteína AChE, a 9,0. Posteriormente, 60 mM de
SOS y Tween-20 (3% p/v) fueron agregados al tampón de corrida. Una inyección
electrocinética como lavado de las paredes internas del capilar, previa al cargado
de la muestra, con el tampón de corrida fue realizada durante 15 min. las
muestras fueron luego inyectadas por presión negativa en al ánodo a 12 p.s.i.
durante 1 seg. y la corrida electroforética fue llevada a cabo aplicando 26 Kv
durante 30 min. El capilar utilizado con 99 ¡.tm de diámetro interno tenía una
distancia efectiva de 34 cm. El volumen de muestra fue de aprox. 10 ni.
3.8.2.2~ Ensayo # 2.
Se trabajó con el tampón de corrida y las condiciones anteriormente
descritas (ensayo# 1), excepto por una diferencia en el tratamiento de las paredes
internas del capilar, previo al cargado de la muestra, con ef tampón de corrida.
Este se realizó por presión negativa, a diferencia del lavado electrocinético,
durante 15 min. Las muestras fueron luego inyectadas por presión negativa en al
ánodo a 12 p.s.i. durante 1 seg. y la corrida electroforética fue nevada a cabo
aplicando· 26 Kv durante 30 min. El capifar utilizado con 99 ¡.tm de diámetro interno
tenía un~ distancia efectiva de 34 cm. El volumen de muestra fue de aprox. 1 O ni.
3.8.2.3- E-ns_ayo # 3.
En esta experiencia, la sal K202S8 a una concentración 0,25 M fue añadida
al tampón de corrida Ches 50 mM a pH 9,6 por encima del pi de la AChE. Un
lavado de las paredes internas del capilar con tal solución, previo a la inyección de
la muestra, fue realizado por presión negativa durante 5 min. Las muestras fueron
posteriormente inyectadas por presión négativa en al ánodo a 12 p.s.i. durante 1
seg. y la corrida electroforética fue llevada a cabo aplicando 22 Kv durante 30 min.
El capilar utilizado con 76 JliTl de diámetro interno tenía una distancia efectiva de
34 cm. y el volumen de muestra fue de aprox. 6 ni.
24
3.8.2.4- Ensayo # 4.
Condiciones similares a las descritas anteriormente (ensayo # 3) fueron
utilizadas pero trabajando con un capilar de 99 Jlm de diámetro interno.
Similarmente, las muestras fueron inyectadas por presión negativa en al ánodo a
12 p.s.i. durante 1 seg. y la corrida electroforética fue llevada a cabo aplicando 20
Kv durante 30 min. El capilar utilizado tenía una distancia efectiva de 34 cm. y el
volumen de muestra fue de aprox. 1 O ni.
3.8.2.5- Ensayo # 5.
El tampón de corrida utilizado fue Ches 50 mM a un pH de 9,6. La
utilización de la sal CuS04 a concentraciones de O, 1 M, O, 15 M, 0,2 M y 0,25 M
fue ensayada. Previamente a la inyección de muestras, un lavado de las paredes
internas del capilar con el tampón de corrida fue realizado durante 5 min., por
presión negativa. las muestras fueron inyectadas por presión negativa en al
ánodo a 12 p.s.i. durante 1 seg. y la corrida electroforética fue llevada a cabo
aplicando 20 Kv durante 30 min. El capilar utilizado, de 99 Jlm de diámetro interno,
tenía una distancia efectiva de 34 cm. y el volumen de muestra fue de aprox.-1 O ni.
3.8.2.6- Ensayo# 6.
Se trabajó con el tampón Ches 100 mM a pH 9,6 y la adición de la sal
CuS04 a una concentración 0,20 M y Acetonitrilo al 10%. Un lavado de las
paredes internas del capilar con el mencionado tampón, previo ara inyección de la
muestra, fue realizado por presión negativa durante 5 min. Las muestras fueron
posteriormente inyectadas por presión negativa en al ánodo a 12 p.s.i. durante
1 seg. y la corrida electroforética fue nevada a cabo aplicando 20 Kv durante 35
min. El capilar utilizado con 99 Jlm de diámetro interno tenía una distancia efectiva
de 34 cm. y el volumen de muestra fue de aprox. 1 O ni.
25
3.9- Análisis de las isoformas de la AChE con el sistema EC-DFLI.
Una vez establecidas las condiciones experimentales para el análisis de
proteínas con el sistema EC-DFLI, se procedió.a realizar pruebas con cada una de
las isoformas de la enzima expresadas in vitro y purificadas.
Las muestras utilizadas en cada uno de los ensayos experimentales
(isoformas de la AChE- Fasciculina-Aiexa 488), tanto en condiciones ácidas como
básicas, fueron sometidas a distintos tratamientos de acuerdo a las condiciones de
pH del tampón de corrida utilizado en cada metodología. Así, bajo condiciones de
acidez, los analitos fueron diluidos en el tampón GLU, a un pH 4,0 por debajo del
punto isoeléctrico de la AChE, con las variaciones descritas en cada exp-eriencia.
Bajo condiciones alcalinas, el tampón utilizado fue Ches a un pH 9,6 por encima
del punto isoeléctrico de la proteína con las variaciones descritas en cada
metodología. Los tampones de muestra fueron diluidos 1/10 con respecto al
tampón de corrida, en cada experiencia, confiriéndoles ello una menor
conductividad. Igualmente; ·se trabajó con 10 mDO/j.JI de cada una de las
isoformas AChE en análisis.
Los resultados obtenidos en las distintas experiencias de estandarización
de las condiciones experimentales para el análisis de proteínas con EC, así como
en el análisis de las distintas isoformas de la AChE, fueron representados en
gráficos utilizando el programa Excei-Microsoft, a partir de datos inicialmente
obtenidos y procesados con el "software" ONICE.
26
3.1 O- Análisis in situ de la A ChE mediante Microscopía Confocal.
Los ratones fueron sacrificados por dislocación de vértebras cervicales, e
inmediatamente se extrajo el músculo tibialis anterior, el cual fue posteriormente
estirado sobre una lámina de corcho, sosteniéndolo con pequeños alfileres a
través de los tendones y posteriormente lavados con solución de Ringer 154 mM
NaCI; 5 mM KCI; 2 mM CaCI2; 1 mM MgCI2; 5 mM HEPES, 11 mM glucosa, pH
7,4; y congelados en nitrógeno líquido. Luego, se realizaron secciones
transversales de 1 O J.lm de espesor con un criostato Laica (Laica lnstruments,
Austria) y se montaron en portaobjetos.
Las muestras se incubaron con Fasciculina-AIIexa 488 durante 2 horas, a
una dilución de 1 :500 en PBS. Luego de varios lavados con PBS, las muestras se
montaron en glicerol al 95% en PBS y se observaron en un microscopio de
fluorescencia invertido Olympus IX-70 (Oiympus Optical Co, Ud, Japan) acoplado
a un sistema Confocal Láser de Barrido Olympus. El sistema Confocal fue
controlado con el "software" Fluoview 2 (Oiympus America lnc, USA). Se empleó
un solo haz de Láser de Argón con una longitud de onda de excitación de 488 nm.
Para la detección del Allexa 488 se utilizó un espejo dicroico que permite el paso
de luz de 520 nm. Las imágenes se obtuvieron usando un lente objetivo de
inmersión X60 (Oiympus UplanFI, 0.17 NA). La apertura del Confocal fue de 100
Jlm. Se utilizo 6% de densidad· del filtro de transmisión y la ganancia del foto
multiplicador se dejo constante durante todos los casos. Se realizaron series de
secciones ópticas de 0.5 ¡.tm de intervalos, las cuales se recogieron utilizando un
rastreador de barrido estándar (512 x 512 pixeles, 154 x 156 con el aumento X2,
ó 75 x 75 cuando el aumento era de X4).
Para cuantificar la cantidad de fotones emitidos por la Alexa acoplada a la
Fasciculina, se utilizó el programa "análisis" del sistema "Fiuoview 2" que mide la
cantidad de fotones en el área seleccionada (rectángulo amarillo).
27
4.- Resultados y Discusion
Parte del objetivo principal de este proyecto, tal y como fue anteriormente
descrito, era resolver e identificar cada una de las isoformas de la AChE utilizando
el sistema EC-DFLI. Para realizar estos análisis, inicialmente, era necesario
expresar las isoformas de la enzima in vitro. Luego, tras posteriores purificaciones
de las isoformas, los análisis mencionados podían llevarse a cabo.
De esta forma, los resultados que se presentan inicialmente corresponden
al estudio de la actividad enzimática de las isoformas AChE expresadas in vitro en
el sistema celular de Xenopus sp., a la expresión temporal de la enzima en el
mencionado sistema, a la purificación de cada una de las isoformas y a la
identificación de las isoenzimas AChE mediante análisis de sedimentación.
3.5- Expresión de lsoformas de la enzima Acetilcolinesterasa (AChE) in vitro
3.5.3 Extracción de las isoformas AChE. Medición de actividad enzimática.
Mediciones de actividad enzimática en cada una de las isoformas
expresadas in vitro y posteriormente purificadas, fueron llevadas a cabo utilizando
el método de Ellman (1961). Tal resultado muestra que las isoformas AChE
obtenidas eran enzimáticamente activas. Valores de unidades enzimáticas, para
cada isoforma, son reportados en la siguiente tabla.
Tabla #1. Actividad enzimática de las isoformas de la enzima AChE expresadas in vitro.
lsofonna AChE mDO /pi (414 nm) U/mi
AChE PRAD-Hist 120 2830
AChE-monómeros 76,4 1862
AChE-CoiQ 17,8 432,5
AChE-PRIMA 53,6 1303
28
3.5.4- Expresión temporal de la AChE en oocitos de Xenopus sp.
Para llevar a cabo el estudio de la expresión temporal de la enzima en el
sistema celular utilizado, era necesario obtener inicialmente una forma soluble y
estable de la AChE, como lo es el tetrámero organizado por el dominio PRAD (Bon
et al, 1997). Para producir una alta concentración de la enzima, oocitos de
xenopus sp. fueron inyectados con una mezcla de ARNm codificando para AChET
y PRAD. El tetrámero de AChE organizado por el dominio PRAD es eficientemente
secretado al medio de incubación, mientras que los monómeros precursores son
retenidos y degradados en el medio intracelular. Así, el análisis de la expresión
temporal de la enzima presente en el medio de incubación (BARTH) de las
células, fue llevado a cabo.
