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Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología
Curso 2018
Resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética
Esteban Hopp
Impacto económico de las infecciones virales
Pérdidas anuales por infecciones virales en el mundo USD 60 billones Primera causa de pérdidas son las infecciones fúngicas seguido por las virales Perdidas indirectas en las plantas infectadas por aumento de la susceptibilidad a otros estreses no cuantificables
Las pérdidas ocasionadas por fitovirus pueden deberse a la destrucción del cultivo, alteración del producto (su sabor, textura, aroma), defectos estéticos y los altos costos de manejo (pesticidas, certificación, manejo, etc.).
Impacto económico de las infecciones virales
Algunos síntomas característicos producidos por virus en plantas. (Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)
Qué son los virus vegetales?
PARÁSITO INTRACELULAR OBLIGATORIO
Un virus vegetal es un conjunto de una o mas moléculas de ácido
nucleico, contenido en una cubierta protectora de proteínas capaz
de autoreplicarse dentro de células vegetales adecuadas y a veces
dentro de su vector transmisor.
Distintas
Morfologías
Virus vegetales
Distintos
genomas
Las pérdidas ocasionadas por fitovirus pueden deberse a la destrucción del cultivo, alteración del producto (su sabor, textura, aroma), defectos estéticos y los altos costos de manejo (pesticidas, certificación, manejo, etc.).
Algunos síntomas característicos producidos por virus en plantas. (Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)
Síntomas
Sintomatología y patogenesis viral
Tomado de: a) Thorben Lundsgaard, Dept. of Plant Biology, KVL, Dinamarca; b) APSNet ; c) Scottish Crop Research Institute.
Moteado (b)
Enanismo (c) Malformaciones
Mosaico (a)
Anillos cloróticos (a)
Clorosis (a) Necrosis (b)
Anillos necróticos (a)
Coloración anormal (b)
Los virus de plantas en general se nombran: primero con el nombre de su hospedante principal y luego por los síntomas característicos que producen
Potato leafroll virus (PLRV)
Tabacco mosaic virus (TMV)
Barley yellow dwarf virus (BYDV)
Mal de Rio Cuarto virus (MRCV)
Nomenclatura
BPMV
PLRV
TSWV
Distintos síntomas,
especificidad de tejidos y
huéspedes alternativos
TMV en tomate
Genes de patogenicidad
Genes de defensa
Genes alterados colateralmente
Planta huésped
Virus
Cambios metabólicos, fisiológicos, morfológicos
SÍNTOMAS
Los síntomas son el resultado de la interacción entre los dos genomas, propia de cada pareja virus-hospedante. Son el fenotipo de la interacción entre 2 genomas.
Los fitovirus reciben sus nombres por los síntomas que producen (y sus hospedantes)
Los principales grupos de virus vegetales se clasifican según su morfología y la naturaleza de su genoma
Clasificación de Baltimore 7 grupos según tipo de genoma y mecanismo de producción de ARNm
Obtención del ARNm a partir del genoma del virus de
acuerdo con la clasificación de Baltimore
- Proteínas de cápside viral
- Proteínas de movimiento
- ARN replicasas ARN dependientes (virus ARN)
- Proteínas para la transmisión por vectores
- Endoproteasas
- Proteínas Vpg
- Proteínas supresoras del mecanismo de silenciamiento
Principales proteínas codificadas por un virus de planta
Virus de animales
¿Cómo es el ciclo de “vida” de un virus?
Adsorción y entrada Salida de los viriones de la célula
X X Virus de animales
Virus de plantas Entrada y salida de los viriones Vector transmisor
Mecánica
Propagación y dispersión de los virus de plantas
El ciclo de replicación viral comienza con su entrada a la célula vegetal. Existen distintos modos de transmisión
Daño mecánico
Mediante vectores (ejemplo: áfidos)
Formas de
transmisión
de los virus
vegetales
Los virus de plantas no salen de su hospedante
espontáneamente para infectara otras plantas. Por esta
razón, no son diseminados por el viento o por el agua
Ciclo de infección de los virus de plantas
Ciclo de
infección
Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) susceptibles inoculadas con buffer (A) o infectadas con TMV (B)
Fuente: Cortesía Dra. G. C. Conti
Mosaico característico
Fuente: APSnet (http://www.apsnet.org)
Referencias
Sumario
Estrategias de protección antiviral en plantas
Resistencia derivada del patógeno mediada
por ARN viral
Resistencia derivada del patógeno mediada
por la expresión de proteínas virales
Resistencia derivada de la expresión de genes
no virales
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Estrategias de protección antiviral
en plantas
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Los métodos
de control de
virosis se basan
principalmente
en prácticas de
manejo
agronómico y
mejoramiento
genético
• Las virosis son frecuentes en aquellos cultivos que
. se propagan en forma no sexual (papa, frutilla,
. especies florales, etc.) o en aquellos que requieren
. la realización de injertos. La transmisión por
. semillas es poco frecuente.
• No existen herramientas químicas para el control
. de las virosis de plantas.
• Se aplican prácticas agrícolas que eviten la
. transmisión viral (limpieza de instrumentos y
. maquinaria, control de vectores de transmisión,
. semillas y propágulos de sanidad controlada,
. rotación de cultivos, eliminación de plantas).
• Las estrategias genéticas convencionales han
. hecho uso intensivo de genes de resistencia (R),
. pero esta resistencia es frecuentemente superada
. en condiciones de campo.
• Una práctica agrícola utilizada tempranamente para
. obtener resistencia fue la denominada "protección
. cruzada“.
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
La protección
cruzada es
una estrategia
de protección
antiviral Protección cruzada:
• La introducción de resistencia mediante genes
. obtenidos del patógeno reconoce antecedentes
. en los métodos tradicionales de manejo agrícola.
