reevaluando el papel de los linfocitos t cd4+: de la
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Facultad de Medicina
Departamento de Biomedicina
REEVALUANDO EL PAPEL DE
LOS LINFOCITOS T CD4+:
DE LA ALORESPUESTA A LA RESPUESTA
INMUNE ANTI-LEUCEMIA
Europa Azucena González Navarro
Tesis doctoral
2019
Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud
Programa de Doctorado en Biomedicina
Departamento de Biomedicina
REEVALUANDO EL PAPEL DE LOS LINFOCITOS T CD4+: DE
LA ALORESPUESTA A LA RESPUESTA INMUNE ANTI-
LEUCEMIA
Memoria presentada por Europa Azucena González Navarro para optar
al grado de Doctora por la Universitat de Barcelona.
Doctoranda:
Fdo: Europa Azucena González Navarro
Fdo: Dr. Manel Juan Otero
Director de la Tesis
Barcelona, 30 septiembre de 2019
A mis padres,
Amparo y Juan Matías
por tanto amor
y por ser mis maestros de la vida
AGRADECIMIENTOS
Me gustaría dedicar unas líneas de agradecimiento a todas aquellas personas que han
contribuido a que esta Tesis haya sido posible.
Especialmente, a mi director de Tesis, al Dr. Manel Juan. Gracias por darme la oportunidad
de hacer lo que más me gusta. Por permitirme vivir la aventura de Seattle y por dejarme
hacer todas las “azucenadas” que se me pasaban por la cabeza
Carles; Gracias por ser un hermano mayor, enseñarme, ayudarme y cuidarme desde el
primer día hasta el último, por ser un compañero noble, gran amigo y el mejor apoyo que
podía tener.
Al Servicio de Inmunología, Especialmente a Patriche, por los primeros años, por Andorra,
México, Portugal, Berlín... Y a mi solete “la pelirroja”, por ser el mejor refugio de
confidencias, por encontrarte siempre que te busco, por ser una gran amiga y por cada uno
de los momentos compartidos desde el mismísimo primer día en que apareciste.
A mi queridísimo Triángulo del amor, por aparecer siempre que os necesito en forma
terrestre o virtual. Porque vuestros abrazos, vuestro sentido del humor y enorme cariño, os
han hecho impresindible en mi vida.
A mis raíces, mis abuelos, mis hermanas, mis sobris. Esto va por vosotros.
A mis padres, por querer siempre lo mejor para nosotras, por darnos todo lo que teníais y lo
que no teniais, porque no nos faltase nada, por vuestro esfuerzo.
ÍNDICE
Y después de todo…
resulta que las pistas
eran el tesoro.
Guille Galván
ÍNDICE
1
ABREVIATURAS.......................................................................................................9
I. INTRODUCCIÓN
1. Inmunidad adaptativa ................................................................................................... 15
1.1. Activación de los linfocitos t preinmunes (naïve o vírgenes) ........................... 16
1.2. Linfocitos efectores y de memoria ............................................................................... 16
1.2.1. Linfocitos efectores.........................................................................................................................17
1.2.2. Linfocitos de memoria ...................................................................................................................17
1.3. Linfocitos T citotóxicos ..................................................................................................... 18
1.4. Linfocitos T cooperadores ............................................................................................... 19
2. Activación de la respuesta inmunitaria ................................................................... 21
2.1. Procesamiento antigénico ............................................................................................... 21
2.2. Receptor de células T (TCR) ........................................................................................... 23
2.3. Moléculas co-señalizadoras ............................................................................................ 26
3. Moléculas HLA ................................................................................................................... 29
3.1. Características de las moléculas MHC ........................................................................ 30
3.1.1. Polimorfismo .....................................................................................................................................30
3.1.1.1. Selección balanceadora .....................................................................................................30
3.1.1.2. Desequilibrio de ligamiento ............................................................................................31
3.1.1.3. Paralogia o duplicación génica.......................................................................................31
3.1.2. Poligenia ..............................................................................................................................................32
3.1.3. Codominancia ....................................................................................................................................32
3.2. Genética de las moléculas HLA ...................................................................................... 32
3.2.1. Región MHC clase I ..........................................................................................................................33
3.2.2. Región MHC clase II ........................................................................................................................34
3.3. Importancia de las cadenas DRB3, DRB4 y DRB5 .................................................. 36
3.4. Interacción HLA-péptido-TCR ........................................................................................ 37
3.5. Regulación de la expresión de las moléculas HLA-II ............................................ 39
3.6. HLA y enfermedad .............................................................................................................. 40
3.6.1. Esclerosis múltiple ..........................................................................................................................42
3.6.2. Diabetes Mellitus tipo I (DM-1) .................................................................................................42
3.6.3. Trombopenia neonatal aloinmune ..........................................................................................43
3.7. Inmunogenicidad de las moléculas HLA en el trasplante ................................... 43
3.8. Nomenclatura de las moléculas HLA ........................................................................... 44
4. Inmunología frente a la infección .............................................................................. 45
4.1. Gripe ......................................................................................................................................... 46
5. Inmunología del cáncer ................................................................................................. 49
ÍNDICE
2
5.1. Microambiente tumural .................................................................................................... 50
5.2. Inmunoedición del cáncer ............................................................................................... 51
5.3. Antígenos tumorales .......................................................................................................... 53
5.3.1. Antígenos embrionarios ...............................................................................................................53
5.3.2. Antígenos sobreexpresados ........................................................................................................53
5.3.3. Antígenos de diferenciación .......................................................................................................54
5.3.4. Antígenos de virus oncógenicos................................................................................................54
5.3.5. Neoantígenos .....................................................................................................................................55
5.4. Mecanismos de evasión .................................................................................................... 56
5.4.1. Modulación de la expresión de antígenos ............................................................................56
5.4.2. Alteraciones en la expresión MHC-I ........................................................................................56
5.4.3. Células inmuoreguladoras y secreción de citoquinas .....................................................57
5.4.4. Moléculas inhibitorias ...................................................................................................................58
5.4.5. Defectos en la señalización mediada por TCR ....................................................................58
6. Melanoma ........................................................................................................................... 58
6.1. Melanoma infantil ............................................................................................................... 60
7. Leucemia linfática crónica (LLC) ................................................................................ 60
7.1. Características de la LLC .................................................................................................. 61
7.2. Inmunología en la LLC ....................................................................................................... 62
7.3. Tratamiento de la LLC ....................................................................................................... 63
8. Estrategias de inmunoterapia ..................................................................................... 63
8.1. Linfocitos infiltrantes de tumor (TILs)....................................................................... 64
8.2. Terapia celular adoptiva con terapia génica ............................................................ 65
8.3. Anticuerpos inmunomoduladores ............................................................................... 66
8.4. Vacunas terapéuticas ......................................................................................................... 66
9. Monitorización de la respuesta inmunitaria ......................................................... 68
9.1. Fenotipificación mediante citometría ......................................................................... 68
9.2. Estudio de neoantígenos .................................................................................................. 68
9.2.1. Modelos bioinformáticos de predicción de afinidad........................................................68
II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………….…………………………..73
III. MATERIAL Y MÉTODOS
1. Estudio in silico de la afinidad de péptidos por moléculas HLA...................... 77
1.1. Determinación de neopéptidos ..................................................................................... 77
1.2. Tipificación HLA .................................................................................................................. 79
2. Separación celular ........................................................................................................... 79
ÍNDICE
3
3. Cultivos celulares ............................................................................................................. 79
4. Antígenos ............................................................................................................................ 80
4.1. Péptidos ................................................................................................................................... 80
4.2. Líneas celulares primarias .............................................................................................. 80
5. Separación de poblaciones ........................................................................................... 80
5.1. Linfocitos T CD4+ o con depleción de LT CD4+ CD25+ ....................................... 80
5.2. Linfocitos T en poblaciones ricas en linfocitos B ................................................... 81
6. Producción de tetrámeros HLA de clase II ............................................................. 81
7. Cultivos ................................................................................................................................ 83
7.1. Cultivos in vitro .................................................................................................................... 83
7.2. Estudios ex vivo .................................................................................................................... 83
8. Expansión rápida de linfocitos (REP) ....................................................................... 84
9. Estudio de citotoxicidad ................................................................................................ 85
10. Marcaje y detección de antígenos celulares por citometría de flujo ........ 86
10.1. Antígenos de superficie .................................................................................................... 86
10.2. Antígenos intracelulares .................................................................................................. 86
10.3. Tinción de linfocitos Tregs .............................................................................................. 87
10.4. Marcaje con tetrámeros .................................................................................................... 87
11. Obtención de células dendríticas .......................................................................... 89
12. Elispot ............................................................................................................................. 90
13. Secuenciacion del repertorio TcR ......................................................................... 91
14. Estudio antígeno aislado mediante Luminex® ................................................ 92
15. Cuantificación del CNV de DRB3, DRB4 y DRB5 ............................................... 92
16. Estadística...................................................................................................................... 93
IV. RESULTADOS
1. Aproximación a una terapia personalizada en pacientes con leucemia
linfática crónica (LLC) ............................................................................................................. 97
1.1. Frecuencias alélicas de los pacientes con LLC respecto a una población
control 97
1.2. Definición informática de los neopéptidos del “mutanoma” en base a
niveles de afinidad frente a las moléculas HLA específicas de cada paciente ......... 102
1.2.1. Definición del “mutanoma” en pacientes con LLC ......................................................... 102
1.2.2. “Mutanoma” específico en los pacientes con LLC .......................................................... 110
1.2.3. Caracterización de los neopéptidos en la LLC ................................................................. 116
ÍNDICE
4
1.2.4. Comparación de las frecuencias de los neopéptidos y las frecuencias de los
pacientes ............................................................................................................................................................ 119
2. Estudio de inmunogenicidad de los linfocitos Tc y Th frente a los
neopéptidos seleccionados ................................................................................................. 121
2.1. Selección de péptidos para el estudio de inmunogenicidad ........................... 122
2.2. Estudio de inmunogenicidad mediante la producción de INF-γ ................... 124
2.3. Estudio de inmunogenicidad mediante el aumento de expresión de CD137
y CD154 ................................................................................................................................................ 126
3. Estudio de la evolución del repertorio celular T como parámetro para la
monitorización de la respuesta anti-tumoral .............................................................. 132
3.1. Estudio del repertorio TCR en pacientes con melanoma infantil tratados
con anti-PD1 y respuesta completa .......................................................................................... 132
3.2. Caracterización de los neopéptidos generados por simulación a partir de
las mutaciones somáticas del paciente pediátrico con melanoma y alta carga
mutacional .......................................................................................................................................... 139
3.3. Estudio del repertorio TcR en un paciente con melanoma y respuesta
completa al tratamiento con terapia celular adoptiva ...................................................... 142
3.3.1. Evolución de la enfermedad y muestras para el estudio ............................................ 143
3.3.2. Estudio de los linfocitos infiltrantes de la zona con albinismo ................................ 143
3.3.3. Evolución de las subpoblaciones linfocitarias tras la ACT ......................................... 144
4. Valoración de la frecuencia en los linfocitos T CD4+ frente a los epítopos
incluidos en la vacuna de la gripe .................................................................................... 145
4.1. Estudio de las frecuencias de los linfocitos específicos frente a péptidos de
la gripe tras la administración de la vacuna ......................................................................... 146
4.2. Estudio del repertorio TcR pre y post administración de la vacuna ........... 147
5. Evaluación de la diversidad de presentacion antígénica mediante
reconocimiento alogénico ................................................................................................... 148
5.1. Estudio de los anticuerpos anti-HLA-DRB para determinar la reactividad
anti-HLA-DRB .................................................................................................................................... 149
5.2. Evaluación de la diversidad de presentación antigénica de los péptidos de
las moléculas HLA-DRB por otros alelos HLA ...................................................................... 152
6. Evaluación de la diversidad en la presentación antigénica derivada del
CNV de las moléculas accesorias de DRB1; DRB3, DRB4 Y DRB5 en diferentes
enfermedades: TNA, esclerosis múltiple y diabetes. ................................................. 157
6.1. CNV en pacientes con Esclerosis Múltiple.............................................................. 157
ÍNDICE
5
6.2. CNV en madres con hijos que han sufrido trombocitopenia neonatal
autoinmune (TNA) ........................................................................................................................... 158
6.3. Capacidad de presentación en función del CNV .................................................. 159
7. Estudio de la frecuencia, especificidad y magnitud de LTh para el epítopo
HPA-1a ........................................................................................................................................ 160
7.1. Selección in silico de los péptidos HPA-1a ............................................................. 160
7.2. Respuesta específica LTh en donantes sanos DRB3*01:01 ............................ 161
7.3. Caracterización de la respuesta de los LTh frente al péptido HPA-1a ....... 162
V. DISCUSIÓN…………………………………………………...……………….167
VI. CONCLUSIONES……………………….……………………………………181
VII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………….185
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
9
aa Aminoácido
AcMo Anticuerpo Monoclonal
ACT Terapia celular adoptiva (Adoptive cell therapy)
Ag Antígeno
APC Célula presentadora de antígeno (Antigen Presenting Cell)
BCR Receptor de células B (B-Cell Receptor)
BSA Albúmina sérica bovina (bovine serum albumin)
CAR Receptor de antígenos quimérico (Chimeric antigen receptor)
CD Grupo de diferenciación
CD40L Ligando de CD40 o CD154
ºC Grados centígrados
CTLA-4 Proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (Cytotoxic T-
lymphocyte-associated protein 4)
DM-1 Diabetes Mellitus tipo I
DC Células dendríticas (dendritic cells)
DL Desequilibrio de ligamiento
DN Doble Negativo
DNA Ácido desoxirribonucleico (Desoxiribonucleic acid)
DMSO Dimetil sulfóxido
dNTPs desoxinucleótidos
DO Densidad óptica
ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay)
ELISPOT Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos
(Enzyme-Linked ImmunoSpot)
FBS Suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum)
-FITC Isotiocianato de fluoresceína
FoxP3 Factor de transcripción forkhead box P3
g Fuerza g
GM-CSF Factor estimunalnte de colonias de granulocitos y macrófagos
(Granulocyte macrophage colony stimulating factor)
HLA Antígeno leucocitario humano (Human leukocyte antigen)
HLA-I Antígeno leucocitario humano de clase I (Human leukocyte
antigen class I)
ABREVIATURAS
10
HLA-II Antígeno leucocitario humano de clase II (Human leukocyte
antigen class II)
HRP Enzima peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase)
IFN Interferón
Ig Inmunoglobulina
IL Interleuquina
IT Inmunoterapia
ITAM Motivo de activación basado en inmunoreceptores de tirosina
(Immunoreceptor-tyrosine-based activation motif)
ITIM Motivo de inhibición basado en inmunoreceptores de tirosina
(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)
kDa Kilodalton
LB Linfocito B
LFA-1 Antigeno-1 asociado a la función del linfocito (Lymphocyte
function-associated antigen 1)
LPS Lipopolisacárido
LT Linfocito T
LTc Linfocito T citotóxico
LTh Linfocitos T cooperadores (Lymphocyte T helper)
MDSC Células supresoras de origen mieloide (myeloid-derived
suppressor cells)
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad
MHC-I Complejo mayor de histocompatibilidad de tipo I
MHC-II Complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II
MFI Intensidad media de la fluorescencia (Mean Fluorescente
Intensity)
Mill Millones
min Minutos
mM Milimolar
Mpb Mega pares de bases
μM Micromolar
mRNA RNA mensajero
NGS Secuenciación masiva (Next Generation Sequencing)
NK Linfocitos asesinos naturales (natural killer)
ABREVIATURAS
11
NKT Linfocitos T asesinos naturales (natural killer T lymphocytes)
nt nucleótido
OR Razón de probabilidad (odds ratio)
OG n-Octyl β-D-Glucopyranoside
pb Pares de bases
PBLs Linfocitos de sangre periférica (peripheral blood lymphocytes)
PBMCs Células mononucleares de sangre periférica (Peripheral blood
Mononuclear Cells)
PBS Tampón fosfato salino (Phosphate Buffered Saline)
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
RT-PCR PCR a tiempo real (Real Time PCR)
PCR-SSP PCR-cebadores específicos de secuencia
PCR-SSO PCR-oligosondas específicas de secuencia
PCR-SBT PCR-tipificación basada en la secuenciación
PGE-2 Prostaglandina E-2
PD-1 Receptor de muerte celular programada 1 (Programmed cell
death 1)
PD-L1 Ligando de muerte celular programada 1 (Programmed cell
death ligand 1)
-PE Ficoeritrina (phycoerithrin)
-PerCP Proteína clorofila peridinina
PGN Peptidoglicano
PHA Aglutinina de phaseolus vulgaris (phytohemaglutin)
PMA Forbol-12-miristato-13-acetato (Phorbol Mystrate Acetate)
Poli (I:C) Ácido poliinosinico policitidilico
p-MHC Complejo formado entre la molécula MHC y un péptido
qPCR PCR cuantitativa (quantitative PCR)
RE Retículo endoplasmático
RNA Ácido ribonucleico
RR Riesgo relativo
rpm Revoluciones por minuto
s segundos
SB Unión fuerte (strong bining)
SFC Células formadoras de puntos (Spot forming cells)
ABREVIATURAS
12
SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single Nucleotide
Polymorphism)
T.A Temperatura ambiente
TAP Transportador dependiente de ATP (Transporter associated
protein)
TBE Tris-Borato-EDTA (Tampón de electroforesis)
Tconv Linfocitos T convencionales (CD4+CD25
-)
TCR Receptor de células T (T-Cell Receptor)
TILs Linfocitos infiltrantes del tumor (Tumour Infiltrating
Lymphocytes)
TGEM Mapeado de epítopos guiado por tetrámeros (Tetramer Guided
Epitope Mapping)
TNF Factor de necrosis tumoral (Tumour Necrosis Factor)
Treg Células T reguladoras
VLA-4 Antígeno muy tardío (Very Late Antigen 4)
WB Unión débil (weak binding)
I. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
15
El Sistema Inmunitario es uno de los sistemas orgánicos que nos garantiza la
individualidad, reconociendo nuestro entorno. En los vertebrados está formado por la
inmunidad innata, natural o inespecífica, y la inmunidad adquirida, adaptativa o
específica. La inmunidad innata es un sistema de acción rápido, que representa la
primera línea de defensa del organismo mientras que la inmunidad adaptativa se genera
tras el contacto con los antígenos y, por tanto, es más tardía (1). Los dos tipos de
inmunidad están interrelacionados mediante una compleja red de interacciones, que
permiten su funcionamiento de forma integrada y coordinada en la defensa del
organismo frente a agresiones exógenas (infecciones) y endógenas (cáncer) (2).
1. INMUNIDAD ADAPTATIVA
Las respuestas inmunitarias adaptativas son más tardías que las innatas, y se
caracterizan por su alta especificidad y diversidad frente a moléculas de origen tanto
microbiano, como no microbiano. El componente celular principal de la inmunidad
adaptativa lo constituye los linfocitos que a su vez necesitan para su función diversas
células accesorias, como son las células presentadoras de antígenos (APCs, del inglés
Antigen Presenting Cells). Por un lado tenemos los linfocitos B (LB) que a través de las
inmunoglobulinas (Ig) de membrana actúan como receptores antigénicos que reconocen
antígenos nativos de diferente composición química (1), y se encargan de la respuesta
humoral. Por otro lado, los linfocitos T (LT) se encargan de la respuesta celular y
reconocen antígenos proteicos a través del receptor de células T (TCR, del inglés T cell
receptor); en este caso, los antígenos reconocidos precisan de un
procesamiento/digestión previo hasta obtener pequeños péptidos que puedan asociarse
a moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, del inglés Major
Histocompatibility Complex) (3). Dentro de esta población celular encontramos varias
subpoblaciones, siendo las más generales las células CD4+ o cooperadoras (LTh, del
inglés Lymphocyte T helper) y las CD8+ o citotóxicas (LTc) (1).
INTRODUCCIÓN
16
1.1. Activación de los linfocitos t preinmunes (naïve o vírgenes)
Los linfocitos T sólo pueden reconocer antígenos de naturaleza peptídica
presentados por moléculas MHC expresadas en las APC (1). Las moléculas MHC de
clase I (MHC-I) presentan péptidos a los LTc mientras que las de clase II (MHC-II), los
presentan a los LTh. El receptor que reconoce estos complejos MHC-péptido (p-MHC)
se denomina TCR y está constituido por dos cadenas glicoproteicas (αβ) unidas por
puentes disulfuro, muy similares a las de las inmunoglobulinas (4) e íntimamente
asociadas al complejo CD3 (cadenas ε, γ, δ y ξ) y directamente relacionadas con un co-
receptor, CD4 ó CD8 (5).
La iniciación de la respuesta por parte de los linfocitos T que no han contactado
anteriormente con su antígeno, es decir, linfocitos T preinmunes (también llamados
naïve o vírgenes), tiene lugar en los órganos linfoides secundarios y requiere del
reconocimiento específico del antígeno (péptido) en el contexto de su complejo con la
MHC (p-MHC), la adhesión estable a las APC y la transducción de señales activadoras
al interior de los linfocitos (3). Estas señales son transmitidas por el complejo CD3 y los
co-receptores CD4 o CD8 y se conocen como primera señal. Para que esta unión pueda
llegar a activar un linfocito preinmune es imprescindible la participación de segundas
señales. Estas señales las proporcionan moléculas accesorias como CD28 y moléculas
de adhesión como CD2 y LFA-1 (del inglés Lymphocyte Function Associated Antigen-
1), que ayudan a estabilizar la interacción LT-APC (6) durante la formación de la
Sinapsis Inmunitaria. El bloqueo de la segunda señal induce una activación parcial que
deja al LT anérgico, es decir, en un estado quiescente y refractario a una re-estimulación
posterior (7).
1.2. Linfocitos efectores y de memoria
El reconocimiento del antígeno produce diferentes señales intracelulares que
generan la activación de una pequeña población de linfocitos preinmunes con receptores
específicos para ese antígeno, induciendo una población mucho más amplia de
linfocitos efectores que eliminen el antígeno, lo que se conoce como expansión clonal,
que incluye una población de células de memoria que permanecerán largos periodos de
INTRODUCCIÓN
17
tiempo en el organismo para reactivarse de forma rápida al encontrarse con ese mismo
antígeno de nuevo (1).
1.2.1. Linfocitos efectores
Los linfocitos efectores tienen una vida media corta, reconocen el antígeno en
los órganos linfoides secundarios o en tejidos periféricos gracias a moléculas de
adhesión como VLA-4 (del inglés, Very Late Antigen 4), su activación es más sensible y
habitualmente provocan la eliminación del antígeno (8).
Los linfocitos efectores se caracterizan por expresar diferentes moléculas de
superficie, por las citoquinas que secretan, por los factores de transcripción que
expresan y porque además, son capaces de activar otras células como LBs, macrófagos
y células dendríticas (DCs, del inglés dendritic cells). Las citoquinas producidas por los
linfocitos efectores determinan su función y su papel en la enfermedad, pero estas
citoquinas también pueden amplificar su acción e inhibir el desarrollo de otras
subpoblaciones.
La diferenciación a linfocitos efectores es distinta en LTc y en LTh; de hecho, la
diferenciación de LTc a linfocitos efectores normalmente requiere la participación de
los LTh (9).
1.2.2. Linfocitos de memoria
Los linfocitos de memoria son generados tras la activación celular, de larga vida
y con una “mejor” habilidad de reaccionar contra el antígeno, ya que necesitan menos
requerimientos para ser activados. Los mecanismos que hacen que un linfocito efector
se convierta en un linfocito de memoria no están claramente definidos (1). Tras la
eliminación del antígeno, su número es mayor al de los linfocitos preinmunes que
reconocieron inicialmente al antígeno y activaron la respuesta. Los linfocitos de
memoria están distribuidos por las mucosas, la piel y los órganos linfoides y pueden
sobrevivir meses e incluso años en el organismo. Estos linfocitos responden
INTRODUCCIÓN
18
rápidamente al encontrarse de nuevo con el antígeno generando nuevos linfocitos
efectores para que lo eliminen (10).
La población de LT memoria se regula mediante mecanismos homeostáticos
para mantener a lo largo del tiempo una representación de toda la población.
Fundamentalmente, dos citoquinas son las responsables de dicha homeostasis: IL-7, que
es esencial para la supervivencia de los LT, promoviendo la expresión de proteínas anti-
apoptóticas e IL-15, que se encarga principalmente de la proliferación basal para
mantener la reserva de LT (11).
1.3. Linfocitos T citotóxicos
Los linfocitos T citotóxicos (LTc) se encargan de destruir las células infectadas
por virus y otros patógenos, y las que están dañadas o alteradas, como las células
tumorales (12–14), vía MHC-I, dando lugar a respuestas de muerte celular (citotóxicas).