El siguiente gráfico muestra el estudio de la expresión temporal de la
enzima AChE en el sistema celular de oocitos de Xenopus sp. La isoforma AChE
PRAD fue expresada en 2 grupos de oocitos (20 cel. C/U). La figura muestra una
comparación entre la actividad enzimática en la experiencia donde luego de la
toma de·muestras, el medio.de incubación de ·las células fue reemplazado por
medio BARTH fresco (fucsia) y la curva de actividad enzimática correspondiente a
la experiencia en donde posteriormente a la toma de muestras, el medio de
incubación no fue removido (azul).
20,0 ..
o 10 20 301 40 '"t"' ~r)
29
60
Gráfico #1. Expresión temporal de la enzima AChE en el sistema celular de oocitos de Xenopus sp. Cincuenta (5ó) ¡.¡1 del medio de incubación de cada grupo de oocitos inyectados con los transcritos, fueron tomados como muestras a las cuales se determinó actividad enzimática AChE. La sumación de actividad enzimática observada tras la remoción del medio de incubación (curva fucsia) posteriormente a la toma de muestras, muestra una producción continua de la enzima, mientras que la actividad enzimática observada en la toma de muestras del medio de incubación que fue mantenido constante (curva azul) muestra un nivel máximo de expresión de la enzima A ChE alrededor de 24 h. posteriores a la inyección del transcrito.
El resultado muestra que el recambio del medio de incubación de las
células con medio BARTH nuevo, posterior a la toma de muestras, permite que las
células traduzcan continuamente el transcrito inyectado, razón por la que la curva
correspondiente a la sumación de actividad enzimática observada (fucsia)
incrementa a lo largo de los 3 días. Contrario a ello, en condiciones en donde el
volumen de muestra tomado es renovado con igual volumen de medio BARTH
nuevo, esto es, donde el medio de incubación es mantentdo, la curva de actividad
entimática observada (azul) indica que la expresión de la enzima AChE alcanza
su nivel máximo alrededor de 24 h. y luego permanece constante.
30
En otras palabras, aún cuando la producción de la enzima parece ser
constante, su acumulación no lo es. Tal resultado hace tentador el especular que
la traducción de la AChE pudiese regular negativamente su expresión, ó que la
isoforma presente en el medio es inestable; razones por las que la actividad
enzimática observada experimentalmente pudiese no ser acumulativa en el
tiempo. Esto sugiere resultados interesantes que están fuera del objetivo de este
trabajo. Posteriores investigaciones que intenten responder las hipótesis
mencionadas, podrían ser desarrolladas. No obstante, los resultados muestran
que el sistema celular de oocitos de Xenopus sp. es eficiente en la traducción de
los transcritos inyectados, permitiendo así obtener isoformas enzimáticamente
activas de la AChE. Las isoformas AChE utilizadas en este proyecto fueron
extraídas de los oocitos, luego 24 h. de la inyección de los transcritos.
3.6- Purificación de las isoformas AChE.
Tal y como fue descrito en la metodología, la _isoforma AChE (G1) no fue
purificada posteriormente a su expresión in vitro ·en el sistema celular de oocitos
de Xenopus sp. Ello se hizo, tomando en cuenta que el transcrito inyectado en las
células (ARNm AChEr) correspondía únicamente al que codificaba para la
subunidad catalítica de la enzima, a diferencia de las otras isoformas en donde el
transcrito inyectado correspondía a una mezcla entre el ARNm AChEr y transcritos
codificando para proteínas que organizan las subunidades AChE, ARNm CoiQ y
ARNm PRAD, respectivamente.
31
3.6.1- Cromatograffa de afinidad en gel de Sefarosa-Procainamida.
El resultado de la purificación de isoformas AChE enzimáticamente activas
(AChE-PRIMA; AChE-CoJQ) por cromatograffa de afinidad, en columnas de
Sefarosa-Procainamida, es evidenciado en los perfiles de efusión obtenidos para
cada isoforma; resultado que se muestra en fa siguiente figura.
'ZD
3'D
i 250
300' .,. .. ~ o 1el) Q
100
~
o o 2 4 6 S 10 12
Volmen de EltsiónCnf)
Gráfico #2. Purificación de la AChE por cromatografía de afinidad utilizando un gel de Sefarosa-Procainamida. La figura muestra el perfil de elusión de la enzima AChE activa (HEPES 25 mM, pH 7,4). Posteriormente al cargado de la muestra se realizaron lavados incrementando la fuerza iónica del tampón utilizado. Cada isoforma fue eluida con 3 mt tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, Procainamida 1 O mM.
32.
3.7-ldentificación de las isoformas de la AChE.
3. 7.1- Centrifugación en gradientes de Sacarosa.
A 8
1 1 1 1
AChEIPRIMA 1'
1 1 1 1
1 1 1 1 1
e AthEG1I
D
1 1 1 1
AChEIG2 1 1 1 1 1
UJ S O CuvJlduatu do ..tima:d8gfa (S)
Gráfico #3. Perfiles de sedimentación obtenidos para cada una de las isoformas de la enzima AChE expresadas in vitro en el sistema celular de oocitos de Xenopus sp. La figura muestra una expresión eficiente de cada uno de los transcritos que codifican para las distintas isoformas de· la enzima. El panel (A), expresión de AChE-CoiQ, muestra también la presencia de monómeros (G1) y hetero-oligómeros (Aa) de la AChE; el panel (B), expresión de AChE-PRIMA, también muestra la presencia de monómeros (G1); panel (C) muestra la expresión de la isoforma AChE G4, y el panel (D), expresión de AChE (G1), muestra también la presencia de dímeros (G2) .
33
El resultado mostrado en el gráfico #3 se correlaciona perfectamente con
las metodologías utilizadas en la extracción y purificación de las isoformas
expresadas. En el caso de la AChE G1 (panel O) esta isoforma no fue purificada
tras su extracción por lisis celular, tomando en cuenta que la expresión del
transcrito (AChET) inyectado en los oocitos, correspondería únicamente a la
subunidad catalítica de la AChE. No obstante la posibilidad de obtener variantes
de monómeros organizados estaba presente al trabajar en estas condiciones
experimentales, razón por la cual el análisis de sedimentación revela que la
expresión del transcrito también dio lugar a la organización de dímeros.
Contrario a lo anteriormente descrito, las isoformas AChE-CoiQ y
AChÉ-PRIMA fueron purificadas por cromatografía de afinidad con procainamida,
molécula que interacciona con subunidades catalíticas de la AChE. En vista de
que el transcrito inyectado a las células fue una mezcla de ARNm codificando para
AChET y ARNm que codifica para CoiQ y PRIMA, respectivamente, existía la
posibilidad de obtener la expresión de variantes distintas a las isoformas
esperadas. Tal consideración explica el por que, independientemente de que las
isoformas expresadas en mayor proporción en los páneles A y B, fueron las
correspondientes a la expresión de los transcritos deseados (AChE CoiQ y AChE
PRIMA, respectivamente), también estuviesen presentes variantes de
subunidades catalíticas organizadas ó individuales. Por ello, se puede observar la
presencia de monómeros, en los paneles A y B, los cuales fueron probablemente
expresados en el sistema celular y posteriormente a la extracción de la enzima por
lisis celular, tales variantes de la proteína se unieron por afinidad a la columna de
sefarosa-procainamida, eluyendo posteriormente con las isoformas purificadas.
Una vez que las isoformas AChE expresadas in vitro fueron purificadas, y
obtenidos los análisis de sedimentación para cada una, se pr:ocedió a realizar el
segundo objetivo del proyecto, el estandarizar las condiciones experimentales
necesarias para llevar a cabo el análisis de proteínas con el sistema EC-DFLI.
Tales resultados se presentan a continuación.
34
3.8- Estandarización del análisis de proteínas con el sistema EC-DFLI.
La estandarización de la metodología de análisis de proteínas con el
sistema EC-DFLI, tuvo como principal obstáculo la adsorción de los analitos a la
superficie interna del capilar, fenómeno conocido como adsorción cromatográfica.
Los ensayos aqui descritos intentaron inhibir el fenómeno de adsorción a través de
distintas estrategias y ello fue realizado utilizando la toxina Fasciculina acoplada al
agente fluorescente Alexa 488 como proteína en análisis. Posteriormente a la
estandarización de las condiciones óptimas de análisis de proteínas con este
sistema, ensayos con las isoformas AChE expresadas y purificadas, fueron
realizados.
La señal de fluorescencia, emitida por el fluoróforo Alexa 488 en un rango
de pH, 4,0-10,0, (Molecular Probes, Oregon USA) representó una ventaja
experimental, en comparación a la utilización de otros fluoróforos con rangos de
fluorescencia a pHs limitados. Esto permitió ensayar distintas técnicas de
inactivación de la superficie interna de los capilares utilizados tanto en condiciones
ácidas como áléalinás. Adicionalmente, sus propiedades eran éómpatibles con el
láser (160 mW /488 nm)y los filtros instalados en el sistema de EC-DFLI.
3.8.1- Estandarización análisis EC-DFll en condiciones ácidas.
El estandarizar distintos métodos de cubrimiento dinámico de la superficie
interna del capilar bajo condiciones acidas en el tampón de corrida, tuvo su origen
en la consideración teórica de que a tal pH {4,0) los grupos silanol (pK 6,3) en la
superfiCie interna de los capilares estarían parcialmente protonados, portando así
una carga positiva que inhibiría la adsorción de superficies proteicas a través de
mecanismos de intercambio iónico (Righetti et al., 2001). Adicionalmente, una
carga neta positiva sería conferida a la proteína AChE a aprox. 3 unidades de pH
por debajo de su punto isoeléctrico (pH 7, 15), lo que daría lugar a una repulsión
electrostática entre cargas iguales en el analito y Jos grupos silanol en la superficie
interna del capilar. Además, distintos mecanismos de inactivación de la superficie
interna de los capilares mediante la formación de una cubierta dinámica, utilizando
ciertos polímeros, eran favorecidos bajo tales condiciones de acidez.
35
3.8.1.1- Ensayo# 1.
Diferentes condiciones de análisis de la toxina Fasciculina acoplada a
Alexa 488, con el sistema EC-DFU, a través del cubrimiento dinámico de la
superficie interna de los capilares de sílice utilizados- añadiendo el polímero
Hidroxi-Propii-Celulosa (HPC) en distintas concentraciones 0,05%, 0,02:5% y
0,0025% al tampón de corrida, en condiciones ácidas (pH 4,0), fueron llevadas a
cabo. El siguiente gráfico muestra la utilización del polímero HPC al 0.05% p/v.