- Tomates/ Tomato mosaic virus
- Papas/ Potato spindle tuber viroid
- Citrus/ Citrus tristeza virus
• La inoculación de una planta con una cepa viral
. atenuada previene la acumulación viral de una
; cepa virulenta que ataque posteriormente.
• Se utilizó para:
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
• La cepa atenuada (o protectiva) puede mutar
y volverse virulenta.
• La cepa protectiva puede tener sinergismo
con un tercer virus que esté en el campo
y causar una enfermedad severa.
• Una misma cepa puede ser protectiva
en una especie y virulenta en otra especie.
• La cepa protectiva puede causar pérdidas
pequeñas pero significativas en el rendimiento.
Todos estos inconvenientes se solucionarían
si se lograra desencadenar protección cruzada
por la expresión de un único gen viral en
plantas transgénicas.
Desventajas
de la
protección
cruzada clásica
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Estrategias
de protección
antiviral
en plantas
por técnicas de
transformación
genética
1. Resistencia derivada del patógeno (PDR)
• Mediada por proteínas: cápside viral (CP)
nucleocápside viral (N)
replicasas virales (RP)
proteínas de movimiento (MP)
• Mediada por ARN:
Silenciamiento génico
ARN antisentido
2. Resistencia derivada de transgenes no virales
- Anticuerpos antivirales
- Proteínas inhibidoras del ribosoma (RIPs)
- Factores del sistema del interferón
- Ribozimas
- Estrategias de suicidio celular
3. Genes R de resistencia naturales
Transcripcional (TGS)
Postranscripcional
(PTGS)
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Resistencia derivada del patógeno mediada
por la expresión de proteínas virales
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
“Puede derivarse resistencia del parásito
expresando funciones del patógeno
en el huésped, de forma tal que ésta ocurra
en forma disfuncional, en exceso o en un
momento inadecuado del desarrollo.”
Sandford and Johnston, 1985.
En 1985,
Sanford
y Johnston
enuncian sus
postulados
sobre la
resistencia
derivada del
patógeno
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Posibles puntos de interferencia con el ciclo de multiplicación
viral de virus a ARNsc de polaridad positiva
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
Tomado de: Powel Abel P. et al., Science, 1986.
A: La expresión de proteína de la cápside (CP) causó un retraso en la
aparición de los síntomas en tres líneas transgénicas independientes.
B: La eficacia del mecanismo de resistencia fue inversamente
proporcional a la concentración del inóculo viral. CP - : progenie que no expresa al gen de cápside de TMV.
CP +: progenie que expresa al gen de cápside de TMV.
Resistencia
a Tobacco
mosaic virus
mediada
por la proteína
de cápside
viral
A B
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
La resistencia se ve sobrepasada por la inoculación con ARN viral.
Esto no ocurre en otros casos de protección mediada por cápside
(Potato virus X o Alfalfa mosaic virus).
Resistencia a Tobacco mosaic virus en plantas de tabaco CP-
y CP +, inoculadas con viriones (A y B) o con ARN viral (C y D)
Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.
La resistencia
derivada
de la cápside
del Tobacco
mosaic virus
requiere la
presencia
de la
proteína viral
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Las plantas que expresan la proteína de la cápside del Soybean
mosaic virus resultan protegidas frente al desafío con virus
relacionados, tales como el Potato virus Y y el Tobacco etch virus.
Tomado de: Beachy et al., Annu. Rev. Phytopatol., 1990.
La resistencia
mediada
por la cápside
provee
protección de
amplio rango
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Gradiente de sacarosa La proteína de cápside
mutada TMV-T28W no
se auto-ensambla.
La proteína de cápside mutada
TMV-42W se auto-ensambla
con más eficiencia que la
proteína de cápside nativa
(TMV U1).
Ensayo de protección a TMV en plantas transgénicas
que expresan proteínas de cápside nativas o mutadas
La planta que expresa a TMV-T28W se comporta igual que la no
transgénica. La que expresa a TMV-42W resulta más protegida
que la transgénica para proteína de cápside nativa (3646).
Tomado de: Bendahmane et al., J. Virol., 1997.
Hay una relación
directa entre
el nivel
de protección a
Tobacco mosaic
virus y la
capacidad de la
proteína de
cápside
expresada para
autoensamblarse
top bottom
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Planta CP -
El virus
se decapsida,
expresa
su genoma
y progresa
la infección.
Planta CP+
El virus no se
decapsida
y la infección
no progresa
o progresa
lentamente.
La protección mediada por la cápside viral
opera a nivel de la decapsidación viral
1 34
Ca2+, pH, ?
2a
b
?
?
R
1
Ca2+, pH, ?
2a
b
?
?
R
1 34
Ca2+, pH, ?
2a
b
?
?
R
1
Ca2+, pH, ?
2a
b
?
?
R
1. El fenotipo de resistencia se expresa como:
- retardo temporal del desarrollo de síntomas
- atenuación de la sintomatología normal
- menor título de virus en los tejidos
- menor número de sitios de infección
2. Se requiere la presencia de proteína viral.
3. Existe correlación entre resistencia y nivel de expresión
de la proteína de la cápside.
4. La protección es superada por altas dosis de inóculo (viriones).
En algunos casos es superada por inoculación con ARN viral.
5. La protección es más efectiva para el virus homólogo.
Sin embargo, abarca también virus y cepas del mismo grupo.
6. En algunos casos, la efectividad y/o el espectro de protección
se modificó por la expresión de versiones truncadas o quiméricas
de la proteína de la cápside.
7. Actúa a nivel celular afectando una etapa temprana del ciclo
infectivo (¿decapsidación?).
