resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética resistencia a... · resistencia a...

-

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología

Curso 2018

Resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética

Esteban Hopp

Impacto económico de las infecciones virales

Pérdidas anuales por infecciones virales en el mundo USD 60 billones Primera causa de pérdidas son las infecciones fúngicas seguido por las virales Perdidas indirectas en las plantas infectadas por aumento de la susceptibilidad a otros estreses no cuantificables

Las pérdidas ocasionadas por fitovirus pueden deberse a la destrucción del cultivo, alteración del producto (su sabor, textura, aroma), defectos estéticos y los altos costos de manejo (pesticidas, certificación, manejo, etc.).

Impacto económico de las infecciones virales

Algunos síntomas característicos producidos por virus en plantas. (Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)

http://www.apsnet.org/







Qué son los virus vegetales?

PARÁSITO INTRACELULAR OBLIGATORIO

Un virus vegetal es un conjunto de una o mas moléculas de ácido

nucleico, contenido en una cubierta protectora de proteínas capaz

de autoreplicarse dentro de células vegetales adecuadas y a veces

dentro de su vector transmisor.

Distintas

Morfologías

Virus vegetales

Distintos

genomas

Las pérdidas ocasionadas por fitovirus pueden deberse a la destrucción del cultivo, alteración del producto (su sabor, textura, aroma), defectos estéticos y los altos costos de manejo (pesticidas, certificación, manejo, etc.).

Algunos síntomas característicos producidos por virus en plantas. (Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)

Síntomas








Sintomatología y patogenesis viral

Tomado de: a) Thorben Lundsgaard, Dept. of Plant Biology, KVL, Dinamarca; b) APSNet ; c) Scottish Crop Research Institute.

Moteado (b)

Enanismo (c) Malformaciones

Mosaico (a)

Anillos cloróticos (a)

Clorosis (a) Necrosis (b)

Anillos necróticos (a)

Coloración anormal (b)

Los virus de plantas en general se nombran: primero con el nombre de su hospedante principal y luego por los síntomas característicos que producen

Potato leafroll virus (PLRV)

Tabacco mosaic virus (TMV)

Barley yellow dwarf virus (BYDV)

Mal de Rio Cuarto virus (MRCV)

Nomenclatura

BPMV

PLRV

TSWV

Distintos síntomas,

especificidad de tejidos y

huéspedes alternativos

TMV en tomate

Genes de patogenicidad

Genes de defensa

Genes alterados colateralmente

Planta huésped

Virus

Cambios metabólicos, fisiológicos, morfológicos

SÍNTOMAS

Los síntomas son el resultado de la interacción entre los dos genomas, propia de cada pareja virus-hospedante. Son el fenotipo de la interacción entre 2 genomas.

Los fitovirus reciben sus nombres por los síntomas que producen (y sus hospedantes)

Los principales grupos de virus vegetales se clasifican según su morfología y la naturaleza de su genoma

Clasificación de Baltimore 7 grupos según tipo de genoma y mecanismo de producción de ARNm

Obtención del ARNm a partir del genoma del virus de

acuerdo con la clasificación de Baltimore

- Proteínas de cápside viral

- Proteínas de movimiento

- ARN replicasas ARN dependientes (virus ARN)

- Proteínas para la transmisión por vectores

- Endoproteasas

- Proteínas Vpg

- Proteínas supresoras del mecanismo de silenciamiento

Principales proteínas codificadas por un virus de planta

Virus de animales

¿Cómo es el ciclo de “vida” de un virus?

Adsorción y entrada Salida de los viriones de la célula

X X Virus de animales

Virus de plantas Entrada y salida de los viriones Vector transmisor

Mecánica

Propagación y dispersión de los virus de plantas

El ciclo de replicación viral comienza con su entrada a la célula vegetal. Existen distintos modos de transmisión

Daño mecánico

Mediante vectores (ejemplo: áfidos)

Formas de

transmisión

de los virus

vegetales

Los virus de plantas no salen de su hospedante

espontáneamente para infectara otras plantas. Por esta

razón, no son diseminados por el viento o por el agua

Ciclo de infección de los virus de plantas

Ciclo de

infección

Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) susceptibles inoculadas con buffer (A) o infectadas con TMV (B)

Fuente: Cortesía Dra. G. C. Conti

Mosaico característico

Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)


Referencias

Sumario

Estrategias de protección antiviral en plantas

Resistencia derivada del patógeno mediada

por ARN viral


por la expresión de proteínas virales

Resistencia derivada de la expresión de genes

no virales

Fitopatología Molecular

Resistencia a virus

vegetales mediante

ingeniería genética

Estrategias de protección antiviral

en plantas


Resistencia a virus

vegetales mediante


Los métodos

de control de

virosis se basan

principalmente

en prácticas de

manejo

agronómico y

mejoramiento

genético

• Las virosis son frecuentes en aquellos cultivos que

. se propagan en forma no sexual (papa, frutilla,

. especies florales, etc.) o en aquellos que requieren

. la realización de injertos. La transmisión por

. semillas es poco frecuente.

• No existen herramientas químicas para el control

. de las virosis de plantas.

• Se aplican prácticas agrícolas que eviten la

. transmisión viral (limpieza de instrumentos y

. maquinaria, control de vectores de transmisión,

. semillas y propágulos de sanidad controlada,

. rotación de cultivos, eliminación de plantas).

• Las estrategias genéticas convencionales han

. hecho uso intensivo de genes de resistencia (R),

. pero esta resistencia es frecuentemente superada

. en condiciones de campo.

• Una práctica agrícola utilizada tempranamente para

. obtener resistencia fue la denominada "protección

. cruzada“.


Resistencia a virus

vegetales mediante


La protección

cruzada es

una estrategia

de protección

antiviral Protección cruzada:

• La introducción de resistencia mediante genes

. obtenidos del patógeno reconoce antecedentes

. en los métodos tradicionales de manejo agrícola.