2000,
l 'l50ü 1 "C «: -::::: A ~ o ' . -~ 100' l-r-. _____ , .... ,.,_,., -~ ·~ ~><", ,1
Toxina-Aiexa 488 (1 ng/IJL)
5!}0 +---.....----.,..-- --.----.-- - -..----; o 12
tiempo (nlir1)
Gráfico #4. Análisis de · Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡.JI). En esta experiencia la inhibición del fenómeno de adsorción intentó llevarse a cabo mediante la inactivación de la superficie interna del capilar, añadiendo el polímero HPC 0,05% p/v al tampón de corrida GLU 20 mM, pH 4,0 y trabajando en condiciones de pH que favorecían la repulsión electrostática entre la muestra y los grupos silanol en el capilar. Una clara irreproducibilidad en el resultado es observada en los patrones distintos que corresponden a corridas electroforéticas consecutivas. El capilar utilizado tenía 76 ¡.Jm de diámetro interno! y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
36
El análisis realizado utilizando 0,05% p/v de HPC mostró no ser eficiente en
la resolución del péptido Fasciculina acoplado al agente fluorescente Alexa 488. El
fenómeno de adsorción cromatográfica no fue inhibido bajo tales condiciones
experimentales. Un claro ensanchamiento de los picos fue obtenido. No se obtuvo
reproducibilidad alguna en los resultados, tal y como se evidencia con la obtención
de patrones de fluorescencia diferentes tras la aplicación consecutiva del campo
eléctrico a la misma muestra. Los tiempos de corrida electroforética fueron de
aproximadamente 1 O m in. y er voltaje aplicado de 26 kV.
Los siguientes gráficos muestran la experiencia en la que el polímero HPC
fue añadido, al tampón de corrida, a una concentración de 0.025% p/v.
4 500' : 4000-:
> 350tJ - · E 3000 - : - .
'i ~ '(151 -
2500 - : ;,
2000 - r
~ 1 000 i·¡~~~~~;~ ..... ~~"'·~¡¡¡¡¡~~~....).~~·~·?t·~ · ¡¡--=~~=---== 50(1: -1 .. ,¿.L.~ - ' ~·-· ¡;-_,
150t):
0:~-------~ •. -------~. -------.~-------. o 2 4
Ti erqlo (rrin)
6 8
-- Tc-x í·n ;a,. .A.Iexa (10 t'lgmer ~:lit' fiJ
-- Toxi'n:a;..Ci..l..oxa (1 r;g/ñ'Jor ;:•litt e.)
-· - Twdn¡¡¡.Aiexa ( 1:<:.0 pglrricHo·litr <::>)
·-- To»~~na-Aie<:a
( 1•úpg/mcr olttro) -· - Toxi:r.a;.AI.;;xa
(1: p,gtrr;cr: o lit!: o:•)• ~. T<»~trra;.AI~<~
(1::00 Fg/J:ncrolitro) ·-- TcJ>dnar. A lllt.<a
(1!ó F {'fiTicr oJitr .c.) -· - ·· T~U>< í th.,• AI~a
( 1 F ~fri:,r;oftro)
Gráfico #5. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488. Polímero HPC 0,025% p/v. La inactivación de la superficie interna del capilar, intentó obtenerse añadiendo el polímero HPC 0,025% plv al tampón de corrida GLU 20 mM, y trabajando en las condiciones de acidez anteriormente descritas (pH 4,0). El resultado manifiesta reproducibilidad en las señales de fluorescencia obtenidas en análisis sucesivos, mediante la aplicación del campo eléctrico, de una misma muestra .. El capilar utilizado tenía 76 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
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(10 pgll'rier olw o)
- T;»< h a- A l;.¡,'<a (1 ¡;:.~m(;t otl:ro)i
-· - - T{.x ha¡. A le < a (-tOO F;g./rricr ao1ib' "')
-- T~ha-AI~a (10 F:glmcr ~:íllr o)
---l'óxn ~AJ...x.a ()i U ' (1 f ',gtrrb ro .. ffro)
37
Gráfico #6. Detalle del gráfico #5. Análisis Fasciculina-Aiexa 488. Polímero HPC 0,025% p/v en el tampón de corrida GLU 20 mM, pH 4,0. Tal figura muestra una detección clara de Toxina-Aiexa 488 a una concentración a 1 pg/1.11.
Tales figuras muestran que la concentración 0,025% p/V del polímero HPC
añadida al tampón de corrida disminuyó significativamente el fenómeno de
adsorción cromatográfica, conllevando a una resolución parcial de la proteína
Fasciculina acoplada a Alexa 488, a una concentración de 1 pg/~1. Una alta
reproducibilidad de los resultados fue obtenida bajo tales condiciones. Sin
embargo, es importante destacar que aún cuando el ensanchamiento de los picos
obtenidos fue reducido, en comparación al ensayo anterior bajo una concentración
0,05% p/v de HPC, pudo evidenciarse un ensanchamiento importante en las
señales reportadas. Los tiempos de corrida electroforética fueron de 10 min. y er
voltaje aplicado de 26 kV.
El siguiente gráfico muestra el ensayo realizado para inhibir la adsorción del
analito a las paredes internas del capilar, utilizando el polímero HPC a una
concentración menor (0.0025% p/v) a la anteriormente reportada.
450U
400Dl ~ S ~OO] ~ .§.. ~~-~o_ o ¡.
1-l -g ..::;OOL 1 ~ 2000 ' j · j 1 50~ . . / - ----------
1000 1_ '-.-...,...,..-------
5000 1-,~-__ ,_./\_ _____ -· -· ---· 1 •. i 1
o 2 4 6 8 Tiempo (mtn)
~- - ··= TOlUM·f'di:Jié<li ( 1 n!;t!rritro~tl'o} 0.002 5% HPC
-- Tmdna-A 1exa (1 ngfffi¡; ro~tr O): 1 0.025% Hf'C
38
Gráfico #7. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡JI). La figura muestra que la inhibición del fenómeno de adsorción no ocurrió al añadir el polímero HPC al ó.Oó25% plv en el tampón GLU 20 mM, pH 4,ó. Una alta irreproducibilidad en las señales de flUorescencia, es evidenciada con la obtención de electroferogramas diferentes tras la aplicación consecutiva del campo eléctrico para el análisis de una misma muestra. El capilar utilizado tenía 76 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
El gráfico #7 evidencia que la concentración de HPC 0,0025% p/v añadida
al tampón de corrida no inhibe el fenómeno de adsorción cromatográfica del
analito; lo cual esta representado en la diferencia de los electroferogramas
obtenidos para el análisis de una misma muestra y en un ensanchamiento
importante de la señal obtenida, en comparación al análisis de la misma muestra,
a igual concentración, con 0,025% p/v del polímero HPC (fucsia). En corridas
iniciales, inmediatamente después de la inyección de muestras, los analitos se
adhirieron a la superficie interna del capilar dando como resultado una pérdida en
su detección. Tales señales fueron posteriormente obtenidas, en subsecuentes
aplicaciones del campo eléctrico mostrando así una alta irreproducibilidad en los
resultados.
39
La diferencia en la señal de la línea base de intensidad en ambas
experiencias, es probablemente debida a cambios de pH en los tampones de
corrida que tienen lugar a consecuencia de la electrólisis que ocurre bajo la
aplicación de tan altos campos eléctricos en los reservorios del tampón de corrida
tanto en el ánodo como en el cátodo. Ello da lugar a variaciones en la
conductividad en la solución, lo cual es observable en la señal del detector como
un cambio de posición de la línea base. Los tiempos de análisis fueron de 1 O m in.
y el voltaje aplicado de 26 kV.
Una vez obtenidas las condiciones experimentales mencionadas en los
análisis utilizando 0,025% p/v de HPC (ensayo #1/condiciones ácidas)
experiencias con la proteína AChE obtenida a partir de macerados del músculo
gastrocnemio de ratones, acoplada a la toxina marcada (t=asciculfna-Aiexa 488)
fueron realizadas. Tal resultado puede apreciarse en la siguiente figura.
4500 4001) 3500
~ 3001]: -'O 2500 ~
:¡ 2000. . ¡ ~
! 150ü .. .
1 Ql)l);
- . .A.Ch6 T«<ina· Ale-:; a ( 1nglrrior (• titr~)
1er .!!l .-le:etr l)tor~ú
-· ·~· ACh~ 1'«-:ir.J"Aie:><ª (1 n~lrriqoltro) 2da e lo.: ctrofor es i>
500: ~:::::::,;;~d!,..,J4c....C:===~====== 0+-----~---=~--~F---~----~.
2 4 ·m
Gráfico #S. Análisis de AChE unida a Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡.11), obtenida apartir del macerado del músculo gastrocnemio de ratón. Las condiciones utilizadas fueron las anteriormente descritas para el ensayo #1 en condiciones ácidas con la utilización del polímero HPC al 0.025% p/v en el tampón GLU 20 mM, pH 4,0. Una alta irreproducibilidad en las señales de fluorescencia obtenidas, se evidencia en electroferogramas con diferentes patrones tras la aplicación consecutiva del campo eléctrico para el análisis de la misma muestra. El capilar utilizado tenía 76 ¡.~m de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
El gráfico #8 muestra que la~ condiciones de anátisis utifizadas en los
ensayos con Fascicutina-Atexa 4BB~ mencionadas en ef gráfico # 5~ no fueron
efiCten.tes en fa inhibición def fenómenG de adsorción cuando se trabajó con :fa
extracción de ta protef:na AChE a partir def músculo gastrocnemio. Se obse.rva
claramente que durante ta primera corrida efectroforética et anafito fue adsorbido
cromatog.ráfJCamente. Contrario a ello, y tras una segunda experiencia, el anafito
migró libremente mostrando un aumento significativo en la sefiat de intensidad
obtenida, probablemente causado por un efecto de adición de señal
correspondiente a las dos inyecciones de muestra. Esto representa una clara
irreprodueibiftdad en tos resultados obtenidos.
Tal resultado sugiere que al trabajar con muestras en conc:ffciones
fisiológicas. en contraste at anáJisis de las isoformas expresadas in vitro y
purificadas, es probablemente mucho más complejo, debido á ta ocurrencia de
pos.ib1es interacciones terciarias de las proteínas en condiciones nativas y/ó
interacciones cuaternarias entre diversas proteinas, que pudiesen interferir eon el
patrón de migración del analito. No obstante, futuros ensayos que incluyan fa
purificación de las formas activas de la AChE a partir del macerado del músculo~
utilizando cromatografía dé afinidad {procainamida), pudiesen ser llevadas a cabo.
3.8.1.2- Ensayo #2.