8. Descripta principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus.
Protección
mediada
por la
cápside viral
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Reportes sobre protección mediada por
proteínas de cápside viral
Tobamo- y
alfamovirus
CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate
Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco
Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV;
MDMV; SMV; WMV II; ZYMV
tabaco; papa; papaya; maíz
Carlavirus CP PVS tabaco; papa
Luteovirus CP PLRV papa
Comovirus CP SLRSV tabaco
Nepovirus CP ArMV Tabaco
Tobravirus CP TRV tabaco
Ilavirus CP TSV tabaco
Geminivirus CP TYLCV tomate
Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco
Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber
mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV:
Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX:
Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato
chlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle
virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White clover
mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.
Ensayos de resistencia a Potato virus X en plantas que
expresan el gen de la proteína de cápside del mismo virus
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
Días posteriores a la inoculación (dpi)
EL
ISA
(A
bs a
40
5 n
m)
SP. INF.
CX34
CX71
CX64
SL94
CX28
SP. MO
Las plantas que expresan
el gen de cápside de PVX
(CX) resultaron protegidas
contra la infección.
Cortesía Dr. F. Bravo-Almonacid.
Solanum
tuberosum
resistente al
Potato virus X
por expresión
de la proteína
de cápside
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Posibles puntos de interferencia con el ciclo de multiplicación
viral de virus a ARNsc de polaridad positiva
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
Tomado de: Braun et al. Plant Cell, 1992
Niveles de antígeno viral en líneas de plantas
transgénicas replicasa+ (ORF1) y CP+ (CP)
A: Niveles promedio de antígeno en hojas
inoculadas
B: Niveles promedio de antígenos en la segunda
hoja superior
Las líneas transgénicas están anotadas en el eje
horizontal. El tipo de inóculo (ARN ó 5 mg de virión)
usado en la inoculación se informa entre paréntesis.
Los niveles de antígeno fueron determinados a los
12 dpi. El nivel de antígeno en los controles, que no
se representan en la figura, estuvo entre 390 y 575
ng de antígeno/mg de peso fresco en las hojas
inoculadas y entre 375 y 400 ng de antígeno/mg de
peso fresco en las hojas superiores
Resistencia mediada por replicasa de Potato virus X ng
de a
ntige
no
viral por
mg
de p
eso h
úm
edo
ORF1 (RNA) ORF1 (5) CP (RNA) CP (5)
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,02
0,00
0
4
2
6
12
10
8
A
B
ORF1 (RNA) ORF1 (5) CP (RNA) CP (5)
ng
de a
ntige
no
viral por
mg
de p
eso h
úm
edo
ORF1 (RNA) ORF1 (5) CP (RNA) CP (5)
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,02
0,00
0
4
2
6
12
10
8
A
B
ORF1 (RNA) ORF1 (5) CP (RNA) CP (5)
Resistencia a
campo contra el
Wheat yellow
mosaic virus en
plantas de trigo
por expresión de
un fragmento
antisentido de la
polimerasa viral
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
El Wheat yellow mosaic virus (WYMV) es un Bymovirus
transmisible por Polymyxa graminis que provoca importantes
pérdidas en el cultivo en Europa, América del Norte y Asia del
este. El genoma está compuesto por dos hebras de ARNsc de
polaridad positiva que codifican sendas poliproteínas. Las mismas
dan origen a 10 proteínas virales por clivaje post-traduccional.
Estructura del ARNg 1 del WYMV y de las construcciones
utilizadas para la transformación genética.
ARN genómico 1: P3: proteína P3; 7k: proteína de 7 KDa; CI: proteína de inclusiones cilíndricas; 14k:
proteína de 14 kDa; Nia-Vpg: proteína Nia-Vpg; Nia-Pro: proteasa Nia-Pro; NIb: polimerasa Nib; CP:
proteína de cubierta viral. Vector pUbi-Nib: NIb8: secuencia parcial complementaria de la Nib; 35S poly A:
terminador de la transcripción del CaMV. Bar: gen de tolerancia a glufosinato; Nos 3¨: terminador de la
transcripción de nopalina sintetasa.
Tomado de : Chen et al., Plant Biotechnology Journal, 2014.
Selección a campo de plantas resistentes a WYMV
Ensayos realizados en las provincias
de Yangzhou y Jiangsu (2002 -2005)
Ensayos de la generación T2 (2002 -2005). El DI se calcula según %DI =
(DS x Ni) x (100 / 3 x N), en que DS es la escala de enfermedad, Ni el
número de plantas con este DS y N el número total de plantas observadas
Tomado de : Chen et al., Plant Biotechnology Journal, 2014.
Ejemplos de resistencia mediada
por replicasas en plantas transgénicas
Mecanismos propuestos para la resistencia mediada por replicasas
1) Efecto “squelching”: inhibición producida por un exceso de uno de los componentes
del complejo de replicación
2) Efecto de inhibición por trans-dominancia: formación de un complejo replicativo no funcional
por incorporación de un componente disfuncional
3) Efecto mediado por ARN: degradación del ARN viral inducida por un mecanismo de
silenciamiento génico
Proteína ? + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobamo TMV
Mecanismo Resistencia Transgén Grupo Virus
Proteína + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobra PEBV
? + Componente de la replicasa en ARN 2 intacto o deletado Cucumo CMV
? + Componente de la replicasa en ARN 1 y 2 mutado Bromo BMV
? + Componente Nlb de la replicasa Poty PVY
ARN + Componente de 166 kDa de la replicasa mutado o intacto Potex PVX
Proteína + Componente sP2 de la replicasa mutado AIMV AIMV
ARN? + Componente de 92 kDa de la replicasa Tombus CYRSV
? + Componente de AC1 de la replicasa Gemini PGMV
Proteína ? + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobamo TMV
Mecanismo Resistencia Transgén Grupo Virus
Proteína + Componente de 54 kDa de la replicasa Tobra PEBV
? + Componente de la replicasa en ARN 2 intacto o deletado Cucumo CMV
? + Componente de la replicasa en ARN 1 y 2 mutado Bromo BMV
? + Componente Nlb de la replicasa Poty PVY
+ Componente de 166 kDa de la replicasa mutado o intacto Potex PVX
Proteína + Componente sP2 de la replicasa mutado AIMV AIMV
+ Componente de 92 kDa de la replicasa Tombus CYRSV
? + Componente de AC1 de la replicasa Gemini PGMV
1. El fenotipo de resistencia se expresa como cuasi-inmunidad.
2. Tolera altas dosis de inóculo.
3. Es una protección de rango estrecho. Opera frente al virus
homólogo o cepas estrechamente relacionadas.