- Tomates/ Tomato mosaic virus

- Papas/ Potato spindle tuber viroid

- Citrus/ Citrus tristeza virus

• La inoculación de una planta con una cepa viral

. atenuada previene la acumulación viral de una

; cepa virulenta que ataque posteriormente.

• Se utilizó para:


Resistencia a virus

vegetales mediante


• La cepa atenuada (o protectiva) puede mutar

y volverse virulenta.

• La cepa protectiva puede tener sinergismo

con un tercer virus que esté en el campo

y causar una enfermedad severa.

• Una misma cepa puede ser protectiva

en una especie y virulenta en otra especie.

• La cepa protectiva puede causar pérdidas

pequeñas pero significativas en el rendimiento.

Todos estos inconvenientes se solucionarían

si se lograra desencadenar protección cruzada

por la expresión de un único gen viral en

plantas transgénicas.

Desventajas

de la

protección

cruzada clásica


Resistencia a virus

vegetales mediante


Estrategias

de protección

antiviral

en plantas

por técnicas de

transformación

genética

1. Resistencia derivada del patógeno (PDR)

• Mediada por proteínas: cápside viral (CP)

nucleocápside viral (N)

replicasas virales (RP)

proteínas de movimiento (MP)

• Mediada por ARN:

Silenciamiento génico

ARN antisentido

2. Resistencia derivada de transgenes no virales

- Anticuerpos antivirales

- Proteínas inhibidoras del ribosoma (RIPs)

- Factores del sistema del interferón

- Ribozimas

- Estrategias de suicidio celular

3. Genes R de resistencia naturales

Transcripcional (TGS)

Postranscripcional

(PTGS)


Resistencia a virus

vegetales mediante



por la expresión de proteínas virales


Resistencia a virus

vegetales mediante


“Puede derivarse resistencia del parásito

expresando funciones del patógeno

en el huésped, de forma tal que ésta ocurra

en forma disfuncional, en exceso o en un

momento inadecuado del desarrollo.”

Sandford and Johnston, 1985.

En 1985,

Sanford

y Johnston

enuncian sus

postulados

sobre la

resistencia

derivada del

patógeno


Resistencia a virus

vegetales mediante


Posibles puntos de interferencia con el ciclo de multiplicación

viral de virus a ARNsc de polaridad positiva

ingreso

decapsidación y

traducción del gRNA

desensamblado

del virión

síntesis de RNA (- )

síntesis de gRNA

formación de viriones

adquisición por el

vector / transmisión

síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales

unión RNA-proteína /

modificación del plasmodesmo

movimiento célula a célula

difusión sistémica

ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





Tomado de: Powel Abel P. et al., Science, 1986.

A: La expresión de proteína de la cápside (CP) causó un retraso en la

aparición de los síntomas en tres líneas transgénicas independientes.

B: La eficacia del mecanismo de resistencia fue inversamente

proporcional a la concentración del inóculo viral. CP - : progenie que no expresa al gen de cápside de TMV.

CP +: progenie que expresa al gen de cápside de TMV.

Resistencia

a Tobacco

mosaic virus

mediada

por la proteína

de cápside

viral

A B


Resistencia a virus

vegetales mediante


La resistencia se ve sobrepasada por la inoculación con ARN viral.

Esto no ocurre en otros casos de protección mediada por cápside

(Potato virus X o Alfalfa mosaic virus).

Resistencia a Tobacco mosaic virus en plantas de tabaco CP-

y CP +, inoculadas con viriones (A y B) o con ARN viral (C y D)

Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.

La resistencia

derivada

de la cápside

del Tobacco

mosaic virus

requiere la

presencia

de la

proteína viral


Resistencia a virus

vegetales mediante


Las plantas que expresan la proteína de la cápside del Soybean

mosaic virus resultan protegidas frente al desafío con virus

relacionados, tales como el Potato virus Y y el Tobacco etch virus.

Tomado de: Beachy et al., Annu. Rev. Phytopatol., 1990.

La resistencia

mediada

por la cápside

provee

protección de

amplio rango


Resistencia a virus

vegetales mediante


Gradiente de sacarosa La proteína de cápside

mutada TMV-T28W no

se auto-ensambla.

La proteína de cápside mutada

TMV-42W se auto-ensambla

con más eficiencia que la

proteína de cápside nativa

(TMV U1).

Ensayo de protección a TMV en plantas transgénicas

que expresan proteínas de cápside nativas o mutadas

La planta que expresa a TMV-T28W se comporta igual que la no

transgénica. La que expresa a TMV-42W resulta más protegida

que la transgénica para proteína de cápside nativa (3646).

Tomado de: Bendahmane et al., J. Virol., 1997.

Hay una relación

directa entre

el nivel

de protección a

Tobacco mosaic

virus y la

capacidad de la

proteína de

cápside

expresada para

autoensamblarse

top bottom


Resistencia a virus

vegetales mediante


Planta CP -

El virus

se decapsida,

expresa

su genoma

y progresa

la infección.

Planta CP+

El virus no se

decapsida

y la infección

no progresa

o progresa

lentamente.

La protección mediada por la cápside viral

opera a nivel de la decapsidación viral

1 34

Ca2+, pH, ?

2a

b

?

?

R

1

Ca2+, pH, ?

2a

b

?

?

R

1 34

Ca2+, pH, ?

2a

b

?

?

R

1

Ca2+, pH, ?

2a

b

?

?

R

1. El fenotipo de resistencia se expresa como:

- retardo temporal del desarrollo de síntomas

- atenuación de la sintomatología normal

- menor título de virus en los tejidos

- menor número de sitios de infección

2. Se requiere la presencia de proteína viral.

3. Existe correlación entre resistencia y nivel de expresión

de la proteína de la cápside.

4. La protección es superada por altas dosis de inóculo (viriones).

En algunos casos es superada por inoculación con ARN viral.

5. La protección es más efectiva para el virus homólogo.

Sin embargo, abarca también virus y cepas del mismo grupo.