Al conocer previamente las condiciones experimentales adecuadas y la
concentración óptima del potfmero HPC (0,025%). para el anáfisis de la proteína
F ascicunna acoplada af fluoróforo Alexa-488, sé procedió a trabajar utilizando otro
polímero, Carboxi-Metii-CeluJosa (CMC). en iguales condk:iones de acidez y 1a
concentración del potimero mencionada, 0,025% plv.
41
4500 400l)
~ 3500 3000 -... - 2500 i
~ 2000 -~ 1500 m 1:: 1000 - 500
o _,_ -- -
-50{JJ 11 2 4 6 8 10
-- -- -- Tet.dna-AJ~a (1nglrric1ófitro) if!t a e.l~.::trt.lf orest>:
- -- -Tcrxm.a..Aiexa (1nglnicrolítr6J ::G:dJ .eJ¡¡:dJO'foresis
Gráfico #9. Análisis de AChE unida a Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡.JI). El ensayo intentó inhibir el fenómeno de adsorción cromatográfica con la adición del polímero CMC al 0.025% p/v en el tampón GLU 20 mM, pH 4,0. Una alta irreproducibilidad en las sef\ales de fluorescencia obtenidas, se evidencia en electroferogramas con diferentes patrones tras la aplicación consecutiva del campo eléctrico para el análisis de la misma muestra. El capilar utilizado tenia 76 ¡.Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
El gráfico #9 evidencia que las condiciones de análisis utilizando el polímero
carboxi-metil-celulosa (CMC) a una concentración de 0,025% p/v en eJ tampón de
corrida, no fueron eficientes para inhibir la adsorción cromatográfica de los
analítos. La figura muestra corridas electroforéticas consecutivas, de una misma
muestra, en donde las diferencias en señal de intensidad obtenida revelan la no
ocurrencia del fenómeno de adsorción en una primera corrida electroforética
(señal 4000 mV) y la ocurrencia del fenómeno tras una posterior aplicación del
campo eléctrico (señal 1500 mV). Ello representa una alta irreproducibilidad en los
resultados obtenidos_. El tiempo de análisis fue de 1 O min. bajo la aplicación de un
voltaje de 26 kV.
42
3.8.2- Estandarización EC-DFU en condiciones alcalinas.
La inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, en condiciones
alcalinas, también fue llevada a cabo tomando en cuenta ciertas consideraciones
teóricas. En tal condición de pH (9,0) los grupos silanol {pK 6,3) portarían una
carga positiva, al igual que la enzima en estudio AChE (pi 7.15), lo que debfa
resultar en una disminución de la adhesión de superficies proteicas a la superficie
interna del capilar, por un efecto de repulsión electrostática (Rig~etti, et al., 2001 ).
3.8.2.1- Ensavo#1.
Bajo estas condiciones de análisis, se intentó inactivar la superficie interna
de los capilares de sílice mediante un tratamiento previo de la superficie interna
del capilar con los detergentes SOS 60 mM y Tween-20 al3% p/v, presentes en el
tampón de corrida Ches 50 mM, pH 9.0, el cual fue realizado por Inyección
electrocinética.
4500 4000
3500 ¡3000 -¡ 2500 l! 2{)00 j 1500 .E
1000
500
o o 5 10 15 20
Tiempo {nin)
- Toxha.AI!ool (1 ngllmrorltto)
Gráfico #10. Análisis de Fascículina-Aiexa 488. La inhibición de la adsorción cromatográfica de intentó llevarse a cabo mediante un tratamiento del capilar con inyección electrocinética del tampón Ches 50 mM, pH 9.0, en presencia de SOS 60 mM 1 Tween 20 3% plv, antes de la inyección de muestras en el capilar. El gráfico muestra una alta irreproducibilidad en las seflales de fluorescencia obtenidas, evidenciando que tales condiciones experimentales no inhibieron el fenómeno de adsorción de los analitos. El capilar utilizado tenia 99 JJm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
43
los análisis del péptido fascicuHna-Afexa 488, mostraron no ser eficientes
en ta inhibición de1 fenómeno de adsorción cromatográftca~ la figura evjdencia
claramente fa aparición de Wl patrón de una señal de fluorescencia que OCUffe
como consecuencia de un desfase en el desplazamiento del analito durante su
migración~ originado a causa de la adsorción parcial del mjsmo, a las paredes
internas del capilar. bajo ia apficadón del campo eléctrico.
Et resu1ta:do esperado era la aparición de solo una sefia1 correspondiente a
la proteína Fascieutina-Atexa 488. Aún cuando en teoría tos detergentes SOS y
Tween.-20 deberfan competir con el analito por tos sitios de adsorción en la
superficie mtema del capilar~ tat efecto no mhibe la adsorción cromatográfica bajo
estas condiciones experimentaies. los tiempos de migración fueron de 30 min. y
el voltaje apticado de 26 kV.
3.8.2.2- Ensayo #2.
En este ensayo fas condiciones expeñmentafes fueron similares a fas
descritas en Ja experiencia anterior excepto por una diferencia ·en el tratamiento
previo de ta superficie interna del ca.pitar, el cual a diferencia de un lavado por
inyección electroeinética con e1 tampón de corrida, fue reaüzado mediante una
inyección por presión negativa de tal solución.
4500 4000 3500
~· 3000 -! 2500 .. 2000 j 1500 -- 1000
500
- Twdna·A1~.J ( 1 fl9/rrier olitl' o)
0+---~~--~----~----~--~----~. o 5 10 15 20 30
Tiempo tmn)
44
Gráfico #11. Análisis de Fascicuiina-Aiexa 488. las condiciones de análisis usadas en esta experiencia fueron esencialmente las anterionnente descritas, pero el tratamiento previo de la superficie interna del capilar, fue Jlevado a cabo con una inyección por presión negativa del tampón Ches 50 mM, pH 9.0, en presencia de SOS 60 mM 1 Tween 20 3% p/v, durante 15 min. antes de la inyección de muestras. las señales de fluorescencia observadas fueron obtenidas tras una segunda aplicación del campo eléctrico, es decir, Juego de 30 min. correspondientes a ia duración de una primera corrida electroforética en la que el analito fue adherido a la superficie interna del capüar. El capilar utüizado tenía 99 pm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 10 ni.
El gráfico #11 muestra que ta1 modificación, en e1 tratamiento previo del
capilar, no inhibe el fenómeno de adsorción cromatográfica. El eJectroferograma
fue obtenido tras la aplicación de una segunda electroforesis, razón por la que fas
señaJes de flluorescencia se observan en Jos primeros mlnutos de Ja segunda
aplicación deJ campo eléctrico. Durante el primer anáJjsis no hubo detección
alguna. Los tiempos de migración fueron de 30 min. y et voltaje apUcado de 26 kV.
45
3.8.2.3- Ensayo #3.
Aquí las consideraciones teóricas tomadas en cuenta para inhibir el
fenómeno de adsorción de los analitos proteicos fueron distintas. La utilización de
una alta concentración de la sal K202Ss 0.25 M en eJ tampón de corrida, crea un
efecto de competencia con los analitos por los posibles sitios de interacción en el
capilar. Ad1cionalmente, un pH aproximadamente a 3 unidades por encima del pi
de la enzima (pH 7,15) le conferiría a esta una carga negativa, al igual que a los
grupos sitanol en la superficie interna del capilar, 1a cual daría Jugar a una
repulsión electrostática.
601]
> 550 s :¡ 500 -¡¡ e a .5 4SO
- TO)(ina·AI&:Xa {t n¡¡V'mcroUro)
400+---~~--~----~----------~--~
o 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min)
Gráfico #12. Análisis de Fasciculína-Aiexa 488. El tampón Ches 50 mM, pH 9,6, inclufa la sal K~2Sa 0,25M, para inhibir la adsorción cromatográfica de los analitos por un efecto de competencia por los posibles sitios de interacción. El electroferograma obtenido evidencia una alta irreproducibilidad de los resultados obtenidos a consecuencia del fenómeno de adsorción. El capllar utilizado tenía 76 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 6 ni.
46
El gráfico muestra que ef efecto de la acfición de fa sal ~ 0.25 M al
tampón de corrida~ no inhibe la adsorción cromatográfica de las muestras bajo
tales condiciones experimentales. tgua1mente, manifiesta una alta
irreproducibilidad en los resultados obtenidos. Es importante destacar que 1a
utilización de una alta concentración de sales en e1 tampón de corrida, daría lugar
a una alta ronductividad en la ·solución, y por consiguiente seria necesaria la
aplicación de una atta intensidad en et sistema trabajando a un voltaje constante.
Sin embargo, la fuente de poder del sistema tiene un limite en ta intensidad de
corriente que puede generar {400 jJAmp), por eflo fue necesario aplicar voltajes
menores {22 kv) en comparación a tas experiencias anteriores {atrededor de 26
kV) en donde la conductividad de las soluciones era menor.
Ahora bienf tomando en cuenta que la resoJueión del sistema anafitico
utilizado es directamente proporcional a fa fuerza del campo eféctrico. fa aplicación
de bajos voJtajes sería contraproducente. Así. una manera de .poder aplicar
mayores voltajes, trabajando con soluciones de atta conductividad, sería utilizar
capilares con diámetros internos menores, además de utifizar tampones con baja
conductividad como el Ches. Por consig:uiente en esta .experiencia se trabajó con
un capiJar de 76l!m de diámetro interno y el mencionado tampón de corrida. las
consideraciones mencionadas deben ser tomadas en cuenta para tos siguientes
ensayos. En este caso ros tiempos de migración fueron de 30 min. mientras que el
voltaje apticado fue de .22 kV. No Obstante, ta:l y como se óljo anteriormente, el
efecto de adsorción cromatográfica de tos anatitos no fue inhibido bajo tates
condiciones experimentafes.
3.8.2.4- Ensayo #4.
El sigUiente gráfico muestra eJ efecto de Ja utilización de un capilar con un
diámetro interno, de 99 pm, mayor a1 utffizado en fa experíencia anterior, en fa
inhibición de ta adsorción cromatográfica. Las condiciones experimentales fueron
enteramente similares a 1as anteriormente descritas.