Es superada por virus pertenecientes al mismo grupo.
4. En muchos casos, no se requiere presencia de la proteína.
No existe correlación entre resistencia y nivel de expresión
de la replicasa viral. Puede obtenerse mediante la expresión
del transcripto correspondiente de ARN.
5. Se asume que, en la mayoría de los casos, la resistencia
es mediada por un mecanismo dependiente de ARN
(PVX, CyRSV, PEBV):
- se asocia a baja acumulación del transcripto de replicasa.
- opera sólo cuando existe alta homología.
- el transgen puede inactivar genes homólogos
(características del mecanismo de silenciamiento génico).
Protección
mediada
por replicasas
virales
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Posibles puntos de interferencia con el ciclo de multiplicación
viral de virus a ARNsc de polaridad positiva
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
ingreso
decapsidación y
traducción del gRNA
desensamblado
del virión
síntesis de RNA (- )
síntesis de gRNA
formación de viriones
adquisición por el
vector / transmisión
síntesis de RNAs
subgenómicos
traducción de las
proteínas virales
procesado de las
proteínas virales
unión RNA-proteína /
modificación del plasmodesmo
movimiento célula a célula
difusión sistémica
Tomado de: Aaziz et al., Trends Plant Sci., 2001.
Estructura del plasmodesmo Los virus
de plantas
se diseminan
de célula
a célula a
través de los
plasmodesmos
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Se han
descripto dos
mecanismos
principales
de transporte
célula a célula
TGBp1, TGBp2 y TGBp3: conjunto tripartito de proteínas de movimiento
La MP nativa permite el movimiento del dextrano F de 10 kDa.
La MP mutada (mMP) no lo permite.
A y B: se inyectó
PVX mMP-GUS.
C y D: se inyectó
PVX MP-GUS.
B y C: detección
de dextrano F de
10 kDa conjugado
a un ligando
fluorescente.
A y D: tinción GUS.
Las proteínas de
movimiento (MP)
de varios virus
de plantas (TMV, PVX,
AIMV, CMV, BDMV)
causan un aumento
en el límite exclusión
de los plasmodesmos
y son capaces de
desplazarse
independientemente
de la replicación viral.
Tomado de: Angell et al., Virology, 1996.
Las proteínas
de movimiento
virales modifican
el límite de
exclusión de los
plasmodesmos
AA BB
CC
AA B B
C C 4
3
2
D 5
4
3
2
DD 5
4
3
2
MP mutada MP mutada
MP nativa
MP nativa Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Tomado de: Lapidot et al., Plant J., 1993.
Se inocularon plantas transgénicas 3A5-SX-11 que expresan el gen de la proteína de movimiento
del TMV (p30) con una deleción de los aminoácidos 3 a 5 [3A5-11(+)], plantas transgénicas que no
lo expresan [3A5-11(-)] y plantas control no transgénicas (WT). Los inóculos fueron: a) 0,25 g/ml
TMV; b) 1 g/ml TMV; c) 1,3 g/ml de ARN de TMV; d) 2 g/ml de ARN de TMGMV.
Cinética del desarrollo de síntomas sistémicos en plantas
transgénicas MP30+ y control inoculadas con TMV o TMGMV
Resistencia
mediada
por un gen
mutado de la
proteína
de movimiento
de Tobacco
mosaic virus Días después de la inoculación Días después de la inoculación
Días después de la inoculación Días después de la inoculación
O,25 g/ml TMV 1 g/ml TMV
1,3 g/ml TMV 2 g/ml TMGMV
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Cinética de infección
en plantas de tabaco
transformadas
con un gen mutado
de la proteína de
movimiento de 13
kDa del White clover
mosaic virus
(WClMV) inoculadas
con dos cepas del
mismo virus o con el
virus PVX. WClMV y
PVX pertenecen al
grupo de los
potexvirus
A: 250 g/mL
de viriones
de WClMV-O;
B: 50 g/mL
de viriones
de WClMV-M;
C: 1 g/mL
de PVX;
D: 10 g/mL
de PVX.
Tomado de: Beck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994.
La resistencia
derivada
de proteínas
de movimiento
es en general
de amplio
espectro
WClMV-O WClMV-M
PVX PVX
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
1. El fenotipo de resistencia se expresa como:
- retardo temporal del desarrollo de síntomas
- menor título de virus en los tejidos infectados
- atenuación o desaparición de la sintomatología normal
2. Se requiere la presencia de la proteína de movimiento,
generalmente en forma mutagenizada.
3. Existe correlación entre nivel de resistencia y nivel
de expresión de la proteína de movimiento.
4. Es una protección de rango amplio. Protege frente
a virus del mismo grupo y frente a virus de grupos
no relacionados.
5. La protección es superada por altas dosis de inóculo.
6. Se asume que interfiere con el mecanismo
de transporte viral, fundamentalmente sobre
el pasaje célula a célula.