Cada LTc reconoce específicamente un antígeno diferente que consiste en un
fragmento peptídico de entre 8 y 12 aminoácidos (aa) (15) presentado en la superficie
celular por las moléculas MHC-I. Cuando el LTc contacta con dichas células, se inicia
un proceso que finalmente desemboca en la lisis de la célula diana mediante la
exocitosis de gránulos que contienen principalmente perforinas y granzimas e inducen
la apoptosis de la célula diana a través de la mediación de moléculas inductoras de
muerte celular como Fas y su ligando (16).
El LTc, al activarse, secreta citoquinas como IFN-γ, TNF-α o IL-2, que
contribuyen a la defensa frente al patógeno. Esta activación tiene unos controles muy
estrictos y, por lo general, requiere una señal de activación fuerte por parte del complejo
p-MHC-I además de señales adicionales proporcionadas por los LTh (17,18). Sin
embargo, no siempre la ayuda LTh es imprescindible, existen varios modelos de
activación de LTc en donde las células LTh no participan (19,20).
INTRODUCCIÓN
19
1.4. Linfocitos T cooperadores
Los linfocitos T cooperadores o helper (LTh) desempeñan un papel importante en la
inducción, el mantenimiento y la regulación de las respuestas inmunitarias, ayudando a
determinar qué tipo de respuesta presentará el organismo ante un patógeno concreto
(7,21).
Los LTh se activan cuando reconocen, a través de su TCR, fragmentos
peptídicos de 8 a 23 aa unidos a moléculas de MHC-II. Su función depende del
reconocimiento específico del antígeno en el contexto del MHC-II presentado en la
superficie de las APC además de la expresión, en su membrana, de moléculas co-
estimuladoras, provocando su expansión, la secreción de citoquinas y su diferenciación.
Tras la activación linfocitaria, las células LTh ya diferenciadas, migran desde los
nódulos linfáticos al foco de la infección o inflamación, guiados por factores
quimiotácticos y moléculas de adhesión presentes en los endotelios vasculares de los
tejidos.
Los LTh una vez activados, se pueden diferenciar en subpoblaciones de
linfocitos efectores, funcionalmente diferentes según la influencia de las distintas
citoquinas del ambiente. De esta manera encontramos los linfocitos LTh1, principales
productores de IFNγ, que a su vez activan a los macrófagos y facilitan la eliminación de
patógenos intracelulares. También encontramos los linfocitos LTh2, productores de IL-
4, IL-5, IL10 e IL-13, destinados a ayudar a los LB en la producción de anticuerpos, a la
activación de eosinófilos y a la eliminación de parásitos extracelulares (22). Mientras la
diferenciación de los linfocitos LTh1 se produce en respuesta a IL-12 inducida por
microorganismos que infectan o activan macrófagos y células NK, la diferenciación de
los linfocitos LTh2 se produce en respuesta a IL-4 inducida por helmintos y alérgenos,
que activan mastocitos y eosinófilos (7). Otra subpoblación de LTh son los LTh17,
inducidos en presencia de IL-6 y TGF-β, que secretan IL-17, IL-22 e IL-21 y que tienen
un papel relevante en el control de la respuesta a bacterias extracelulares y hongos (23).
Los LTh17 están implicados en procesos inflamatorios y en el desarrollo de
determinados fenotipos autoinmunes (24). Además de las subpoblaciones citadas,
encontramos otros subtipos de LTh efectores, como los llamados LTFH o foliculares, por
su localización en los centros germinales, y encargados de activar células B y la
respuesta humoral subsiguiente (25). Otros dos subtipos de linfocitos son los LTh9 y
INTRODUCCIÓN
20
LTh22, caracterizados por la producción de IL-9 e IL-22, respectivamente. Pese a que
su función no se ha descrito totalmente, ambos subtipos se han relacionado con la
inmunidad anti-tumoral y procesos alérgicos y autoinmunes (26).
Existe además una subpoblación de LT CD4+CD25+FoxP3+, conocidas como
células T reguladoras (Treg), con funciones inmunosupresoras o reguladoras de la
respuesta inmunitaria y que juegan un papel fundamental en los procesos de tolerancia
periférica (27,28). A pesar de que aún no están totalmente claros sus mecanismos de
acción, la mayoría de los estudios en humanos y ratones concluyen que las Treg llevan a
cabo su efecto supresor mediante un mecanismo dependiente del contacto directo
célula-célula aún desconocido (29), pero dependiente de TGF-β e IL-10 (30,31). Para
que una célula LTh preinmune se diferencie a Treg, es necesaria la presencia de TGF-β
en su ntorno (Fig. I1).
Figura I1: Subpoblaciones de linfocitos efectores TH. Las células de tipo 1 (Th1), tipo 2 (Th2), tipo 17 (Th17),
células reguladoras (Treg) se generan según las citoquinas producidas por los macrófagos, DC y otros subtipos
celulares. Adaptado de (32).
INTRODUCCIÓN
21
Es importante mencionar que en determinadas circunstancias
un ambiente dominado por determinadas citoquinas puede evolucionar y cambiar las
subpoblaciones allí presentes, sugiriendo que se trata de un proceso dinámico.
Asimismo, dentro de una misma subpoblación, podemos encontrar diferentes patrones
de producción de citoquinas (33).
2. ACTIVACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA
2.1. Procesamiento antigénico
La respuesta inmune adaptativa se inicia con una interacción temprana entre el
antígeno y la célula inmunitaria. Las APCs son quimio-atraídas hacia el sitio de
exposición del antígeno, capturan antígenos propios y ajenos que son procesados y
presentados en su superficie en forma de péptidos cortos unidos a las moléculas MHC,
para poder ser reconocidos por los LT (34). Las APC se diferencian a un estado de
maduración que les permite migrar hacia los órganos linfoides secundarios.
Dependiendo del tipo de antígeno, tendrá un procesamiento diferente y será presentado
en las moléculas MHC-I o MHC-II (35,36).
Los antígenos endógenos, como proteínas propias, proteínas intracelulares derivadas
de un patógeno que ha infectado la célula (virus, bacterias, protozoos), o proteínas
inducidas durante el desarrollo de un tumor, se degradan en el citoplasma de la APC por
un complejo enzimático multiprotéico llamado proteosoma. Algunos de los fragmentos
peptídicos generados, son trasportados mediante un transportador dependiente de ATP,
TAP (del inglés, Transporter associated protein) desde el citoplasma hasta el retículo
endoplasmático, donde se unen a las moléculas MHC-I. El complejo pasa a través del
aparato de Golgi antes de llegar a la superficie celular, donde serán reconocidos por los
los LTc a través de su TCR. Tras el reconocimiento y con ayuda de los LTh1, los LTc
van a producir citoquinas y a lisar las células diana, en lo que se denomina fase efectora
de eliminación del antígeno (Fig. I2).
INTRODUCCIÓN
22
Figura I2: Procesamiento antigénico mediante la vía MHC de clase I y II. También se muestra la presentación
alternativa o cross presentation por la que péptidos del medio exógeno son presentados por moléculas HLA-I.
Adaptado de (36).
Los antígenos exógenos son captados e internalizados en endosomas por APCs
especializadas, y se procesan a través de la ruta endocítica. Estos antígenos se degradan
mediante enzimas proteolíticas que actúan a pH ácido en el interior de vesículas
endocíticas, donde se unen con las moléculas MHC-II. Finalmente, el complejo es
transportado a la superficie celular para ser presentado a los LTh. Este complejo forma
una unión estable que puede permanecer varios días en la superficie celular (Fig. I2).
Existen antígenos pertenecientes a microorganismos que no infectan a las APCs o
que se expresan en tumores de poblaciones celulares diferentes a las APC. Para que se
produzca la presentación en MHC-I de dichos antígenos, se ha postulado una vía
alternativa: la presentación cruzada (cross-presentation), en la que los antígenos de la
vía exógena pasan a la vía endógena. Se cree que dichos microorganismos, células o
componentes celulares son capturados por APC profesionales y procesados mediante
mecanismos que pueden ser tanto dependientes como independientes del proteasoma.
INTRODUCCIÓN
23
De este modo, los antígenos son presentados a través del MHC-I de una APC al LTc
(37,38) (Fig. I2).
2.2. Receptor de células T (TcR)
El receptor de células T o TCRαβ, es un heterodímero que está formado por dos
cadenas polipeptídicas transmembrana, denominadas α y β, unidas de forma covalente
entre sí mediante puentes disulfuro. Hay una subpoblación minoritaria de células T
innatas o TCRγδ cuyo receptor está formado por heterodímeros con dos cadenas
diferentes, γ y δ. Los genes que codifican las cadenas alfa y beta del TCR están
formados a partir de la unión de elementos génicos separados. Gracias a este proceso, se
genera una enorme diversidad de receptores. Así, varias combinaciones de diferentes
cadenas Vα y Jα pueden codificar alrededor de 5000 diferentes cadenas TCRα (39);
además del reagrupamiento génico, diferentes nucleótidos pueden ser añadidos o
eliminados, resultando en una considerable variabilidad en la secuencia del DNA y por
tanto de la secuencia de aminoácidos (40). Esta región hipervariable se incluye dentro
de la región conocida como CDR3 de la cadena TCRα. Estas incorporaciones aleatorias
pueden ocurrir en varios órdenes de magnitud en un organismo, llegando hasta 107(41).
Un fenómeno similar ocurre en la cadena TCRβ, por lo que se obtienen una gran
cantidad de secuencias de la cadena TCRβ. Estos reordenamientos génicos hacen que
sean, junto a los de las inmunoglobulinas, los genes más hipervariables que se
encuentran en la naturaleza (40). La capacidad de generar esta multitud de
reagrupamientos explica por qué los TCRs son tan variables y capaces de reconocer
diferentes patógenos (Fig. I3).
INTRODUCCIÓN
24
Figura I3: Esquema del reordenamiento del gen TCR e interacción entre el MHC y el receptor TCR. El
esquema comienza en la configuración de la línea germinal, seguido por el reordenamiento del gen V-DJ. La
configuración de TCR reordenada se transcribe y se traduce en un monómero de proteína, que se combina con su
homólogo de proteína monomérica para formar un TCR funcional que interacciona con un péptido procesado y
presentado por una molécula MHC. Adaptado de (42)
Cada cadena αβ (o γδ) está constituida por un dominio variable (V) N-terminal,
encargado de reconocer el complejo p-MHC, y un dominio constante (C), ambos de tipo
inmunoglobulínico. También dispone de un dominio transmembrana hidrófobo y una
pequeña cola citoplasmática. Este módulo central no dispone de capacidad transductora
de señales intracelulares por sí mismo. Las cadenas αβ (o γδ) están asociadas de forma
no covalente a las cadenas ε, γ, δ y ξ del complejo CD3, que constituye el módulo
facilitador de la transmisión de señales al interior de la célula (43,44). De esta manera,
las cadenas CD3 vinculan el reconocimiento del p-MHC por el TCR con los procesos
bioquímicos que producen la activación funcional de los LT.
El TCR inicia la señalización reclutando y activando las enzimas PTKs (del
inglés Protein Tyrosin Kinases) de las familias Src (Lck y Fyn), Syk (Zap-70, del inglés
Zeta-chain associated protein-70) y Tec (Itk), que se asocian a la región citoplasmática
de las moléculas CD4 o CD8 y CD3. La PTK Lck se asocia constitutivamente al
receptor CD4 o CD8 y fosforila los motivos ITAM (del inglés, Immunoreceptor-
INTRODUCCIÓN
25
tyrosine-based activation motifs) de las cadenas CD3 permitiendo el reclutamiento de
ZAP-70 a través de sus dominios SH2 (del inglés, Src-Homolgy 2). La enzima ZAP-70
unida, se convierte en sustrato para las enzimas Lck y Fyn próximas, que fosforilan
tirosinas específicas de ZAP-70 (3). En consecuencia, ZAP-70 adquiere actividad
enzimática propia y fosforila proteínas adaptadoras como LAT (del inglés, Linker for
Activation of T cells), que a su vez recluta otras proteínas adaptadoras como SLP-76
(del inglés, Src-Homology 2 domain-containing Leukocyte Protein of 76 kDa) (44). Las
proteínas adaptadoras se convierten en puntos de anclaje para enzimas celulares como
PLC-γ1 (del inglés, Phospholipase C-γ1) y pequeñas proteínas G intercambiadoras de
nucleótidos de guanina (Ras, Rac, Vav). Finalmente aumentan los niveles de Ca+2
citosólico y se activa la vía de las MAPK (del inglés, Mitogen-Activated Protein
Kinases). Esta activación, enumerada de manera general, da lugar a la síntesis y
activación de factores de transcripción (NFAT, NFkB, AP-1), que estimulan la
expresión de diversos genes (como, por ejemplo, IL-2) (Fig. I4).
Figura I4: Esquema de la señalización desencadenada por el reconocimiento de complejos p-MHC vía
TCR/CD3. El modelo describe la señalización proximal y las siguientes respuestas inducidas por el TCR tras el
reconocimiento de los complejos p-MHC que genera la activación del LT. Adaptado de (45)
INTRODUCCIÓN
26
2.3. Moléculas co-señalizadoras
La participación de señales facilitadas por moléculas accesorias, además de las
señales inducidas por el propio antígeno, es imprescindible para que los LT puedan
diferenciarse. Estas moléculas pueden complementar las primeras señales generadas por
el complejo TCR/CD3 y/o ayudar a estabilizar y madurar la sinapsis entre APC-LT,
proporcionando el tiempo necesario para que la señalización vía TCR/CD3 dé lugar a la
activación linfocitaria (46). Las moléculas co-señalizadoras no pueden activar a los
linfocitos por sí mismas (47), necesitan la participación del TCR.
Las moléculas co-señalizadoras se han descrito como receptores de membrana
que transmiten señales intracelulares a la célula T; pueden estar constitutivamente
expresadas o ser inducibles, modular positivamente (co-estimuladoras) o negativamente
(co-inhibidoras) la señalización procedente del TCR/CD3 y llegan a informar sobre el
lugar de acción de éstos. El repertorio de moléculas co-señalizadoras es muy diverso y
está sujeto a cambios en el microambiente celular. Aunque actualmente se han descrito
moléculas co-señalizadoras para casi todos los tipos celulares (48), su expresión se ha
caracterizado sobre todo en APC, ya que son las principales responsables de la
activación de los LT.
La mayoría de estas moléculas son miembros de la Superfamilia de las Igs (Ig-
SF), de la Superfamilia de los Receptores del TNF (TNFR-SF) y de la superfamilia de
los ligandos del TNF (TNFL-SF). Dentro de la Ig-SF encontramos CD28 y sus ligandos
B7.1/CD80 y B7.2/CD86 (49). CD28 es el prototipo de molécula co-estimuladora, se
encuentra expresada constitutivamente en más del 90% de LTh y en el 50% de LTc (1)
y su dominio intracelular tiene un motivo basado en tirosinas de unión a PI3K (del
inglés, Phosphatidilinositol 3-Kinase), que a su vez interacciona con PKB (del inglés,
Protein Kinase B). Tras la interacción de CD28 con sus ligandos B7.1/CD80 y
B7.2/CD86 expresados en APCs, este complejo promueve la proliferación y
supervivencia de las células T, activando otras moléculas distales como el factor de
transcripción NFAT (del inglés, Nuclear Factor of Activated T cells) (50). Sin la unión
de CD28 a uno de sus ligandos, la señalización a través del TCR es ineficaz y se traduce
en un estado de parálisis o anergia (falta de respuesta específica).
INTRODUCCIÓN
27
Dentro de la misma familia encontramos la molécula co-inhibidora
CD152/CTLA-4 (del inglés, Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) expresada de
forma inducible en linfocitos T activados y que comparte con CD28 los mismos
ligandos (B7.1/CD80 y B7.2/CD86). La mayor afinidad de CD152/CTLA-4 por las
moléculas B7, hace que desplace a CD28 atenuando la co-estimulación inducida por
este último. Además, la cola citoplasmática de CD152/CTLA-4 presenta motivos de
inhibición basados en tirosinas ITIM (del inglés, Immunoreceptor Tyrosine-based
Inhibitory Motif) que reclutan tirosinfosfatasas que defosforilan residuos del complejo
TCR-CD3ζ y reducen la señalización vía TCR/CD3. En conjunto, CD152/CTLA-4
bloquea la progresión del ciclo celular y la producción de citocinas (51).
Además de éstas, dentro de la Ig-SF existen otras moléculas inducibles que
ejercen una función co-estimuladora (como por ej. ICOS) o inhibitoria (como por ej.
PD-1). La molécula ICOS (del inglés, Inducible T-cell COStimulator) se expresa en
células T activadas. Su ligando ICOS-L (CD275) se expresa en células B, monocitos,
DCs, fibroblastos y células endoteliales. A diferencia de su homólogo CD28, la co-
estimulación vía ICOS no induce la proliferación de LT, sino que regula la función
efectora de las células T (por ej. LTh1 y LTh2) y, parece tener un papel fundamental en
la respuesta humoral, particularmente en la reacción en el centro germinal (52).
Otro ejemplo de creciente interés es la molécula PD-1 (del inglés, Programmed
cell death-1). PD-1 libera señales inhibidoras una vez interacciona con sus dos ligandos
PD-L1 y PD-L2. Esta molécula, así como sus ligandos, se encuentran ampliamente
expresados y ejercen una gran variedad de funciones moduladoras de la activación de
LT y en el mantenimiento de la tolerancia periférica. De la misma manera, este receptor
también se ha relacionado con la atenuación de procesos infecciosos y en la inmunidad
tumoral, motivo por el que se ha propuesto a PD-1 como diana terapéutica en
determinados contextos de enfermedad (53) y actualmente se utiliza en la práctica
clínica. Otra molécula inhibitoria dentro de la Ig-SF es TIM-3 (del inglés, T cell
immunoglobulin and mucin domain-containing 3) cuyo ligando es Galectina-9. La
interacción entre ambos puede inducir el agotamiento o apoptosis de los LT efectores ya
que inhibe la liberación de IFN por parte de los linfocitos. TIM-3 también participa en
la regulación de los LTh, monocitos y DCs (54). También encontramos dentro de la
misma familia a LAG-3 (del inglés, Lymphocyte activation gene 3), otra molécula
INTRODUCCIÓN
28
inhibitoria que se une a moléculas MHC-II. LAG-3 promueve la tolerancia de células
tumorales ya que bloquea la función de los LT y de las APCs (53).
Dentro de la TNFL-SF, otra de las moléculas co-señalizadoras que aumenta sus
niveles de expresión en superficie tras la activación de los LTh es el ligando de CD40
(CD154). Este ligando interactúa con la molécula CD40 presente en la superficie de las
DC promoviendo su activación (55). Estas interacciones inducen un aumento de la
expresión de MHC y de moléculas de adhesión y co-estímulo (CD40, ICAM/CD54, B7-
1/CD80, B7-2/CD86) en la superficie de las DC, así como la producción de citoquinas
pro-inflamatorias (IL-12, TNFα) (56–58). Esta unión protege a la célula B de la
apoptosis mediada por Fas, e induce la proliferación y diferenciación de la célula B, así
como la generación de células B memoria, cambio de clase de Ig y la maduración de la
afinidad. Fas es otro miembro importante de esta familia, cuya interacción con su
ligando FasL, da lugar a la muerte por apoptosis de las células que expresan FasL.
Otra molécula co-estimuladora es CD137/4-1BB, miembro de la TNFR-SF que
puede actuar con independencia de CD28. Se expresa en LT activados con funciones
co-estimuladoras y antiapoptóticas, promoviendo la proliferación, la actividad citolítica
y la supervivencia de los linfocitos (59,60). Se une a su ligando 4-1BBL que se expresa
en APCs activadas, incluyendo LB, macrófagos y DCs (59,60). La interacción de ambos
induce el reclutamiento de los receptes asociados a TNF, TRAF1 y TRAF2 que activan
diversas vías de señalización y factores de trascripción como NFkB, AKT, p38,
induciendo la expresión de genes de supervivencia como Bcl-XL o Bfl-1 e inhibiendo la
expresión de genes pro-apoptóticos como Bim (61). Tanto CD137 como su ligando
CD137L han sido descritos en el rechazo de tumor, en la apoptosis, la inmunidad
antiviral, diabetes, y en la co-estimulación y modulación de la respuesta inmunitaria
tanto de los LB como de los LT (62–64).
Las moléculas co-señalizadoras tienen una función fundamental en la regulación
de la activación, diferenciación, función y supervivencia de las células T (65). Por tanto,
los linfocitos preinmunes, recientemente activadas o de memoria expresan una única
combinación de receptores co-estimuladores dependiendo de su historia de activación y
su estado de señalización (66). Una vez los linfocitos han realizado su función,
comienza la fase de homeostasis, en la que la mayoría de ellos mueren por apoptosis.
Sin embargo, como ya se ha comentado, algunos se diferencian en linfocitos memoria,
INTRODUCCIÓN
29
que sobreviven durante periodos prolongados en un estado de reposo y tras una nueva
exposición al mismo antígeno generarán una respuesta inmunitaria más intensa y rápida.
Hay que destacar que los mismos mecanismos que activan una respuesta T efectora,
también ponen en marcha los dispositivos de freno y control de dicha respuesta
inmunitaria (Fig. I5).
Figura I5: Esquema de las principales moléculas co-señalizadoras implicadas en la regulación de la activación
de los LT. Adaptado de (67).
3. MOLÉCULAS HLA
El MHC denominado HLA (del inglés, Human Leukocyte Antigen) en humanos,
es una región de DNA que contiene múltiples genes que codifican proteínas con
funciones inmunitarias. Los genes que codifican las diversas moléculas presentadoras
de antígeno se mantiene en todas las especies de vertebrados mandibulados y se han
conservado a lo largo de la evolución (68). Muchos de estos genes codifican proteínas
que intervienen en el procesamiento antigénico, mientras que otros codifican proteínas
que participan en la respuesta inmunitaria innata o adaptativa.
INTRODUCCIÓN
30
3.1. Características de las moléculas MHC
La región del MHC posee unas características genéticas que las diferencian del resto del
genoma y son fundamentales para garantizar su función.
3.1.1. Polimorfismo
En la actualidad, más de 22.000 moléculas diferentes de HLA clase I y clase II
han sido identificadas (69).
La diversidad de las moléculas de HLA expresadas en humanos es generada
para maximizar la probabilidad de que al menos algunos individuos dentro de la
población general puedan desarrollar un ataque inmunitario frente a una infección
emergente y sobrevivir. Genéticamente, esta diversidad se produce por mutaciones
puntuales, inserciones, deleciones y recombinación, pero también es frecuente que se
genere debido a mecanismos como la conversión génica, donde un alelo es convertido
en otro mediante mecanismos de reparación de las mencionadas mutaciones puntuales.
El polimorfismo de las moléculas de MHC, tanto MHC-I como MHC-II, se
centra en la región de unión al antígeno, lo que origina diferentes motivos de unión al
péptido (70), y por tanto diferentes moléculas de MHC unen grupos de péptidos no
solapados. En las moléculas MHC-I son los exones 2 y 3 de la cadena α los más
polimórficos y en las moléculas MHC-II es el exón 2 de la cadena β. Estos exones son
los que se corresponden con los dominios que forman el surco donde se une el péptido.
La capacidad de una molécula de MHC de unirse a diferentes péptidos es específica y
define su repertorio peptídico.
La mayoría de sustituciones que se encuentran en la zona de unión al antígeno son
no sinónimas, indicando una fuerte presión de selección en el surco de unión al péptido
de gran importancia en la interacción HLA-péptido (71).
Los mecanismos para mantener este amplio polimorfismo son:
3.1.1.1. Selección balanceadora
La selección balanceadora permite mantener la diversidad en la población al
mantener las diferentes variantes alélicas de un locus.
INTRODUCCIÓN
31
El potencial que tienen los patógenos para generar una selección en las
moléculas de HLA ha sido investigado a través de infecciones emergentes como el VIH
(virus de la inmunodeficiencia humana), donde la heterozigosidad correlaciona con un
retraso en la enfermedad (72). Sin embargo, la resistencia a la enfermedad puede que
no sea el único mecanismo que confiere heterozigosidad a las moléculas de HLA, ya
que las moléculas de HLA están implicadas en la capacidad reproductiva, pues regulan
la supervivencia tanto de la madre como del feto (73).
3.1.1.2. Desequilibrio de ligamiento
Se define como desequilibrio de ligamiento (DL) la asociación alélica que se
observa en una determinada región génica. Este DL hace que algunos loci HLA se
hereden en bloques o haplotipos y con ello los polimorfismos de un gen se relacionan
con los de otro colindante. Debido a ello, las frecuencias de los alelos de una población
no son las esperadas de encontrar si los alelos estuviesen siguiendo el equilibrio Hardy-
Weinberg (74).
Distintos estudios han observado que no todas las regiones de HLA tienen el
mismo DL (75). La parte más telomérica de la región de clase I junto con el cluster de
receptores olfatorios representa la región más larga en DL que se ha encontrado en el
genoma (76).