3500
3000
5'2500 = .. ¡2000 :; 1500 i 1 1000
500
-T$'ll;brA~
(1 ~itlrófitfill)
0+---~----~----r----T----~--~
o 5 10 15 Ti elq)O {Hift)
47
Grifico #13. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/pl). El tampón utilizado fue el descrito en la experiencia anterior: Ches 50 mM, pH 9,6, K20~s 0,25 M. La inhibición de la adsorción cromatográfica por un efecto de competenCia entre la sal y los analitos por los posibles sitios de interacción en el capilar, intentó llevarse a cabo. Igualmente se evidencia una alta irreproducibilidad de los resultados obtenidos a consecuencia del fenómeno de adsorción. El electroferograma fue obtenido tras la aplicación de una 2da aplicación del campo eléctrico. A diferencia del ensayo anterior el capilar utilizado tenía 99 J.!m de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O nl
Tal figura muestra de nuevo una alta irreproducibilidad en los resultados
obtenidos a consecuencia del fenómeno de adsorción, al utilizar un capilar de 99
t.tm de diámetro interno. La señal de fluorescencia fue observada tras una segunda
aplicación del campo eléctrico. El tiempo de migración fue de 30 min. y el voltaje
aplicado, 20 kV, fue menor en comparación a cualquiera de las experiencias
anteriores.
48
3.8.2.5- Ensavo #5.
Bajo estas condiciones de análisis, se intentó inhibir el fenómeno de
adsorción de los analitos tomando en cuenta el criterio anteriormente descrito
(ensayo #3 y #4) pero utilizando una sal distinta, CuS03, a concentraciones de
O, 1, O, 15, 0,20 y 0,25 M en ef tampón de corrida Ches 50 mM, pH 9,6.
......
3500
3000
~ 2500 -:¡ 2000 'a 1500 e '1 1000 ....
500
- Tt!»tirta·Afexa (1 ng!'ltltét'OWO)
0+---~----~----~--~--~~~--0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (m in)
Grifico #14. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/JII}. Tampón Ches 50 mM. pH 9,6, CuSO" O, 1 M. La inhibición de la adsorción cromatográfica por un efecto de competencia entre la sal y los analitos por los posibles sitios de interacción en el capilar, intentó obtenerse. Igualmente se evidencia una alta irreproducibilidad de los resultados obtenidos a consecuencia del fenómeno de adsorción. El capilar utilizado tenia 99 Jim de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 10 ni.
1000
500 '
4500
4000 ~ 3500 tii!_3000 .S ¡¡2500 "C .• 2000 i 1500 li
- lbi>Cba-Aié:;<.a (1 nglmic r'Oiitro)
0+---~----~----T---~----~--~
o 10 15 20 25 Tiempo (min)
49
Gráfico #15. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/IJI). Tampón Ches 50 mM. pH 9,6, CuS04 0,15 M. El elect.roferograma manifiesta una alta irreproducibilidad de los resultados obtenidos a consecuencia del fenómeno de adsorción. El capilar utilizado tenía 99 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O nt.
3500
3000
~ 2500
i. 2000 1 , ·m 1500
i 1000
500.
- T <»dna.Alex.a (1 ngmer6litro)
0+---~----~----~--~~---p--~
o 5 10 15 20 30 Tierq,o (nin)
Gráfico #16. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/J.JI). Tampón Ches 50 mM. pH 9,6, CuS04 O ,20 M. El elect.roferograma manifiesta igualmente una alta irreproducibilidad de los resultados obtenidos. El capilar utilizado tenfa 99 ¡.Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 10 ni.
4500 4000 3500
13000 ¡2500 1:: 2000.· . .. : 1500 - 1000
500
-· · -· T(!Xb.t-Aitlí'll\:il (1 tlg¡/'n'Jot~ó)
0+----r----r---~--~~--~--~
o 5 10 15 20 Tie~qJo {nln)
50
Gráfico #17. Anáfisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/JJI). Tampón Ches 50 mM. pH 9,6, CuS04 0,25 M. El electroferograma evidencia una alta inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, a diferencia de las experiencias anteriores. Una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, fue obtenida, tras aplicaciones sucesivas del campo eléctnco. El capilar utilizado tenía 99 J.Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
En tales condiciones experimentales, se logró determinar que
concentraciones de O, 1, O, 15 y 0,20 M de la sal CuS04 en el tampón de corrida, a
un pH alcalino, no inhibieron la adsorción cromatográfica de los anaUtos a la
superficie .interna del capilar (Gráficos #14, #15 y #16). La concentración óptima
de la sal, en la inhibición del fenómeno de adsorción, fue de 0,25 M, resultado que
se observa en el gráfico #17. El tiempo de la aplicación del campo eléctrico fue de
30 min. y el voltaje aplicado de 20 kV.
Este resultado establecía las condiciones experimentales óptimas para el
análisis de analitos proteicos con el sistema de EC-DFLI, inhibiendo la adsorción
cromatográfica aparentemente a través de un mecanismo de competencia entre la
sal (CuS04 ) añadida al tampón de corrida y la muestra. Sin embargo, cierta
inestabilidad en la conductividad del tampón de corrida utilizado Ches 50 mM, pH
9,6, CuS04 era apreciable tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico.
51
3.8.2.6- Ensayo #6.
En esta experiencia se evidenció el efecto inhibitorio del fenómeno de
adsorción cromatográfica, causado por la sal CuS03 a concentración 0,20 M, en
el tampón de corrida Ches 100 mM a pH 9,6 en presencia de acetonitrilo al 1 ~h
p/v.
o 5
-1 n9'mc,ott,o Toxna.At!xa
10 15
Tiempo (min)
21:3 25
Gráfico #18. Análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/lJI). Tampón Ches 100 mM. pH 9,6, CuS04 0,20 M, Acetonitrifo 10% plv. El electroferograma evidencia una alta inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, y a diferencia de fa experiencia anterior (gráfico #17), la adición de tal solvente orgánico confirió una conductividad estable al tampón de corrida. Esto se evidencia con una disminución de la señal de fluorescencia basal y con una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, obtenido, tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El capilar utilizado tenía 99 IJfTI de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 10 ni.
Tal concentración 0,20 M de la sal CuS03, presente en el tampón de
corrida, manifiesta una clara inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica
def péptido FascicuJina-Aiexa 488. Debe resaJtarse que la concentración óptima de
fa sal en la inhibición de fa adsorción cromatográfica reportada en el gráfico #14
(0,25 M) difiere de la utilizada en esta experiencia (0,20 M). Ello se logró
adicionando al tampón de corrida el solvente orgánico Acetonitrilo al 10% v/v, el
cual además de estabilizar la conductividad en la solución por su naturaleza
orgánica, permitió inesperadamente inhibir eJ fenómeno de adsorción
cromatográfica a una concentración menor de saL
52
La adición de Acetonitrito al tampón de corrida fue considerada tomando en
cuenta los reportes de un incremento en la señal de fluorescencia obtenida a
través del fenómeno de concentración de la muestra en el volumen de inyección
del anaHto, durante la aplicación de altos campos eléctricos; efecto conocido como
"stacking" (Shihabi Z, 1996). Este resultado mostró una alta reproducibilidad tras
aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El tiempo de la aplicación del campo
eléctrico fue de 30 min. y el voltaje aplicado de 20 kV.
3.9- Análisis de las isoformas de la AChE con el sistema EC-DFLI.
Una vez estandarizadas las condiciones de análisis de proteínas con el
sistema EC-DFU, se procedió a realizar pruebas con una de las isoformas
purificadas de la enzima AChE.
4500] 4000 !
> 3500 .S 3000 "8 2500 ·~ 2000 i 1500 "= .::: 1000
Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/microlitro)
500 jl ...... .;J ' .
0+-. ------~~----T~~~~~~~~-=--~----~
5 15 20 25 30
Tiempo (min)'
Gráfico #19. Análisis de AChE-PRAD marcado con Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/1 .. 11). El gráfico muestra el electroferograma obtenido en esta experincia (azul) y el obtenido en el análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (fucsia). Tampón Ches 100 mM. pH 9,6, CuS04 0,20 M, Acetonitrilo 10% plv. Ninguna señal adicional que pudiese corresponder a AChE-PRAD, fue detectada. Una señal de fluorescencia (azul) que aparentemente corresponde al tiempo de migración de la toxina-Aiexa 488 (fucsia), resultado similar al obtenido con el control, fue obtenida. Se muestra una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, obtenida tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El capilar utilizado tenía 99 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni. ·
53
El resuUado evidencia que no nubo detección de una señal que pudiese
corresponder a fa isoforma en anátisis .(AChE-PRAD). No obstante~ se evidenció et
efecto inhibitorio del fenómeno de adsorción cromatográfica .para et estudio de
Fascieuüna-Atexa 488; análisis que se infiere at comparar los tiempos de
migración obtenidos para la toxina marcada (fucsra) y el tiempo de migración de la
única señal de fluorescencia observada para el análisis del tetrámero ACñE-PRAD
unido a Fascicutina-Atexa 488 (azul). Las condiciones experimentales utilizadas
fueron exactamente jguales a las anteriormente descritas con en el tampón de
corrida Ches 100 mM, pH 9.6$ CuSOa 0,20 M, 100k de acetonitrilo. Et tiempo de la
aplicación del campo e:léctrim fue de 30 min. y el vo:Jtaje .aplicado de 20 kV.
Este resultado sugeria diversos escenarios. Uno sería que probablemente
los mecanismos de adsorción cromatográfica de una molécula con una masa
molecular importante, como en el caso de 4a AChE (aprox. 70 Kda), serian muoho
más complejos en comparación at caso de anatitos con masas moleculares
significativamente menores. fascicutina (aprox. 6.7 Kda). razón .por la que ta
detección de ta ;Fasciclifma era posible y la del comp:lejo AChE-F asciculina-Alexa
488 (aprax. 76.7 Kda) no lo era. Otro escenario e.ra que los tiempos de migración
correspondientes a taJ horno-tetrámero (G4) estuviesen fuera deJ trempo de
a.pücación del campo ·eléctrico (30 min), ó que tal .jsofo.rma .fuese inestable y por
consiguiente más sensible a una degradación en comparación al resto de las
isoformas AChE.
Por tates razones. anáisis posteriores del tetrámero (G4) con ,aplicaciones
del campo eléctrico en su Jimite máximo de tiempo {40 min.) fueron realizadas.
Similarmente al resultado -obtenido en el gráfico #19, et análisis del tetrámero (G4)
con apl.icaciones det campo eléctrico de 40 min., no mostraron detección alguna
de ta isoforma. De esta forma. tos escenarios que pudiesen explicar el resultado
obtenido. pareciesen estar representados por interaCCiones entre la isoforma (G4)
y fa superficie interna det capifar mucho más complejas que tas teóricamente
esperadas 6 una degradación de fa enzima. Futuros estudios que intenten resolver
las interrogantes planteadas en el caso del tetrámero {G4), utilizando tal
metodología EC-OFU, deben ser tleva.dos a cabo.