6. En algunos casos, la efectividad y/o el espectro de protección

se modificó por la expresión de versiones truncadas o quiméricas

de la proteína de la cápside.

7. Actúa a nivel celular afectando una etapa temprana del ciclo

infectivo (¿decapsidación?).

8. Descripta principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus.

Protección

mediada

por la

cápside viral


Resistencia a virus

vegetales mediante


Reportes sobre protección mediada por

proteínas de cápside viral

Tobamo- y

alfamovirus

CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate

Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco

Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV;

MDMV; SMV; WMV II; ZYMV

tabaco; papa; papaya; maíz

Carlavirus CP PVS tabaco; papa

Luteovirus CP PLRV papa

Comovirus CP SLRSV tabaco

Nepovirus CP ArMV Tabaco

Tobravirus CP TRV tabaco

Ilavirus CP TSV tabaco

Geminivirus CP TYLCV tomate

Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco

Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber

mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV:

Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX:

Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato

chlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle

virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White clover

mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.

Ensayos de resistencia a Potato virus X en plantas que

expresan el gen de la proteína de cápside del mismo virus

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60

Días posteriores a la inoculación (dpi)

EL

ISA

(A

bs a

40

5 n

m)

SP. INF.

CX34

CX71

CX64

SL94

CX28

SP. MO

Las plantas que expresan

el gen de cápside de PVX

(CX) resultaron protegidas

contra la infección.

Cortesía Dr. F. Bravo-Almonacid.

Solanum

tuberosum

resistente al

Potato virus X

por expresión

de la proteína

de cápside


Resistencia a virus

vegetales mediante




ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





Tomado de: Braun et al. Plant Cell, 1992

Niveles de antígeno viral en líneas de plantas

transgénicas replicasa+ (ORF1) y CP+ (CP)

A: Niveles promedio de antígeno en hojas

inoculadas

B: Niveles promedio de antígenos en la segunda

hoja superior

Las líneas transgénicas están anotadas en el eje

horizontal. El tipo de inóculo (ARN ó 5 mg de virión)

usado en la inoculación se informa entre paréntesis.

Los niveles de antígeno fueron determinados a los

12 dpi. El nivel de antígeno en los controles, que no

se representan en la figura, estuvo entre 390 y 575

ng de antígeno/mg de peso fresco en las hojas

inoculadas y entre 375 y 400 ng de antígeno/mg de

peso fresco en las hojas superiores

Resistencia mediada por replicasa de Potato virus X ng

de a

ntige

no

viral por

mg

de p

eso h

úm

edo

ORF1 (RNA) ORF1 (5) CP (RNA) CP (5)

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,02

0,00

0

4

2

6

12

10

8

A

B


ng

de a

ntige

no

viral por

mg

de p

eso h

úm

edo


0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,02

0,00

0

4

2

6

12

10

8

A

B


Resistencia a

campo contra el

Wheat yellow

mosaic virus en

plantas de trigo

por expresión de

un fragmento

antisentido de la

polimerasa viral


Resistencia a virus

vegetales mediante


El Wheat yellow mosaic virus (WYMV) es un Bymovirus

transmisible por Polymyxa graminis que provoca importantes

pérdidas en el cultivo en Europa, América del Norte y Asia del

este. El genoma está compuesto por dos hebras de ARNsc de

polaridad positiva que codifican sendas poliproteínas. Las mismas

dan origen a 10 proteínas virales por clivaje post-traduccional.

Estructura del ARNg 1 del WYMV y de las construcciones

utilizadas para la transformación genética.

ARN genómico 1: P3: proteína P3; 7k: proteína de 7 KDa; CI: proteína de inclusiones cilíndricas; 14k:

proteína de 14 kDa; Nia-Vpg: proteína Nia-Vpg; Nia-Pro: proteasa Nia-Pro; NIb: polimerasa Nib; CP:

proteína de cubierta viral. Vector pUbi-Nib: NIb8: secuencia parcial complementaria de la Nib; 35S poly A:

terminador de la transcripción del CaMV. Bar: gen de tolerancia a glufosinato; Nos 3¨: terminador de la

transcripción de nopalina sintetasa.

Tomado de : Chen et al., Plant Biotechnology Journal, 2014.

Selección a campo de plantas resistentes a WYMV

Ensayos realizados en las provincias

de Yangzhou y Jiangsu (2002 -2005)

Ensayos de la generación T2 (2002 -2005). El DI se calcula según %DI =

(DS x Ni) x (100 / 3 x N), en que DS es la escala de enfermedad, Ni el

número de plantas con este DS y N el número total de plantas observadas

Tomado de : Chen et al., Plant Biotechnology Journal, 2014.

Ejemplos de resistencia mediada

por replicasas en plantas transgénicas

Mecanismos propuestos para la resistencia mediada por replicasas

1) Efecto “squelching”: inhibición producida por un exceso de uno de los componentes

del complejo de replicación

2) Efecto de inhibición por trans-dominancia: formación de un complejo replicativo no funcional

por incorporación de un componente disfuncional

3) Efecto mediado por ARN: degradación del ARN viral inducida por un mecanismo de

silenciamiento génico

Proteína ? + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobamo TMV

Mecanismo Resistencia Transgén Grupo Virus

Proteína + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobra PEBV

? + Componente de la replicasa en ARN 2 intacto o deletado Cucumo CMV

? + Componente de la replicasa en ARN 1 y 2 mutado Bromo BMV

? + Componente Nlb de la replicasa Poty PVY

ARN + Componente de 166 kDa de la replicasa mutado o intacto Potex PVX

Proteína + Componente sP2 de la replicasa mutado AIMV AIMV

ARN? + Componente de 92 kDa de la replicasa Tombus CYRSV

? + Componente de AC1 de la replicasa Gemini PGMV

Proteína ? + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobamo TMV

Mecanismo Resistencia Transgén Grupo Virus

Proteína + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobra PEBV

? + Componente de la replicasa en ARN 2 intacto o deletado Cucumo CMV

? + Componente de la replicasa en ARN 1 y 2 mutado Bromo BMV

? + Componente Nlb de la replicasa Poty PVY

+ Componente de 166 kDa de la replicasa mutado o intacto Potex PVX

Proteína + Componente sP2 de la replicasa mutado AIMV AIMV

+ Componente de 92 kDa de la replicasa Tombus CYRSV

? + Componente de AC1 de la replicasa Gemini PGMV

1. El fenotipo de resistencia se expresa como cuasi-inmunidad.

2. Tolera altas dosis de inóculo.

3. Es una protección de rango estrecho. Opera frente al virus

homólogo o cepas estrechamente relacionadas.