3.1.1.3. Paralogia o duplicación génica
El fenómeno de duplicación génica que da lugar a varias copias de un gen en una
especie determinada es un mecanismo de evolución del genoma (77). Además, en el
genoma también se encuentran grupos de genes duplicados juntos y ligados,
distribuidos en más de un cromosoma. Este hecho se denomina paralogia y los
segmentos duplicados, regiones parálogas.
En el MHC se encuentran las 2 formas de paralogia: existen 3 regiones parálogas
del MHC en los cromosomas 1,9 19 (77,78), y dentro del propio MHC. La existencia de
regiones parálogas del MHC en diferentes puntos del genoma se explica mediante
diversas hipótesis, donde, la de la duplicación es la que lo explica mejor (79). Según
esta hipótesis, la paralogia dentro del propio MHC se explica como consecuencia de
INTRODUCCIÓN
32
duplicación génica y como una forma para evolucionar, ya que, para una efectiva
presentación de todos los antígenos posibles, es mejor disponer de diferentes moléculas
que puedan realizar esta función y no sólo de 1.
3.1.2. Poligenia
La poligenia se refiere a la característica de las moléculas HLA de expresar
varios genes que codifican la misma proteína, además estas proteínas se pueden
expresar simultáneamente.
3.1.3. Codominancia
Los genes de los loci de HLA son codominantes, es decir, se expresan de manera
simultánea las 2 copias del genoma (74), por tanto, un individuo expresa 6 moléculas de
clase I clásicas y 6 moléculas de clase II; aparte, pueden encontrarse más moléculas de
DR, formadas por la expresión de la paralogia de los genes DRB3, DRB4 y DRB5.
Así, en un individuo que es heterocigoto para cada una de las 6 moléculas de
HLA clase I clásicas o de clase II, ha sido estimado que una APC podría presentar
teóricamente alrededor de 1012
péptidos diferentes (80).
3.2. Genética de las moléculas HLA
En humanos, el MHC se sitúa en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3) en
una región que comprende unos 3,6 Mpb de DNA en la que están contenidos unos 260
genes (81) que codifican para más de 160 proteínas. La región de DNA se divide en 3
regiones, las regiones I y II que codifican proteínas que intervienen en el procesamiento
antigénico y en la respuesta inmunitaria y la región III que se encuentra localizada entre
las 2 anteriores y consta de 720 Kpb. En dicha región no se encuentran loci que
codifiquen para moléculas presentadoras de antígenos, sino componentes del sistema
del complemento (C2, C4 y factor Bf), genes implicados en la respuesta inflamatoria
como el Factor de Necrosis Tumoral (TNF, del inglés Tumour Necrosis Factor) o las
linfotoxinas α y β que ayudan a la maduración leucocitaria (82) (Fig. I6).
INTRODUCCIÓN
33
Figura I6: Genética de las moléculas HLA. Representación esquemática del área del cromosoma 6 donde se
localiza el complejo HLA y la localización relativa de los genes HLA de clase I y clase II. Adaptado (83).
En la última década con la llegada de la secuenciación masiva (NGS, del inglés
Next Generation Sequencing), se ha mejorado el conocimiento del MHC sobre todo a
nivel de secuencia en las regiones de no unión al péptido y de las regiones de no
traducción (UTR, del inglés untranslated region).
3.2.1. Región MHC clase I
La región de MHC de clase I es la región más telomérica, consta de 1,8 Mpb y
contiene los loci que codifican para la cadena α de las tres moléculas de clase I
principales: HLA-A, HLA-B y HLA-C. Estas moléculas se expresan en casi todos los
tipos celulares, a excepción de los glóbulos rojos, y presentan a los LTc péptidos que
provienen de patógenos intracelulares. La cadena α de las moléculas de clase I está
formada por 5 dominios: dos dominios de unión al péptido (α1 y α2), un dominio de la
Ig-SF (α3), una región transmembrana y una cola citoplasmática. Los dominios de
unión al péptido α1 y α2 son los más polimórficos y a nivel génico están codificados por
los exones 2 y 3, el dominio α3 es el que está involucrado en la interacción con CD8. A
HLA clase II
HLA clase I
Clase II Clase III Clase I
INTRODUCCIÓN
34
parte de la cadena α, también forma parte de las moléculas MHC-I, la β2-
microglobulina, una proteína no polimórfica y codificada en el cromosoma 15, fuera de
la región de HLA. Ambas cadenas se asocian de manera no covalente.
En la región de clase I, a parte de las moléculas clásicas ya comentadas, hay otros
loci funcionales, como son los que codifican para las moléculas HLA-E, HLA-F y
HLA-G (84). Estas moléculas son parte de las moléculas consideradas como moléculas
HLA clase I no clásicas, son menos polimórficas y poseen una expresión mucho más
restringida de tejidos. También se localizan en esta región los loci que codifican para las
moléculas MICA y MICB (del inglés, MHC-class I chain-related), estas moléculas no
son de clase I pero mantienen una cierta homología de secuencia.
A parte de los loci funcionales, las regiones de clase I también contiene un gran
número de pseudogenes y de genes fragmentados o truncados de HLA de clase I (85).
3.2.2. Región MHC clase II
La región de clase II se encuentra en la región más centromérica del MHC y
consta de 800Kpb. En esta región se encuentran los loci codificantes para las moléculas
HLA de clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. La expresión de las moléculas de
clase II está restringida a las APCs. También se expresan en las células epiteliales
tímicas para que se pueda llevar a cabo la selección tímica. En humanos, los linfocitos T
pueden presentarlas después de su activación (86). Las moléculas MHC de clase II
presentan péptidos que provienen de patógenos extracelulares a los LTh (87).
Las moléculas MHC-II son heterodímeros formados por dos glicoproteínas
denominadas cadenas α y β de unos 35 y 30 kDa respectivamente, unidas no
covalentemente. Se designan con el nombre del locus seguido de “A” o “B” en función
de la cadena “α” o “β” que codifiquen. En una cadena están los dominios extracelulares
α1 y α2 y, en la otra, los dominios β1 y β2. Los dominios α2 β2 son los proximales a la
membrana y α1 y β1 se encuentran distales a ésta y forman la hendidura de unión al
péptido. Ambas cadenas se anclan a la membrana a través de una región de 20-25aa
seguidos de una cola citoplasmática corta de 12-15 aa (88,89). La zona de interacción
con CD4 es la región β2. La cadena α está más conservada evolutivamente, por tanto, es
INTRODUCCIÓN
35
menos polimórfica, de hecho, en algunos locus como es el caso de DRA es
prácticamente monomórfica. La cadena β es la más polimórfica, sobre todo en el
dominio β1, codificada a nivel génico por el exón 2.
Un caso particular es el de la cadena β de la molécula DRB, ya que puede estar
codificada por diferentes loci; algunos funcionales y otros pseudogenes. Los diferentes
loci que codifican para las cadenas β del DRB se indican con números. Los loci de
DRB1 y el del pseudogen DRB9 se encuentran en todos los individuos. Y en función
del alelo DRB1 que tenga un individuo, puede tener diferentes pseudogenes y genes
paralelos de DRB (90). Las diferentes cadenas β de DRB (β1, β3, β4, β5) se combinan
con la misma cadena DRA para formar diferentes moléculas DRB (DRB1, DRB3,
DRB4, DRB5) que pueden expresarse en la superficie celular (Fig. I7).
Figura I7: Características de la estructura génica de las moléculas HLA-DRB.
En esta región también se encuentran los loci de un grupo de genes que
codifican proteínas necesarias para la presentación de antígenos, algunas de la vía de
clase I como TAP y LMP y otras de clase II, por ejemplo, los loci DOA, DOB, DMA y
DMB codifican las moléculas HLA-DM y HLA-DO; estas moléculas intervienen en el
tránsito intracelular y en la carga de péptidos de las moléculas de clase II (91).
INTRODUCCIÓN
36
3.3. Importancia de las cadenas DRB3, DRB4 y DRB5
Como ya se ha comentado, el gen HLA-DRB1 se expresa en todos los
individuos. En contraste, los loci HLA-DRB3/4/5 están sólo presentes en algunos
individuos dándoles un segundo producto HLA-DR, lo que permite la expresión de 4
moléculas diferentes HLA-DR en individuos heterocigotos. Estas “cadenas secundarias
β” pueden combinarse con la cadena α para formar moléculas DR adicionales en la
superficie celular, aumentado la alta variabilidad DR. Estos productos están en
desequilibrio de unión con un alelo particular del DRB1. Específicamente, los
haplotipos DRB1*03, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 y DRB1*14 expresan DRB1 y
DRB3; DRB1*04, DRB1*07 y DRB1*09 expresan DRB1 y DRB4; y DRB1*15 y
DRB1*16 expresan DRB1 y DRB5. Estas duplicaciones genéticas de DRB pueden
considerarse en sí mismas una variación en el número de copias o CNV y como tales
un mecanismo de variabilidad polimórfica (92). El hecho de que algunos haplotipos
porten dos genes DRB funcionales indica que genera algunas ventajas en relación con la
presentación de péptidos derivados de patógenos a los LTh. Así por ejemplo, DRB3
reconoce patrones característicos de antígeno y sus glicoproteínas (existe también
polimorfismo, aunque en mucho menor grado que DRB1) parecen ser responsables de
la presentación de moléculas diferentes a las presentadas por su complementario DRB1;
diversos datos en este sentido sugieren que al menos DRB3 no actuaría como un mero
duplicado de los alelos DRB1 asociados a éste (93), sino que sería un “suplemento”
funcionalmente relevante.
Si se tiene en cuenta que los alelos DRB3/4/5 son mucho menos polimórficos
respecto a su análogo DRB1: DRB3 codifica hasta 142 proteínas distintas (175alelos),
DRB4 63 (83 alelos) y DRB5 59 (68 alelos) (94), los péptidos que se unan a estos alelos
serían de interés (menor variabilidad por lo que podrían usarse en más individuos) para
el diseño de terapias peptídicas. Una de las limitaciones de esta aproximación es que la
especificidad de estas “moléculas secundarias” y cómo complementan a HLA-DRB1
está todavía en estudio.
INTRODUCCIÓN
37
3.4. Interacción HLA-péptido-TCR
El sitio de unión al péptido en las moléculas de MHC-I y MHC-II es
estructuralmente similar y consiste en un surco formado por dos hélices alfa, a modo de
paredes, sobre una base formada por ochos hebras β antiparalelas, aportadas de forma
similar por los dominios α1 y α2 en MHC-I y α1 y β1 en MHC-II. Algunos residuos de esta
estructura forman cavidades o pockets donde se pueden acomodar las cadenas laterales
de los aminoácidos del ligando peptídico según las propiedades fisicoquímicas de los
residuos que forman el pocket. Cada alelo puede unir un repertorio peptídico compuesto
por varios miles de moléculas diferentes (95).
El surco de unión de las moléculas de MHC-I es cerrado en los extremos y une
péptidos habitualmente de entre 8 y 12 aa, mayoritariamente nonámeros (96) en
conformación extendida (97). Los péptidos más largos logran acomodarse adoptando
una conformación abultada en el centro, sobresaliendo hacia el TCR (98–100). Además
de por los extremos peptídicos, el ligando se une a las moléculas de MHC-I en alguna
otra posición de anclaje. En muchos alelos esta posición es la P2 además del residuo C-
(97,100). Las posiciones P2 y P6 son las que determinan principalmente qué péptidos se
pueden unir en un determinado alelo de clase I; la variación de los aa que forman estos
pockets en las diferentes MHC-I es la que confiere la especificidad de unión. La
posición carboxilo terminal del ligando peptídico suele contener residuos alifáticos,
aromáticos o básicos (95,101). Existe consenso de que el proteosoma genera
directamente el extremo C-terminal de los péptidos anclados a las moléculas de MHC-I
(95,102). El proteosoma puede generar directamente el extremo N-terminal (103) o
extensiones del mismo (104), que serán procesadas en el RE mediante la
aminopeptidasa ERAAP (del inglés, ER aminopeptidase associated with antigen
processing) (105). Otros residuos, que no interaccionan con el surco de unión, se
exponen hacia el exterior y pueden ser reconocidos por el TCR del LT específico (106).
Los péptidos unidos a MHC-II tienen entre 10 a 20 residuos de longitud, siendo
mayoritarios los péptidos de entre 13 y 16 residuos (107), aunque péptidos de hasta 30
aa pueden ser presentados (108). El surco de unión de la molécula de clase II está
abierto en los extremos, por lo que el ligando después de colocarse en el núcleo de
interacción o core, sobresale por los extremos de éste. El core de 9 aa, interacciona en el
INTRODUCCIÓN
38
sitio de unión en donde participan las posiciones P1, P4, P6/P7 y P9 en la mayoría de
los alelos (89,109). Las cadenas laterales, localizadas en las posiciones P-1, P2, P3, P5,
P8 y P10 se acomodan en los pockets presentes en el surco de unión estabilizándose y
proyectándose hacia arriba de la superficie de la molécula MHC-II e influyen en su
reconocimiento por parte de los LT a través del TCR (110). La activación de los LT por
esta interacción del receptor por sí sola no induce la producción de citoquinas ni la
proliferación, sino que en ausencia de segunda señal activa la apoptosis de los LT o la
inducción de anergia tras la reestimulación con el mismo antígeno (111).
A diferencia de MHC-I, el hecho de que los extremos de los ligandos de MHC-
II puedan sobresalir del surco de unión de las cadenas laterales en un grupo amplio de
aa, dificulta la identificación inequívoca del core de interacción. Esto genera que los
algoritmos de predicción de unión peptídica al MHC-II sean más imprecisos, ya que
pueden identificar de forma errónea los residuos de anclaje para un determinado péptido
(Fig. I8).
Figura I8: Esquema del surco peptídico de la molécula HLA. En el esquema se muetran las posibilidades de
anclaje a la molécula HLA en función de los aa situados en posiciones determinadas del core peptídico.
INTRODUCCIÓN
39
En relación a la interacción de las pMHCs con el TCR de los LT, las
interacciones de línea germinal CDR1 y CDR2, que están relativamente conservadas
(112), proporcionan la afinidad básica del TCR para el alelo MHC genérico y los
bucles CDR3 se colocan para contactar con el péptido (106). En cuanto a la
contribución péptidica al reconocimiento de TCR, para la clase I está en los aa de las
posiciones P5, P7 y P8, mientras que para la clase II, los residuos correspondientes son
P5 y P8.
Datos experimentales mediante cristalografía demuestra que de modo natural se
necesita de al menos dos moléculas TCR y pMHC para la interacción entre ambas
células (113). La interacción entre el TCR y los pMHC de clase I es, en promedio, casi
10 veces más fuerte que la interacción con los pMHC de clase II (114).
Hay que tener en cuenta que los LT con el receptor TCRγδ reconocen el péptido
en su forma nativa, sin la necesidad de ser procesado y presentado por las moléculas
MHC (114).
3.5. Regulación de la expresión de las moléculas HLA-II
El papel de MHC-II en la regulación de la respuesta inmune lo determina su
polimorfismo, pero también el nivel de expresión en la superficie celular de las APC,
afectando directamente a la respuesta T (115). La expresión de los genes del HLA-II
está altamente regulada, coincidiendo con su papel crítico durante el desarrollo del
sistema inmunitario y durante la regulación de una respuesta inmune eficiente (116).
Las moléculas MHC-II se expresan basalmente en la superficie de las APCs. Los
niveles de expresión varían en función del estado de maduración y diferenciación de las
APCs. Por ejemplo, la diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas está
caracterizada por la represión de los genes del MHC clase II, mientras que la
maduración de las células dendríticas se acompaña de una mayor expresión de
moléculas de DR en superficie. Como también se ha comentado anteriormente, los
linfocitos T activados también expresan MCH-II y determinados estudios evidencian
diferencias de expresión de HLA-DR que permiten definir una subpoblación de células
Treg (117).
INTRODUCCIÓN
40
La expresión de las moléculas MHC de clase II está regulada fundamentalmente a
nivel transcripcional mediante un proceso que contiene secuencias conservadas en las
regiones próximas al promotor conocidas como cajas W (o S), X, X2 y Y (116). A la
caja X se une el factor regulador X, compuesto por RFX5, RFXANK y RFXAP. La caja
X2 es reconocida por X2BP, un complejo que incluye CREB. Finalmente, el complejo
NF-Y se une a la caja Y. A la caja S se pueden unir determinadas proteínas, pero
ninguna función relevante se ha podido establecer en vivo de esa unión. La unión de
estos factores de forma estable al promotor genera un complejo macromolecular
conocido como “MHC-II enhancesoma” que sirve como diana para el Transactivador de
Clase II (CIITA). CIITA es un coactivador que, a pesar de no unirse directamente al
DNA sirve como principal factor de control para la expresión de MHC-II.
Figura I9: Representación esquemática de la regulación transcripcional de los genes MHC clase II. Adaptado
de (116).
3.6. HLA y enfermedad
El conjunto de la región del MHC se ha relacionado con un centenar de
enfermedades diferentes, esencialmente, enfermedades autoinmunes. Una posible
hipótesis para explicar la relación de las moléculas HLA con la autoinmunidad podría
ser que la autoinmunidad sea debida a que sólo los LT altamente auto-reactivos son
eliminados en el timo, en cambio, los LT auto-reactivas de baja afinidad pueden escapar
a la selección negativa tímica.
Al revisar las asociaciones HLA y enfermedad, los loci DRB son donde mayor
número de relaciones se han establecido (118) (Tabla I1). A pesar de que sea DRB1 el
polimorfismo principal responsable de definir una respuesta inmunitaria causante de las
INTRODUCCIÓN
41
enfermedades donde se ha demostrados asociación, DRB3/4/5 tienen en su alta
frecuencia poblacional, una importante limitación para definir de manera significativa
un riesgo relativo determinante de enfermedad.
Tabla I1: Asociación entre la presencia de alelos HLA-I y HLA-II y enfermedades autoinmunes y su grado de
asociación (RR). RR: Riesgo Relativo. Adaptado de (71).
INTRODUCCIÓN
42
De todas las enfermedades en las que ha descrito asociación con moléculas HLA,
nos centraremos en 3 enfermedades en las que se visto asociación con moléculas HLA-
DRB accesorias, ya que al tener una elevada frecuencia poblacional pueden tener mayor
relevancia a la hora de establecer terapias o seguimientos individualizados.
3.6.1. Esclerosis múltiple
La esclerosis múltiple es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema
nervioso central, considerada una patología autoinmune mediada por células T. Su
prevalencia es de 0,5-1,5 por cada 1000 habitantes en el hemisferio norte. La asociación
genética más fuerte es con el haplotipo HLA-DR15 con un OR (odds ratio) descrito de
3,08 (119). Los alelos contenidos en el haplotipo DR15 son, casi exclusivamente, HLA-
DRB1*15:01 y HLA-DRB5*01:01. Hace años se describieron los motivos de anclaje y
con ellos los ligandos asociados a la enfermedad (120,121), aunque en la actualidad se
siguen obteniendo más ligandos que hace que exista un elevado número de ligandos no
asociados a los motivos de anclaje descritos inicialmente (122).
Aunque hasta el momento no se ha analizado si ambas moléculas contribuyen de
una manera similar a la conformación del repertorio peptídico de HLA-DR15 o, en
cambio, una de ellas es la que aporta de forma significativa un porcentaje mayor de los
epítopos potencialmente reconocidos por los LTh, varios trabajos demuestran que los
epítopos presentados por DRB5 y DRB1*15 son diferentes (123), por lo que la
presentación complementaria existe.
3.6.2. Diabetes Mellitus tipo I (DM-1)
La diabetes mellitus tipo I es una enfermedad de origen autoinmunitario en que
hay una destrucción de las células β del páncreas generando fallos en la secreción de
insulina cuya consecuencia es la hiperglucemia. El desarrollo de la enfermedad se
atribuye a una combinación de factores genéticos predisponentes y una serie de factores
ambientales que actuarían como desencadenantes de la enfermedad.
INTRODUCCIÓN
43
Se ha observado que existen diferentes alelos de HLA-DQ asociados con la
enfermedad en función del grupo étnico estudiado. El alelo DQB1*03:02 es el que se
encuentra en mayor asociación positiva (OR 3-10), mientras que el alelo DQB1*06:02
resulta protector para la DM-1. También se ha visto que las moléculas HLA-DR pueden
tener una influencia epistásica1, ya que la combinación de algunos alelos HLA-DR
incrementan el riesgo relativo (RR) de sufrir la enfermedad hasta 20 veces en relación a
otras combinaciones HLA-DR (124).
3.6.3. Trombopenia neonatal aloinmune
En la Trombopenia Neonatal Aloinmune (TNA) se produce una destrucción de las
plaquetas neonatales por aloanticuerpos plaquetarios maternos dirigidos contra un
antígeno plaquetario específico fetal heredado del padre. Aunque los anticuerpos son los
responsables de la trombocitopenia, los LT son la clave de porqué sólo el 10% de las
pacientes con incompatibilidad provocan la enfermedad en sus hijos. Junto a la
importancia diagnóstica de determinar sensibilización T frente a HPA-1a, estos
linfocitos aparecen como dianas centrales para modular la respuesta aloinmune. Desde
hace ya bastantes años, se conoce la implicación de HLA-DRB3*01:01 (95% de los
casos) como responsable de la presentación del antígeno a los LTh en la generación de
la respuesta aloinmune (125,126). El RR de DRB3*01:01 es de 141, al mismo nivel que
la espondilitis alquilosante, uno de los mejores ejemplos de enfermedad autoinmune y
asociación HLA (127).
3.7. Inmunogenicidad de las moléculas HLA en el trasplante
Anticuerpos frente a las moléculas de HLA pueden generarse mediante la
exposición a HLA extraños, generalmente a través de una transfusión de sangre,
embarazo o trasplante. Se han publicado numerosos estudios que demuestran la
relevancia clínica de estos anticuerpos (128–131) en el trasplante.
1 Influencia epistásica: cuando la expresión de uno o más genes dependen de la expresión de otro gen.
INTRODUCCIÓN
44
El desarrollo de Anticuerpos Específicos de Donante tras el trasplante (dnDSA,
del inglés de novo Donor Specific Antibodies) contra las moléculas HLA es marcador de
mal pronóstico de la supervivencia del injerto (132–136). La pérdida del injerto dentro
de los tres años posteriores a la aparición de dnDSA ocurre en aproximadamente el 20%
de los pacientes (135,137,138).
Los alelos HLA pueden compartir epítopos, ya que los epítopos no son
exclusivos de un alelo HLA particular. Por otro lado, no todos los epítopos de los
antígenos HLA tienen la misma reactividad con un anticuerpo específico ni tienen la
misma capacidad de generar anticuerpos (132-133).
3.8. Nomenclatura de las moléculas HLA
Existe un comité de nomenclatura del sistema HLA denominado WHO
(Nomenclature Committee for Factors of the HLA System), que establece las normas de
nomenclatura y clasifica los alelos nuevos descritos.
El sistema de nomenclatura utilizado actualmente por este comité permite identificar
el locus y la familia del locus al cual pertenece un alelo en concreto; da información de
las variantes del alelo que no generan un cambio a nivel proteico y de las variantes que
no son expresadas (141).
El sistema de nomenclatura consiste en el nombre del locus seguido de un asterisco
(para indicar que se trata de información alélica), seguido de 4 campos numéricos. Los 2
primeros dígitos (el primer campo) hacen referencia a la familia alélica a la que
pertenece el alelo, el siguiente campo indica el nombre de la variante alélica dentro de la
misma familia o proteína HLA específica. Estos 2 primeros campos se encuentran en
todos los alelos. Si aparecen 2 dígitos más, dan información de que este alelo presenta
distintas variantes de secuencia que no provocan cambios de aminoácidos en la
proteína. Los últimos 2 dígitos indican polimorfismos en zonas no codificantes de
dicho alelo (Fig. I10).
INTRODUCCIÓN
45
Figura I10: Nomenclatura actual del sistema HLA. Adaptado de (142).
4. INMUNOLOGÍA FRENTE A LA INFECCIÓN
El reconocimiento de patógenos virales por la interacción de las células del
sistema innato da lugar a la activación de la inmunidad adaptativa que reconocerá
antígenos (Ags) virales específicos para su eliminación y generará memoria (1). La
acción coordinada de los LTc, los LTh y las células plasmáticas será la encargada de
eliminar la infección y proteger contra la reinfección.
La interacción del patógeno con las APCs influye en el balance de citoquinas
inicial de la respuesta inmune, determinando el desarrollo preferencial de células Th1 o
Th2 y desplazando la respuesta inmune hacia una respuesta humoral o celular mediada
por fagocitos y LTc. Las DCs procesan el virus, migran a los nódulos linfáticos y allí
presentan los Ags virales, restringidos por MHC-II, a los LTh. Los LTh, en función de
las citoquinas que haya en el ambiente, se diferenciarán a LTh1, si el ambiente es rico
en IL-2, o en LTh2, si el ambiente es rico en IL-4.