Protección
mediada
por proteínas
de movimiento
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Resistencia derivada del patógeno
mediada por ARN viral
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
En muchos
casos no
se requiere
la presencia
de proteína
de cápside
para conferir
resistencia
B49: Planta no transgénica.
RC#5: Planta transgénica que expresa una versión no
traducible del ARNm de proteína de cápside
de TEV.
AS#3: Planta que expresa el ARNm antisentido de
proteína de cápside de TEV.
La expresión de ARN derivado del patógeno
es suficiente para conferir resistencia
Tomado de: Lindbo et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 1992.
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Fenotipo de recuperación en plantas de tabaco transformadas
con el gen de la proteína de cápside del Tobacco etch virus
1, 2, 3: hojas inferiores, medias y superiores de
la planta CP+ (arriba) o CP- (abajo).
A: CP de TEV; B: ARN de TEV;
C: ARN de actina.
1: CP- infectada con TEV; 2: CP-
no infectada; 3, 5, 7: plantas CP+
infectadas con TEV; 4, 6, 8:
plantas CP+ recuperadas luego
de la infección.
Tomado de: Lindbo et al., Plant Cell, 1993.
CP+
CP-
Fenotipo de recuperación en plantas transgénicas
de tabaco para CP-TEV infectadas con TEV
Los experimentos de Dougherty demostraron que:
• La resistencia no depende de la expresión de la proteína,
. sino de la del ARN viral
• Los transcriptos de ARN no codificantes también inducen
. resistencia
• Existe una correlación positiva entre el nivel de transcripción
. del ARN transgénico a nivel nuclear y el nivel de resistencia
• El nivel de RNA transgénico a nivel citoplasmático es muy
. bajo. Por lo tanto, en las plantas resistentes, el ARN
. transgénico es degradado a este nivel.
Resistencia
mediada por
ARN
• Se caracteriza por elevados niveles de transcripción
en el núcleo y niveles acumulación de ARNm muy bajos
o nulos en el citoplasma.
• Requiere la transcripción del transgén: es más frecuente con el aumento del número de copias y la
fuerza del promotor.
• La replicación viral puede gatillar la protección en una
planta transgénica susceptible y, en consecuencia, la
misma se vuelve resistente al virus (fenotipo de
recuperación).
• Desaparece luego de la meiosis y reaparece semanas
después de la germinación de las semillas.
• El pasaje in vitro o la regeneración del tejido vegetal no afectan el fenotipo de resistencia.
• El proceso se gatilla a partir de la presencia de ARNdc
• La resistencia se difunde a los tejidos distales.
El factor difusible contendría un ARN pequeño.
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
El proceso implica la degradación del ARN viral y es gatillado por la presencia de ARNdc.
•
• Silenciamiento génico post-transcripcional
(PTGS):
Ausencia de expresión del gen de interés debido
a una degradación inducible y específica del
transcripto de ARNm. Se desencadena por
reconocimiento de secuencias homólogas bajo
la forma de ARNdc a nivel citoplasmático.
• Silenciamiento génico transcripcional (TGS):
Ausencia de expresión del gen de interés debido
a que ocurre metilación de ADN cerca de la región
promotora, lo que impide su transcripción normal.
Se desencadena por un camino que incluye la
actividad de ARN-polimerasas ADN-dependientes
y ADN metilasas.
Silenciamiento
génico
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
El ingreso al
silenciamiento
génico post-
transcripcional
puede gatillarse
de diversas
maneras
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Virus a ADN
Transgenes u
genes endógenos
en repeticiones
invertidas
Genes o transgenes de
copia única en
orientación sentido
Virus a ARN
Mecanismo de
vigilancia y
amplificación
ARN “aberrante”
Degradación del
ARN blanco
Formación de
ARN en horquilla
ARNdc Virus a ARN
Las ARN polimerasas dependientes de ARN juegan un papel en la iniciación y/o amplificación del silenciamiento en plantas y gusanos
a) Los ARNm normales no son silenciados porque las polimerasas (RDR) no tienen acceso a la secuencia de ARN.
Las estructuras de poli(A), los CAPs y las proteínas unidas a las mismas estarían involucradas en esta limitación.
b) Si el CAP o el poli(A) están ausentes, la polimerasa sintetiza una secuencia de ARNdc, la que ingresa en la ruta del
silenciamiento y produce siRNAs
c) Este siRNA puede aparearse al ARNm normal y actuar como iniciador de la RPRD, lo que induce su silenciamiento e
inicia un proceso de amplificación del silenciamiento. El proceso puede originarse en un virus o un transgen
Iniciación del silenciamiento
mediada por ARN aberrante CBP: cap binding proteins
PABP: poli(A) binding proteins
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
El PTGS es
un mecanismo
de defensa
frente a las
infecciones
virales
Los virus de
plantas pueden
desencadenar el
PTGS a partir de la
propia replicación
viral o de
intermediarios
de ARNdc. Este
mecanismo se
conoce como VIGS
(Viral Induced Gene
Silencing)
Se especula que el
silenciamiento
génico se originó
como un sistema de
defensa de las
células eucariotas
ante la invasión de
genomas extraños
(virus, transposones
y secuencias
repetitivas). Los
distintas rutas de
silenciamiento que
hoy se conocen
habrían
evolucionado a
partir de esta
función primitiva.
RNA blanco
siRNAs primarios
dsRNA
Difusión desde 3’ independiente de iniciador
Difusión hacia 5’ dependiente de iniciador
siRNAs secundarios 3’ siRNAs secundarios 5’
¿ RNA aberrante?
Tomado de: Brodersen and Voinnet, Trends in Genetics, 22:268-280, 2006.