54
Subsecuentes análisis de las .isoformas AChE-PRlMA y AChE ColO y AChE
(G1) fueron también realizadas con aplicaciones del campo eléctrico de 40 min.;
resultados que pueden observarse en los siguíentes gráficos.
Fasciculina-Aiexa 488
AChE-PRIMA
i o .,.... -......,..._,.._f"'_-r""_~~-r--..,...,..--r-~
o 5 15 20 25 3[l
Hetll)O Onhl)
Gráfico #20. Análisis de AChE-PRIMA Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/1.11). Tampón Ches 100 mM. pH 9,6, CuS04 0,20 M, Acetonitrilo 10% p/v. El electroferograma evidencia la inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, mostrando señales de fluorescencia para la Fasciculina-Aiexa 488 y una señal adicional alrededor de los 35 min. correspondiente a la isoforrna en análisis. Una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, fue obtenida tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El capilar utilizado tenía 99 ¡.~m de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
El análisis comparativo de los electroferogramas correspondientes al
péptido Fasciculina-Aiexa 488 (amarillo) y la isoforma AChE-PRIMA purificada y
unida a Fasciculina-Aiexa 488 (azul), muestra la aparición de una señal que
corresponde a tal isoforma de la enzima alrededor de los 35 min. Las señales
correspondientes al péptido Fasciculina-Aiexa 488 en el caso control y
experimental tuvieron tiempos de migracton de 19,02 y 20,38 min.
respectivamente. En el caso de la isoforma AChE-PRIMA, un análisis detallado de
tal señal (Gráfico #21) mostró la co-migración de distintas moléculas.
500
S 400 e -300 1 11 200 i !100
Banda#2
Banda#1
0~==~~--------------------~ 34 36
Tiempo(mn)
-·-· ACbS f'RINSfl\
55
Gráfico #21. Detalle del análisis de AChE-PRIMA-Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/IJI). El electroferograma evidencia la comigración de distintas moléculas en un patrón de bandas que no fueron resueltas bajo ta1es condiciones experimentales. Posiblemente, las bandas correspondan a distintas variantes de la isoforma con diferentes grados de glicosidación, que presentan tiempos de migración distintos. Una a1ta reproducibilidad del electroferograma mostrado, fue obtenida tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. E1 capilar utilizado tenJa 99 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
El análisis detallado de la sefial AChE-PRIMA manifestó un resultado
esperado, acorde con la purificación de la isoforma en cuestión por cromatografía
de afinidad con procainamida. En efecto, el gráfico evidencia que distintas
moléculas ca-migraron juntas durante la aplicación del campo eléctrico, lo cual
está representado con la aparición de 4 bandas identificadas en el
electroferograma con tiempos de migración de 34,56, 35,17, 35,33, y 35,44 min.,
respectivamente. Tales bandas posiblemente correspondan a distintas variantes
de la isoforma con diferentes grados de glicosidación (Nalivaeva & Turnar, 2001).
La purificación de tal isoforma fue realizada a partir de macerados de cerebros de
raton solubilizados, por cromatografía de afinidad, razón por la que distintas
variantes activas de la enzima pudieron haber sido obtenidas. Tal es el resultado
observado en el análisis con el sistema EC-DFLI.
56
Igualmente, una baja resolución de tales isoformas es claramente ilustrada
en el resultado obtenido. Ello pudiese estar relacionado a distintas razones.
Primero, al hecho de que la longitud efectiva del capilar, 34 cm, es probablemente
más corta que la necesaria para una resolución óptima de ls variantes AChE
observadas, razón por la que posteriores experiencias utmzando una longitud
efectiva mayor deben ser reaHzadas. También, al hecho de que el campo eléctrico
aplicado (20 kv) fue relativamente bajo a consecuencia de la alta concentración de
sal CuS04 0,2M utifizada en el tampón de corrida, lo cual disminuye el poder
resolutivo de la técnica. Pudiese también estar relacionado a que la alta intensidad
en la que se trabajó (400 ~Amp) en tales condiciones experimentales generó una
cantidad de calor importante que disminuye la resolución debido a un
ensanchamiento de las señales obtenidas a consecuencia del calor producido tras
la aplicación del campo eléctrico, fenómeno conocido como: "efecto Joule ... Y
finalmente, la baja resolución y la baja señal de fluorescencia detectada, podrían
también ser relacionadas at hecho de que bajo tales condiciones experimentales,
la AChE unida a un dominio de anclaje intramembranal (PRIMA), pudo agregarse
por interacciones hidrofóbicas entre tales dominios, en análisis con EC-DFLI en
donde el tampón de corrida utilizado: Ches 100 mM. pH 9,6, CuS04 0,20 M,
Acetonitrilo 10% p/v., carecía de un agente surfactante que permitiera solubilizar y
resolver tales isoformas tomando en cuenta el coeficiente de partición de cada
analjto con distintos grados de gUcosidación, tal y como ocurre en el caso de los
análisis de sedimentación en gradientes de sacarosa que incluyen la adición de el
surfactante Brij 96/97.
El siguiente gráfico muestra el análisis de la ísoforma AChE-ColQ, con la
aplicación de un campo eléctrico durante 40 min. Una resolución óptima de la
isoforma en análisis es claramente evidenciada.
51
--+ Fasciculina Alexa 488
AChE-CoiQ +--
5 10 15 20 25 30 40
Tienl)o (min)
Gráfico #22. Análisis de AChE-CoiQ Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡.JI). Tampón Ches 100 mM. pH 9,6, CuS04 0,20 M, Acetonitrilo 10% p/v. El electroferograma evidencia la inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, mostrando señales de fluorescencia para la Fasciculina-Aiexa 488 y una señal adicional alrededor de los 30 min. correspondiente a la isoforma AChE-CoiQ. Una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, fue obtenida tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El capilar utilizado tenía 99 ¡.Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
Al igual que en el caso anterior, el análisis comparativo de los
electroferogramas correspondientes a la proteína Fasciculina-Aiexa 488 (amarillo)
y la isoforma AChE-CoiQ purificada y marcada con Fasciculina-Aiexa 488 (azul),
evidencia la aparición de una señal que corresponde a la isoforma en análisis. Los
tiempos de migración del péptido Fasciculina-Aiexa 488 en la experiencia control y
experimental fueron de 19,02 y 19,20 min., respectivamente. Por su parte, la
isoforma AChE-CoiQ tuvo un tiempo de migración promedio de 30,38 min.
Un anáffsis detaltado de la señal de la enzima, gráfico #23, muestra la
migración de dos bandas daramente distinguib1es que probablemente
corresponden a distintas asociaciones de subunidades catalíticas a la protefna
colagenosa CoiQ, hetero-oligómeros (As, A12) de la AChE, asf como a monómeros
(G1); resultado que estaria de acuerdo con tas especies AChE detectadas en los
análisis de sedimentación para esta isoforma.
4500 4000
S' 3600 ,¡ 3000 '12500 :: :2000 1 1500 'E '1000 . - 500
·-+ Banda2
Banda 1 ...-
0+-------------_.--~--------~------~ 29 30 31 32
Tiel't1K' (rnn)
-AChS.I'AD
Gráfico #23. Detalle del análisis de AChE-CoiQ Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/J,JI). El etectroferograma evidencia la migraCión de 2 bandas claramente resueltas en tales condiciones experimentales, las cuales posiblemente correspondan a monómeros (G1) (Banda 1) y al heterooligómero (Aa) de la AChE. Un aumento significativo en la senat de fluorescencia de la banda 2 puede observarse. Una dara inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, fue obtenida bajo tates condiciones experimentales y una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado, fue obtenida tras aplicaciones sucesivas del campo eléctrico. El capilar utilizado tenía 99 ¡Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O nt
Tal resultado muestra una buena resolución de las 2 bandas obtenidas en
el análisis de las isoformas AChE-CoiQ, con tiempos de migración de 30,23 y
30,53 min., respectivamente. Probablemente la primera banda en el
electroferograma corresponde al monómero (G1) de la enzima, mientras que la
segunda señal podría corresponder a los hetero-oligómeros As y A12 de la AChE.
59
Es importante destacar que esta última banda mostró una señal saturada, lo
cual pudo haber sido una consecuencia de un efecto de concentración de muestra
inducido por la presencia de acetonitrilo al10% p/v en el tampón de corrida ó por
un efecto aditivo de la señal proveniente de la ca-migración de distintas variantes
de la isoforma (As, A12) a una alta concentración. Posteriores análisis con un
incremento en la longitud efectiva del capilar y una mayor difusión de las muestras,
probablemente permitan resolver la señal saturada.
Es importante señalar que en el caso de la isoforma AChE-CoiQ, luego de
su extracción por lisis celular, la enzima estaría disuelta en un medio con una muy
alta concentración de sal debido a la composición del tampón de lisis utilizado: Tris
50 mM, pH 7,0, MgCb 10 mM, Triton X-100 (1%), NaCI 0,8 M. Por tal razón, una
posterior purificación por afinidad con procainamida permitía remover tan alta
concentración de sal presente en el medio donde se encontraba la enzima, hecho
que pudo interferido con la aplicación del campo eléctrico en el sistema de EC
DFLI, por una muy alta conductividad en el tampón de muestra. La isoforma en
análisis, fue finalmente obtenida en el tampón HEPES 25 mM; pH 7 ,4, al igual que
la isoforma AChE-CoiQ también purificada por afinidad con procainamida.
Posteriores análisis del monómero AChE (G1), fueron realizados. Sin
embargo, antes de llevarse a cabo, mediciones de actividad enzimática de la
isoforma (datos no reportados) revelaron un resultado inesperado: una
disminución en la actividad enzimática de la isoforma. Ello indicaba 2 posibles
escenarios: una perdida de fa enzima presente en el "stock" de fa proteína
purificada por degradación de la isoforma en el tiempo ó a fa pérdida de actividad
enzimática del monómero (G1) sin necesidad de haber sido degradado.
El siguiente gráfico corresponde al análisis de la isoforma AChE-(G1) con la
aplicación de un campo eléctrico durante 40 min. La figura evidencia que no hubo
detección alguna de fa isoforma en análisis, simHarmente al caso de fa isoforma
AChE-PRAD.
4500 4000 "'~00
i jó,;; .;
- 301)0 --iíiiliij 2500 .... {C "C 201]0 ·m .... ....