Los LTh1 y LTh17 promueven principalmente la respuesta celular contra
patógenos intracelulares. Los LTh1 secretan IL-2 e INFγ activando la proliferación de
INTRODUCCIÓN
46
LTc. Estos LTc migran hacia el foco de la infección donde reconocen las células
infectadas que muestran péptidos virales asociados a moléculas MHC-I.
Por otro lado, los LTh se diferenciaran a LTh2 si el ambiente es rico en IL-4 al
reconocer las células infectadas, que son capaces de secretar IL-4 e IL-5 activando los
LB (143) que generarán una respuesta humoral frente al patógeno. La colaboración LTh
es crítica para la generación de inmunidad humoral frente al virus (144), pero también
se ha visto su importancia para que los LTc tengan una respuesta citotóxica potente
(145).
La respuesta humoral genera linfocitos de memoria; además de los LB memoria
existe otra población circulante de LT memoria (tanto LTc como LTh) que surgen como
subpoblaciones diferenciadas a partir de la proliferación de LT preinmunes y LT
efectores durante una respuesta primaria. Estas células están preparadas para responder
de un modo más rápido e intenso cuando se vuelven a encontrar con el antígeno. En
contraste, se cree que algunos virus inducen la activación de los linfocitos Treg como
una estrategia de inmuno-evasión (146).
4.1. Gripe
La gripe es una enfermedad respiratoria aguda altamente contagiosa. Las
epidemias de los virus de la gripe están causadas por la rápida evolución del genoma
viral, ocurren prácticamente cada año, pero varían en intensidad sobre todo en los meses
más fríos del año en las zonas de clima templado, causando una considerable morbilidad
en todos los grupos etarios, llegando a causar alrededor de 500.000 muertes al año
(147). Surgen por una combinación de deriva antigénica, que ocurre de temporada en
temporada, y por una disminución de la inmunidad entre la población.
Desde 1933 se han producido grandes cambios antigénicos: en 1957, cuando el
subtipo H2N2 reemplazó al H1N1, conocida como la gripe asiática, en 1968, cuando el
virus H3N2 reemplazó a H2N2, conocida como la gripe de Hong Kong, y en 1977
cuando reapareció el subtipo H1N1. La última referencia es la pandemia originada en
2009, denominada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como un nuevo
virus de la gripe A/H1N1. Esta nueva pandemia se focalizó principalmente en las
INTRODUCCIÓN
47
personas menores de 65 años. Esto podría explicarse porque los adultos nacidos antes
de 1957 probablemente han estado expuestos a variantes menores del virus de la “Gripe
Española” (H1N1) que circularon hasta 1958. Recientemente se han identificado las
mutaciones específicas que le confirieron la capacidad de ser transmitido de humano a
humano y de producir la alta mortalidad que lo caracterizó (148).
Los virus de la gripe forman parte de la familia de Orthomyxoviridae, incluye 5
géneros en base a sus diferencias genómicas y estructurales. Los virus de la gripe tipo A
se clasifican en subtipos en función de la naturaleza antigénica de sus glicoproteínas de
superficie: Hemaglutinina (HA) y Neuraminidasa (NA). Todas las proteínas del virus
están codificadas por 8 segmentos de RNA. Las proteínas estructurales están presentes
en la partícula viral completa, pudiendo distinguir a las HA, NA, matriz (M1), proteína
transmembrana (M2), nucleoproteína (NP) y un complejo formado por las proteínas PA,
PB1 y PB2 que forman un complejo polimerasa. Las proteínas no estructurales solo se
encuentran en la célula infectada y pueden aparecer en el núcleo como NS1 o en el
núcleo y citoplasma como NS2 (Fig. I11).
Figura I11: Virus de la gripe. El virus con un diámetro de aproximadamente 100nm. Contiene una envuelta exterior
y una capa de proteínas que envuelve un segmento de RNA genómico. Adaptado de (149).
INTRODUCCIÓN
48
Normalmente una RNA polimerasa viral posee una tasa de error de 1x103
a 1x105
y son los virus de la gripe A los que muestran el mayor número de mutaciones
acumuladas a través del tiempo (deriva antigénica).
Las 2 proteínas más importantes del virus desde el punto de vista de la infectividad,
antigenicidad e inmunidad son la hemaglutinina y la neuramidasa:
Hemaglutinina (HA): tiene capacidad para aglutinar hematíes.
Actualmente se conocen 16 clases de HA. Es responsable de la unión con el
receptor de la célula huésped e interviene en la fusión y penetración del
virus dentro de la célula. Es la proteína más frecuentemente implicada en la
variación antigénica (150).
Neuraminidasa (NA): contiene determinantes antigénicos comunes para
cada subtipo y específicos de cepa, se conocen 9 clases de NA y desempeña
un papel importante en la discriminación del hospedador (151).
Los reordenamientos genómicos del virus son epidemiológicamente importantes
ya que permiten grandes cambios en términos de antigenicidad de las proteínas que
componen el virión2. El virus es capaz de padecer cambios hasta en un 50% de su
secuencia aminoacídica en las glicoproteínas de envoltura (HA y NA) y conservar su
función. Algunas de las sustituciones se asocian a cambios antigénicos. Por tanto, las
pandemias de gripe se deben a la aparición de una cepa antigénicamente nueva
(“antigen shifts”), es decir, con una HA o/y NA perteneciente a un subtipo previamente
no identificado en humanos, para los cuales la especie humana no tiene inmunidad. Este
fenómeno se produce por el intercambio de genes entre cepas humanas y animales o
entre cepas animales (porcina y aviar, principalmente) y su transmisión a la especie
humana por cruce de la barrera interespecie (152,153). Así, el nuevo virus contiene 5
segmentos de origen porcino (HA, NA, NP, NS y M), 2 aviares (PB2 y PA) y 1 humano
(PB1) (154).
2 Virión: partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa.
INTRODUCCIÓN
49
Las vacunas se fabrican a partir de las recomendaciones de la OMS en función de
las cepas de la temporada anterior en el hemisferio opuesto (155). La composición de
las vacunas para la última epidemia se basaba en la cepa A/California/07/2009 (H1N1).
En relación con la respuesta inmune frente al virus de la gripe, los LTh de
memoria son capaces de generar una protección sustancial frete a la gripe mediante
mecanismos directos efectores y mediante mecanismos cooperadores y reguladores.
Diversos estudios demuestran que la especificidad de la primera infección se mantiene a
lo largo del tiempo en menor frecuencia hasta que se produce un nuevo contacto
(156,157). Tras el nuevo contacto, estas células requieren menor densidad de epítopos
para reactivarse y además se expanden más rápidamente que los LT preinmunes (158–
161).
En modelos ex vivo, los linfocitos Th de memoria obtenidos de donantes no
infectados con el virus emergente de la gripe reconocen el virus gripal pandémico y
contribuyen a generar una respuesta B y T óptima. El número de veces de exposición al
virus de la gripe podría tener un impacto en el ratio CD8/CD4, en donde varios estudios
demuestran que la acción de los LTh de memoria actúan de forma más rápida que los
LTc (162), contribuyendo no solo al desarrollo de la respuesta B y citotóxica, sino
también como reguladores de la respuesta innata y potenciando la respuesta efectora.
5. INMUNOLOGÍA DEL CÁNCER
Entendemos por cáncer, tumores malignos o neoplasias malignas, al término
genérico que designa un amplio grupo de enfermedades que pueden afectar a cualquier
parte del organismo. Se caracterizan por la multiplicación rápida de células anormales
que se extienden más allá de sus límites habituales y pueden invadir partes adyacentes
del cuerpo o propagarse a otros órganos, proceso conocido como metástasis, siendo ésta
la principal causa de muerte por cáncer. Según los datos de la OMS debido al cáncer en
2015 se produjeron 8,8 millones de muertes (aproximadamente el 16% del total de las
ocurridas en todo el mundo) (163).
INTRODUCCIÓN
50
Está bien establecido que el cáncer es una enfermedad progresiva, que tiene lugar en
una serie de etapas bien definidas, típicamente iniciado como consecuencia de
mutaciones activadores (oncogenes) o mutaciones inhibidoras (genes supresores de
tumor) en células proliferantes. Un único proceso mutagénico no tiene como resultados
la formación de un tumor maligno, son necesarios acontecimientos genéticos y
epigenéticos adicionales para la progresión a tumor. Las células iniciales requieren
alteraciones que les hagan autosuficientes para crecer, insensibles a las señales
inhibitorias de crecimiento, resistentes a programas de diferenciación terminal,
senescencia o apoptosis, así como una capacidad ilimitada de renovación, la habilidad
de iniciar y dirigir el proceso de angiogénesis, la capacidad de invadir y colonizar
tejidos ectópicos. El desarrollo de un tumor sugiere una sucesión de cambios genéticos
que le confieren algún tipo de ventaja en el crecimiento, llevando la conversión
progresiva de una célula normal hacia una célula tumoral (164). Una vez transformada,
esta célula crea una red de diferentes tipos celulares que colaboran entre ellos para
favorecer el crecimiento maligno (165).
La posibilidad de que respuestas inmunitarias específicas puedan erradicar los
tumores ha motivado a lo largo de los años un debate sobre esta hipótesis en el campo
de la inmunología tumoral.
5.1. Microambiente tumural
Los tumores son estructuras complejas que contienen muchos tipos diferentes de
células. Durante muchos años los científicos centraron sus investigaciones en entender
la transformación de células normales a células neoplásicas. Sin embargo, con la
investigación reciente, se ha puesto de manifiesto que otros componentes de los
tumores, incluyendo células residentes no cancerosas (fibroblastos, células endoteliales,
células del sistema inmunitario), tejido conectivo y matriz extracelular (componentes de
tejidos que proveen soporte estructural, como por ejemplo colágeno) son de igual
importancia en la iniciación y progresión tumoral. En conjunto, estos componentes son
conocidos como microambiente tumoral, ya que abarca células infiltrantes del sistema
inmunitario (macrófagos, linfocitos infiltrantes de tumor (TILs, del inglés Tumor-
INTRODUCCIÓN
51
infiltrating lymphocytes) y citoquinas, además de los componentes más o menos
permanentes del estroma (166,167).
La composición real del microambiente tumoral es altamente variable, cambiando
entre pacientes, entre distintas áreas de éste e incluso mientras la enfermedad progresa.
De hecho, la comunicación entre los diferentes componentes de un tumor y sus
alrededores es un factor importante en el desarrollo del tumor.
5.2. Inmunoedición del cáncer
Una de las primeras indicaciones claras y directas de que la manipulación del
sistema inmunitario podía causar la regresión de tumores establecidos en humanos, fue
a través de la administración de altas dosis de interleucina-2 (IL-2) recombinante en
humanos, identificada como factor de crecimiento de LT (168), vía endovenosa que
conseguía la regresión de tumores grandes e invasivos en pacientes de melanoma
metastático (169) y otros tumores. Por otro lado, se ha observado que individuos con
inmunodeficiencias adquiridas o hereditarias, y pacientes que reciben tratamiento
inmunosupresor post-trasplante, presentan un riesgo significativamente mayor de
desarrollar cáncer que los controles sanos. Además, se han observado casos de regresión
espontánea en algunos tumores y una mayor supervivencia asociada a un mayor
infiltrado celular (170,171). Todas estas evidencias indican que el sistema inmune juega
un papel en el control de la transformación maligna de las células del organismo.
El sistema inmunitario puede reconocer y eliminar las células tumorales, sin
embargo, estas células pueden evadir al sistema inmunitario, seleccionando células
tumorales menos inmunogénicas que pueden escapar de la presión del sistema
inmunitario para favorecer su crecimiento. La teoría de la inmunoedición explica el
reconocimiento del tumor por el sistema inmunitario, donde se distinguen tres fases:
Eliminación: La activación coordinada y equilibrada entre el sistema
inmunitario innato y adaptativo es fundamental para la inmunovigilancia frente al
desarrollo de tumores. El mecanismo por el cual el sistema inmunitario es alertado de la
presencia de células tumorales no está del todo claro, se han descrito señales de peligro
que inducen señales inflamatorias reclutando células del sistema inmunitario (172). Si la
INTRODUCCIÓN
52
célula tumoral se destruye, la inmunovigilancia habrá cumplido con su función, la
protección frente al desarrollo del tumor.
Equilibrio: Si el proceso de la eliminación no se desarrolla adecuadamente, las
células del tumor pueden entrar en la fase de equilibrio donde las células tumorales se
mantienen para producir nuevas variantes tumorales. Algunos modelos experimentales
demuestran que la inmunidad adaptativa es la responsable de mantener las células
tumorales en un estado quiescente, mientras que la inmunidad innata no ejerce ninguna
función en esta fase (173).
Escape: Cuando el sistema inmunitario no consigue eliminar todas las células
del tumor, los tumores con baja inmunogenicidad pueden ser capaces de escapar al
reconocimiento inmune y su eliminación (174,175). Estas células tumorales continúan
creciendo y se expanden de una manera incontrolada, conduciendo a tumores malignos
y la progresión del cáncer que puede ser clínicamente detectable. En esta fase los
mecanismos inmunosupresores que se inducen en el microambiente tumoral son
determinantes para el escape inmunológico (Fig. I12).
Figura I12: Las tres Es de la teoría de la inmunoedición del cáncer.
INTRODUCCIÓN
53
5.3. Antígenos tumorales
Las células tumorales presentan en su superficie unas moléculas que les da una
característica diferencial frente a las células normales, hecho que permite que sean
reconocidas por el sistema inmune como algo ajeno y puedan ser atacadas.
5.3.1. Antígenos embrionarios
Los antígenos embrionarios son proteínas que se expresan en los
espermatozoides y en la placenta, pero normalmente están silenciados en las células
somáticas. Debido a la ausencia de moléculas MHC en estas células germinales, estos
antígenos se describieron como específicos de tumor. Existen más de 60 genes
identificados que codifican para estos Ags y se clasifican en diferentes familias según su
homología, como MAGE, BAGE, GAGE, SSX, CTAG entre otras. El prototipo de esta
familia en la proteína MAGE-1 (176), siendo el primer gen humano identificado en
cáncer que es reconocido por LTc. Estos antígenos han sido de gran importancia en el
melanoma, observándose que pacientes que expresaban la proteína NY-ESO-1 (de la
misma familia), pueden generar anticuerpos frente a dicha molécula (177), además fue
una de las moléculas en la que se describieron epítopos que son reconocidos por LTh
(178).
5.3.2. Antígenos sobreexpresados
Existen antígenos que se consideran antígenos tumorales debido a su
sobreexpresión en células tumorales, pero con una baja expresión en células normales.
Debido a este hecho, es difícil encontrar linfocitos T específicos frente a dichos
antígenos, ya que serían eliminados en el timo mediante los mecanismos de tolerancia
central, si bien es cierto que quedarían algunos linfocitos T capaces de reconocer dichos
“autoantígenos” con baja afinidad (179). Dentro de este grupo podemos encontrar a la
telomerasa, MUC-1 o el factor de transcripción WT1. La telomerasa se encuentra
expresada en más del 85% de los tumores humanos, mientras que su expresión en
tejidos sanos es prácticamente indetectable (180). La sobreexpresión y la glicosilación
aberrante es un signo de mal pronóstico en diversos tumores (181).
INTRODUCCIÓN
54
5.3.3. Antígenos de diferenciación
Son antígenos que se expresan tanto en las células tumorales como en sus
equivalentes sanos a partir de las que se origina el tumor.
En el melanoma, han sido definidos en diferentes estadios de diferenciación
melanocito/melanoma, y distinguen a los melanocitos de otras líneas celulares. Uno de
los Ag más utilizados en inmunoterapia se encuentra dentro de esta familia, la proteína
específica del melanocito MART-1/Melan-A (182).
Otro Ag de diferenciación es el Ag carcinoembrionario, una glicoproteína
plasmática asociada a las membranas, con gran importancia en diferentes procesos
como adhesión celular (183) y agregación de células tumorales facilitando el proceso de
metástasis (184). Actualmente se utiliza como marcador de diagnóstico y progresión de
la enfermedad.
Es posible que la inmunidad contra antígenos que también se expresan en células
normales esté inhibida para evitar reacciones autoinmunitarias, que se desinhiben en
algunos pacientes tras el tratamiento con checkpoint inhibitor, ya estos tratamientos
aumentan la inmunidad global de las células T (185).
5.3.4. Antígenos de virus oncógenicos
Los productos de los virus oncogénicos podrían actuar como Ag tumorales y
activar una respuesta específica de LT. Estos Ags se expresan como resultado de la
transformación inducida por virus oncogénicos.
Existen ejemplos donde se muestra esta correlación, como el caso de la infección
por los virus de la hepatitis B o C y cáncer de hígado (186), el virus del papiloma
humano y el cáncer de cuello uterino (187), el virus de Epstein-Barr y el linfoma de
linfocito B (188) o Helicobacter pylori y el cáncer de estómago (189). Estos
acontecimientos evidencian que la infección y, por tanto, la inflamación, pueden
progresar a una fase crónica que facilita la oncogénesis (190). Hay una clara diferencia
entre la respuesta contra tumores inducidos por virus, altamente antigénicos, en
INTRODUCCIÓN
55
comparación con la poca o nula respuesta de tumores que crecen de una manera
espontánea en humanos.
Estos Ags son una diana tumoral ideal, ya que se expresan de manera constitutiva
en la célula tumoral y son esenciales para el crecimiento de la célula maligna.
5.3.5. Neoantígenos
Las células tumorales se dividen y multiplican muy rápidamente, lo que genera
una serie de mutaciones; inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, amplificaciones
o inversiones que da lugar a los neoantígenos. También se pueden generar por
alteraciones en la traducción del RNA mensajero, el procesamiento del antígeno para
ser cargado en las MHC, así como en la presentación del antígeno a los LT. En estos
casos, la incorporación de un cambio en la región codificante de una proteína expresada
por el tumor puede causar un incremento en la afinidad del péptido por la molécula de
MHC, y por tanto una mayor presentación en la superficie, o una alteración en la
secuencia de aa que interaccionan directamente con el TCR. Se trata de moléculas que
se expresan exclusivamente en células tumorales, en la que no existe tolerancia frente a
ellas por lo que pueden generar respuestas de alta afinidad. Algunas de estas mutaciones
pueden estar directamente implicadas en dicha transformación (mutaciones driver),
otras apenas presentan un papel relevante en el proceso (mutaciones pasajeras). Un
neoantígeno solo se forma cuando una mutación somática genera un epítopo que es
expresado, procesado y presentado por las moléculas de MHC de un paciente dado y
reconocido por el repertorio de LT presente en ese paciente; por tanto cada mutación
que se genera aumenta las posibilidades de que se forme un neoantígeno (191).
Los neoantígenos se pueden dividir (192) en neoantígenos dominantes, aquellos
que inducen de forma espontánea la respuesta inmune y subdominantes, aquellos que
requieren una inmunización previa para generar una respuesta inmune. Lo interesante de
esta clasificación es que, si un neoantigeno dominante es eliminado mediante la inmuno
edición, los neoantígenos subdominantes pueden ser una diana prometedora para la
inmunoterapia.
INTRODUCCIÓN
56
Actualmente, se considera la carga mutacional de un tumor como un factor
relevante en el resultado de diferentes tratamientos, lo que está reforzando el papel de
este tipo de antígenos como dianas en las diferentes estrategias terapéuticas.
5.4. Mecanismos de evasión
Durante la progresión tumoral se generan múltiples mecanismos inmunosupresores
que conducen a la evasión del reconocimiento inmune o a la desactivación de los
mecanismos efectores de LT antitumorales:
5.4.1. Modulación de la expresión de antígenos
La pérdida de expresión de antígenos tumorales produce la evasión de la
respuesta inmunitaria mediada por los LTc por parte del tumor (193). La disminución
de la expresión podría deberse a la presencia de antígenos inmmunodominantes (194).
Esta teoría postula que las variantes tumorales en combinación con la pérdida antigénica
son capaces de evadir la respuesta inmunitaria porque las células tumorales parentales
que poseen el Ag inmunodominante sirven como dianas para el ataque inmunitario,
consiguiendo desviar la atención de las variantes menos inmunogénicas.
5.4.2. Alteraciones en la expresión MHC-I
Gran cantidad y diversidad de tumores humanos presentan anomalías en la
expresión de las moléculas HLA-I que constituyen una enorme ventaja en el
crecimiento y el desarrollo neoplásico. El defecto en la presentación antigénica derivado
de las alteraciones HLA bloquea directamente el reconocimiento de péptidos tumorales
y, por tanto, la acción de los LTc frente al tumor, iniciándose el escape tumoral a la
inmunovigilancia.
Los mecanismos moleculares implicados en las alteraciones de la expresión de
moléculas HLA pueden afectar a los genes de cadena pesada, al gen que codifica la
cadena β2 microglobulina o a la maquinaria de procesamiento antigénico (195–198). En
INTRODUCCIÓN
57
la mayoría de los casos donde se produce una disminución de la actividad de la
maquinaria de procesamiento antigénico, la expresión se recupera tras el tratamiento
con IFN-γ (199), lo que sugiere que esta disminución de la expresión se debe a un
fenómeno epigenético reversible.
5.4.3. Células inmuoreguladoras y secreción de citoquinas
En el microambiente tumoral se localizan poblaciones de células efectoras de
origen mieloide y linfoide que, inducidas por el efecto de factores derivados del tumor,
contribuyen a potenciar una red inmunosupresora que perjudica a la efectividad de la
inmunidad innata o adaptativa. Entre estas poblaciones están los macrófagos asociados
a tumor (TAM); normalmente tienen a polarizar hacia M2 (200), con capacidad para
suprimir la activación y la proliferación de los LT y la función de células NK mediante
la liberación de IL-10, TGF-β y prostaglandinas. La polarización hacia M2 viene
ayudada por los fibroblastos asociados a tumor que además modulan el
microambiente tumoral hacia un fenotipo Th2. Otra de las poblaciones las constituyen
las células supersoras de origen mieloide (MDSC), con capacidad de inhibir la
producción de INF-γ por parte de los LTc en respuesta a péptidos generados a partir de
Ags tumorales presentados en la superficie de las MDSC (201). Los linfocitos Treg
son otra de las poblaciones que contribuyen a mantener y propagar el ambiente tumoral
tolerogénico e inmunosupresor. Por último, están las DCs, que por un defecto en su
activación son las responsables del escape tumoral ya que vuelven anérgicos y
tolerantes a los LTh1 y LTc por un fallo en la señal co-estimuladora. Además, diversos
factores derivados del tumor pueden actuar de forma directa sobre las células
linfocitarias (TGF-β, IL-10), o de forma indirecta (VEGF, PGE2) sobre poblaciones de
APC para hacerlas no estimuladoras o tolerogénicas. Otra enzima que está teniendo en
los últimos años un gran interés en el contexto de los tumores es la enzima indolamina
2,3-dioxigenasa (IDO), esta enzima está regulada por varios estímulos inflamatorios,
teniendo un efecto inmunosupresor que induce la inmunotolerancia y suprime la
actividad de los LT (202,203). IDO está sobre expresada en una alta variedad de
tumores humanos y algunos estudios la correlacionan con la progresión de la
enfermedad y una reducción en la supervivencia (204).
INTRODUCCIÓN
58
5.4.4. Moléculas inhibitorias
La falta de moléculas co-estimuladoras en las células tumorales puede inducir
fenómenos de anergia de los LT preinmunes o apoptosis. También se han descrito
moléculas que trasmiten señales inhibitorias al interior del LT como CTLA-4. Además,
en las células tumorales se expresan diversas moléculas, como PD-L1, que al fijarse a su
receptor PD-1 de los LT activados puede inhibir la función efectora de éstos. La
ausencia de señales co-estimuladoras y/o el aumento de señales inhibidoras disminuyen
los efectos antitumorales de los LT.
5.4.5. Defectos en la señalización mediada por TCR
Las regiones hipervariables CDR 1, 2 y 3 del TCR en el LT son las que
interaccionan con el péptido presentado por la molécula MHC. La especificidad y la
activación del linfocito quedan restringidas al reconocimiento del péptido cuando ha
sido procesado y presentado en una MHC específica (205).
En el tumor, a pesar de que el antígeno pueda ser presentado mediante una molécula
MHC y se genere la sinapsis inmunológica, el propio tumor induce la disrupción de la
activación del LT en los diferentes pasos de la señalización; bloqueando la actividad de
la tirosina quinasa, el flujo de calcio, la disociación temprana del CD8 del propio TCR o
actúa sobre funciones dependientes de la actividad lítica para inhibir la fase efectora de
los LTc (206) entre otros. Las bases bioquímicas de cómo genera estas alteraciones no
están establecidas.