Transitividad del silenciamiento génico post-transcripcional
Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by
grafting from silenced stocks to non-silenced scions. Jean-Christophe Palauqui, Taline Elmayan,
Jean-Marie Pollien and Herve Vaucheret The EMBO Journal, 16:4738-4745, 1997
Systemic spread of sequence-specific transgene
RNA degradation in plants is initiated by localized
introduction of ectopic promoterless DNA. Olivier
Voinnet, Philippe Vain, Susan Angell,and David C. Baulcombe Cell, 95:177–187,1998
NS S S NS S NS
3, 4 y 5 semanas post infección
El silenciamiento se transmite sistémicamente
Las proteínas virales supresoras del silenciamiento
actúan a distintos niveles
Tomado de: Bey, Tesis Doctoral, 2010.
La supresión del
silenciamiento es una
estrategia usada por
los virus de plantas a
ARN y ADN para
suprimir la respuesta
defensiva de la planta
• P1/HC-Pro de TEV ó PVY (potyvirus, ARNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de patogenicidad, en el sinergismo
y en el movimiento a larga distancia. Previene la degradación
del ARN pero no elimina la señal móvil que propaga el
silenciamiento.
• 2b de CMV (cucumovirus, ARNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de patogenicidad y como responsable
del movimiento viral a distancia. Solo previene el silenciamiento
en hojas jóvenes y cuando se localiza en el núcleo.
• p25 de PVX (potexvirus, ARNsc)
Es la proteína responsable del movimiento viral en las plantas
infectadas. Interfiere con la señal de propagación sistémica.
• p19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de síntomas y de especificidad de huésped.
Solo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y sólo
en y alrededor de las venas.
• Ac2 de ACMV (geminivirus, ADNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de síntomas. Suprime el mantenimiento del PTGS.
Las proteínas
virales
supresoras del
silenciamiento
actúan a
distintos niveles
Agrobiotecnología
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es un mecanismo de defensa residente en
las plantas. En la ausencia de mecanismos supresores (línea superior) los ARNs virales son
reconocidos a partir de su replicación o de formas de ARNdc e identificados para su
degradación por las células infectadas, limitando la acumulación de nuevo ARNg e inhibiendo
su replicación. El silenciamiento sistémico adquirido es inducido a través de una señal que se
transporta a larga distancia. En presencia de proteínas virales supresoras (P1/HCPro; línea
inferior), la inducción y/o el mantenimiento del silenciamiento es inhibida. En consecuencia, el
genoma viral se acumula y difunde a los tejidos sistémicos. .
Silenciamiento
inducido por virus
Silenciamiento
inducido por virus
Silenciamiento
sistémico adquirido
Silenciamiento
sistémico adquirido
Ausencia de
replicación y
dispersión viral
Acumulación y
dispersión
sistémica de
partículas virales
y de partículas
vilales no
relacionadas
Complejo de
replicación
viral del TEV
P1/ Hc -Pro
RNAs virales
acumulados
Shut - off de la amplificación por
degradación del RNA viral
Modelo para la respuesta defensiva de
silenciamiento génico inducido por virus
VIGS
El silenciamiento
génico puede
afectar la
formación de
síntomas virales
por distintas vías
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
• Las proteínas supresoras del virus (VSR) pueden interferir con la biogénesis de
miRNAs, afectando el programa de desarrollo de la planta. Alternativamente, las VSRs
pueden impedir el silenciamiento de genes del huésped provocando cambios en los
tejidos afectados.
• Los siRNAs virales pueden silenciar genes del huésped por reconocimiento fortuito de
sus ARNm.
• La replicasa viral puede reconocer motivos de iniciación en ARNm del huésped,
guiando la síntesis de ARNdc y la degradación por silenciamiento.
• Las proteínas supresoras u otras proteínas virales pueden actuar como factores de
avirulencia, gatillando respuestas defensivas mediadas por genes de resistencia.
El silenciamiento
génico explicaría
el fenómeno
de protección
cruzada • La caracterización de respuestas defensivas
basadas en el silenciamiento brinda una
explicación al fenómeno de "protección
cruzada“.
• La infección con una cepa viral atenuada
desencadenaría eficazmente el VIGS.
• El establecimiento del silenciamiento génico
post-transcripcional originaría la protección
subsecuente contra cepas virulentas que
compartan homología de secuencia.
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Ensayos de
campo de
papaya
resistente
al Papaya
ringspot virus
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Ensayos de campo con
la variedad de papaya
transgénica Rainbow
en Hawai durante 1995.
La comercialización se
autorizó en 1998.
El Papaya ringspot virus
es un potyvirus que
produce una enfermedad
devastadora en plantas
de papaya que puso en
riesgo la producción en
Hawai. La variedad
Rainbow fue
transformada con una
construcción que expresa
la proteína de la cápside
viral. El mecanismo de
resistencia está mediado
por silenciamiento de
ARN.
Ensayos de
campo de
papaya
resistente
al Papaya
ringspot virus
Efecto de la presencia
del gen de la cápside
viral y del método de
inoculación en el
desarrollo de
síntomas visibles de
PRSV en condiciones
de campo.
Efecto de la
resistencia derivada
del patógeno en el
diámetro del tronco
de papaya bajo
condiciones de
campo fue altamente
significativo (P<0,01)
para cada dato
recogido.
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Desafío con PVY en cámara de crecimiento
0 dpi
20 dpi
35 dpi
Desafío con PVY en invernáculo
Papa resistente al Potato virus Y
por inducción del silenciamiento post-transcripcional
Plantas son síntomas bajo condiciones de presión de infección natural:
Línea transgénica SY233: 1/1500 infectadas
Control no transgénico: 450/1500 infectadas
Papa resistente al Potato virus Y
por expresión de la proteína de cápside
Ensayos comparativos de rendimiento con líneas de papa transgénicas en Córdoba, Argentina
Tomado de: Smith et al., Nature, 2000.
