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Introducción de resistencia genética a
Tobamovirus en variedades locales de ‘Pimiento
de Gernika’ y ‘Guindilla de Ibarra’.
Avance resultados 2016
Larregla S, Elorrieta J, Abaunza L, Juaristi B,
Aragonés A, Ruiz de Galarreta JI, Ortíz-Barredo A
OBJETIVOS GENERALES. PROYECTO TOBAMOVIRUS. PARTICIPANTES
1. Incidencia de Tobamovirus y determinación de patotipos en las
comarcas vascas de cultivo de la Guindilla de Ibarra y Pimiento de
Gernika.
2. Introducir genes de resistencia mediante sucesivos
retrocruzamientos. Fijar genes de resistencia para obtener dos nuevas
variedades de Guindilla de Ibarra y Pimiento de Gernika.
3. Obtener pimientos resistentes que, a su vez, presenten
características fenotípicas deseadas de la Guindilla de Ibarra y el
Pimiento de Gernika.
4. Elaboración y difusión entre los productores de protocolo de pautas
de manejo que minimicen el riesgo de transmisión y que aumente
durabilidad de la resistencia a largo plazo.
Proyecto a largo plazo (7 generaciones entre parentales y variedad ).
Introducción genes de resistencia
Recuperación características morfológicas
G0: Parentales
G1: PseudoF1
G2: RC1
G3: RC2
G4: RC3
G4: RC4
G5: Autofecundación 1
G6: Autofecundación 2 = Variedad resistente
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
Ciclo 4
Ciclo 5
Ciclo 6
Ciclo 7
Año 2015
Año 2016
Año 2017
Año 2022*
* 1 ciclo/año
Obtención de híbridos con
genes de resistencia
Recuperación
características
morfológicas
Fijación genes
resistencia
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para seleccionar plantas resistentes
(Genotipado). Objetivo metodológico.
2. Comprobar resistencia mediante inoculación de plantas con el virus
(Fenotipado). Objetivo metodológico.
6. Comprobar si gen L4 en homocigosis puede dar problemas de
androesterilidad y mal cuajado de frutos. Cruzamientos en campo para obtener
PseudoF2 (1ªautofecundación de plantas resistentes de PseudoF1).
Inoculación virus para comprobar resistencia.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1).
4. Genotipado con marcadores moleculares para seleccionar plantas
resistentes de 2ª generación (RC1).
5. Comprobar resistencia mediante inoculación del virus en 2ª generación
(RC1).
7. Solicitud proyecto GO liderado por GILBE en el que intervienen GILBE-
BIHOEL-NEIKER y participan SSVV y HAZI.
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para gen L3 (resistencia a patotipo
12 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 8 y funcionan 2
País: Korea, Estudio: Tomita et al. (2008) Theor Appl Genet 117:1107-1118
A339(NK)
AFLP → SCAR
A339(YB)
AFLP → SCAR
IH1-04(NK & YB)
RGA, SCAR
189D23M(NB)
BAC-end, SCAR
189D23M(YB)
BAC-end, SCAR
253A1R(YB)
BAC-end, SCAR
YB2A25(NK & YB)
AFLP → SCAR
YB2A19(NK)
AFLP → SCAR
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para gen L3 (resistencia a patotipo
12 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 8 y funcionan 2
YB2A25(NK & YB) Marcador SCAR (Theor Appl Genet (2008) 117:1107-1118)
Derio X VR(L3)
Proporción esperada:50%Resi-50%Sensi
Plantas con marcador=31/69=45%
Ibarroria X VR(L3)
Proporción esperada: 50%Resi-50%Sensi
Plantas con marcador=45/91=49%
Controles negativos: Derio, Ibarroria. Controles positivos: VR(L3)
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para gen L4 (resistencia a patotipo
123 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 4 y funciona 1
País: Korea, Estudios: Kim et al. (2008) Mol. Cells 25:205-210
087H3T7HRM
SNP
087H3T7
SNP
158K24HRM
SNP
L4SC340
Yang et al. (2009) Mol. Breeding 24: 433
AFLP → SCAR
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para gen L4 (resistencia a patotipo
123 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 4 y funciona 1
L4SC340. Marcador SCAR (Mol. Cells (2008) 25:205-210)
Derio X VR(L4)
Proporción esperada:50%Resi-50%Sensi
Plantas con marcador=41/89=46%
Ibarroria X VR(L4)
Proporción esperada: 50%Resi-50%Sensi
Plantas con marcador=39/91=43%
Controles negativos: Derio, Ibarroria. Controles positivos: VR(L4)
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
1. Encontrar marcadores moleculares para gen L4 (resistencia a patotipo
123 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 4 y funciona 1
Marcadores SNP 087H3T7HRM, 087H3T7, 158K24HRM (Mol. Breeding
(2009) 24: 433)
Marcadores SNP 087H3T7HRM, 087H3T7, 158K24HRM codominantes para gen L4.