6. MELANOMA
El melanoma es un tipo de cáncer que se origina en los melanocitos o células
pigmentadas de la piel. Representa un 3% de las neoplasias cutáneas, pero en cambio
supone el 65% de las muertes por cáncer de piel (163). El riesgo de sufrir esta
enfermedad durante el curso de la vida, ha pasado de una de cada 1500 personas en
1935 a una de cada 40 en 2018 (163).
INTRODUCCIÓN
59
En el melanoma se pueden diferenciar dos tipos de crecimiento, el radial y el
vertical. Durante la fase radial el tumor crece en sentido superficial, pero no en
profundidad, debido posiblemente al control del sistema inmunitario. Este tipo de
crecimiento puede durar meses o años. El crecimiento vertical, se da con posterioridad
al radial (o al mismo tiempo) y aparece cuando el sistema inmunitario ya no puede
controlar el crecimiento tumoral. Diversos factores están implicados en el crecimiento
vertical, tanto del huésped como de las células tumorales: la angiogénesis, la
adhesividad celular, los factores de crecimiento, las citocinas, los linfocitos reguladores
y efectores entre otros. Precisamente este crecimiento en profundidad se utiliza para el
estadiaje de la enfermedad y como factor pronóstico. Además de las características del
tumor primario, también se tienen en cuenta el grado de afectación ganglionar (N) y la
existencia de metástasis (M).
Los factores de riesgo del melanoma incluyen una combinación de predisposición
genética y la exposición a factores ambientales. El gen que más se ha estudiado, por
desempeñar un papel predominante en el desarrollo neoplásico, es el del inhibidor de
quinasas dependiente de ciclina 2 (CDKN2) o p16INK4a. Este gen se encuentra
alterado frecuentemente en líneas celulares de melanoma esporádico y también en
pacientes con presentación familiar. Por otro lado, se ha demostrado que
aproximadamente el 60% del melanoma adulto tiene un BRAF V600 oncogénico y
cerca del 20% tiene una mutación NRAS oncogénica (207,208). Estos descubrimientos
se han traducido rápidamente a la clínica, con resultados prometedores que utilizan la
terapia dirigida contra BRAF (209).
Además, la exposición intermitente a la luz solar hace que el DNA de los
melanocitos absorba las radiaciones ultravioletas, produciéndose lesiones moleculares
que estimulan la división celular y la producción de melanina que contribuyen a
desarrollar esta neoplasia.
La evidencia de la regresión mediada por células T de los cánceres humanos, en
particular en el melanoma después de la inmunoterapia está consolidada
. Las reactividades de las células T están involucradas en la regresión del cáncer
inducida por inmunoterapia (210) y se ha sugerido que el reconocimiento de epítopos
mutados específicos del paciente es un componente potencialmente importante (211).
INTRODUCCIÓN
60
6.1. Melanoma infantil
El melanoma en los niños es raro (212), pero su incidencia sigue aumentando,
especialmente en adolescentes y adultos jóvenes (213). Aunque el melanoma infantil es
en su mayoría una afección esporádica, ciertos factores predisponentes como el
xeroderma pigmentoso (XP), los antecedentes familiares de melanoma y la presencia de
un nevo melanocítico congénito (CMN) grande/gigante aumentan el riesgo de
desarrollar melanoma en la vida temprana (214).
Se cree que el desarrollo de melanoma es el resultado de la adquisición secuencial
de múltiples mutaciones que cooperan para inducir una malignidad manifiesta. El
primer evento es la adquisición de una mutación en la vía de la proteína quinasa
RAS/RAF/ mitógeno que promueve la proliferación melanocítica. Sin embargo, las
mutaciones oncogénicas en BRAF y NRAS son insuficientes por sí mismas para el
desarrollo del cáncer, como lo demuestra su presencia en los nevos (215–217). Eventos
genéticos adicionales, como la interrupción de la vía supresora de tumores RB/p16, la
activación de la vía del fosfatidilinositol 3 quinasa/AKT y la reactivación de los
mecanismos de mantenimiento de los telómeros, son necesarios para la transformación
maligna (218,219).
7. LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA (LLC)
La LLC es la forma de leucemia más frecuente en los países occidentales (220),
aumenta su incidencia con la edad y presenta mayor prevalencia en hombres que en
mujeres (221). La LLC representa el 0,8 % de todos los cánceres y existen diferencias
en la frecuencia según las razas y países (222), representa un cuarto de todas las
leucemias, con una incidencia de alrededor 3-7 casos por 100.000 hab/año (223),
alcanzando una incidencia de 12-15/100.000 en pacientes mayores de 60 años. La
mediana de supervivencia de los pacientes con LLC es de 8-10 años, aunque algunos
pacientes fallecen pocos meses después del diagnóstico mientras que otros sobreviven
durante más de 10 años sin necesidad de ser tratados (224). El curso largo de la
enfermedad abre una ventana para el uso de inmunoterapia en la misma. De hecho, una
de las aproximaciones más relevantes para el tratamiento de la enfermedad viene de la
INTRODUCCIÓN
61
inmunoterapia con linfocitos T modificados por un receptor quimérico contra un
antígeno (CAR, del inglés Chimeric Antigen Receptor) que en el caso del anti-CD19 ha
demostrado claramente que es una opción terapéutica posible.
7.1. Características de la LLC
La LLC se caracteriza por la proliferación y acumulación de linfocitos B
monoclonales, morfológicamente maduros pero inmunológicamente inmaduros
(225,226) de pequeño tamaño, aspecto maduro y fenotipo B (227,228) CD5+, con
infiltración progresiva de la médula ósea, ganglios linfáticos y otros tejidos junto con
alteraciones inmunológicas (221). Hasta ahora no se ha demostrado una alteración
genética molecular asociada al desarrollo de la enfermedad (229,230), pero sí se han
descrito diversas alteraciones cromosómicas. La anomalía más frecuente es la
del(13q14) asociada con una mayor supervivencia de los pacientes, seguida por la
del(11q22-q23) que implica la pérdida del gen ATM3 asociada a mal pronóstico y
necesidad temprana de tratamiento, y la trisomía del cromosoma 12 (231,232), también
asociada a mal pronóstico (222). Otra anomalía recurrente es la del(17p13) que implica
la pérdida del gen TP534 que también se asocia a mal pronóstico y supervivencia
reducida de los pacientes (233).
La relación entre la LLC y determinados genes no está clara, aunque el nivel de
expresión del gen Bcl-2 parece tener relación con formas clínicas agresivas y con
resistencia a la quimioterapia. Por otro lado, alrededor del 50% de los casos tienen
mutaciones somáticas en los genes de las Ig, lo que sugiere un origen de la enfermedad
en las células B post-germinales, con memoria inmunológica (234,235).
Los pacientes con LLC pueden clasificarse en dos grupos de acuerdo con el
estatus mutacional de la Ig: aquellos que poseen IgVH no mutadas y aquellos que
poseen IgVH mutadas, teniendo el estatus mutacional un importante valor predictivo.
Pacientes con IgVH mutadas presentan una enfermedad estable con una media de
supervivencia superior a 20 años.
3 ATM Gen cuyo producto proteico es un importante regulador del ciclo celular y la reparación del DNA
en respuesta a daño. 4 TP53 Gen implicado en la regulación del ciclo celular.
INTRODUCCIÓN
62
Otras moléculas con valor predictivo son, ZAP-70, que como ya se ha
comentado anteriormente, participa en la transducción de señales a través de receptores
de activación como es el TCR y CD38, una enzima que sintetiza componentes claves en
la regulación de los niveles intracitoplasmáticos de calcio (236). Pacientes positivos
para alguna o ambas moléculas presentan mayor linfocitosis en sangre periférica e
infiltración medular y requieren tratamiento mucho antes que los pacientes doble
negativos. Otro marcador con carácter pronóstico es la alta expresión (>30%) de la
subunidad α4 de la integrina α4β1 (237).
7.2. Inmunología en la LLC
Desde un punto de vista inmunofenotípico, las células LLC parecen linfocitos
relativamente inmaduros, con expresión de marcadores B (CD19, CD24, CD20 y
CD22), aunque con menor intensidad a la de los linfocitos B maduros normales.
También tienen Ig de superficie, cuya monoclonalidad viene determinada por la
expresión de una única cadena ligera (κ o λ), aunque su nivel de expresión en la
superficie es bajo. Las células LLC también expresan CD5, un antígeno inicialmente
descrito como específico de LT (222,238,239), CD23, un marcador de activación de
células B (240) y en un 50% de los casos CD25, otro marcador de activación celular
(241,242).
Una característica de las células LLC es que todas presentan un fenotipo de LB
que ha sido activado por el Ag (243) y, dependiendo de esa activación antigénica se
favorece o no el proceso de hipermutación somática. No se conocen los Ags implicados
en esta activación, pero se ha visto que alrededor de un 20% de los pacientes con IgVH
no mutada poseen Ig muy similares, lo que sugiere que estas células han sido
seleccionadas por un mismo Ag o por un conjunto limitado de determinantes
antigénicos.
Desde el punto de vista de la inmunidad celular, existen alteraciones de los
linfocitos T, con aumento en el valor absoluto, alteración del cociente CD4/CD8 en
sangre periférica por un aumento de los LTc circulantes debido a una prevalencia de los
LTh en la médula ósea y en los ganglios comprometidos, junto con una disminución del
crecimiento de los LT en cultivo inducido (244). Por otro lado, la expresión de los genes
INTRODUCCIÓN
63
LTh1 está aumentada, aunque no se asocia con la progresión de la enfermedad. El
número de LTh2 se ha visto elevado en los pacientes que no progresan en comparación
con los que si lo hacen (245), algo que confirma la mayor secreción de IL-4 durante la
progresión de la enfermedad (246).
Los pacientes con LLC tienen una mayor susceptibilidad a las infecciones
bacterianas recurrentes debido a la hipogammaglobulinemia; defectos de la respuesta
inmune celular T, así como disfunciones de los neutrófilos y del sistema de
complemento pueden contribuir también al aumento de la susceptibilidad de estos
pacientes a las infecciones (247). En estos pacientes también se han observado
fenómenos autoinmunes contra componentes sanguíneos y una mayor incidencia de
neoplasias, alrededor de un 10% de los pacientes presentan carcinomas de piel, tubo
digestivo y pulmón.
7.3. Tratamiento de la LLC
Actualmente no existe un tratamiento curativo para la LLC, aunque en los últimos
años, nuevos tratamientos han aumentado las tasas de respuestas, como los análogos de
las purinas y los anticuerpos monoclonales. De aquí la importancia que tiene la
identificación de marcadores biológicos e inmunológicos con valor predictivo que
posibiliten un mejor tratamiento terapéutico. Por ejemplo, puesto que cada clon
linfocitario produce una inmunoglobulina concreta, con su propio idiotipo, estas
regiones específicas se han considerado como dianas de alta especificidad en el diseño
de vacunas frente a este tipo de neoplasias hematológicas.
8. ESTRATEGIAS DE INMUNOTERAPIA
La inmunoterapia del cáncer se puede definir como cualquier procedimiento que
modifique el sistema inmunitario y que afecta de manera negativa al crecimiento de un
tumor establecido. Estos procedimientos pueden ser o no específicos para el tumor. La
inmunoterapia especifica implica la utilización de antígenos concretos del tumor como
dianas contra la que se quiere dirigir la respuesta inmunitaria (248,249).
INTRODUCCIÓN
64
8.1. Linfocitos infiltrantes de tumor (TILs)
Son linfocitos que infiltran los tumores sólidos y pueden crecer en suspensión a
partir de la disgregación de los tumores con un medio de cultivo que contenga IL-2
(250). Tienen capacidad de reconocer antígenos específicos de tumor y pueden
mantener la capacidad de lisis específica después de ser expandidos y altamente
activados ex vivo.
Por ejemplo, en pacientes con melanoma aproximadamente el 70% de los linfocitos
obtenidos exhiben lisis específica de tumor o secreción de citoquinas cuando se expone
al tumor autólogo (251).
Aunque en términos generales, la capacidad de reconocer el tumor autólogo por
parte de los LTc intratumorales está limitada a un 10% de éstos (252), se ha visto que
los TILs son capaces de mediar la regresión del tumor aunque sólo estén dirigidos frente
a un neoantígeno concreto (253).
El tratamiento con TILs ha demostrado su eficacia y su capacidad antitumoral
pero no ha dado los resultados esperados. Una nueva estrategia puede centrarse en
seleccionar in vitro aquellos clones que reconocen el tumor y muestran una actividad
citotóxica contra antígenos después de la expansión de los TILs para mejorar la
especificidad de reconocimiento, pero también debe asegurarse que los LT inoculados
lleguen al tumor. El análisis de linfocitos con especificidad antitumoral que expresan
TCR específicos de tumor ha permitido definir ciertos elementos que influyen en la
eficacia de la inmunoterapia antitumoral con linfocitos T y diseñar estrategias para
maximizar su actividad. La cantidad de linfocitos administrados y más en concreto el
número de linfocitos con especificidad antitumoral parece estar asociados con la
eficacia a la terapia, pero también parece tener importancia el grado de diferenciación
de éstos, ya que se ha observado que a pesar de que la actividad citotóxica de los
linfocitos contra el tumor in vitro aumenta de manera progresiva con la diferenciación,
su actividad antitumoral in vitro disminuye (254). El grado de diferenciación está
asociado con la pérdida de su habilidad de producir IL-2, su capacidad proliferativa y de
su habilidad para extravasar a tejidos linfáticos y mediar en la regresión tumoral
(254,255). Algunas estrategias incluyen la expansión con citocinas alternativas (IL-7,
IL-15 o IL-21), la inhibición de la diferenciación farmacológicamente o modificar
INTRODUCCIÓN
65
genéticamente los linfocitos para que expresen TCR con especificidad anti-tumoral
(256).
La administración de quimio o de radio puede eliminar células inmunosupresoras
y pueden tener un efecto inmunoestimulador a través de la activación de APC. Además,
la necrosis tumoral inducida por la radiación o la quimioterapia causa la liberación de
Ag que pueden ser captados y presentados por las APC, lo que a su vez puede contribuir
a la activación de los linfocitos administrados.
También se ha conseguido la expansión de linfocitos antitumorales a partir de
sangre periférica mediante la estimulación repetida con un antígeno tumoral in vitro
(257).
Además, en un gran número de tumores, como en el caso del melanoma,
carcinoma de ovario, carcinoma de colon y cáncer de cuello, la presencia de TILs se usa
como marcador pronóstico (258–260).
8.2. Terapia celular adoptiva con terapia génica
El tratamiento celular que está consiguiendo mejores resultados consiste en
células T modificadas genéticamente, que expresan una proteína de fusión formada por
los dominios de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal (que le da la especificidad
a la célula T), junto con los dominios de señalización de las moléculas que dan la
primera (CD3) y segunda señal (CD28 o CD28 más CD137) de activación. Esta célula
T que expresa el receptor quimérico de antígeno (CAR) tiene la capacidad de reconocer
estructuras en la superficie de las células diana sin necesidad de ser presentadas vía
MHC, ya que el receptor CAR tiene la misma especificidad y “modo de acción” que el
anticuerpo monoclonal que le cede la región de reconocimiento (261). La especificidad
monoclonal de los CARs representa un ataque muy dirigido a una molécula diana, lo
que puede dar lugar a una deriva antigénica por parte del tumor y escapar a la respuesta
inmune mediada por CARs.
Otra estrategia consistiría en células T modificadas genéticamente que expresan
un TCR frente a un Ag concreto del tumor, rompiendo así la tolerancia hacia el tumor.
INTRODUCCIÓN
66
Este tipo de terapia podría generar una inmunidad de tipo “viral” frente a los Ags de un
tumor (262).
8.3. Anticuerpos inmunomoduladores
Se han desarrollado anticuerpos que consiguen bloquear las moléculas de
expresión inhibidoras de la inmunidad como son CTLA-4, PD-1/PD-L1, para evitar la
inhibición del sistema inmune por parte del tumor. El uso de estos fármacos ha
demostrado la importancia que juega el sistema inmune en la respuesta antitumoral. Con
estos tratamientos se ha observado que una vez desaparece dicha inhibición, el sistema
inmune vuelve a funcionar en condiciones óptimas, con buenos resultados al
tratamiento.
El uso de estos fármacos genera reacciones adversas, sobre todo de tipo
autoinmunitario por la inhibición de la tolerancia inmunológica. La respuesta al
tratamiento en pacientes que desarrollaban efectos adversos de grado II o superiores se
ha correlacionado con respuestas claramente mejores que la de los pacientes que no
presentaban toxicidad (263).
Una consecuencia importante del uso clínico de estos anticuerpos moduladores
del sistema inmunitario ha sido el cambio de paradigma en los métodos de valoración
de respuesta al tratamiento, aceptando una valoración de la respuesta a más largo plazo,
ya que las acciones antineoplásicas son indirectas y puede verse un retraso en la
aparición de la respuesta (no a 1-3 meses como se valoran las quimioterapias). Este
cambio en la valoración de la respuesta da por válidos muchos resultados obtenidos con
inmunoterapia celular que antes no se consideraban eficaces (264).
8.4. Vacunas terapéuticas
El uso de células tumorales completas (lisadas y/o atenuadas) para generar una
respuesta inmune antitumoral se ha empleado como abordaje terapéutico desde hace
varias décadas, así como el uso de adyuvantes para potenciar la respuesta, como podrían
ser el Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) (265) o el virus de la enfermedad de Newcastle
INTRODUCCIÓN
67
(266). Debido a la dificultad de trabajar con líneas tumorales y a la posibilidad de
generar fenómenos de autoinmunidad a consecuencia de la presencia de antígenos no
tumorales en la vacuna de células completas (267), se ha intentado otro abordaje de
vacunación, utilizando péptidos derivados de antígenos tumorales.
La NGS ha permitido entender que las mutaciones implicadas en la
transformación maligna de las células tumorales tienen gran relevancia en la inmunidad
antitumoral, pudiendo considerarse buenas dianas para el desarrollo de vacunas, ya que
son secuencias extrañas para el organismo y por tanto no se ha inducido tolerancia
inmunológica contra ellas. Los resultados preliminares de ensayos clínicos donde
utilizan vacunas basados en neoantígenos tumorales demuestran que este tipo de
vacunas son seguras y pueden inducir respuestas específicas frente al tumor (268).
Se han intentado desarrollar vacunas que tienen como diana neoantigens que
contienen mutaciones frecuentes (269). Sin embargo, la mayoría de las mutaciones son
únicas de cada paciente, por tanto, para cada paciente se deben seleccionar los
neoepítopos obtenidos de su propio mutanoma que generen una fuerte respuesta
inmunológica. Una gran limitación de este tipo de aproximaciones es que, de todo el
mutanoma sólo una pequeña fracción (1%) de éstos son capaces de generar una
respuesta inmune espontánea (270).
En la actualidad, se está procesando la enorme cantidad de datos obtenidos en
relación con neoantígenos para identificar biomarcadores que permitan seleccionar los
neoantígenos más inmunogénicos sin que generen efectos adversos de autoinmunidad
por reacciones cruzadas con su versión no mutada (271).
A pesar de que muchos cánceres son constitutivamente MHC-II negativos, en
los últimos años, estudios in vitro han demostrado que los LTh reconocen un amplio
número de neoantigenos y poseen una gran actividad antitumoral (272,273). Por tanto,
el reconocimiento tumoral por parte de los LTh requiere de la presentación los péptidos
por parte de las DCs en el microambiente del tumor o en los ganglios linfáticos
adyacentes (272–274). De manera muy interesante la mayoría de los antígenos
restringidos a MHC-II que son reconocidos por células reactivas LTh son antígenos
mutados o proteínas de fusión.
INTRODUCCIÓN
68
9. MONITORIZACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA
9.1. Fenotipificación mediante citometría
La citometría de flujo es una herramienta básica para identificar cambios en las
subpoblaciones linfocitarias o la cuantificación de citocinas producidas en cultivos que
definen parámetros de la función linfocitaria para poder definir como se desarrolla una
respuesta inmunitaria in vivo.
La citometría de flujo se ha visto ampliamente desarrollada con la citometría de
masas que permite aumentar el número de parámetros que se pueden estudiar
simultáneamente haciendo uso de iones de metales pesados para el marcaje de los
anticuerpos (275). Otra revolución en citometría consistió en la utilización de
tetrámeros para el estudio de la especificidad T. Está aproximación se basa en utilizar
varios pMHC idénticos unidos a una molécula tetramérica que incrementa la interacción
con los TCRs y estabiliza la unión específica TCE-pMHC para que se pueda medir por
citometría.
9.2. Estudio de neoantígenos
La introducción de la NGS está abriendo la posibilidad de caracterizar a nivel
personalizado los antígenos tumorales producidos por mutaciones somáticas. Para ello,
se compara la secuencia genómica del tejido canceroso con la secuencia de células no
transformadas del mismo paciente identificando las alteraciones genómicas dentro del
tumor. La mayoría de las mutaciones no generan neoantígenos, y las que los forman son
generalmente no esenciales para la progresión del tumor y únicas de cada paciente
(276).
9.2.1. Modelos bioinformáticos de predicción de afinidad
Existe la posibilidad de predicción de péptidos inmunogénicos por análisis
bioinformático (in silico) predictivo de las secuencias mutadas (mutanoma) que se
pueden presentar por los diferentes alelos HLA del paciente. Los estudios del mutanoma
han determinado que los tumores sólidos contienen entre 50 y miles de mutaciones
somáticas, las cuales difieren entre diferentes individuos, incluso tratándose del mismo
INTRODUCCIÓN
69
tumor (269). La afinidad diferente entre un péptido mutado y su original (WT, del
inglés wild type) y la estabilidad conformacional del péptido en su interacción con la
moléculas de MHC, son las 2 propiedades que se correlacionan con la posibilidad de
que un neopéptido sea reconocido por los LTc (277).
De este modo es posible definir neoantígenos candidatos del tumor para cada
paciente que, a pesar de que necesitan validación funcional, pueden permitir la
identificación de los antígenos diana para un paciente y su tumor.
II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
73
La evaluación de la respuesta T antígeno específica es fundamental para
comprender y poder llegar a modular enfermedades tan diversas como infecciones,
enfermedades autoinmunes y respuestas anti-tumorales. La detección específica de los
linfocitos T, si bien es central para comprender la respuesta inmune, es una actividad de
compleja realización. Esta dificultad se explica principalmente porque el
reconocimiento de antígenos se realiza de manera simultánea a las moléculas de
histocompatibilidad (HLA), lo que conlleva combinar la altísima variabilidad antigénica
(millones de opciones) con la también alta variabilidad de las moléculas HLA (miles de
alelos).
Como HIPÓTESIS de esta tesis postulamos que se pueden diseñar mejores
aproximaciones imnunoterápicas centradas en los linfocitos T mediante el estudio in
silico del abanico de antígenos naturales (TNA, gripe) así como los antígenos
específicos mutados (neopéptidos) de pacientes con Leucemia Linfática Crónica (LLC)
que deberán posibilitar respuestas clínicas más eficaces y específicas.
.
OBJETIVOS
Como objetivo general de la presente tesis se plantea definir parámetros o
aspectos de la respuesta inmune T generada frente a péptidos y neopéptidos específicos
definidos in silico en 5 situaciones inmunopatológicas concretas:
a) anti HPA-1a, en trombopenia neonatal aloinmune (TNA);
b) contra el virus de la gripe (H1N1 y H3N1) basal y post-vacunación;
c) anti-HLA-DRB3 como aloantígeno en trasplante;
d) contra péptidos específicos mutados en pacientes con LLC (neopéptidos);
e) respuesta específica al melanoma.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
74
Así mismo, la realización de dicha aproximación conlleva unos objetivos específicos:
1. Definir bioinformáticametne los neopéptidos del “mutanoma” en base a
niveles de afinidad frente a las moléculas HLA específicas de cada paciente
2. Evaluar la inmunogenicidad y especificidad de los linfocitos Tc y Th frente a
los neopéptidos seleccionados.
3. Definir la evolución del repertorio celular T como un parámetro para la
monitorización de la respuesta anti-tumoral.
4. Valorar la variación de la frecuencia de los linfocitos T CD4+ frente a los
epítopos de la gripe.
5. Evaluar el papel de los anti-DRB3 como aloantígeno en pacientes
hipersensibilizados en lista de espera de trasplante renal.
6. Evaluar el CNV de las moléculas complementarias de DRB1, DRB3, DRB4 y
DRB5 en diferentes enfermedades; TNA, Diabetes y Esclerosis múltiple.
7. Precisar parámetros que permitan definir la presencia de los linfocitos T
CD4+ frente a los epítopos HPA-1 en madres de neonatos con TNA.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
77
1. ESTUDIO IN SILICO DE LA AFINIDAD DE PÉPTIDOS POR
MOLÉCULAS HLA
1.1. Determinación de neopéptidos
A partir de la comparación de las secuencias entre tejido normal y células
tumorales, se identificaron las mutaciones somáticas presentes y/o expresadas en las
células del tumor en los pacientes con LLC y en los pacientes con melanoma. A
continuación, con las mutaciones puntuales detectadas que codifican cambios
aminoacídicos, se generaron todos los posibles péptidos concatenados de 8-11 aa para
clase I y de 9-19 aa para clase II que contuviesen dichas mutaciones (Fig. M1).