El silenciamiento se puede inducir expresando horquillas de ARNdc viral en plantas transgénicas
Vectores de transformación vegetal que permiten
expresar transcriptos de ARNdc con forma de horquilla
Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con esta construcción para
realizar una prueba de concepto. Las plantas transgénicas fueron
seleccionadas en medio conteniendo herbicidas, analizadas por Southern
blot y sometidas a ensayos de infección en condiciones de invernadero.
Resistencia a PVY en líneas transgénicas evaluada
en ensayos de infección en invernadero
Utilizando extractos de plantas infectadas con PVY, se inocularon en forma mecánica
. 5 plantas de 5 líneas diferentes de tabaco (CRASH) y 5 plantas control no transformadas.
El desarrollo de la infección se evaluó por la formación de síntomas y mediante ensayos
. de ELISA .
Resistencia a reovirus en plantas de arroz mediante
la expresión de horquillas de ARNdc
Los reovirus poseen genomas multipartitos que
comprenden entre 10 y 12 segmentos de ARNdc linear de
sentido positivo. Los mismos codifican entre 10 y 12
proteínas que proveen las funciones necesarias para la
replicación y propagación en las plantas y en los insectos
vectores. Las partículas son icosahédricas y están
rodeadas por una o dos cápsides proteicas.
Los principales reovirus que afectan al arroz son el Rice
dwarf virus (RDV), el Rice gall dwarf virus (RGDV), el Rice
black streaked dwarf virus (RBSDV) y el Rice ragged stunt
virus (RRSV). El RDV y el RGDV pertenecen al género
Phytoreovirus, el RRSV al género Oryzavirus y el RBSDV
al género Fidjivirus. Todos ellos tienen un alto impacto en
todos los países de la región asiática.
Con el fin de introducir resistencia a RDV, RGDV y RBSDV,
se adoptó la misma estrategia descripta para los tenuivirus
RSV y RGSV. Con este fin, se clonaron en el vector “gatillo“
para el silenciamiento horquillas de ARNdc de secuencias
parciales correspondientes a cada ORF del RDV (P1, P2,
P3, Pns4, P5, Pns6, P7, P8, P9, Pns10, Pns11, Pns12).
Las secuencias empleadas se señalan con flechas en la
figura. Dichas construcciones se utilizaron para transformar
plantas del cultivar de arroz Nipponbare.
RDV
Tomado de: Sasaya et al., Frontiers in Microbiology, 2014.
Resistencia a reovirus en plantas de arroz mediante
la expresión de horquillas de ARNdc
Tomado de: Sasaya et al., Frontiers in Microbiology, 2014.
Las construcciones correspondientes a los ORFs de RDV
que codifican a la proteínas de movimiento y de cápside viral
(Pn6 y P8) y una proteína de función desconocida (Pns12)
fueron las más efectivas en promover el silenciamiento del
virus. En consecuencia, las de los correspondientes
ortólogos funcionales en RGDV y RBSDV fueron utilizadas
para introducir resistencia a estos virus en plantas de arroz.
Ensayos de infección de plantas de arroz con los RDV. RGDV
y RBSDV bajo condiciones controladas. Se muestran líneas
transgénicas (T) que expresan ARNdc correspondiente a los
ORFs Pns12 (RDV), Pns9 (RGDV) y P9-1 (RBSDV). Pns9 y
P9-1 son ortólogos funcionales de la proteína P8 de RDV. Las
fotografías fueron tomadas a los 4 meses post-infección.
Injertos
El pie GM injertado
permite obtener una
planta quimérica cuyo
tejido vascular está
conectado
La copa (o
scion) puede
contener RNAs,
cambios
epigenéticos y
proteínas
provenientes del
pie, pero NO es
GM
Aplicaciones: resistencia a
virosis en cítricos (GFLV)
Resistencia a virus mediada por miRNAs artificiales
a) Estructura del pre-miRNA 159ª. Las secuencias correspondientes a miRNA159 y miRNA159* fueron reemplazadas por
secuencias que codifican a las proteínas supresoras del PTGS P69 de Turnip yellow mosaic virus (TYMV) y HC-Pro de
Turnip mosaic virus (TuMV) mediante mutagénesis dirigida. Los pre-miRNAs generados (pre-amiR-P69159 y pre-amiR-HC-
Pro159) fueron subclonados en el vector pENTR y transferidos a un vector binario usando el sistema Gateway. Los vectores
fueron probados por agro-infiltración de Nicotiana benthamina antes de transferirlos a Arabidopsis thaliana. b) Estructura
de un vector que porta la construcción 35S-pre-amiR-P69159/amiR-HC-Pro159, capaz de expresar dos amiRNAs específicos
para ambos virus. c) Northern blot análisis de líneas que expresan amiR69159 y amiR-HC-Pro159.
Tomado de: Niu et al. Nature Biotechnology, 2006.
Resistencia a virus mediada por miRNAs artificiales
A B C
D
E F
A: Plantas transgénicas que expresan amiR-HC.Pro159 y amiR-69159 y control inoculadas con TYMV. B: Idem
inoculadas con TuMV. C: Plantas transgénicas amiR-P69159/amiR-HC-Pro159 inoculadas con ambos virus.
D: Plantas amiR-HC-Pro159 inoculadas con la versión TuMV-GFP, que permite seguir el movimiento célula a
célula del virus mediante iluminación fluorescente en el microscopio confocal. E: Detección por ELISA de la
proteína de cápside de TYMV en plantas transgénicas y control. F: Idem para la proteína de cápside de TuMV
Tomado de: Niu et al. Nature Biotechnology, 2006.