1500 a.> 1:::: - 1000
500 u
o 5
: --Jt Fasciculina-Aiexa 488
16 20 25 ~ .:>U 35
60
40
Gráfico #24. Análisis del monómero AChE (G1)-Fasciculina-Aiexa 488 (1ng/j.JI). El electroferograma evidencia que no hubo detección alguna de la isoforma en análisis. Solo señales de fluorescencia correspondientes a la proteína Fasciculina-Aiexa 488, en el caso control (amarillo) y en el análisis de Fasciculina-Aiexa 488 (azul), fueron obtenidas. Una clara inhibición del fenómeno de adsorción cromatográfica, se obtuvo bajo tales condiciones experimentales así como una alta reproducibilidad del electroferograma mostrado. El capilar utilizado tenía 99 ¡.Jm de diámetro interno y el volumen de muestra inyectado fue de aprox. 1 O ni.
Así, la observación experimental (datos no reportados), de que tras cierto
período de tiempo luego de la expresión y purificación de las isoenzimas de la
AChE, y después de ser guardadas a -20 °C en condiciones óptimas para evitar su
degradación, la actividad enzimática de esta isoforma se había perdido, fue
interpretada tomando en cuenta ciertas consideraciones teóricas. Este oligómero,
abundante en tejidos nerviosos y musculares con una ubicación principal en
compartimientos intracelulares, estaría relacionado a la síntesis de distintas
formas de la AChE, organizadas por interacciones con distintas proteínas no
catalíticas, actuando así como un precursor de formas complejas de la enzima.
61
Esta isoforma no requeriria de funcionalidad ó actividad enzimática en el
tiempo ya que su síntesis ocurr-e continuamente en et soma celular a partir de
donde es "transportado at terminal nervioso para fungir como precursor de
jsoformas complejas de ta AChE.
Por tates razones. es tentador suponer que et tiempo de vida media de fa
mencionada isoforma fuese mas corto en comparación al del resto de las
isoformas de ta AChE~ las cuales se -encontrarjan andadas a fa matriz extracetular
{AChE-GotQ) ó a membranas celulares {AChE-PRIMA) ejerciendo su efecto. en la
modulación de la duración de fa sefiaf colinérgica, permanentemente. Tales
consideraciones, se inclinan hacia et escenario de que :fa pérdida de actividad
enzimáfica pudo haber ocurrido a consecuencia de una degradación de fa
isoforma~ ello tomando en cuenta que la presencia det monómero (G1) aún en
estado inactivo, pudo haber sido reconocido por la toxina marcada dando fugar a
una sefiat de fluorescencia correspondiente a la isoforma en análisis. Posteriores
experimentos que intenten dilucidar tales especulaciones son necesarios.
En resumen de Jos resultados obtenidos, es importante destacar que las
dos isoformas~ AChE~P:Rf.MA y AChE-CotQ, que representan fas especies más
importantes. presentes en fa unión neuromuscular y en membranas refutares a
nivel del sistema nervioso oentrat, pudiero.n ser analizadas con -e1 sistema EC-OFU
bajo tas condiciones experimentales descritas en esta investigación. Análisis
posteriores de las isoformas ACflE-PRAD y del flomo-oligómero {Gt}, deben ser
realizados tomando en cuenta las consideraciones anteriormente descritas en
cada experiencia. los tiempos de migración observados experimentalmente para
las isoformas anaUzadas, AChE- PRIMA y AChE-CoJQ, son esquematizados en ta
siguiente figura.
4500 4.l)ij{J
! ;;~~ ~ 250:0 r= -·m 2ooo ""' i 15ú0 e ·1000
500 0+---~--~~--~~~----~--~--~~~
ü 5 10 15 20 25 30 40
--ACh5 CotQ-1'C.Xna.A~x<J(1n~rri~r <:l!liit.;¡)
- · AC'hS ~íM?;,, TcxhacAt<!:X:.a 41S~ (1iit\.'mé.rollro)
62
Gráfico #25. Análisis de las isoformas AChE CoiQ (azul) y AChE-PRIMA (verde) acopladas a Fasciculina-Aiexa 488 (1 ng/¡.JI). El electroferograma evidencia diferentes tiempos de migración correspondientes a cada isoforrna. Diferencias en las señales de intensidad obtenidas son claramente apreciables. El gráfico corresponde a una esquematización de resultados obtenidos en experiencias individuales realizadas con cada isoforrna.
Tal y como fue anteriormente descrito, las diferencias entre las señales de
intensidad obtenidas para cada isoforma, pudieron ocurrir por distintas razones.
En el caso de AChE-CoiQ, la obtención de una señal saturada pudo haber sido
una consecuencia de un efecto de concentración de muestra inducido por la
presencia de acetonitrilo al 10% p/v en el tampón de corrida ó por la co-migración
de distintas variantes de la isoforma a una alta concentración; caso contrario a lo
observado con la AChE-PRIMA, en donde la disminución de la señal observada
así como la baja resolución de las bandas obtenidas, pudieron haber ocurrido a
consecuencia de la agregación de la isoforma en el tampón de corrida, por
interacciones hidrofóbicas entre los dominios de anclaje intramembranal (PRIMA)
en cada una, minimizando así la resolución y detección de la isoforma. Los
tiempos de migración de cada isoforma son reportados en la siguiente tabla.
63
Tabla #2. Tiempos de migración de las isofonnas AChE purificadas, en Jos análisis EC-DFLI.
lsofonna # Bandas Observadas Tiempo de Migración
(min)
1 34,56
2 35,17 AChE-PRIMA
3 35,33
4 35,44
1 30,23 AChE-CoiQ
2 30,53
La variación en los tiempos de migración de los analitos, como la diferencia
observada para Fasciculina-Aiexa 488 en ambas experiencias, está relacionada al
hecho de que bajo tates condiciones experimentales, a tan atta concentración
(0,20 M) de la sal CuS04, la conductividad en el tampón de corrida es
extremadamente alta, y por consiguiente la resistencia disminuye en igual
magnitud a la que aumenta la intensidad de corriente, bajo la aplicación del campo
eléctrico en el sistema operando a un voltaje constante. Por tal razón, las corridas
electroforéticas fueron llevadas a cabo en el límite de la intensidad de corriente
que puede generar la fuente de poder (400 tJAmp), lo que originó un cambio
operacional en el sistema que ahora estaba trabajando no a voltaje sino a
intensidad constante.
El sistema operando en tal modo mantiene constante la intensidad a través
de la modulación del voltaje aplicado. Por tales razones, y considerando el hecho
de que Ja velocidad de migración de los analitos es directamente proporcional a la
fuerza del campo eléctrico aplicado, puede entenderse que la ocurrencia de
migraciones, de un mismo analito en distintos tiempos, este relacionada a
variaciones en el campo eléctrico aplicado necesarias para mantener la intensidad
de corriente constante, en cada experiencia.
64
No obstante, el patrón :de bandas obtenidas es s-mitar en todos los ensay.os
realizados -con una mima muestra. Tales consideraciones son apticab1es a todos
tos resultados aqui reportados.
Este análisis es romptetamente válido al considerar que el efecto inhibitorio
def fenómeno de adsorción de Jos analitos. tlevado a cabo en este trabajo,
depende de un efecto de competencia entre las proteinas y la sal por tos posibles
sitios de interacción en la superficie interna del capi1ar. mecanismo que es
dinámico en su naturaleza; además de una repulsión electrostática originada por
cargas negativas presentes en tos anatitos y en tos grupos ·silanoJ en la superficie
interna del capilar.
En resumen, los resultados de los análisis de AChE-ColQ y AChE-PRf.MA
reportados en este proyecto~ muestran que es posible resolver las distintas
ísofonnas de fa AChE utilizando el sistema de EC-OFLI. Análisis clásicos de
sedimentación han sido siempr-e llevados a ~bo para tales propósitos y
actuatmente ·prevateeen como ta principal forma de resolución y anátisis de fas
isoenzimas mencionadas. No obstante, tal ,metodologia requiere de largos tiempos
de análisis* alrededor de 17-18 h. e igualmente de una gran cantidad de muestra
(alrededor de 200 pJ) ; en otras palabras, la técnica requiere de una aJta
concentración de la AChE. Contrario a etJo, la introducción del sistema EC-OFU
para ta resolución y aná1isis de fas distintas isofofmas de ta ACbE. representaria
una técnica que permite el anár.sis de muy pequeñas cantidades de muestra, en el
orden de los nanotitros (10-9L). y a su vez conttevaria al estudio de muy pequeñas
variaciones de la AChE a nivel de la sinapsis neuromuscular. Jguafmente, se
contarla con una técnica que posee la resolución necesaria para estudiar sutiles
variaciones en los niveles de ta enzima ACnE. la importancia de este alcance se
ve reflejada en los análisis que podrían reatizarse, tomando en ceuenta tal
sensibilidad del sistema, at estudiar variaciones en los niveles de las distintas
isoformas AChE en diferentes múscutos en un mismo organismo. Elfo
propordonarta una herramienta clave en el estudio de desórdenes neuro16gicos
heterogéneos como tos sindromes de miastenia congenitos.
65
Es importante señalar que parte de los objetivos iniciales del proyecto,
además de resolver las isoformas de la AChE, era el desarrollo de un análisis
cuantitativo de la enzima mediante el sistema EC-DFLI. Sin embargo, estudios en
actual desarrollo acerca del marcaje de la AChE con la Fasciculina unida al
fluoróforo Alexa 488 (resultados no publicados), han mostrado una competencia
entre moléculas de Fas.ciculina-Aiexa 488 y moléculas de Fasciculina-no. marcada,
por los sitios de reconocimiento en la proteína, resultado que se manifiesta en
análisis in situ de la AChE a nivel de la sinopsis neuromuscular, utilizando
Microscopía Confocal.
Figura #5. Marcaje in situ de la AChE presente en la unión neuromuscular del músculo tíbíalís anterior de raton. (1) Micrografías confocal de barrido láser de secciones de 1 O ¡.~m de espesor. (A) muestra el contorno de cada miocélula en un área desprovista de sinapsis neuromusculares. (8), (C) y (D) muestran el marcaje diferencial de AChE dependiendo de la relación Fasciculina/Aiexa bajo la misma condición de adquisición.
66
Tal figura evidencia, un desplazamiento del marcaje inicial con la toxina
Aiexa 488, induCido por moléculas de toxina-no marcada, así como un marcaje
diferencial de la AChE dependiendo de la relación Fasciculina/Aiexa 488 utilizada.
Los páneles B, C y D (micrografías obtenidas utilizando similares condiciones de
adquisición del fotomultiplicador) muestran una relación no-lineal de la AChE
utilizando relaciones Fasciculina/Aiexa 488, 1:1 (B), 1:2 (C) y 1:4 (D). Esto es, la
mayor emisión de fotones dada por el fluoróforo Alexa 488 acoplado a Fasciculina,
ocurre en la proporción 1 :2 (C) y no en la relación 1 :4 (D) como era teóricamente
esperado, resultado que se manifiesta en el siguiente gráfico.