Figura M1: Flujo de trabajo de una terapia personalizada. Para la selección de los neopéptidos pacientes
específicos que posean mayor inmunogenicidad para llegar a conseguir una terapia personalizada efectiva.
MATERIALES Y MÉTODOS
78
Para todos los péptidos obtenidos, se estudió la afinidad de unión con todas las
moléculas HLA que posibilita el software NETMHCpan 3.0-4.0 para las moléculas
HLA de clase I y NETMHCIIpan 3.1 para las moléculas HLA de clase II y se
seleccionaron en función de la afinidad.
Los diferentes parámetros de afinidad se definieron como se muestra en el Figura M2:
Figura M2: Esquema explicativo de la selección de los neopéptidos en función del %Rank. El %Rank se define a
partir de la comparación de un conjunto de 200000-400000 péptidos naturales lo que evita las desviaciones que
generan las afinidades de predicciones anteriores y que utilizan distintos algorítmos. Los parámetros de afinidad se
establecen de forma diferente en función si las moléculas son de clase I o clase II.
En todos los casos el péptido WT tenía menos afinidad que el mutado, en el caso
contrario ese péptido no fue estudiado.
Para reducir el número de péptidos a estudio y centrarnos en los péptidos de
proteínas que se expresaran en el tumor, se estudió el grado de expresión de las
proteínas que contenían neopéptidos con elevada afinidad a las moléculas HLA
específicas del paciente.
Los programaos NETMHCpan 3.0 y NETMHCIIpan 3.1 también fueron
utilizados para la predicción de unión de las distintas moléculas HLA frente a las
distintas moléculas HLA-DRB y para la predicion de los neopéptidos en los 2 pacientes
con melanoma en los que monitorizó la respuesta anti-tumoral.
% Rank
HLA-I
SB<0.5%
WB 0.5-2%
>2%
Sin unión
HLA-II
SB<20%
WB 20-90%
>90%
Sin unión
MATERIALES Y MÉTODOS
79
Si el RPKM (reads per kilobase of transcript per million mapped reads) oscilaba
entre 3 y varios cientos (determinado mediante RNA-seq) fueron sintetizados para su
estudio funcional.
1.2. Tipificación HLA
Para determinar la tipificación HLA de los pacientes con LLC, las secuencias
WES o WGS generadas dentro del proyecto del Consorcio de Genoma de la Leucemia
Linfática Crónica y utilizando el programa de tipificación para NGS NGSengine®
(GenDX, Holanda) se determinaron los alelos HLA-A, B, C, DR, DQ de 506 pacientes.
Para aquellos alelos que no había una cobertura mínima (establecida en 10x) se utilizó
la tecnología PCR-SSO (del inglés, Sequence Specific Oligonucleotides) para su
tipificación. Para ello, se amplificó 20-80 ng de DNA con los cebadores de los kits
Lifecodes HLA eRes Typing kit (GenProbe, Alemania) siguiendo las instrucciones del
fabricante y se analizaron mediante el programa Match it DNA.
2. SEPARACIÓN CELULAR
A partir de sangre heparinizada obtenida por venopunción se separaron las células
mononucleadas de sangre periférica (PBMCs, del inglés Periferial Blood Mononuclear
Cells) mediante gradiente de densidad con Ficoll-Paque PLUS® (GE Healthcare®).
Para ello, la sangre diluida en PBS se centrifugo en tubos de 50 ml sobre 12 ml de Ficoll
durante 25 min a 700 g y temperatura ambiente (T.A), a continuación, se recogió la capa
de la interfase y finalmente se lavó un mínimo de 2 veces mediante centrifugación.
3. CULTIVOS CELULARES
Los ensayos con PBMCs se realizaron mediante cultivo en medio X-Vivo 15
(Lonza) suplementado con suero humano AB 10% y 1% de Penicilina-Streptomicina
(Gibco BRL). En este trabajo este medio se referirá como MC (medio completo). El
mantenimiento de los cultivos celulares se hizo en incubadoras estándar (Thermo
MATERIALES Y MÉTODOS
80
scientific), a una temperatura constante de 37 ºC y a una presión parcial de CO2 del 5%,
en placas o en frascos de cultivo con tapón ventilado según las necesidades del
experimento.
4. ANTÍGENOS
4.1. Péptidos
Los distintos péptidos utilizados en este trabajo fueron sintetizados por la empresa
ProteoGenix SAS (Francia). La pureza de los péptidos fue analizada por HPLC y fue
superior al 95%. Los péptidos llegaron liofilizados al laboratorio donde se
resuspendieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 20 mg/ml.
4.2. Líneas celulares primarias
A partir de biopsias frescas se realizó fragmentación mecánica y se cultivaron en
placas de 6 pocillos con medio DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-
estreptomicina y anfotericina B (Gibco BRL®) al 1%. El medio se cambio 2-3 veces
por semana hasta obtener una densidad de más del 80% de la superficie de los pocillos.
Con este crecimiento, las células se triptinizaron y se siguieron cultivando en frascos
con tapón ventilado para conseguir las cantidades necesarias usadas.
5. SEPARACIÓN DE POBLACIONES
5.1. Linfocitos T CD4+ o con depleción de LT CD4+ CD25+
A partir de PBMCs obtenidas mediante ficoll, los linfocitos T CD4+ se
aislaron mediante separación magnética negativa con el kit CD4+ T Cell Isolation Kit II
human de Miltenyi Biotec® según las instrucciones especificadas en el manual del
fabricante y utilizando el separador celular autoMACS Pro Separator MACS® (Miltenyi
Biotec®).
La obtención de los linfocitos convencionales CD4+CD25- (Tconv) se consiguió
mediante la depleción de los linfocitos T reguladores, para este proposito se utilizó el kit
MATERIALES Y MÉTODOS
81
de separación magnética positiva CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit human,
ligeramente modificado, sólo se utilizó un pase por la columna para minimizar el daño
celular, añadiendo como fracción positiva el anticuerpo frente a CD25. La separación se
realizó manualmente con columnas MS Colunms (Miltenyi Biotec®).
5.2. Linfocitos T en poblaciones ricas en linfocitos B
Los LT de los pacientes con LLC se aislaron mediante separación magnética
tras incubación con Dynabeads Human T activator CD3/ CD28 (GibcoTM
) a una ratio
3:1 en rotación a 1 rpm durante 2h a TA. Tras la incubación, las células marcadas se
enfrentaron a un imán durante 10 min a TA, se eliminaron las células no unidas al imán
y se recuperó la fracción unida que contenía los LT.
6. PRODUCCIÓN DE TETRÁMEROS HLA DE CLASE II
Los tetrámeros consisten en moléculas HLA solubles y estables que en algunos
casos pueden obtenerse comercialmente, aunque en este trabajo ante no estar
disponibles en las variantes deseadas, fueron producidas por la doctoranda.
Estas moléculas se obtienen mediante la transfección de sus secuencias
codificantes en células S2 de Drosophila capaces de producirlas y secretarlas tras su
inducción con cobre. La purificación de las moléculas MHC-II se realizó por
cromatografía de afinidad. Para conseguir moléculas tetraméricas, se biotinaron en
presencia de BirA añadiendo ATP y biotina overnight en el tampón de BirA disponible
(5 mM Bicine，10 mM ATP, 10 mM MgAcetatate, 50 µM D-Biotin at pH 8,3).
La carga de los monómeros con el péptido se realizó incubando el monómero
soluble a una concentración final de 0,5 mg/ml, con una concentración final de tampón
fosfato 1x que contiene OG 12,5 mg/ml, perfabloc (un cóctel de inhibidores de
proteasas, Sigma-Aldrich®) 5 mg/ml con cantidades saturantes del péptido escogido
(concentración final de 400 µg/ml) en un volumen final de 30 µl durante 3 días a 37ºC.
Durante los 3 días se centrifugaron para evitar la condensación y el último día se
centrifugaron a 14.000 rpm y se cambio de tubo evitando coger el precipitado.
MATERIALES Y MÉTODOS
82
Los pMHC-II se multimerizan con estreptavidina que tiene distintos lugares de unión
para la biotina (4 de promedio en la forma utilizada, Biosource®) y viene marcada con
el fluorocromo PE (0,25 mg/ml), incubando en una relación molar 8:1 de pMHC:
Estreptavidina que facilita la estructuración tetramérica. Para ello se incubaron los 30 µl
de los monómeros con 3 µl de estreptavidina durante 2h a TA, a continuación, se
añadieron otros 3 µl de estreptavidina durante 1 h más (Fig. M3).
Figura M3: Esquema de la producción de tetrámeros de clase II. La producción se inicia mediante la transfección
de los plásmidos de interés en células S2 de Drosophila que tras la inducción con cobre serán secretadas. A
continuación, los monómeros se cargarán con el péptido de interés y finalmente formar estructuras tetraméricas
mediante su unión a moléculas de estreptavidina.
MATERIALES Y MÉTODOS
83
7. CULTIVOS
7.1. Cultivos in vitro
Según las necesidades del ensayo, las células para los cultivos fueron distintas;
para cultivos con PBMCs totales, 5*106 de células fueron cultivadas en MC
directamente. En el caso de células seleccionadas negativamente, la fracción positiva se
utilizó como fuente de APCs, para ello, 2,5*106 células se incubaron en una placa de 48
pocillos durante 1 h a 37ºC para facilitar la adhesión de los monocitos. A continuación,
los pocillos se lavaron un par de veces con MC para eliminar todas las células no
adheridas y se sembraron 2*106 de células T CD4+ o Tconv, según el caso.
En todos los casos se añadió 20 µg/ml del péptido o del conjunto de péptidos de
interés. A día 3, se le añadió IL-2 recombinante (20 UI/ml, Proleukin®) y se fue
controlando el cultivo cada 1-2 días hasta finalizar el cultivo a los 14 días, donde se
procedió al análisis.
7.2. Estudios ex vivo
La especificidad y frecuencia de los linfocitos se estudió mediante selección con
tetrámeros o por la expresión de CD154 en la superficie de LT CD4+ tras la
estimulación con los péptidos a estudio.
En el caso de selección con tetrámeros, las PBMCs se incubaron con Dasatinib® a
37ºC durante 10 min. A continuación, se añadieron 6 µl del tetrámero cargado con el
péptido de interés y tetramerizado con estreptavidina marcada con PE durante 2h a TA.
Para finalizar, los LT específicos se seleccionaron mediante separación magnética con
beads anti-PE y columnas MS Colunms (Miltenyi Biotec®) y se calculó la frecuencia
mediante análisis por citometría de flujo (Fig. M4).
MATERIALES Y MÉTODOS
84
Figura M4: Estudio de la frecuencia de LT específicos mediante citometría de flujo. Los linfocitos a estudio se
incubaron con los péptidos de interés 5h a 37ºC, a continuación, se realizó una separación magnética de los LT
específicos y se analizaron mediante citometría de flujo. Para el cálculo de la frecuencia, el número de eventos del
tubo con los LT seleccionados se interpoló con el número de eventos de la fracción antes de la selección.
Cuando la especificidad de los LT se estudió mediante el aumento de expresión de
CD154, las PBMCs se incubaron con antiCD40 blocking durante 10 min a TA y se
incubaron durante 6 h con 10 µg/ml de los péptidos a estudio. A continuación, las
células se marcaron con anti-CD154-PE durante 10 min a 4ºC. Para finalizar, las células
específicas se seleccionaron mediante separación magnética con beads anti-PE y
columnas MS Colunms (Miltenyi Biotec®).
8. EXPANSIÓN RÁPIDA DE LINFOCITOS (REP)
Para poder realizar todos los experimentos y estudiar el cambio en las poblaciones
y en el repertorio de los linfocitos y ser lo más parecidos a las condiciones de terapia
adoptiva celular, se realizó, según el caso, una expansión rápida de linfocitos de algunas
de las muestras: TILs, LT purificados de sangre periférica o de PBMCs.
Para ello se cultivaron durante 14 días 100.000 células con 10-20 millones de
feeders irradiadas, 0,2 µl/ml de anti-CD3 (Miltenyi Biotec®) y 6.000 UI/ml de IL2
(Proleukin®, Novartis). Al igual que en los cultivos in vitro, el quinto día se cambió la
mitad del medio y se fue controlando y añadiendo medio enriquecido con 3.000 UI/ml
MATERIALES Y MÉTODOS
85
de IL2 según las necesidades del cultivo, en días alternos hasta finalizar el cultivo (Fig
M5).
Figura M5: Expansión rápida de linfocitos (REP) a partir de PBMCs, TILs o LT purificados de sangre
periférica. Los LT de interés, purificados inicialmente de tumor o sangre o incluidos en una población mixta de
PBMCs, se cultivaron durante 14 días con células feeders, anticuerpo anti-CD3 y altas dosis de IL2 para obtener una
población final altamente purificada de LT. Los LT se expandieron una ratio de 20 hasta 500 veces el número inicial
de LT.
9. ESTUDIO DE CITOTOXICIDAD
Para el estudio de la evolución del repertorio celular T durante la monitorización
de la respuesta anti-tumoral, se determinó la capacidad citotóxica de los linfocitos del
paciente obtenidos en distintos puntos del seguimiento. Con este propósito, las
diferentes líneas tumorales de las que disponíamos se co-cultivaron con distintas
proporciones de linfocitos del durante 12h. Tras la incubación, se estudió la producción
de LDH por las células dañadas en el sobrenadante mediante el kit Cytotoxicity
Detection Kit (LDH) de Roche® siguiendo las instrucciones del fabricante, en donde se
midió la densidad óptica (DO) a 405 nm y se comparo con el control positivo
MATERIALES Y MÉTODOS
86
10. MARCAJE Y DETECCIÓN DE ANTÍGENOS CELULARES
POR CITOMETRÍA DE FLUJO
Las tinciones se realizaron en placas de 96 pocillos de fondo en “U”. La lectura se
hizo en un citómetro FACS CANTO II® (BD).
10.1. Antígenos de superficie
Para la determinación de antígenos de superficie, se bloquearon 200.000 células
con PBS al 10% de FBS durante 10 min a 4 ºC. A continuación, se centrifugaron a 600
g durante 5 min y se descartó el sobrenadante. En el siguiente paso se añadieron los
anticuerpos para los antígenos de interés, marcados con fluorocromos, y se incubaron
durante 20 min a TA. A continuación, las muestras se lavaron dos veces con exceso de
PBS, centrifugando a 600 g durante 5 min.
10.2. Antígenos intracelulares
Para la determinación de antígenos intracelulares, las células se cultivaron a 37 ºC
con MC durante 5 h en presencia de monensina (que inhibe el tráfico de las proteínas en
el Aparato de Golgi, BD) junto a los péptidos de interés (10 µg/ml) en distintos pocillos.
En otro de los pocillos, se añadieron estímulos inespecíficos: PMA (50 ng/ml) y
Ionomicina (1 μg/ml) (Sigma Adrich) como control positivo de la técnica. A
continuación, se lavaron las células, se bloquearon con PBS al 10% de FBS y se tiñeron
los antígenos de la superficie celular, con anticuerpos específicos marcados con
fluorocromos. Una vez teñidas, las células se fijaron con solución de fijación y
permeabilización (BD) durante 30 min a 4 ºC. El exceso de solución de fijación se
descartó tras centrifugación a 600 g 5 min. Las células se incubaron con los anticuerpos
contra los antígenos intracelulares de interés, diluidos en solución permeabilizarte (BD)
durante 30 min a 4 ºC. A continuación, las células se lavaron para su adquisición en el
citómetro de flujo.
MATERIALES Y MÉTODOS
87
10.3. Tinción de linfocitos Tregs
De la misma manera que en el caso anterior, las células se tiñeron con los
anticuerpos de superficie una vez bloqueadas con PBS al 10% de FBS en oscuridad
durante 10 min a 4ºC. Después de lavar el exceso de anticuerpo con PBS, se fijaron con
la solución de fijación y permeabilización (Miltenyi Biotec®) en oscuridad durante 30
min a 4 ºC. Posteriormente se lavaron (600g 5 min a 4 ºC) e incubaron con la solución
de permeabilización donde se encontraba diluido el anticuerpo intracelular anti-FoxP3-
Vio667 junto con un potenciador de la unión específica del anticuerpo. Finalmente, las
células se lavaron con exceso de PBS a 2.100 rpm 5 min y se adquirieron en el
citómetro de flujo.
10.4. Marcaje con tetrámeros
Para la determinación de linfocitos específicos para un péptido concreto, las
células que han estado en cultivo con los péptidos de interés se incubaron con 1 µl de
tetrámero (cargado con el péptido y conjugado con estreptavidina a 0,5 mg/ml) durante
una hora a 37ºC en un incubador de CO2.
A continuación se procedió a la tinción de superficie durante 20 min a TA, después de
lavar con exceso de PBS a 600 g durante 5 min se eliminó el sobrenadante y se
adquirieron por citometría de flujo.
A continuación, se detallan los anticuerpos monoclonales (AcMo) usados en este
trabajo (Tabla M1):
Anticuerpo Clon Referencia (Si no se especifica son de
BD Pharmingen™)
CD3 BV421 SK7 563798
CD3 APC-Cy7 SK7 557832
CD3 BV510 SK7 740202
CD4 FITC RPA-T4 555346
CD4 BV421 RPA-T4 562424
CD4 BV510 SK3 562970
CD4 APC-Cy7 RPA-T4 557871
MATERIALES Y MÉTODOS
88
CD4 APC SK3 345771
CD8 PerCPCy5.5 RPA-T8 560662
CD8 APC-Cy7 SK1 557834
CD8 PE-Cy7 RPA-T8 557746
CD14 APC-H7 M5E2 561384
CD16 PE B73.1 561313
CD16 BV421 3G8 562874
CD19 BV510 SJ25C1 562947
CD25 PE M-A251 555432
CD25 PerCPCy5.5 M-A251 560503
CD27 PE Cy7 M-T271 560609
CD28 FITC CD28.2 555728
CD39 FITC TU66 561444
CD154 PE TRAP1 555700
CD45RO APC UCHL1 340438
CD45RA PE-Cy7 HI100 560675
CD45RA APC-H7 5H9 561212
CD56 PE-Cy7 B159 557747
CD62L FITC SK11 347443
CD62L APC DREG-56 559772
CD69 PE-Cy7 L78 335792
CD69 APC-H7 FN50 557756
CD127 PE-Cy7 HIL-7R-M21 560822
PD1 APC MIH4 558694
BTLA BV510 J168-540 743985
CCR7 PerCP5.5 150503 561144
CTLA-4 PE BNI3 555853
HLA-DR APC G46-6 560744
HLA-DR FITC G46-6 555811
LAG3 Alexa 647 T47-530 565716
TIM-3 PE 7D3 565560
NKP46 APC 9E2/NKp46 558051
Perforina PE dG9 12-9994-42 (Invitrogen)
MATERIALES Y MÉTODOS
89
Tabla M1: Lista de AcMo. En la tabla se detallan todos los AcMo utilizados en los diferentes experimentos
realizados en este trabajo, también se especifica el clon utilizado y la referencia de la casa comercial.
11. OBTENCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
Para el estudio de la especificidad de LT CD4+ a péptidos de más de 12 aa de
longitud mediante Elispot y en aquellos estudios donde se ha realizado una expansión
rápida de linfocitos o se utilizan TILs que no contienen APCs, se produjeron células
dendríticas para que procesaran dichos péptidos y ejerciesen su función de APC
Primer día: adherencia de los monocitos y diferenciación a célula dendrítica
inmadura. Se tomaron 15 ml de PBMCs resuspendidas a 5 x 106 células/ml y se
distribuyeron en 3 pocillos de una placa de 6 pocillos y se dejaron durante 2 horas en el
CD4-VioGreen REA623 Treg Detection Kit
130-122-994
CD25-VioBright515 REA570 Treg Detection Kit
130-122-994
CD127-PE REA614 Treg Detection Kit
130-122-994
FoxP3-Vio667 REA944 Treg Detection Kit
130-122-994
CD4 PerCP-Cy5.5 SK3 Human Th1/Th2/Th17
Phenotyping Kit 560751
IL17A-PE N49-653 Human Th1/Th2/Th17
Phenotyping Kit 560751
INF-γ-FICT B27 Human Th1/Th2/Th17
Phenotyping Kit 560751
IL4-APC MP4-25D2 Human Th1/Th2/Th17
Phenotyping Kit 560751
CD3 pure OKT3 130-093-387
Miltenyi Biotec
TCR Vb Repertoire Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit
PN IM3497 Beckman Coulter
MATERIALES Y MÉTODOS
90
incubador a 37ºC. A continuación, se recogieron las células no adheridas al plástico
mediante pipeteo suave, que representan el resto de las células que no son monocitos
(principalmente linfocitos T y B, células NK) descritas como PBLs. Se lavaron las
células adheridas con PBS a TA un par de veces y se añadió 5 ml del MC junto con los
factores de crecimiento y diferenciación; IL-4 (1.000 U/ml) + GM-CSF (1.000 U/ml) a
los pocillos del cultivo. El tercer día de cultivo se volvió a añadir los factores de
crecimiento y diferenciación en las mismas condiciones. Las células se mantuvieron
hasta el séptimo día de cultivo en estas condiciones.
Séptimo día: maduración de las céluas. Se añadió directamente a los pocillos las
citocinas madurativas que componen el cóctel de maduración. Las concentraciones
fueron las siguientes: TNF (20 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml), IL-1 β (10 ng/ml), PGE2 (1
μg/ml). También se añadió Poli I:C (20 μg/ml) para potenciar la respuesta junto a los
péptidos de estudio según el experimento a 5 µg/ml a cada uno de los pocillos.
Octavo día: obtención del producto final. Se lavaron los pocillos con PBS frío
para deseganchar las células dendríticas y se resuspendieron a la concentración deseada
para continuar con el experimento.
12. ELISPOT
La frecuencia de linfocitos específicos para los diferentes péptidos de estudio, se
midió también mediante el recuento de linfocitos productores de INF-γ mediante un
ensayo de EliSpot utilizando un kit comercial (Diaclone). El ensayo de EliSpot consiste
en un ensayo de inmunoabsorción (ELISA) donde la membrana se ha modificado y la
detección se realiza mediante la cuantificación de spot en lugar de mediante DO. Las
placas (Multiscreen HTS, MIllipore) se incubaron con el anticuerpo purificado anti-
INF-γ (5 ug/ml) durante 2 horas a 37ºC. A continuación, las placas se bloquearon con
MC durante 2 horas a TA y seguidamente se añadieron las células dendríticas cargados
con los péptidos de interés junto con los linfocitos, se cultivaron a 37ºC y 5% de CO2 en
MC. En uno de los pocillos, las DCs no estaban cargadas con ningún péptido, y se
añadió DMSO, que se utilizó como control negativo y en otro pocillo sólo con linfocitos
se añadió fitohemaglutinina (PHA, del inglés phytohemaglutin A) a una concentración
MATERIALES Y MÉTODOS
91
de 10 μg/ml, como control positivo durante 5 horas. Tras la incubación las placas se
lavaron y se incubaron con el anticuerpo biotinilado anti-INF-γ (2 µg/ml) diluido en
PBS al 2% BSA. Tras 1,5 horas, se lavaron y se incubaron con una dilución 1:100 de
estreptavidina-AP a 37ºC. Una hora más tarde, se lavaron los pocillos y se revelaron con
el sustrato BCIP/NBT (5-bromo 4-cloro 3-indolilfosfato/nitroazul tetrazoleno; Sigma).
La reacción colorimétrica se paró con agua destilada y el número de puntos se
cuantificó utilizando un contador de EliSpot (CTL, Aelen, Alemania).
El reconocimiento se consideró positivo si el número de spot excedía más de 5
los spots del control negativo cultivado con DMSO.
Tras las 5 h de cultivo, las células se recuperaban para la determinación de la
expresión de CD154 mediante citometría de flujo.
Cuando fue necesario los LT CD3+CD4+CD154+ se separaron mediante FACS
sorting. Los LT aislados fueron expandidos usando exceso de células feeders irradiadas
en MC y 30 ng/mL de anti-CD3 (OKT3) y 3.000 IU/mL de IL2. Tras un cultivo de 2
semanas los LT fueron reevaluados mediante Elispot y extraído el DNA para el estudio
del repertorio de los TCRs.
13. SECUENCIACION DEL REPERTORIO TCR
Las frecuencias individuales de los diferentes clonotipos fueron determinadas
mediante el análisis de los TCRs de los LT a partir de PBMCs, de TILs o de LT
expandidos mediante el protocolo REP. El estudio de la clonalidad de los genes TCR se
llevó a cabo mediante NGS, tras la amplificación por PCR de los genes del TCR.