Es superada por virus pertenecientes al mismo grupo.

4. En muchos casos, no se requiere presencia de la proteína.

No existe correlación entre resistencia y nivel de expresión

de la replicasa viral. Puede obtenerse mediante la expresión

del transcripto correspondiente de ARN.

5. Se asume que, en la mayoría de los casos, la resistencia

es mediada por un mecanismo dependiente de ARN

(PVX, CyRSV, PEBV):

- se asocia a baja acumulación del transcripto de replicasa.

- opera sólo cuando existe alta homología.

- el transgen puede inactivar genes homólogos

(características del mecanismo de silenciamiento génico).

Protección

mediada

por replicasas

virales


Resistencia a virus

vegetales mediante




ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





ingreso

decapsidación y


desensamblado

del virión


síntesis de gRNA


adquisición por el


síntesis de RNAs

subgenómicos

traducción de las

proteínas virales

procesado de las

proteínas virales





Tomado de: Aaziz et al., Trends Plant Sci., 2001.

Estructura del plasmodesmo Los virus

de plantas

se diseminan

de célula

a célula a

través de los

plasmodesmos


Resistencia a virus

vegetales mediante



Resistencia a virus

vegetales mediante


Se han

descripto dos

mecanismos

principales

de transporte

célula a célula

TGBp1, TGBp2 y TGBp3: conjunto tripartito de proteínas de movimiento

La MP nativa permite el movimiento del dextrano F de 10 kDa.

La MP mutada (mMP) no lo permite.

A y B: se inyectó

PVX mMP-GUS.

C y D: se inyectó

PVX MP-GUS.

B y C: detección

de dextrano F de

10 kDa conjugado

a un ligando

fluorescente.

A y D: tinción GUS.

Las proteínas de

movimiento (MP)

de varios virus

de plantas (TMV, PVX,

AIMV, CMV, BDMV)

causan un aumento

en el límite exclusión

de los plasmodesmos

y son capaces de

desplazarse

independientemente

de la replicación viral.

Tomado de: Angell et al., Virology, 1996.

Las proteínas

de movimiento

virales modifican

el límite de

exclusión de los

plasmodesmos

AA BB

CC

AA B B

C C 4

3

2

D 5

4

3

2

DD 5

4

3

2

MP mutada MP mutada

MP nativa

MP nativa Fitopatología Molecular

Resistencia a virus

vegetales mediante


Tomado de: Lapidot et al., Plant J., 1993.

Se inocularon plantas transgénicas 3A5-SX-11 que expresan el gen de la proteína de movimiento

del TMV (p30) con una deleción de los aminoácidos 3 a 5 [3A5-11(+)], plantas transgénicas que no

lo expresan [3A5-11(-)] y plantas control no transgénicas (WT). Los inóculos fueron: a) 0,25 g/ml

TMV; b) 1 g/ml TMV; c) 1,3 g/ml de ARN de TMV; d) 2 g/ml de ARN de TMGMV.

Cinética del desarrollo de síntomas sistémicos en plantas

transgénicas MP30+ y control inoculadas con TMV o TMGMV

Resistencia

mediada

por un gen

mutado de la

proteína

de movimiento

de Tobacco

mosaic virus Días después de la inoculación Días después de la inoculación

Días después de la inoculación Días después de la inoculación

O,25 g/ml TMV 1 g/ml TMV

1,3 g/ml TMV 2 g/ml TMGMV


Resistencia a virus

vegetales mediante


Cinética de infección

en plantas de tabaco

transformadas

con un gen mutado

de la proteína de

movimiento de 13

kDa del White clover

mosaic virus

(WClMV) inoculadas

con dos cepas del

mismo virus o con el

virus PVX. WClMV y

PVX pertenecen al

grupo de los

potexvirus

A: 250 g/mL

de viriones

de WClMV-O;

B: 50 g/mL

de viriones

de WClMV-M;

C: 1 g/mL

de PVX;

D: 10 g/mL

de PVX.

Tomado de: Beck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994.

La resistencia

derivada

de proteínas

de movimiento

es en general

de amplio

espectro

WClMV-O WClMV-M

PVX PVX


Resistencia a virus

vegetales mediante


1. El fenotipo de resistencia se expresa como:

- retardo temporal del desarrollo de síntomas

- menor título de virus en los tejidos infectados

- atenuación o desaparición de la sintomatología normal

2. Se requiere la presencia de la proteína de movimiento,

generalmente en forma mutagenizada.

3. Existe correlación entre nivel de resistencia y nivel

de expresión de la proteína de movimiento.

4. Es una protección de rango amplio. Protege frente

a virus del mismo grupo y frente a virus de grupos

no relacionados.

5. La protección es superada por altas dosis de inóculo.

6. Se asume que interfiere con el mecanismo

de transporte viral, fundamentalmente sobre

el pasaje célula a célula.

Protección

mediada

por proteínas

de movimiento


Resistencia a virus

vegetales mediante


Resistencia derivada del patógeno

mediada por ARN viral


Resistencia a virus

vegetales mediante


En muchos

casos no

se requiere

la presencia

de proteína

de cápside

para conferir

resistencia

B49: Planta no transgénica.