Cultivo Virus País
Ají CMV y TMV China
Ají pimiento PVY Indonesia
Algodón ClCV Pakistán
Vigna mungo virus India
Tungro virus Malasia
Arroz RRSV Tailandia
RDV China
Banana BTV Filipinas
Batata SPFMV India y Kenia
Caña de azúcar SCMV y Yellow virus Brasil
SCMV Egipto
Cítricos Tristeza virus Cuba
CPsV Argentina
Maíz MSV Sudáfrica
MRCV Argentina
Maní PStV Indonesia
Tomado de: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp
Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapa de experimentación
o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo
Cultivo Virus País
Pimienta picante CMV y TMV Corea
Pimienta dulce CMV China
Poroto BGMV Brasil
Repollo TuMV China
Tabaco TSWV y PVY Brasil
PVY Corea
TMV Indonesia y China
México y Corea
Trigo BYDV China
Tomate Geminivirus y Tospovirus Brasil
Geminivirus Cuba
CMV México y China
TYLCV Tailandia, China y Egipto
Zapallo PMV, PAMV y SMV2 México
Zuchini PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV México
Tomado de: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp
Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapa de experimentación
o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo
Cultivo Virus País
Melón CMV México y China
ZYMV Egipto
Nuez moscada Stripped virus China
Papa PVY Argentina y China
PLRV Argentina y Cuba
PVY y PLRV Brasil Egipto China y Colombia
PVX y PVY Perú Sudáfrica Indonesia México
Papaya PMV Bangladesh e Indonesia
PRSV Malasia China Brasil y México
RV Filipinas
RSV Cuba
PRV Tailandia
Pepino ZYMV Egipto
Pimienta CMV Malasia
CVBMV Tailandia
Tomado de: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp
Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapa de experimentación
o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo
Resistencia derivada de la expresión
de genes no virales
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Expresión de anticuerpos de cadena única
(scFv antibodies) o “plantibodies” en plantas
Resistencia
a virus
por expresión
de anticuerpos
o “plantibodies”
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Tomado de: Tavladoraki et al., Nature, 1993.
Título de virus en hojas inoculadas
y hojas superiores de plantas
inoculadas con AMCV a los 14 días
post-infección.
Porcentaje de infección de plantas
control y de dos líneas transgénicas
inoculadas con AMCV.
Expresión de anticuerpos de cadena única contra la proteína
de cápside del Artichoke mottled crinkle virus en plantas de tabaco
Especificidad de la protección
en un ensayo de infección de
protoplastos con AMCV y CMV
ACMV CMV
Control
Transformadas
21 h
0
1
2
pg
de v
iru
s p
or
pro
top
laso
t
ACMV CMV
Control
Transformadas
21 h
0
1
2
pg
de v
iru
s p
or
pro
top
laso
t
Tomado de: Tavladoraki et al., Nature, 1993.
Expresión de
anticuerpos
de cadena
única contra
la proteína
de cápside
del Artichoke
mottled
crinkle virus
en plantas
de tabaco
AMCV
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
• Se requieren muy altos niveles de expresión.
• Se debe lograr que el anticuerpo se exprese
en los compartimentos celulares donde
ocurren los pasos de multiplicación viral a ser
inhibidos.
• Los anticuerpos a expresar deben ser
seleccionados previamente por su habilidad
de bloquear un paso crucial en el ciclo
de multiplicación o transmisión viral.
Por lo tanto se requiere de un ensayo
de interferencia viral bien diseñado.
Los anticuerpos más promisorios son
aquellos dirigidos hacia proteínas con
actividad catalítica y no los dirigidos hacia
proteínas estructurales.
Cuellos
de botella
en el uso
de “plantibodies”
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Especie Gen R Estructura Patógeno
Arabidopsis HRT LZ-NBS-LRR Turnip crinkle virus
Arabidopsis RCY1 CC-NBS-LRR Cucumber mosaic virus
Papa Rx1 NBS-LRR Potato virus X
Papa Ry TIR-NBS-LRR Potato virus Y
Soja KR1 TIR-NBS-LRR Soybean mosaic virus
Tabaco N TIR-NBS-LRR Tobacco mosaic virus
Tomate Tm-2(2) CC-NBS-LRR Tomato mosaic virus
Tomate Sw-5 NBS-LRR Tospovirus
CC: Dominio coiled coil.
LRR: Repetición rica en leucinas o leucine rich repeat.
LZ: Dominio de zipper de leucina o leucine zipper.
NBS: Dominio de unión a nucleótidos o nucleotide binding domain.
TIR: Receptor con homología a Toll y receptor de interleukina 1 o Toll-interleukin-1 receptor.
Genes R de resistencia a virus clonados
Resistencia
a virus
por expresión
de genes R
de resistencia
natural
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética
Mecanismo de defensa CRISPR
clustered regularly interspaced
short palindromic repeats
secuencias cortas, palindrómicas,
interespaciadas y agrupadas de
ARN
En el 40% de las bacterias y 90% de las arqueas:
CRISPR/Cas
Charpentier and Doudna, 2013
La nucleasa Cas9 es
guiada por un RNA
para hacerlas sitio
específicas
1. Sanford, J.C. and Johnston, S.A. The concept of parasite-
derived resistance: deriving resistance genes from the
parasite's own genome. Journal of Theoretical Biology,
113:395-405, 1985.
2. Beachy, R.N. Coat-protein-mediated resistance to tobacco
mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation.
Philosophical Transactions Royal Society and London. Series
B Biological Sciences, 354:659-664, 1999.
3. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against
viruses. Trends in Genetics, 17:449-59, 2001.
4. Waterhouse, P.M., Wang, M.B. and Lough, T. Gene silencing
as an adaptive defence against viruses. Nature, 411:834-42,
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5. Carrington, J.C., Kasschau, K.D. and Johansen, L.K.
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Referencias
Fitopatología Molecular
Resistencia a virus
vegetales mediante
ingeniería genética