Para la amplificación se utilizó una PCR multiplex con 23 primers Fw y con 13
primers Rv. El producto se purificó mediante beads magnéticas (SPRIselect, Beckman
Coulter) a una ratio de 0,8 y en una segunda PCR se añadieron los identificadores de
muestra. Tras una segunda purificación por electroforesis en gel de agarosa, las
diferentes librerías se normalizaron y se secuenciaron mediante la plataforma
Illumina®.
MATERIALES Y MÉTODOS
92
Los datos brutos se analizaron mediante el software MiXCR para obtener la
frecuencia relativa y la secuencia específica de cada clon a partir de las secuencias in
frame de los reordenamientos del CDR3. Diferentes parámetros como la clonalidad, la
distribución de las muestras (Index Shannon) o la abundancia relativa (index de
Evenness) también fueron analizados. El análisis fue válido cuando la cobertura de las
secuencias fue superior a x5 a partir de un mínimo de 250ng de DNA.
14. ESTUDIO ANTÍGENO AISLADO MEDIANTE LUMINEX®
Este ensayo se realizó utilizando el kit LSA Clase II (Immucor). La técnica se
realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 10 µl de suero del
paciente se añadieron a 40 µl de beads de antígeno, se incubaron durante 30 minutos a
TA y en la oscuridad en agitación. Tras la incubación, se lavó 3 veces con tampón de
lavado. A continuación, se añadieron 50 µl de dilución 1/10 de IgG de cabra
antihumana conjugada con PE y se incubaron 30 minutos a TA en la oscuridad y
agitación. Finalmente, las beads se resuspendieron en 130 µl de tampón de lavado y se
realizó la lectura en un analizador Luminex® 200TM. La adquisición de datos se realizó
mediante el software xPONENT®.
La intensidad de fluorescencia media (MFI) se recogió y analizó utilizando el
software específico MATCHIT®. Se considera la presencia de anticuerpos frente a las
moléculas HLA-DRB positivo cuando la MFI es superior a 1500.
15. CUANTIFICACIÓN DEL CNV DE DRB3, DRB4 Y DRB5
Para evaluar la presencia de CNV de DRB3/4/5 se usan primers y sondas
Taqman® de diseño propio. Las sondas Taqman® permiten una buena sensibilidad y
reproducibilidad en la cuantificación de la señal por lo que pueden permitir la
cuantificación del número de copias de estos loci.
MATERIALES Y MÉTODOS
93
NOMBRE SECUENCIA
PRIMER DRB3_ Fw CACGTTTCTTGGAGCT
PRIMER DRB3_ Rv CCGTAGTTGTGTCTGCAGTAAT
SONDA DRB3/5 6 FAM CGACAGCGACGTGGGGGAGTACC TAM
PRIMER DRB4_ Fw ACGGAGCGAGTGT
PRIMER DRB4_ Rv GCTGTTCCAGTACTCAGCG
SONDA DRB4 6 FAM CGCTACAACAGTGACCTGGGGGAG TAM
PRIMER DRB5_ Fw CACGTTTCTTGCAGCAGGA
PRIMER DRB5_ Rv2 CCCGTAGTTGTGTCTGCAGTA
Tabla M2: Secuencias de los primers y sondas utilizadas para la determinación de los CNV
Los valores se referencian respecto a los valores que se obtienen para el gen
RNaseP del que se conoce que existen 2 copias por genoma diploide. La sonda y
primers para RNaseP son los descritos por el proveedor (Applied Biosystems®). Para
cada muestra, la amplificiación del gen diana (HLA-DRB3, HLA-DRB4 o DRB5) y el
gen control RNaseP se realiza en el mismo pocillo (multiplex) por triplicado. Para la
generación de la curva estándar, se emplean diluciones seriadas de un DNA del que se
conoce que tiene 2 copias para HLA-DRB5. El CNV se establece como la ratio de la
cantidad de amplificación para HLA-DRB3-4-5 y la cantidad de amplificación para
RNaseP, multiplicada por 2.
16. ESTADÍSTICA
Para comparar dos grupos independientes se usó la prueba paramétrica t-Student. En
estos casos, la corrección de Welch se aplicó sólo cuando se obtuvieron varianzas
significativamente diferentes entre grupos. Para distribuciones no normales se usaron
los test no paramétricos de Kruskal-Walls, U-Mann-Whitney o Wilcoxon. Para
comparar tres o más grupos independientes se usó el Análisis de la Varianza (ANOVA).
Tanto para un análisis como para otro, se considera diferencias significativas aquellos
valores de p inferiores a 0,05 y se ha representado con * si p<0,05; ** si p<0,01 y *** si
p<0,001 y, en los gráficos se muestra la desviación estándar de los valores (SD). El
análisis estadístico de los resultados obtenidos en este trabajo se hizo con el software
GraphPad PRISM versión 5.0 (2009, USA)
IV. RESULTADOS
RESULTADOS
97
1. APROXIMACIÓN A UNA TERAPIA PERSONALIZADA EN
PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA (LLC)
Con el objetivo de definir posibles respuestas antitumorales en LLC, y ante la
disponibilidad de más de 506 pacientes con secuencias exónicas completas (del
Consortium CLL Genoma Project), se presentan a continuación los resultados de la
evaluación de la potencial antigenicidad de estos tumores en relación con la respuesta T.
1.1. Frecuencias alélicas de los pacientes con LLC respecto a una
población control
A pesar de que la LLC es una enfermedad ampliamente y algunos trabajos han
asociado diferentes alelos HLA con susceptibilidad a la enfermedad (224,278), pocos
estudios están hechos en amplias series de pacientes caucásicos europeos y técnicas de
tipificación HLA convencionales, ya que la mayoría de estas asociaciones se realizan
mediante estudios genómicos. En este trabajo realizamos la tipificación HLA-A, B, C,
DRB1 y DQB1 de los 506 pacientes y se compararon las frecuencias con la de donantes
de médula ósea obtenidas de la base de datos del Servicio de Inmunología del Hospital
Clínic de Barcelona.
Respecto a los alelos HLA-A, se observan diferencias estadísticamente
significativas en 6 alelos: A*01:02, A*02:05, A*03:01, A*11:01, A*29:01 y A*29:02,
en este último caso, la población control es más del doble que en los pacientes con LLC
(38 vs 83). De forma contraria en A*11:01 se observa una frecuencia de casi el doble en
los pacientes con LLC en comparación con la población control (85 vs 57) (Fig. R1).
RESULTADOS
98
Figura R1: Distribución de las frecuencias HLA-A. Se representan las frecuencias alélicas de 502 pacientes con
LLC (negro) en comparación con 542 (gris) controles (registro de donantes de médula ósea del Servicio de
Inmunología del Hospital Clínic de Barcelona). De los 6 alelos que tienen frecuencias diferentes estadísticamente
significativas, 4 aparecen con mayor frecuencia en los pacientes con LLC (A*01:02, A*03:01, A*11:01 y A*29:01),
mientras que 2 (A*02:05 A*29:02) son más frecuentes en los controles. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 (test t
de Student).
Con relación al alelo HLA-B, 6 alelos son también los que muestran diferencias
significativas: B*13:01 B*14:01, B*18:02, B*27:05, B*35:01 y B*44:03. B*13:01,
B*14:0, B*18:02 y B*35:01 tienen una frecuencia más alta en los pacientes con LLC (9
vs 0, 43 vs 18, 6 vs 0 y 72 vs 46 respectivamente), en cambio, la frecuencia de B*27:05
y B*44:03 es mayor en los controles (10 vs 35 y 64 vs 107 respectivamente) (Fig. R2).
Figura R2: Distribución de las frecuencias HLA-B. Se representan las frecuencias alélicas de 502 pacientes con
LLC (negro) en comparación con 542 (gris) controles (registro de donantes de médula ósea del Servicio de
Inmunología del Hospital Clínic de Barcelona). De los 6 alelos que tienen frecuencias estadísticamente significativas,
4 aparecen con mayor frecuencia en los pacientes con LLC (B*13:01, B*14:0, B*18:02 y B*35:01), mientras que 2
(B*27:05 y B*44:03) son más frecuentes en los controles. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 (test t de Student).
RESULTADOS
99
En cuanto a HLA-C, el último alelo HLA de clase I, se observan diferencias en
la frecuencia de 3 alelos; uno de ellos, C*05:01, más frecuente en los pacientes con
LLC (124 vs 91) y los otros 2, C*07:02 y C*12:03 con una frecuencia estadísticamente
significativa mayor en los controles (102 vs 59 y 87 vs51, respectivamente). En el resto
de los alelos HLA-C no se observan diferencias significativas en sus frecuencias (Fig.
R3).
Figura R3: Distribución de las frecuencias HLA-C. Se representan las frecuencias alélicas de 494 pacientes con
LLC (negro) en comparación con 542 (gris) controles (registro de donantes de médula ósea del Servicio de
Inmunología del Hospital Clínic de Barcelona). De los 3 alelos que tienen frecuencias estadísticamente significativas,
1 aparece con mayor frecuencia en los pacientes con LLC (C*05:01), mientras que 2 (C*07:02 y C*12:03) son más
frecuentes en los controles. **p<0,01 (test t de Student).
Relacionado con HLA-DRB1, una de las 2 moléculas estudiadas de HLA clase
II, son varios alelos los que poseen frecuencias con diferencias estadísticamente
significativa, DRB1*03:01, DRB1*04:01, DRB1*04:03 y DRB1*14:01 con mayor
frecuencia estadísticamente significativa en los pacientes con LLC y DRB1*07:01
donde la frecuencia en mayor en los controles (103 vs 180; p< 0.0001) (Fig. R4).
RESULTADOS
100
Figura R4: Distribución de las frecuencias HLA-DRB1. Se representan las frecuencias alélicas de 504 pacientes
con LLC (negro) en comparación con 542 (gris) controles (registro de donantes de médula ósea del Servicio de
Inmunología del hospital Clínic de Barcelona). De los 5 alelos que tienen frecuencias estadísticamente significativas,
4 aparecen con mayor frecuencia en los pacientes con LLC (DRB1*03:01, DRB1*04:01, DRB1*04:03 y
DRB1*14:01), mientras que 1 (DRB1*07:01) es más frecuentes en los controles. **p<0,01, ***p<0,001 (test t de
Student).
Respecto a DQB1, la otra molécula HLA-II estudiada, debido al alto
desequilibrio de unión con HLA-DRB1, son los alelos DQB1 asociados a los alelos
DRB1 que mostraban diferencias significativas, los que también muestran diferencias
estadísticamente significativas en sus frecuencias. DQB1*02:01 asociado a
DRB1*03:01 y DQB1*05:03 asociado a DRB1*14:01. En el caso de DRB1*04:01, este
alelo se asocia con 2 alelos DQB1, por lo que, por separado, las frecuencias de esos 2
alelos, DQB1*03:01 y DQB1*03:02 no muestran diferencias estadísticamente
significativas. DQB1*02:02 también muestra diferencias estadísticamente significativas
entre los pacientes con LLC y controles. DQB1*02:02 es el alelo que con mayor
frecuencia se asocia a DRB1*07:01 (Fig. R5).
RESULTADOS
101
Figura R5: Distribución de las frecuencias HLA-DQB1. Se representan las frecuencias alélicas de 504 pacientes
con LLC (negro) en comparación con 542 (gris) controles (registro de donantes de médula ósea del Servicio de
Inmunología del Hospital Clínic de Barcelona). De los 3 alelos que tienen frecuencias estadísticamente significativas,
2 aparecen con mayor frecuencia en los pacientes con LLC (DQB1*02:01 y DQB1*05:03), mientras que 1
(DQB1*02:02) es más frecuentes en los controles. **p<0,01, ***p<0,001 (test t de Student).
Existen evidencias que asocian la presencia de alelos en homocigosis con mayor
predisposición con la enfermedad (224) por lo que quisimos estudiar si existía
diferencias en la presencia de homocigosis en nuestra serie de pacientes respecto al
grupo control. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en
ninguno de los alelos estudiados por separado ni tampoco cuando se estudió la presencia
de homocigosis en todo el haplotipo HLA-I (Fig. R6).
Figura R6: Diferencias de homocigosis entre pacientes con LLC y controles. En la gráfica se muestran las
diferencias en el número de pacientes con LLC y grupo control que presentan homocigosis para los diferentes alelos
HLA-I; HLA-A, HLA-B y HLA-C y alelos HLA-II; DRB1 y DQB1. La última columna representa el número de
pacientes o controles que presentan homocigosis para todo el haplotipo HLA-I. En ninguna de las condiciones se
observan diferencias estadísticamente significativas (test t de Student).
HLA
-A
HLA
-B
HLA
-C
HLA
-DRB1
HLA
-DQ
B1
HLA
-I0
20
40
60
80
PTES LLC
CONTROLES
N p
acie
nte
s
RESULTADOS
102
1.2. Definición informática de los neopéptidos del “mutanoma” en
base a nivels de afinidad frente a las moléculas HLA específicas
de cada paciente
En los últimos años con el desarrollo de nuevas técnicas de secuenciación se ha
hecho un gran avance en la determinación de las mutaciones somáticas de los diferentes
tipos de tumores. Existe una gran diferencia en la carga mutacional entre unos tumores
y otros. La frecuencia entre las mutaciones no sinónimas pueden variar alrededor de
1.000 veces entre unos tumores y otros (279). En tumores con una alta carga mutacional
alrededor de 10 mutaciones somáticas por Mb corresponden a alrededor de 150
mutaciones no sinónimas dentro del exoma. En cambio, en los tumores con baja carga
mutacional, el número de mutaciones dentro del exoma se reduce considerablemente.
En este trabajo hemos comparado la capacidad de respuesta inmunogénica a
través de la predicción de unión a las moléculas HLA de 2 tumores descritos por tener
diferente carga mutacional: por un lado, en pacientes con melanoma, tumor descrito por
su elevada carga mutacional, y por otro el grupo de pacientes con LLC, enfermedad
descrita por tener menos de 1 mutación somática por Mb (baja carga mutacional) (280).
1.2.1. Definición del “mutanoma” en pacientes con LLC
Dentro del proyecto del consorcio de genoma de la Leucemia Linfática Crónica,
se secuenció el genoma y/o exoma a 506 pacientes. En las secuencias de los 506
pacientes se encontraron 6.926 mutaciones somáticas codificantes (MECs), con una
media de 12,02 MECs por paciente y una mediana de 7. En la fig. R7 se muestra la
distribución del número de pacientes en función del número de MECs que presentan. El
mayor número de mutaciones que presentaron los pacientes fueron 42 y el número de
MECs más frecuente es 9-10.
RESULTADOS
103
Figura R7: Distribución de pacientes con LLC por el número de mutaciones exónicas codificantes (MECs). En
la figura se muestra la distribución de los 506 pacientes en función del número de MECs que presentan. Hay varios
pacientes que sólo tienen 1 o 2 MECs y hay otros 2 pacientes en donde el número de mutaciones asciende hasta 41-
42. El mayor número de pacientes está comprendido en un intervalo de 7-16 mutaciones.
De las 6926 mutaciones, el 94,86% fueron mutaciones missense, coincidiendo
con lo que está descrito en la bibliografía y fueron solo estas mutaciones las que se
utilizaron para la definición del mutanoma en los pacientes con LLC. También coincide
con la bibliografía que los cambios de nucleótidos más frecuente que ocasiona son,
C>T/G>A (Fig. R8).
Figura R8: Distribución del cambio de nucleótido en las mutaciones missense de los pacientes con LLC. El
mayor número de cambios que se producen en las mutaciones missense que ocasionan las mutaciones somáticas en
los 506 pacientes con LLC es C>T/G>A.
RESULTADOS
104
Para la caracterización del “mutanoma” en esta serie de 506 pacientes, se han
caracterizado los neopéptidos generados por estas 6.926 mutaciones. Para ello, se
simularon péptidos a través de concatenaciones de 8-11 aa para la predicción de unión a
moléculas HLA-I y de 12-20 péptidos para las moléculas HLA-II. Dentro de la
secuencia simulada siempre se incluyó el aa que genera la mutación. El número de
posibles péptidos que se simularon fue muy elevado, en la fig. R9 se visualiza la
diferencia de predicciones relacionando el número de alelos para cada una de las
moléculas HLA con el número de posibles neopéptidos con una afinidad IC50 <500 nM.
Para HLA-A se obtuvieron 4.227.258, para HLA-B 7.070.501, 2.921.824 para HLA-C,
en cuanto a las moléculas HLA-II donde se obtuvieron 31.747.040 para HLA-DRB1,
109.387.699 para HLA-DQB1/DQA1 y finalmente 14194752 para HLA-DPB/DPA. El
número tan elevado para DQB y DPB se debe a que se utilizaron todas las
combinaciones posibles entre las moléculas DQB/DPB y DQA/DPA y no sólo se
tuvieron en cuenta las que están descritas en las bases de datos.
Figura R9: Descripción del número de péptidos simulados. En la primera simulación que se realizó con las
mutaciones somáticas de la serie de 506 pacientes con LLC se tuvieron en cuenta todos los alelos descritos en la base
de datos IMGT/HLA para las moléculas HLA-I y HLA-DRB1. En el caso de HLA-DPB1 y HLA-DQB1 se hicieron
todas las combinaciones posibles con las moléculas HLA-DPA y HLA-DQA y no sólo las descritas en la base de
datos.
Como los números obtenidos resultados sen mucho mayores de los esperados, la
caracterización de los péptidos simulados se realizó con todos los alelos HLA que
tienen nuestra serie de pacientes, seleccionando de cada uno de ellos el neopéptido con
mayor afinidad para cada una de las mutaciones de la serie.
RESULTADOS
105
Al observar la distribución de los alelos HLA-A que son capaces de presentar
mayor número de neopéptidos, HLA-A*03:01 es la molécula que con mayor número de
neopéptidos es capaz de unirse con una afinidad fuerte (n=126; %Rank<0,5). En
cambio, si sumamos las uniones fuertes y las débiles, HLA-A*02:01 es el alelo HLA-A
que con mayor número de neopéptidos es capaz de unirse (n=708). Cabe destacar, en
cambio, que HLA-A*25:01 no es capaz de presentar ninguno de los neopéptidos de la
serie y otros alelos son capaces de unirse a menos de 10 neopéptidos (Fig. R10).
Figura R10: Distribución de las uniones de los alelos HLA-A a los neopéptidos de los pacientes con LLC. En la
gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones somáticas de los
506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida mediante %Rank,
donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<0,5 (negro) y una unión débil (WB,
del inglés weak binding) en %Rank= 0,5-2 (gris). En el eje Y se muestra el número de neopéptidos.
En cuanto a HLA-B, son los alelos de HLA-B*44, HLA-B*44:02 y HLA-
B*44:03 los que presentan mayor número de uniónes fuertes a los neopéeptidos, aunque
a nivel global, teniendo en cuenta las uniones SB y WB son los alelos con alta
frecuencia poblacional, HLA-B*35:01, HLA-B*07*02 y HLA-B*15:01 son los que
mayor número de uniones presentan (n= 189, 171 y 145 respectivamente). Al igual que
ocurría con HLA-A, algunos alelos HLA-B no son capaces de unirse a ningún
neopéptido. Estos alelos son: HLA-B*27:02, HLA-B*35:03 y HLA-B*51:01 (Fig.
R11).
RESULTADOS
106
Figura R11: Distribución de las uniones de los alelos HLA-B a los neopéptidos de los pacientes con LLC. En la
gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones somáticas de los
506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida mediante %Rank,
donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<0,5 (negro) y una unión débil (WB,
del inglés weak binding) en %Rank= 0,5-2 (gris). En el eje Y se muestra el número de neopéptidos.
En relación con los alelos HLA-C, se puede observar que algunos la mayoría de
los alelos unen los neopéptidos mediante SB. A pesar de ello hay 2 alelos, HLA-
C*04:01 o HLA-C*07:04 y no son capaces de unirse a ningún péptido a pesar de ser
alelos bastante frecuentes en la población de estudio (Fig. R12).
Si pasamos a la descripción de las moléculas HLA-II, se observa que se generan
un menor número de uniones a los neopéptidos definidos a partir de las mutaciones
somáticas de los 506 pacientes con LLC respecto a las uniones generadas por las
moléculas de HLA-I. Además, en ambos casos, tanto en HLA-DRB1 como en HLA-
DQB1/DQA1 el número de uniones fuertes es mucho menor que en las moléculas de
HLA clase I.
RESULTADOS
107
Figura R12: Distribución de las uniones de los alelos HLA-C a los neopéptidos de los pacientes con LLC. En la
gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones somáticas de los
506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida mediante %Rank,
donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<0,5 (negro) y una unión débil (WB,
del inglés weak binding) en %Rank= 0,5-2 (gris). En el eje Y se muestra el número de neopéptidos.
Respecto a HLA-DRB1, la mayoría de los alelos presenta uniones WB, solo los
alelos de las familias HLA-DRB1*03 y algunos de los alelos de la familia HLA-
DRB1*04 son capaces de unirse con en mayor número a los neopéptidos con afinidades
de unión SB. Sólo el alelo HLA-DRB1*08:01 no es capaz de unirse a ninguno de los
péptidos en estudio (Fig. R13).
RESULTADOS
108
Figura R13: Distribución de las uniones de los alelos HLA-DRB1 a los neopéptidos de los pacientes con LLC.
En la gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones somáticas de
los 506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida mediante
%Rank, donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<20 (negro) y una unión débil
(WB, del inglés weak binding) en %Rank= 20-90 (gris). En el eje Y se muestra el número de neopéptidos.
En relación con HLA-DQB1/DQA1, todos los alelos son capaces de presentar al
menos 1 neopéptido. Además, hay 2 alelos, DQB1*03:02/DQA1*03:01 y
DQB1*05:01/DQA1*01:01 que son capaces sólo de unirse mediante uniones SB a un
elevado número de neopéptidos (211 y 203 respectivamente) (Fig. R14).
RESULTADOS
109
Figura R14: Distribución de las uniones de los alelos HLA-DQB1/DQ1 a los neopéptidos de los pacientes con
LLC. En la gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones
somáticas de los 506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida
mediante %Rank, donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<20 (negro) y una
unión débil (WB, del inglés weak binding) en %Rank= 20-90 (gris). En el eje Y se muestra el número de
neopéptidos.
Para finalizar la descripción de las uniones de los neopeptidos del “mutanoma” de
los pacientes con LLC y teniendo en cuenta su alta frecuencia poblacional, la
distribución de las uniones a las moléculas HLA-DRB accesorias. En esta distribución
se observa que todas ellas son capaces de unir un elevado número de neopéptidos, a
pesar de que la mayoría de los neopéptidos a los que se unen lo hacen mediante uniones
WB (Fig. R15).
RESULTADOS
110
Figura R15: Distribución de las uniones de los alelos HLA-DR accesorias a los neopéptidos de los pacientes con
LLC. En la gráfica se muestra la distribución de los neopéptidos definidos in silico a partir de las mutaciones
somáticas de los 506 pacientes con LLC. En la distribución la unión se clasifica en función de la afinidad definida
mediante %Rank, donde una unión fuerte (SB, del inglés strong binding) se establece en %Rank<20 (nego) y una
unión débil (WB, del inglés weak binding) en %Rank= 20-90 (gris). En el eje Y se muestra el número de
neopéptidos.
Es importante tener en cuenta que las moléculas HLA-DR accesorias al tener
una frecuencia poblacional mayor que la molécula HLA-DRB1 y tener la misma
capacidad para unir péptidos como muestran estos resultados, las pone en un relevante
puesto como moléculas decisivas para la generación de terapias específicas.
1.2.2. “Mutanoma” específico en los pacientes con LLC
En el apartado anterior se ha realizado una descripción general del “mutanoma”
de las mutaciones generadas en esta amplia serie de pacientes y sus capacidades de
unión a las moléculas HLA más frecuentes en la población general y en concreto en la
población de los pacientes con LLC que estamos estudiando.
A continuación, se describe el “mutanoma” de los 506 pacientes con LLC
teniendo en cuenta su propia tipificación HLA: De las 6.926 mutaciones iniciales 77
fueron excluidas por no generar neopéptidos que cumpliesen las características
establecidas. 2.102 mutaciones fueron capaces de generar neopéptidos pero no fueron
capaces de unirse a ninguna de las moléculas HLA específicas del paciente que posee
RESULTADOS
111
esa mutación concreta. El resto de las mutaciones fueron capaces de generar
neopéptidos con capacidad de unión a las moléculas HLA propias del paciente, de las
cuales 2.121 tenían capacidad de unión a moléculas HLA-I y HLA-II (Esquema R1)
con afinidades en su mayoría WB, pero un gran número SB.