RC#5: Planta transgénica que expresa una versión no

traducible del ARNm de proteína de cápside

de TEV.

AS#3: Planta que expresa el ARNm antisentido de

proteína de cápside de TEV.

La expresión de ARN derivado del patógeno

es suficiente para conferir resistencia

Tomado de: Lindbo et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 1992.


Resistencia a virus

vegetales mediante


Fenotipo de recuperación en plantas de tabaco transformadas

con el gen de la proteína de cápside del Tobacco etch virus

1, 2, 3: hojas inferiores, medias y superiores de

la planta CP+ (arriba) o CP- (abajo).

A: CP de TEV; B: ARN de TEV;

C: ARN de actina.

1: CP- infectada con TEV; 2: CP-

no infectada; 3, 5, 7: plantas CP+

infectadas con TEV; 4, 6, 8:

plantas CP+ recuperadas luego

de la infección.

Tomado de: Lindbo et al., Plant Cell, 1993.

CP+

CP-

Fenotipo de recuperación en plantas transgénicas

de tabaco para CP-TEV infectadas con TEV

Los experimentos de Dougherty demostraron que:

• La resistencia no depende de la expresión de la proteína,

. sino de la del ARN viral

• Los transcriptos de ARN no codificantes también inducen

. resistencia

• Existe una correlación positiva entre el nivel de transcripción

. del ARN transgénico a nivel nuclear y el nivel de resistencia

• El nivel de RNA transgénico a nivel citoplasmático es muy

. bajo. Por lo tanto, en las plantas resistentes, el ARN

. transgénico es degradado a este nivel.

Resistencia

mediada por

ARN

• Se caracteriza por elevados niveles de transcripción

en el núcleo y niveles acumulación de ARNm muy bajos

o nulos en el citoplasma.

• Requiere la transcripción del transgén: es más frecuente con el aumento del número de copias y la

fuerza del promotor.

• La replicación viral puede gatillar la protección en una

planta transgénica susceptible y, en consecuencia, la

misma se vuelve resistente al virus (fenotipo de

recuperación).

• Desaparece luego de la meiosis y reaparece semanas

después de la germinación de las semillas.

• El pasaje in vitro o la regeneración del tejido vegetal no afectan el fenotipo de resistencia.

• El proceso se gatilla a partir de la presencia de ARNdc

• La resistencia se difunde a los tejidos distales.

El factor difusible contendría un ARN pequeño.


Resistencia a virus

vegetales mediante


El proceso implica la degradación del ARN viral y es gatillado por la presencia de ARNdc.

•

• Silenciamiento génico post-transcripcional

(PTGS):

Ausencia de expresión del gen de interés debido

a una degradación inducible y específica del

transcripto de ARNm. Se desencadena por

reconocimiento de secuencias homólogas bajo

la forma de ARNdc a nivel citoplasmático.

• Silenciamiento génico transcripcional (TGS):

Ausencia de expresión del gen de interés debido

a que ocurre metilación de ADN cerca de la región

promotora, lo que impide su transcripción normal.

Se desencadena por un camino que incluye la

actividad de ARN-polimerasas ADN-dependientes

y ADN metilasas.

Silenciamiento

génico


Resistencia a virus

vegetales mediante


El ingreso al

silenciamiento

génico post-

transcripcional

puede gatillarse

de diversas

maneras


Resistencia a virus

vegetales mediante


Virus a ADN

Transgenes u

genes endógenos

en repeticiones

invertidas

Genes o transgenes de

copia única en

orientación sentido

Virus a ARN

Mecanismo de

vigilancia y

amplificación

ARN “aberrante”

Degradación del

ARN blanco

Formación de

ARN en horquilla

ARNdc Virus a ARN

Las ARN polimerasas dependientes de ARN juegan un papel en la iniciación y/o amplificación del silenciamiento en plantas y gusanos

a) Los ARNm normales no son silenciados porque las polimerasas (RDR) no tienen acceso a la secuencia de ARN.

Las estructuras de poli(A), los CAPs y las proteínas unidas a las mismas estarían involucradas en esta limitación.

b) Si el CAP o el poli(A) están ausentes, la polimerasa sintetiza una secuencia de ARNdc, la que ingresa en la ruta del

silenciamiento y produce siRNAs

c) Este siRNA puede aparearse al ARNm normal y actuar como iniciador de la RPRD, lo que induce su silenciamiento e

inicia un proceso de amplificación del silenciamiento. El proceso puede originarse en un virus o un transgen

Iniciación del silenciamiento

mediada por ARN aberrante CBP: cap binding proteins

PABP: poli(A) binding proteins


Resistencia a virus

vegetales mediante


El PTGS es

un mecanismo

de defensa

frente a las

infecciones

virales

Los virus de

plantas pueden

desencadenar el

PTGS a partir de la

propia replicación

viral o de

intermediarios

de ARNdc. Este

mecanismo se

conoce como VIGS

(Viral Induced Gene

Silencing)

Se especula que el

silenciamiento

génico se originó

como un sistema de

defensa de las

células eucariotas

ante la invasión de

genomas extraños

(virus, transposones

y secuencias

repetitivas). Los

distintas rutas de

silenciamiento que

hoy se conocen

habrían

evolucionado a

partir de esta

función primitiva.

RNA blanco

siRNAs primarios

dsRNA

Difusión desde 3’ independiente de iniciador

Difusión hacia 5’ dependiente de iniciador

siRNAs secundarios 3’ siRNAs secundarios 5’

¿ RNA aberrante?

Tomado de: Brodersen and Voinnet, Trends in Genetics, 22:268-280, 2006.