Cultivares: D=Derio; I=Ibarroria; P=VR(L3); G=VR(L4); K=VR2(L3); M=VR3(L3).
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
2. Comprobar resistencia mediante inoculación de plantas con el virus
(Fenotipado). Puesta a punto de la técnica. Objetivo metodológico.
A) Preparación inóculo del virus PMMoV
B) Inoculación mecánica virus PMMoV. Invernadero seguridad P2
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención
de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Cultivo 2016 para Retrocruzamiento1 (RC1). Plantas seleccionadas (20)
64 7463 72
16 62 7161 IPP2.F2 6660 5159 47
15 58 46 IBARRORIA X PALERMO (L3)57 IPP2.F1 4556 4055 39
14 54 3153 IPP1.F3 3052 1351 12 Transplante 22-03-16
13 50 6 (se desconoce si marcador L3)
49 IPP1.F1 2 (se encuentra presente)
48 7 Transplante 15-04-16
47 5 (se conoce si marcador L3)
12 46 2 (se encuentra presente)
45 DPP5.F1 144 7843 66
11 42 68 DERIO X PALERMO (L3)41 DPP10.F2 6240 4739 46
10 38 4837 IBARRORIA DPP10.F1 4136 3435 25
9 34 2433 DPP9.F4 3332 9131 IBARRORIA DERIO 90
8 30 8729 IGP1.F10 8228 7727 70
7 26 64 IBARRORIA X GIULIO (L4)25 IGP1.F9 6224 5623 49
6 22 42 Transplante 09-02-16
21 IGP1.F8 41 (resistentes con marcador L4)
20 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 3719 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 31
5 18 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 2417 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 IGP1.F7 2216 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 9715 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 94
4 14 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 9113 DERIO X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 DGP22.F2 8112 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 7611 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 72
3 10 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 66 DERIO X GIULIO (L4)9 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 DGP19.F9 658 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 577 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 51
2 6 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 505 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 DGP19.F7 424 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 113 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 9
1 2 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 61 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 DGP16.F6 1
Planta FILA 1 FILA 2 FILA 3 FILA 4
Saco culivo COMPARTIMENTO 2 MULTI PLACA RÍGIDA ENTRADA PseudoF1 resistentes plantas
nºmax / = = 44 / 5 = 8
nº = 5 por programa (cv-gen) = 5 lineas (cv.-gen)
Consigna calefacción: 12ºC(18-8h) a 18ºC (8-18h)
Consigna ventana: 18ºC (20-8h) a 20ºC (8-20h)
Hidropónico sustrato coco
Riegos 4-5 min (3-4/día)
CE=1.5, pH=5.5
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención
de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Plantas escogidas como polinizadoras para Retrocruzamiento1 2016
PseudoF1_Derio X VR(L4) PseudoF1_Derio X VR(L3)
PseudoF1_Ibarroria X VR(L4) PseudoF1_Ibarroria X VR(L3)
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención
de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4.
PseudoF1_Derio X VR(L4) PseudoF1_Derio X VR(L3)
PseudoF1_Ibarroria X VR(L4) PseudoF1_Ibarroria X VR(L3)
Plantas PseudoF1 escogidas como polinizadoras para Retrocruzamiento1
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención
de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4.
PseudoF1_Derio X VR(L4) PseudoF1_Derio X VR(L3)
PseudoF1_Ibarroria X VR(L4) PseudoF1_Ibarroria X VR(L3)
Plantas PseudoF1 escogidas como polinizadoras para Retrocruzamiento1
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención
de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Semilla de Retrocruzamiento1 (RC1) 2016 (180 frutos-11389 semillas)
CRUCE Planta Fruto Nº SemillasF. PolinizaciónF. Recolección Días polin-recolec
nº plantas
repicadas
nº pl
genotipado
nº pl
inoculación
Derio x Giulio 1 1 112 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20
Derio x Giulio 2 1 228 29/07/2016 26/09/2016 59 40 20 20
Derio x Giulio 3 1 210 10/08/2016 10/10/2016 61 40 20 20
Derio x Giulio 4 1 172 05/08/2016 26/09/2016 52 40 20 20
Derio x Giulio 5 1 224 10/08/2016 10/10/2016 61 40 20 20
Derio x Palermo 1 1 144 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20
Derio x Palermo 2 1 191 28/07/2016 20/09/2016 54 40 20 20
Derio x Palermo 3 1 108 29/07/2016 20/09/2016 53 40 20 20
Derio x Palermo 4 1 136 10/08/2016 10/10/2016 61 33 16 17
Derio x Palermo 5 2 191 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20
Ibarroria x Giulio 1 1 71 05/08/2016 20/09/2016 46 40 20 20
Ibarroria x Giulio 2 1 100 29/07/2016 20/09/2016 53 40 20 20
Ibarroria x Giulio 3 1 79 05/08/2016 20/09/2016 46 40 20 20
Ibarroria x Giulio 4 1 129 29/07/2016 26/09/2016 59 40 20 20
Ibarroria x Giulio 5 1 25 25/05/2016 16/08/2016 83 40 20 20
Ibarroria x Palermo 1 1 74 28/07/2016 20/09/2016 54 40 20 20
Ibarroria x Palermo 2 2 40 17/08/2016 10/10/2016 54 23 15 15
Ibarroria x Palermo 3 1 82 29/07/2016 20/09/2016 53 40 20 20
Ibarroria x Palermo 3 2 79 29/07/2016 20/09/2016 53 40 20 20
Ibarroria x Palermo 4 1 63 17/08/2016 10/10/2016 54 27 15 12
Derio x VR(L4)
Derio x VR(L3)
Ibarroria x VR(L4)
Ibarroria x VR(L3)
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
4.Genotipado con marcadores moleculares para seleccionar plantas
resistentes de 2ª generación (RC1). Mantenimiento de 20 líneas (5
GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4).