IG :e: o -o u. CD 'O o .... CD E ::::J :z
FO F1 F2 F4
Numero de Al ex a 1 F asclcullna
Gráfico #26. Marcaje in situ de la AChE presente en la unión neuromuscular del músculo tibialis anterior de raton. Número de fotones emitidos por Alexa 488 acoplada a FasciculinaAChE en uniones neuromusculares (área analizada: rectángulo) en diferentes proporciones Fasciculina/Aiexa. Nótese el mayor número de fotones emitidos con la relación F2.
67
Por consiguiente, al tomar en cuenta que el "stock'' Fasciculina-Aiexa 488
utilizado en este proyecto para marcar la AChE, probablemente incluía moléculas
de toxina-no marcada que pudiesen desplazar señales de fluorescencia obtenidas
inicialmente con la toxina marcada, en los actuales momentos no es posible
realizar una cuantificación absoluta de la AChE, sino reportar variaciones relativas
de la enzima.
5.- Conclusión
• Las condiciones experimentales óptimas en la inhibición del fenómeno de
adsorción cromatográfica, utilizando el sistema EC-DFLI, fueron establecidas
favoreciendo un fenómeno de repulsión electrostática entre los analitos y la
superficie interna del capilar, y la competencia por sitios .de interacción en el
capilar, entre la sal "CuS04" y los analitos proteicos.
• Las condiciones de análisis de proteínas establecidas, permitieron la
resolución de las isoformas AChE-CoiQ y AChE-PRIMA de la enzima
acetilcolinesterasa. Ello representa el desarrollo de una técnica con la resolución
necesaria para llevar a cabo análisis cualitativos de pequeñas cantidades de la
A ChE.
• La cuantificación de las isoformas AChE aquí analizadas no es posible
utilizando el sistema de marcaje empleado. Sin embargo, la toxina fasciculina
unida al fluoróforo alexa 488, es eficiente en la detección de la enzima AChE.
68
6.- Referencias
- Bon S., Coussen F., and Massoulié J. Quaternary associations of
acetylcholinesterase. 11. The polyproline attachment domain of the collagen tail.
J. Biol. Chem. 1997, 272 (5): 3016-21
- Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by
fasciculin: crystal of the complex. Ce/l. 1995, 83(3): 503-512.
- Castelleti L, Verzola E, Gelfi C, Stoyanov A, Righetti P.G. Quantitative
studies on the adsorption of proteins to the bare silica wall in Capillary
Electrophoresis. 111 Efects of adsorbant surfactants on quenching the interaction.
J. Chromatogr. A. 2000, 894: 281-289.
- Dalhoeven G., Narahari J., Rodriguez N., Hernández L. Simultaneus
measurements of capillary electrophoresis fluorescence peaks and their
corresponding spectra. J. Liq. Chromatogr. 1995; (18): 3729-49.
- Dhasakumar N., Shama F., Priddle J., Giles K., Clegg S., Pappin D.,
Craig 1., & Smith D. Hydrophobic Protein that Copurifies with Human Brain
Acetylcholinesterase: Aminoacid Sequence, Genomic Organization, and
Chromosomal Localization. J. Neurochem. 2000, 74 (5): 2146-2153.
- Deprez Paola Nicole. Caracterización del tallo colagenoso de la AChE
asimétrica y su interacción con la lámina basaL Tesis para optar al grado de
doctor en Ciencias Biológicas. Pontificia Universidad de Chile. 2000.
69
- Ellman G.L., Courtney K.O., Andres V.J. & Featherstones R.M. A new
and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem.
Pharmaco/1961, 7:88-95.
- Engel A.E., Ohno K., Sine S.M. Sleuthing molecular targets for
neurological diseases at the neuromuscular junction.
Neuroscience. 2003, 4: 339-352.
Nature Reviews.
- Gilges M., Kleemiss M.H. and Shomburg G. Separation of Enantiomers
on a Chiral Stationary Phase Based on Ovoglycoprotein. Anal. Chem. 1997, 66:
2038.
- Harel M., Kleywegt G., Ravelli R., Silman 1., Sussman J.L. Crystal
structure of an acetylcholinesterase-fasciculine comptex: interaction of the three
toxin from snake venom with its target. Structure. 1995, 3(12): 1355-1366.
- Hernández L., Narahari J.;Verdeguer P., Mifsud C. and Guzman N.
Collinear laser induced fluorescence detector for capilary electrophoresis.Analisys
of Glutamic acid in brain dialisates. J. Chromatogr. A. 1993; (652): 399-405.
- Hemández L., Marquina R., Escalona J., Guzman N. Detection and
quantification of capillary electrophoresis zone by fluorescence mycroscopy.
J. Cromatogr. 1990; (502): 247-255.
- Hjerten S. Free Zone Electrophoresis. Chromatography Review. 1967,
9:122.
70
- Jorgenson JW. & Luckaes KD. Zone electrophoresis in open tubular
glass capillaries. Anal. Chem. 1981, 53: 1298.
- Jorgenson JW. & Luckaes KD. High resolution separations based on
electrophoresis and electro-osmosis. J. Chromatogr. 1981, 218: 209.
- Kaufer D., Friedman A., Seidman S., Soreq H. Acute stress facilitates
long-lasting changes in cholinergic gene expression. Nature. 1998, 393: 373-377.
- Krejci E., Thomine S., Boschetti N., Legay C., Sketelj J., Massoulie J.
The mammalian gene of acetylcholinesterase-associated collagen. J. Biol.
Chem. 1997, 272(36): 22840-22847.
- Legay C., Huchet M., Massoulie J., Changeux J.P. Developmental
regulation of acetylcholinesterase transcripts in the mouse diaphragm:
alteARNtive splicing and focaliz:ation. Eur. J.Neuroscí. 1995, 7: 1803-1809.
- Li Y., Camp S., Rachinsky T.L., Getman O., Taylor P. Gene structure of
mammalian acetylcholinesterase. AlteARNtive exons dictate tissue-specific
expression. J. Bíol. Chem. 1991, 266; 23083-23090.
- Lindner H., Helliger W., Sarg B., Meraner C. Effect of buffer
composítion on the migration arder and separation of histone H1 subtypes.
Electrophoresis. 1995, 16: 604.
- Marchot P., Khelif A., Ji Y., Mansuelle P., Bougis P. Binding of 1251-
fasciculin to rat brain acetylcholínesterase. The complex stíll binds di-isopropyl
fluorophosphates. J. Biol. Chem. 1993, 268(17): 12458-12467.
71
- Massoulié J., Anselmet A., Bon S., Krejci E., Legay C., Morel N.,
Simon S. 1998. Acetylcholinesterase: C-terminal domains, molecular forms and
functionallocalization. J. Physiol. 1998, 92: 183-190.
- Massoulié J., Pezzementi L., Bon S., Krejci E. & Vallette F.M.
Molecular and cellular biology of cholinesterases. Prog. Neurobiol. 1993, 41: 31-
91.
- Matsumuto B. 1993. Methods in Cell Biology. Cell Biological Applications
of Confocal Microscopy. Volumen 38. In (ed.): Matsumuto Brian. Academic
Press, INC. USA.
- Nalivaeva N. & Tumer A. Post-translational modifications of proteins:
acetylcholinesterase as a model system. Proteomics. 2001, 1: 735-747.
- Ohno K., Brengman J., Tsujino A., Engel A. Human end-plate
acetylcholinesterase deficiency causad by mutations in the collagen like-tail
subunit (ColO) of the assymetric enzyme. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1998, 95:
9654~9659.
- Ohno K., Milone W., Wang H., Nakano s~, Hutchinson D., Pruitt J.,
Brengman J., Bren N., Sieb J., Sine S., Engel A. ldentification of neuromuscular
junction acetylcholine receptor mutations in the slow 8 channel congenital
myasthenic syndrome. Neuro/ogy. 1996, 46: A214.
- Ohno K., Wang H., Milone M., Milone W., Bren N., Brengman J.,
Nakano S., Quiram P., Pruitt J., Sine S., Engel A. Congenital myasthenic
syndrome caused by decreased agonist binding affinity due to a mutation in the
acetylcholine receptor 8 subunit. Neuron. 1996, 17: 157-170.
72
- Peng B., Hongbo Xie H., Rossi S., Rotundo R. Acetylcholinesterase
clustering at the Neuromuscular Junction lnvolves Perlecan and Dystroglycan. J.
Ce// Biol. 1999, 145(4): 911-921.
- Perrier A., Massoulié J., Krejci E. PRIMA: The Membrana Anchor of
Acetylcholinesterase in the Brain. Neuron 2002, 33: 275-285.
- Perrier A., Cousin X., Boschetti N., Haas R., Chatel J., Bon S., Roberts
W., Pickett S., Massoulie J., Rosenberry T., Krejci E. Two distinct proteins are
associated with tetrameric acetylcholinesterase on the cell surface. J. Biol.
Chem. 2000, 275(44): 34260-34265.
- Radie Z., Duran R., Vellom D., Li Y., Cervenansky C., Taylor P. Site of
Fasciculin interaction with Acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. 1994, 269(15):
11233-11239.
- Righetti P.G., Gelfi C., Verzola B. & Castelleti L. Protein analysis by
Capillary electrophoresis. Electrophoresis 2001, 22: 603-611.
- Rodriguez l. & Li S.F.Y. Capillary Surfaée Deactivation. Anal. Chím. Act.
1999, 383: 1-26.
- Shihabi Z. Peptide stacking by acetonitrile-salt mixtures for capillary zone
electrophoresis. J. Chromatogr. A. 1996, 744: 231-240.
- Simon S., Krejci E., Massoulie J. A four-to-one association between
peptide motifs: tour e-terminal domains from cholinesterase assemble with one
proline-rich attachment domain (PRAD) in the secretory pathway. The EMBO
Journal. 1998, 17(21): 6178-6187.
73
- Stoyanov A, Righetti P.G. Fundamental properties of isoelectric buffers
for capillary zone electrophoresis. J. Chromatogr. A. 1997, 790: 169-176.
- Tucci S., Rada P., Sepúlveda J. y Hemández L. Glutamate measured
by 6-s resolution brain microdialysis: capillary electrophoresis and laser induced
fluorescence detection application. J. Chromatogr. B. 1997, 694: 343-349.
- Voet D. & Voet J. 1996. Biochemistry. 2da Edición. Jhon Wiley &
Sons INC. New York, USA
- Wilson T, & Sheppard C. 1984. Theory and Practica of Scanning Optical
Microscopy. Academic press. New York, USA