Transitividad del silenciamiento génico post-transcripcional

Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by

grafting from silenced stocks to non-silenced scions. Jean-Christophe Palauqui, Taline Elmayan,

Jean-Marie Pollien and Herve Vaucheret The EMBO Journal, 16:4738-4745, 1997

Systemic spread of sequence-specific transgene

RNA degradation in plants is initiated by localized

introduction of ectopic promoterless DNA. Olivier

Voinnet, Philippe Vain, Susan Angell,and David C. Baulcombe Cell, 95:177–187,1998

NS S S NS S NS

3, 4 y 5 semanas post infección

El silenciamiento se transmite sistémicamente

Las proteínas virales supresoras del silenciamiento

actúan a distintos niveles

Tomado de: Bey, Tesis Doctoral, 2010.

La supresión del

silenciamiento es una

estrategia usada por

los virus de plantas a

ARN y ADN para

suprimir la respuesta

defensiva de la planta

• P1/HC-Pro de TEV ó PVY (potyvirus, ARNsc)

Previamente esta proteína había sido reportada como

determinante de patogenicidad, en el sinergismo

y en el movimiento a larga distancia. Previene la degradación

del ARN pero no elimina la señal móvil que propaga el

silenciamiento.

• 2b de CMV (cucumovirus, ARNsc)


determinante de patogenicidad y como responsable

del movimiento viral a distancia. Solo previene el silenciamiento

en hojas jóvenes y cuando se localiza en el núcleo.

• p25 de PVX (potexvirus, ARNsc)

Es la proteína responsable del movimiento viral en las plantas

infectadas. Interfiere con la señal de propagación sistémica.

• p19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc)


determinante de síntomas y de especificidad de huésped.

Solo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y sólo

en y alrededor de las venas.

• Ac2 de ACMV (geminivirus, ADNsc)


determinante de síntomas. Suprime el mantenimiento del PTGS.

Las proteínas

virales

supresoras del

silenciamiento

actúan a

distintos niveles

Agrobiotecnología

Resistencia a virus

vegetales mediante


El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es un mecanismo de defensa residente en

las plantas. En la ausencia de mecanismos supresores (línea superior) los ARNs virales son

reconocidos a partir de su replicación o de formas de ARNdc e identificados para su

degradación por las células infectadas, limitando la acumulación de nuevo ARNg e inhibiendo

su replicación. El silenciamiento sistémico adquirido es inducido a través de una señal que se

transporta a larga distancia. En presencia de proteínas virales supresoras (P1/HCPro; línea

inferior), la inducción y/o el mantenimiento del silenciamiento es inhibida. En consecuencia, el

genoma viral se acumula y difunde a los tejidos sistémicos. .

Silenciamiento

inducido por virus

Silenciamiento

inducido por virus

Silenciamiento

sistémico adquirido

Silenciamiento

sistémico adquirido

Ausencia de

replicación y

dispersión viral

Acumulación y

dispersión

sistémica de

partículas virales

y de partículas

vilales no

relacionadas

Complejo de

replicación

viral del TEV

P1/ Hc -Pro

RNAs virales

acumulados

Shut - off de la amplificación por

degradación del RNA viral

Modelo para la respuesta defensiva de

silenciamiento génico inducido por virus

VIGS

El silenciamiento

génico puede

afectar la

formación de

síntomas virales

por distintas vías


Resistencia a virus

vegetales mediante


• Las proteínas supresoras del virus (VSR) pueden interferir con la biogénesis de

miRNAs, afectando el programa de desarrollo de la planta. Alternativamente, las VSRs

pueden impedir el silenciamiento de genes del huésped provocando cambios en los

tejidos afectados.

• Los siRNAs virales pueden silenciar genes del huésped por reconocimiento fortuito de

sus ARNm.

• La replicasa viral puede reconocer motivos de iniciación en ARNm del huésped,

guiando la síntesis de ARNdc y la degradación por silenciamiento.

• Las proteínas supresoras u otras proteínas virales pueden actuar como factores de

avirulencia, gatillando respuestas defensivas mediadas por genes de resistencia.

El silenciamiento

génico explicaría

el fenómeno

de protección

cruzada • La caracterización de respuestas defensivas

basadas en el silenciamiento brinda una

explicación al fenómeno de "protección

cruzada“.

• La infección con una cepa viral atenuada

desencadenaría eficazmente el VIGS.

• El establecimiento del silenciamiento génico

post-transcripcional originaría la protección

subsecuente contra cepas virulentas que

compartan homología de secuencia.


Resistencia a virus

vegetales mediante


Ensayos de

campo de

papaya

resistente

al Papaya

ringspot virus


Resistencia a virus

vegetales mediante


Ensayos de campo con

la variedad de papaya

transgénica Rainbow

en Hawai durante 1995.

La comercialización se

autorizó en 1998.

El Papaya ringspot virus

es un potyvirus que

produce una enfermedad

devastadora en plantas

de papaya que puso en

riesgo la producción en

Hawai. La variedad

Rainbow fue

transformada con una

construcción que expresa

la proteína de la cápside

viral. El mecanismo de

resistencia está mediado

por silenciamiento de

ARN.

Ensayos de

campo de

papaya

resistente

al Papaya

ringspot virus

Efecto de la presencia

del gen de la cápside

viral y del método de

inoculación en el

desarrollo de

síntomas visibles de

PRSV en condiciones

de campo.

Efecto de la

resistencia derivada

del patógeno en el

diámetro del tronco

de papaya bajo

condiciones de

campo fue altamente

significativo (P<0,01)

para cada dato

recogido.


Resistencia a virus

vegetales mediante


Desafío con PVY en cámara de crecimiento

0 dpi

20 dpi

35 dpi

Desafío con PVY en invernáculo

Papa resistente al Potato virus Y

por inducción del silenciamiento post-transcripcional

Plantas son síntomas bajo condiciones de presión de infección natural:

Línea transgénica SY233: 1/1500 infectadas

Control no transgénico: 450/1500 infectadas

Papa resistente al Potato virus Y

por expresión de la proteína de cápside

Ensayos comparativos de rendimiento con líneas de papa transgénicas en Córdoba, Argentina

Tomado de: Smith et al., Nature, 2000.