Semillero plantas de Retrocruzamiento1 (RC1) Noviembre 2016 (20 líneas)
DP1 IG1 DG1 IP1
RC1. 20 LÍNEAS
Gernika (L3): DP1-DP5
Guindilla (L3): IP1-IP5
Gernika (L4): DG1-DG5
Guindilla (L4): IG1-IG5
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
5. Comprobar resistencia mediante inoculación del virus en 2ª generación
(RC1). 20 líneas x 20 pl/línea: patotipo 1-2 (5 GernikaL3, 5 GuindillaL3) y
patotipo123 (5 GernikaL4, 5 GuindillaL4)
C) Inoculación mecánica virus PMMoV. Valoración síntomas 4-7 semanas
1) Planta sensible 2) Planta resistente 3) Escape inoculación
Mosaico
Deformación
Necrosis
Enanismo
Sin síntomas Sin síntomas
Ho
jas
NO
ino
cu
lda
s
Ho
jas
ino
cu
lda
s
Sín síntomas Puntos necróticos
Necrosis nervios
Abscisión
Sin síntomas
Respuesta Hipersensibilidad Infección sistémica
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
6. Comprobar si gen L4 en homocigosis dá problemas de androesterilidad
y mal cuajado de frutos. Obtención PseudoF2 (1ªautofecundación de
plantas resistentes de PseudoF1). Inoculación virus para comprobar
resistencia en 10 líneas: (DG1-DG5, IG1-IG5). ¿Se puede obtener variedad
fijada con resistencia a patotipo 123 o hay que obtener híbrido cada año?
1. PseudoF2 Semillero Ago-2016
(10 líneas: DG1-DG5, IG1-IG5) 2. Plantas PseudoF2 Inoculación
Sep-2016 (10 líneas x 40 pl/línea)
3. Plantas PseudoF2 sín síntomas
(10 líneas x 5 pl/línea) Nov-2016 Junio 2017→ Obtener PseudoF3
(2ªautofecundación de plantas
resistentes de PseudoF2).
Máximo 30 líneas a comprobar
resistencia
OBJETIVOS -TAREAS 2016.
7. Solicitud proyecto GO liderado por GILBE en el que intervienen GILBE-
BIHOEL-NEIKER y participan SSVV y HAZI. Junio 2016
Denegado en noviembre 2016.
Grupo de trabajo que se planteaba para realizar tareas adicionales como:
Protocolo manejo medidas higiene a consensuar por participantes.
Entrega de semilla del material vegetal de mejora obtenido para
evaluar su resistencia en campo en ensayos en fincas piloto de
agricultores afectados por Tobamovirus.
Desarrollo, validación y transferencia de técnica de análisis simultáneo
a múltiples virus en pimiento (polisonda 15 virus).
SOLICITANTES PARTICIPANTES
Conclusiones
Se han puesto a punto marcadores moleculares para los dos genes de
resistencia a introducir (L3 para patotipo 1-2 y L4 para patotipo 1-2-3).
Esto ha permitido seleccionar plantas resistentes en la primera generación
de híbridos obtenida (PseudoF1) y comenzar en la segunda (RC1).
En la Pseudo F1 se han seleccionado 20 líneas. Por cada uno de los 4
cruzamientos se han obtenido 5 líneas considerando la morfología del
fruto mas parecida a los parentales de interés (cv. Derio y cv. Ibarroria).
Se ha comenzado la puesta a punto metodológica de inoculación de los
dos patotipos de Tobamovirus (1-2 y 1-2-3) para comprobar la
expresión de resistencia en las plantas genotipadas como resistentes.
Se ha comenzado a comprobar si el gen L4 en homocigosis puede causar
problemas de androesterilidad y posterior mal cuajado de frutos en la
PseudoF3 (10 líneas, Gernika: DG1-DG5, Guindilla: IG1-IG5). Esto
permitirá determinar si se podrían obtener variedades fijadas con
resistencia al patotipo 1-2-3 o habría que obtener híbridos cada año.
MILA ESKER ZUEN ARRETAGATIK!
¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!