El silenciamiento se puede inducir expresando horquillas de ARNdc viral en plantas transgénicas

Vectores de transformación vegetal que permiten

expresar transcriptos de ARNdc con forma de horquilla

Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con esta construcción para

realizar una prueba de concepto. Las plantas transgénicas fueron

seleccionadas en medio conteniendo herbicidas, analizadas por Southern

blot y sometidas a ensayos de infección en condiciones de invernadero.

Resistencia a PVY en líneas transgénicas evaluada

en ensayos de infección en invernadero

Utilizando extractos de plantas infectadas con PVY, se inocularon en forma mecánica

. 5 plantas de 5 líneas diferentes de tabaco (CRASH) y 5 plantas control no transformadas.

El desarrollo de la infección se evaluó por la formación de síntomas y mediante ensayos

. de ELISA .

Resistencia a reovirus en plantas de arroz mediante

la expresión de horquillas de ARNdc

Los reovirus poseen genomas multipartitos que

comprenden entre 10 y 12 segmentos de ARNdc linear de

sentido positivo. Los mismos codifican entre 10 y 12

proteínas que proveen las funciones necesarias para la

replicación y propagación en las plantas y en los insectos

vectores. Las partículas son icosahédricas y están

rodeadas por una o dos cápsides proteicas.

Los principales reovirus que afectan al arroz son el Rice

dwarf virus (RDV), el Rice gall dwarf virus (RGDV), el Rice

black streaked dwarf virus (RBSDV) y el Rice ragged stunt

virus (RRSV). El RDV y el RGDV pertenecen al género

Phytoreovirus, el RRSV al género Oryzavirus y el RBSDV

al género Fidjivirus. Todos ellos tienen un alto impacto en

todos los países de la región asiática.

Con el fin de introducir resistencia a RDV, RGDV y RBSDV,

se adoptó la misma estrategia descripta para los tenuivirus

RSV y RGSV. Con este fin, se clonaron en el vector “gatillo“

para el silenciamiento horquillas de ARNdc de secuencias

parciales correspondientes a cada ORF del RDV (P1, P2,

P3, Pns4, P5, Pns6, P7, P8, P9, Pns10, Pns11, Pns12).

Las secuencias empleadas se señalan con flechas en la

figura. Dichas construcciones se utilizaron para transformar

plantas del cultivar de arroz Nipponbare.

RDV

Tomado de: Sasaya et al., Frontiers in Microbiology, 2014.

Resistencia a reovirus en plantas de arroz mediante

la expresión de horquillas de ARNdc

Tomado de: Sasaya et al., Frontiers in Microbiology, 2014.

Las construcciones correspondientes a los ORFs de RDV

que codifican a la proteínas de movimiento y de cápside viral

(Pn6 y P8) y una proteína de función desconocida (Pns12)

fueron las más efectivas en promover el silenciamiento del

virus. En consecuencia, las de los correspondientes

ortólogos funcionales en RGDV y RBSDV fueron utilizadas

para introducir resistencia a estos virus en plantas de arroz.

Ensayos de infección de plantas de arroz con los RDV. RGDV

y RBSDV bajo condiciones controladas. Se muestran líneas

transgénicas (T) que expresan ARNdc correspondiente a los

ORFs Pns12 (RDV), Pns9 (RGDV) y P9-1 (RBSDV). Pns9 y

P9-1 son ortólogos funcionales de la proteína P8 de RDV. Las

fotografías fueron tomadas a los 4 meses post-infección.

Injertos

El pie GM injertado

permite obtener una

planta quimérica cuyo

tejido vascular está

conectado

La copa (o

scion) puede

contener RNAs,

cambios

epigenéticos y

proteínas

provenientes del

pie, pero NO es

GM

Aplicaciones: resistencia a

virosis en cítricos (GFLV)

Resistencia a virus mediada por miRNAs artificiales

a) Estructura del pre-miRNA 159ª. Las secuencias correspondientes a miRNA159 y miRNA159* fueron reemplazadas por

secuencias que codifican a las proteínas supresoras del PTGS P69 de Turnip yellow mosaic virus (TYMV) y HC-Pro de

Turnip mosaic virus (TuMV) mediante mutagénesis dirigida. Los pre-miRNAs generados (pre-amiR-P69159 y pre-amiR-HC-

Pro159) fueron subclonados en el vector pENTR y transferidos a un vector binario usando el sistema Gateway. Los vectores

fueron probados por agro-infiltración de Nicotiana benthamina antes de transferirlos a Arabidopsis thaliana. b) Estructura

de un vector que porta la construcción 35S-pre-amiR-P69159/amiR-HC-Pro159, capaz de expresar dos amiRNAs específicos

para ambos virus. c) Northern blot análisis de líneas que expresan amiR69159 y amiR-HC-Pro159.

Tomado de: Niu et al. Nature Biotechnology, 2006.

Resistencia a virus mediada por miRNAs artificiales

A B C

D

E F

A: Plantas transgénicas que expresan amiR-HC.Pro159 y amiR-69159 y control inoculadas con TYMV. B: Idem

inoculadas con TuMV. C: Plantas transgénicas amiR-P69159/amiR-HC-Pro159 inoculadas con ambos virus.

D: Plantas amiR-HC-Pro159 inoculadas con la versión TuMV-GFP, que permite seguir el movimiento célula a

célula del virus mediante iluminación fluorescente en el microscopio confocal. E: Detección por ELISA de la

proteína de cápside de TYMV en plantas transgénicas y control. F: Idem para la proteína de cápside de TuMV

Tomado de: Niu et al. Nature Biotechnology, 2006.

Cultivo Virus País

Ají CMV y TMV China

Ají pimiento PVY Indonesia

Algodón ClCV Pakistán

Vigna mungo virus India

Tungro virus Malasia

Arroz RRSV Tailandia

RDV China

Banana BTV Filipinas

Batata SPFMV India y Kenia

Caña de azúcar SCMV y Yellow virus Brasil

SCMV Egipto

Cítricos Tristeza virus Cuba

CPsV Argentina

Maíz MSV Sudáfrica

MRCV Argentina

Maní PStV Indonesia

Tomado de: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp

Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapa de experimentación

o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo

Cultivo Virus País

Pimienta picante CMV y TMV Corea

Pimienta dulce CMV China

Poroto BGMV Brasil

Repollo TuMV China

Tabaco TSWV y PVY Brasil

PVY Corea

TMV Indonesia y China

México y Corea

Trigo BYDV China

Tomate Geminivirus y Tospovirus Brasil

Geminivirus Cuba

CMV México y China

TYLCV Tailandia, China y Egipto

Zapallo PMV, PAMV y SMV2 México

Zuchini PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV México




Cultivo Virus País

Melón CMV México y China

ZYMV Egipto

Nuez moscada Stripped virus China

Papa PVY Argentina y China

PLRV Argentina y Cuba

PVY y PLRV Brasil Egipto China y Colombia

PVX y PVY Perú Sudáfrica Indonesia México

Papaya PMV Bangladesh e Indonesia

PRSV Malasia China Brasil y México

RV Filipinas

RSV Cuba

PRV Tailandia

Pepino ZYMV Egipto

Pimienta CMV Malasia

CVBMV Tailandia




Resistencia derivada de la expresión

de genes no virales


Resistencia a virus

vegetales mediante


Expresión de anticuerpos de cadena única

(scFv antibodies) o “plantibodies” en plantas

Resistencia

a virus

por expresión

de anticuerpos

o “plantibodies”


Resistencia a virus

vegetales mediante


Tomado de: Tavladoraki et al., Nature, 1993.

Título de virus en hojas inoculadas

y hojas superiores de plantas

inoculadas con AMCV a los 14 días

post-infección.

Porcentaje de infección de plantas

control y de dos líneas transgénicas

inoculadas con AMCV.

Expresión de anticuerpos de cadena única contra la proteína

de cápside del Artichoke mottled crinkle virus en plantas de tabaco

Especificidad de la protección

en un ensayo de infección de

protoplastos con AMCV y CMV

ACMV CMV

Control

Transformadas

21 h

0

1

2

pg

de v

iru

s p

or

pro

top

laso

t

ACMV CMV

Control

Transformadas

21 h

0

1

2

pg

de v

iru

s p

or

pro

top

laso

t

Tomado de: Tavladoraki et al., Nature, 1993.

Expresión de

anticuerpos

de cadena

única contra

la proteína

de cápside

del Artichoke

mottled

crinkle virus

en plantas

de tabaco

AMCV


Resistencia a virus

vegetales mediante


• Se requieren muy altos niveles de expresión.

• Se debe lograr que el anticuerpo se exprese

en los compartimentos celulares donde

ocurren los pasos de multiplicación viral a ser

inhibidos.

• Los anticuerpos a expresar deben ser

seleccionados previamente por su habilidad

de bloquear un paso crucial en el ciclo

de multiplicación o transmisión viral.

Por lo tanto se requiere de un ensayo

de interferencia viral bien diseñado.

Los anticuerpos más promisorios son

aquellos dirigidos hacia proteínas con

actividad catalítica y no los dirigidos hacia

proteínas estructurales.

Cuellos

de botella

en el uso

de “plantibodies”


Resistencia a virus

vegetales mediante


Especie Gen R Estructura Patógeno

Arabidopsis HRT LZ-NBS-LRR Turnip crinkle virus

Arabidopsis RCY1 CC-NBS-LRR Cucumber mosaic virus

Papa Rx1 NBS-LRR Potato virus X

Papa Ry TIR-NBS-LRR Potato virus Y

Soja KR1 TIR-NBS-LRR Soybean mosaic virus

Tabaco N TIR-NBS-LRR Tobacco mosaic virus

Tomate Tm-2(2) CC-NBS-LRR Tomato mosaic virus

Tomate Sw-5 NBS-LRR Tospovirus

CC: Dominio coiled coil.

LRR: Repetición rica en leucinas o leucine rich repeat.

LZ: Dominio de zipper de leucina o leucine zipper.

NBS: Dominio de unión a nucleótidos o nucleotide binding domain.

TIR: Receptor con homología a Toll y receptor de interleukina 1 o Toll-interleukin-1 receptor.

Genes R de resistencia a virus clonados

Resistencia

a virus

por expresión

de genes R

de resistencia

natural


Resistencia a virus

vegetales mediante


Mecanismo de defensa CRISPR

clustered regularly interspaced

short palindromic repeats

secuencias cortas, palindrómicas,

interespaciadas y agrupadas de

ARN

En el 40% de las bacterias y 90% de las arqueas:

CRISPR/Cas

Charpentier and Doudna, 2013

La nucleasa Cas9 es

guiada por un RNA

para hacerlas sitio

específicas

1. Sanford, J.C. and Johnston, S.A. The concept of parasite-

derived resistance: deriving resistance genes from the

parasite's own genome. Journal of Theoretical Biology,

113:395-405, 1985.

2. Beachy, R.N. Coat-protein-mediated resistance to tobacco

mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation.

Philosophical Transactions Royal Society and London. Series

B Biological Sciences, 354:659-664, 1999.

3. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against

viruses. Trends in Genetics, 17:449-59, 2001.

4. Waterhouse, P.M., Wang, M.B. and Lough, T. Gene silencing

as an adaptive defence against viruses. Nature, 411:834-42,

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5. Carrington, J.C., Kasschau, K.D. and Johansen, L.K.

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Virology, 281:1-5, 2001.

6. Schillberg, S., Zimmermann, S., Zhang, M.Y. and Fischer, R.

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Research, 10:1-12, 2001.

7. Ding, S-W and Voinnet, O. Antiviral inmunity directed by small

RNAs. Cell, 130:413-426, 2007.

Referencias


Resistencia a virus

vegetales mediante


resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética resistencia a... · resistencia a...

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