Esquema R1: Distribución de las los neopéptidos diseñados in silico con capacidad de unión a las moléculas
HLA específicas del paciente. En el esquema se clasifican los neopéptidos diseñados in silico con capacidad de
unión a las moléculas HLA específicas del paciente que ha generado la mutación de la que se ha obtenido el
neopéptido. La clasificación se divide entre los neopéptidos capaces de unirse a HLA-I y HLA-II teniendo en cuenta
una sola ID por neopéptdo, de las que 2121 son capaces de unirse a moléculas HLA-I y HLA-II. A continuación, en
la clasificación en función de la afinidad de unión, las ID pueden estar repetidas en función de si el neopéptido que
genera puede ser presentado por varias moléculas HLA específicas del paciente.
Si nos centramos en las características específicas analizando paciente a paciente
podemos ver que esta serie de pacientes posee una media de mutaciones somáticas de
13,63 algo que coincide con los datos en otras series de pacientes, mientras que la media
de mutaciones que capaces de ser presentadas por alguna de las moléculas HLA de los
pacientes que las contienen es de 6,82. El número de neopéptidos difiere en función del
número inicial de mutaciones que tiene el paciente (Tabla R1 y Fig R16), los pacientes
con 10 mutaciones o menos, son capaces de presentar una media de 3,47 neopéptidos,
en cambio, los pacientes con más de 20 mutaciones son capaces de presentar más de 11
neopéptidos en moléculas HLA-I. Si nos referimos a estos mismos valores para
neopéptidos capaces de unirse a moléculas HLA-II, los valores van desde 4,25
neopéptidos para pacientes con 10 mutaciones o menos hasta 14,11 neopéptidos para
pacientes con más de 20 mutaciones iniciales. En datos generales, la media de
mutaciones específicas que pueden ser presentadas por moléculas HLA-I o HLA-II es
RESULTADOS
112
diferente, teniendo menor capacidad de unir neopéptidos específicos las moléculas
HLA-I, siendo 6,26 y 7,39 respectivamente (Tabla R1 y Fig. R17).
Tabla R1 y Figura R17: Características de la capacidad de unir neopéptidos a las moléculas HLA de los 506
pacientes con LLC. Características de los neopéptidos que son capaces de unir los 506 pacientes con LLC en
función del número inicial de mutaciones y su tipificación HLA. Figura R17: Distribución del número de
neopéptidos con capacidad de unión a moléculas HLA. El número de neopéptidos con capacidad de unión a
moléculas HLA específicas de los pacientes se dividen en función del número inicial de mutaciones y dentro de esta
clasificación están divididos en función de si se unen a moléculas HLA-I y HLA-II.
Número
Promedio de mutaciones totales 13,63
Promedio de mutaciones
específicas
6,82
Pacientes divididos por n inicial mutaciones
Clase I/Clase II
1-10 (n=183) 3,47/4,25
11-20 (n=251) 6,76/7,73
>20 (n=72) 11,58/14,11
Pacientes sin mutaciones específicas
Clase I+ Clase II 2
Clase I 11
Clase II
3
Promedio de mutaciones en pacientes sin mutaciones específicas
Total/Clase I/
Clase //
5,81/6,3/2,6
RESULTADOS
113
Figura R17: Distribución de las mutaciones y neopéptidos en los 506 pacientes con LLC. En el gráfico se
muestras el número de mutaciones específicas en los 506 pacientes con LLC de nuestra serie de estudio. La línea
horizontal verde muestra la media de las mutaciones de los pacientes (x=13,63), la línea horizontal amarilla muestra
la media de los neopéptidos específicos de paciente con capacidad de unión a moléculas HLA-II específicas de
paciente (x=7,4). Por último, la línea azul muestra la media de los neopéptidos específicas con capacidad de unión a
las moléculas HLA-I concretas de cada paciente.
De los 506 pacientes de la serie, solomente 2 de ellos no tuvieron capacidad de
unión con niguna molécula de HLA. Estos 2 pacientes son los únicos que sólo tienen
una mutación. A parte de estos 2 pacientes, 11 pacientes no tuvieron ningún neopéptido
que fuera capaz de unirse a sus moléculas HLA-I, la media de mutaciones iniciales de
estos pacientes fue de 6,3. 3 pacientes tampoco tuvieron capacidad de unión de ninguno
de sus neopéptidos con sus moléculas HLA-II, la media de mutaciones iniciales de estos
pacientes fue de 2,6.
Como se ha comentado anteriormente, la capacidad de unión de las moléculas
HLA se clasifica en función de la afinidad de éstas, en funión del %Rank, parámetro
que tiene en cuenta para calcular el valor de los neopéptidos una serie de péptidos
naturales con lo que se intenta eliminar la desviación que se pueda cometer en la
predicicón de unión si se tuviese en cuenta otros péptidos en los que la afinidad también
ha sida calculada mediante algorítmos de predicción. Como ya se ha comentado
anteriormente en nuestra serie de pacientes sólo hay 2 que no tienen ningún neopeptido
RESULTADOS
114
con uniones a moléculas de HLA. En la fig. R18 se muestra el número de uniones SB y
WB para las moléculas HLA-I (Fig. R18 A) y HLA-B en los 506 pacientes.
Figura R18: Distribución del número de neopéptidos simulados por su afinidad de unión a las moléculas HLA
en 506 pacientes con LLC. En la figura se muestra en número de neopéptidos en función su unión a moléculas HLA.
(A) Distribución del número de neopéptidos a moléculas HLA-I. La afinidad de unión se define como SB
(%Rank<0,5) y WB (%Rank=0,5-2). (B) Distribución del número de neopéptidosa moléculas HLA-II. La afinidad de
unión se define como SB (%Rank<20) y WB (%Rank=20-90).
Cuando las uniones las clasificamos en función grupo alélico que son capaces de
unir los diferentes neopéptidos, podemos observar que el grupo alélico HLA-A y HLA-
DRB1 (51% y 56% respectivamente), teniendo en cuenta que para HLA-I tenemos
encuenta 3 grupos alélicos y en cambio, para HLA-II sólo tenemos en cuenta 3 grupos
alélicos (Fig. R19Ay R19C).
RESULTADOS
115
Un dato que aparece en estos resultados y que es de gran relevancia para el
diseño de una terapia personalizada es que algunas de los neopéptidos que generan las
mutaciones somáticas de los pacientes con LLC pueden ser presentadas por más de un
alelo especifico del paciente. 10 de los neopéptidos simulados pueden ser presentados
por 5 de los 6 alelos de las moléculas HLA-I del paciente y 60 pueden ser presentados
por 4 de los 6 alelos de las moléculas HLA-I. Ninguno de los neopéptidos de la serie
tubo la capacidad de unión a los 6 alelos HLA-I del paciente que generó la mutación
somática a partir de la cual los neopéptidos fueron simulados. Respecto a las moléculas
HLA-II, existen 146 neopéptidos que pueden unirse a las 4 moléculas estudiadas del
paciente y más de 500 neopéptidos pueden ser presentados por 3 de los alelos de HLA-
II (Fig. R19B y R19D).
Figura R19: Distribución de los neopéptidos con capacidad de unión a moléculas HLA en función del grupo
alelo al que son capaces de unirse y el número de alelos a los que son capaces de unirse. (A) Distribución de los
neopéptidos que tenían capacidad de unirse a alguna molécula HLA-I específica del paciente en función del gen
HLA-I al que se une, HLA-A (verde oscuro), HLA-B (verde claro) o HLA-C (azul). (B) Distribución de los
neopéptidos que tenían capacidad de unirse a alguno de los alelos HLA-I específicos del paciente. 61,7%, 27,3, 8,8%,
1,9% y 0,3% de los neopéptidos tenían capacidad de unirse a 1 (verde claro), 2 (azul), 3 (amarillo), 4 (verde oscuro) y
5 (blanco) alelos respectivamente. (C) Distribución de los neopéptidos que tenían capacidad de unirse a alguna
molécula HLA-II específica del paciente, HLA-DRB1 (verde oscuro) o HLA-DQB1/DQA1(verde claro). (D)
Distribución de los neopéptidos que tenían capacidad de unirse a alguno de los alelos HLA-II específicos del
paciente. 48,9%, 33,3%, 13,9% y 3,9% de los neopéptidos tenían capacidad de unirse a 1 (verde claro), 2 (azul),,3
(amarillo) y 4 (verde oscuro) alelos HLA-II específicos de paciente respectivamente.
RESULTADOS
116
1.2.3. Caracterización de los neopéptidos en la LLC
Otra de las características importantes a la otra de diseñar una terapia
personalizada con péptidos es la longitud de los péptidos que tienen afinidad de unión
por las distintas moléculas HLA-I.
En nuestra serie de datos, la longitud de los péptidos que establecimos en la
simulación fue de 8 a 11 aa, por tanto, en la predicción de unión estaban todas las
combinaciones de péptidos con estas longitudes. Tras la selección del pneopéptido con
mayor afinidad y tras hacer la selección por la pareja neopéptido-HLA específica de
paciente se observa que son los péptidos con una longitud de 9 y 10 aa los que generan,
a nivel de predicción, un número mayor de uniones, tanto SB como WB (Fig. R20).
Cabe destacar que los neopéptidos con longitud de 11 aa tienen mayor número de
uniones.
Figura R20: Distribución de los neopéptidos por la longitud de aa. Los neopéptidos simulados se seleccionaron
por su mayor capacidad de unión a las moléculas HLA-I específicas del paciente que tenía la mutación de la que se
simuló el péptido. La longitud de péptido con mayor número de uniones neopéptido-HLA-I específica es la de 9 aa
para neopéptidos con unión tanto SB como WB. (n= 4798 (SB/WB); 27/28, 985/930, 834/1212 y 232/550 para
longitud de 8 aa, 9 aa, 10 aa y 11 aa respectivamente).
Si hacemos la distribución de los neopéptidos por su longitud y los distintos alelos
HLA-I, observamos una distribución bastante homogénea en los alelos HLA-A
(Fig.R21A), muy variable en los alelos HLA-B (FIg.R21B) Respecto a los alelos HLA-
C, la mayoría de los alelos unen neopéptidos con una longitud de 9 aa y a un logaritmo
de distancia están los neopéptidos con longitud de 10 aa y capacidad de unión
(Fig.R21C).
RESULTADOS
117
Para la longitud de neopéptidos para la simulación de unión a moléculas HLA-II,
al intentar hacer la predicción de todos los concatámeros con todas las longitudes
propuestas, el número de posibilidades era enorme y tras hacer la predicción en un
número aleatorio de mutaciones y alelos HLA-II (datos no mostrados), observamos que
todos los neopéptidos con 19 aa tenían una afinidad de unión dentro de los límites que
establecimos en este estudio (%Rank=0-90), por tanto, la longitud de 19 aa fue la
seleccionada para hacer la predicción de afinidades por pareja neopéptido-molécula
HLA-II específica de paciente.
Figura R21: Distribución de los neopéptidos en función de su longitud y la molécula HLA-I a la que se unen.
(A) Distribución de los neopéptidos con longitudes de 9-11aa con capacidad de unión a moléculas HLA-A. No se
observa ninguna longitud concreta que tenga una tendencia en su capacidad de unión a moléculas HLA-A. (B)
Distribución de los neopéptidos con longitudes de 9-11aa con capacidad de unión a moléculas HLA-B. No se observa
ninguna longitud específica que tenga una tendencia en su capacidad de unión a moléculas HLA-B. (C) Distribución
de los neopéptidos con longitudes de 9-11 aa con capacidad de unión a moléculas HLA-C. Los péptidos con longitud
de 9 aa son los que con mayor número se unen a las moléculas HLA-C con un logaritmo de diferencia respecto a los
neopéptidos con longitud de 10 aa. Los neopéptidos con longitud de 11 aa no tienen mucha afinidad para unirse a
moléculas HLA-C.
RESULTADOS
118
Figura R22: Representación gráfica de las secuencias de distintos alelos HLA-I. (A) Representación de los logos
de 3 alelos HLA-A (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 y HLA-A*11:01) con las distintas longitudes de aa. La última
posición del neopéptido es la que contiene el aa más conservado en los 3 ejemplo, en el caso concreto de HLA-
A*02:01 la posición P2 también se encuentra bastante conservada en los 4 conjuntos de péptidos. (B) Representación
de los logos de 3 alelos HLA-B (HLA-B*08:01, HLA-B*15:01 y HLA-B*27:05) con las distintas longitudes de aa.
En el caso de los alelos HLA-B la última posición de neopéptido de unión no se conserva al mismo nivel que en los
alelos HLA-A. Además, existen diferentes posiciones en donde la conservación y frecuencia de diferentes aa también
es elevada, en el ejemplo de HLA-B*08:01, existe conservación de péptidos en P2, P3, P4 P5 y P7. (C)
Representación de los logos de 3 alelos HLA-C con las distintas longitudes de aa. En el caso de los 3 alelos HLA-C
(HLA-C*02:02, HLA-C*03:03, HLA-C*05:01), la última posición del péptido también es la más conservada y donde
aparecen mayor número de aa con una frecuencia elevada. Al igual que pasaba en HLA-B no solo es la posición P2 la
que también tiene conservación de péptidos, P1, P3 y P4 también contiene determinados aa conservados y frecuentes.
La altura de los logos indica la conservación del aa en esa posición y el tamaño del aa indica la frecuencia con la que
aparece dicho aa.
RESULTADOS
119
Los puntos de unión a las moléculas HLA-I están bastante establecidos, siendo las
posiciones P2 y P6 las más conservadas en cuanto al aa que unen. Al observar la
diferencia en la capacidad de unión de los diferentes alelos HLA-I en relación a la
longitud de neopéptidos, quisimos observar si estas posiciones mantenían conservado el
aa en nuestra serie de neopéptidos. Para ello utilizamos la herramienta informática
Weblogo para determinar la distribución de los aa en las diferentes posiciones de unión
(Fig. R22).
1.2.4. Comparación de las frecuencias de los neopéptidos y las
frecuencias de los pacientes
Finalmente comparamos las frecuencias de los pacientes, con las frecuencias de
los alelos específicos de los 506 pacientes con LLC que unen neopéptidos generados
por las mutaciones específicas de cada uno de los pacientes y estudiamos si estas
diferencias pudiesen estar relacionadas con las diferencias con la frecuencia poblacional
(promedio entre las frecuencias obtenidas de nuestra base de datos y las frecuencias de
la población europea obtenidas de la web allelefrequencies.net). Los neopéptidos que se
unen a los alelos HLA-A parecen tener, en promedio, la misma ratio que los pacientes
con LLC, sólo se observa diferencia en HLA-A*01:01 donde la frecuencia es mayor en
los pacientes con LLC. Esta diferencia coincide con la diferencia que existe entre la
frecuencia del alelo HLA-A*01:01 entre los pacientes con LLC y la frecuencia
poblacional. En la misma dirección, pero en sentido contrario, para los alelos HLA-
A*03:01 y HLA-A*11:01 la frecuencia en la predicción de unión es mayor que en los
pacientes con LLC, esta diferencia coincide con la diferencia que existe entre la
frecuencia de los alelos entre pacientes con LLC y la población control donde los
pacientes con LLC tenían una mayor frecuencia que la población control (Fig. R23A).
Esta situación también sucede en algunos alelos HLA-B (Fig. 23B) como HLA-
B*15:01, HLA-B35:01 y HLA-B*40:02. Una situación que no mantiene las
proporciones en las diferencias de frecuencias es HLA-B*51:01 donde la frecuencia
poblacional es mayor a la frecuencia en los pacientes con LLC, pero la frecuencia en la
capacidad de unión a los neopéptidos es muy baja. Para finalizar, HLA-C contiene
varios ejemplos en los que la unión a neopéptidos es menos frecuente que la frecuencia
RESULTADOS
120
de los pacientes con LLC, como es el caso de HLA-C*05:01 y C*07:01. En estos alelos
la frecuencia en los pacientes con LLC era mayor que en el grupo control (Fig.23C).
Figura R23: Comparación de frecuencias alélicas. En la figura R23 se comparan las frecuencias de los alelos
HLA-I de los 506 pacientes con LLC (columna verde) con las frecuencias de los alelos de los 506 pacientes con LLC
capaces de presentar algún neopéptido específico de paciente (columna azul) y la diferencias entre la frecuencia de
los pacientes de nuestra serie de estudio y la población caucásica europea en la que se incluye nuestra población
control (columna marrón). (A) Comparación de los alelos HLA-A de todos los alelos presentes en la población de
estudio. (B) Comparación de los alelos HLA-B de todos los alelos presentes en la población de estudio. (C)
Comparación de los alelos HLA-C de todos los alelos presentes en la población de estudio
RESULTADOS
121
Estas diferencias podrían ser decisivas a la hora de hacer una selección de
neopéptidos para una terapia personalizada, donde la capacidad de unión y por tanto de
presentación es determinante. También se debe tener en cuenta a la hora de seleccionar
péptidos para ensayos funcionales que podrían condicionar el éxito de los ensayos y
podrían influir en las conclusiones generadas a partir de los resultados de los ensayos.
2. ESTUDIO DE INMUNOGENICIDAD DE LOS LINFOCITOS TC
Y TH FRENTE A LOS NEOPÉPTIDOS SELECCIONADOS
La tolerancia asegura que los LT no sean capaces de reconocer péptidos propios
presentados por las moléculas HLA propias. Pero a su vez, para que un determinado
neopéptido se convierta en un neoepítopo no sólo debe ser distinto a las secuencias
propias, sino que debe mantener o incrementar su capacidad de unión a las moléculas
HLA propias. Si la mutación o mutaciones eliminan esta unión no podrá haber
reconocimiento.
A su vez, un neopéptido que puede ser presentado por las moléculas HLA debe ser
distinto a la secuencia original tolerada, y su inmunogenicidad dependerá de su
diferencia con la secuencia normal (wt) y de que sea reconocible por un TcR de un LT
en periferia, un condicionante sólo valorable por estudios experimentales. Es decir, la
unión a HLA es imprescindible y pueden utilizarse algoritmos para predecir la afinidad
de unión, pero sigue siendo necesarios estudios experimentales que nos confirmen las
selecciones de neoepítopos in silico.
Así, en este apartado, para el estudio de la inmunogenicidad de los neopéptidos
diseñados mediante las simulaciones in silico explicadas en Materiales y Métodos a
partir de las mutaciones somáticas de los pacientes y en especial en base a su afinidad a
sus propias moléculas HLA, se sintetizaron neopéptidos de los pacientes con mayor
número de uniones a diferentes moléculas HLA y de las que disponíamos PBMCs para
hacer los estudios experimentales.
RESULTADOS
122
2.1. Selección de péptidos para el estudio de inmunogenicidad
El estudio se realizó en 4 pacientes con LLC del grupo de la serie de 506 pacientes
del apartado anterior (Tabla R2 y R3) y en un paciente pediátrico con baja carga
mutacional MEL-SJD1 (Tabla R4).
En el paciente LLC-01 se emplearon 3 péptidos para HLA-I y 2 para HLA-II, para
estudiar el impacto de los neopéptidos que se generan debido a las mutaciones en los
genes B3GAT2 y CYP2A7 y generan neopéptidos con afinidades de unión SB a sus
moléculas HLA (Tabla R2 y R3).
En el paciente LLC-305 se emplearon 2 péptidos para estudiar la mutación en
CCNYL2 y uno para la mutación en HTRA3. Este paciente no tenía ningún neopéptido
con la afinidad de unión preestablecida a sus moléculas HLA-II (Tabla R2).
Para el paciente LLC-778, se sintetizaron 5 péptidos restringidos a moléculas
HLA-I para estudiar las mutaciones en ANOA, PLXNC1 y PTPRR y otro más para la
mutación en ANOA con unión a moléculas HLA-II (Tabla R2 y R3).
El último paciente con LLC, el paciente LLC-785, sólo tenía un neopéptido con
capacidad de unión a HLA-DQA1*01:01/DQB1*05:01 generado debido a la mutación
somática en el gen EXT2 (Tabla R3).
El paciente MEL-SJD1 era homocigoto para HLA-I, mostrando 146 mutaciones
somáticas que generaron 39 transcritos para estudiar su unión a moléculas HLA. En los
estudios in silico se determinaron 10 neopéptidos con capacidad de unión a sus
moléculas HLA derivados de 9 mutaciones somáticas. Estos 10 neopéptidos fueron los
usados para los estudios experimentales. A pesar de ser homocigoto para HLA-I, 8 de
los péptidos tenían afinidad por moléculas HLA-I, con longitudes comprendidas entre
9-11 aa. Los 2 péptidos restantes tenían afinidad por alelos HLA-II (Tabla R4).
RESULTADOS
123
Tabla R2: Neopéptidos utilizados en los estudios experimentales con afinidad de unión SB (%Rank<0,5) en la
unión a alelos HLA-I en 3 de los pacientes con LLC. En la tabla se muestra el gen que contiene la mutación
somática (en rojo) con la restricción HLA-I del neopéptido y la secuencia del péptido wt.
Los péptidos se utilizaron en diferentes combinaciones en función de su
restricción a las moléculas HLA y las células que disponíamos.
Tabla R3: Neopéptidos utilizados en los estudios experimentales con afinidad de unión para alelos HLA-II
para 3 pacients con LLC. En la tabla se muestra el gen que contiene la mutación somática (en rojo), la restricción
HLA-II del neopéptido y la secuencia del péptido wt.
RESULTADOS
124
Tabla R4: Neopéptidos utilizados en los estudios experimentales de MEL-SJD1 con restricción de unión a
HLA-I y HLA-II. Para este paciente sólo se han considerado los péptidos con afinidad de unión SB
(%Rank<0,5(HLA-I) y %Rank<20% (HLA-II)).
2.2. Estudio de inmunogenicidad mediante la producción de INFγ
Para determinar la inmunogenicidad de los neopéptidos diseñados en diferentes
pacientes se estudió la producción de INF-γ mediante Elispot. Para ello, las PBMCs se
incubaron con 20 µg/ml de péptido en 1 paciente con LLC y en el paciente MEL-SJD1.
En el experimento del paciente con LLC-785 se utilizaron PBMCs y PBMCs
eliminando la fracción CD19 (Fig. 24) para determinar si las células CD19 ejercen
acción inhibitoria a los LT reactivos. El paciente LLC-785 no mostró reactividad frente
al neopéptido en ninguna de las condiciones estudiadas. A pesar de que el péptido no
genera reactividad al incubarlo con las células del paciente (no se observa producción
de INFγ), la población B del paciente tiene un efecto inhibitorio en de la producción de
INFγ, que se observa en la estimulación con PHA (estímulo policlonal).
RESULTADOS
125
Figura R24: Producción de INFγ en el paciente LLC785. La producción de INFγ se estudió mediante Elispot. Las
células se estimularon con el neopéptido específico con restricción a HLA-DQA1*01:01/DQB1*05:01. Los
experimentos se realizaron sobre PBMCs totales y en PBMCs eliminando la población B. (A) SFC en PBMCs
(negro) y PBMCs sin células CD19+ (gris) en tres condiciones; control negativo, con el péptido y tras estimulación
con un estímulo policlonal (PHA). (B) Ejemplo de spots en las diferentes condiciones del experimento. El
experimento se realizó por duplicado en días diferentes.
Los 10 péptidos específicos del paciente MEL-SJD1 se incubaron con 3 muestras
diferentes. Las muestras fueron obtenidas en el periodo de respuesta completa. Se
observó producción de INFγ escasa en las 2 primeras determinaciones que se reduce
completamente en la última determinación (Fig. R25).
RESULTADOS
126
Figura R25: Producción de INFγ en el paciente MEL-SJD1. La incubación con los 10 péptidos diseñados a partir
de simulaciones informáticas y predicciones de afinidad de unión in silico genera escasa inmunogenicidad en el
paciente MEL-SJD1. Se estudió la producción de INFγ mediante Elispot tras estimulación con el pool de 10
neopéptidos específicos del paciente con afinidad de unión a moléculas HLA-I y HLA-II del paciente. Los
experimentos se realizaron sobre PBMCs totales. (A) SFC productoras de INFγ en PBMCs en 3 determinaciones en el
periodo de respuesta completa. 3 condiciones se utilizaron en el experimento; control negativo, con el péptido y tras
estimulación con un estímulo policlonal (PHA). (B) 3 ejemplos de spots en los pocillos incubados con el pool de 10
péptidos.
La producción de INFγ en las 2 fechas más próximas a la resolución de la
enfermedad pueden ser linfocitos remanentes de los que han generado la respuesta
completa, que tras un periodo más alejado de la resolución de la enfermedad ya no se
observan en sangre periférica.
2.3. Estudio de inmunogenicidad mediante el aumento de expresión
de CD137 y CD154
La inducción de la expresión de CD137 en LT es un mecanismo transitorio y
limitado a la activación reciente del linfocito a través del TCR y es más específica de
LT CD8+. Por su lado, CD154 también es una molécula que se expresa de forma
transitoria tras la activación reciente del linfocito a través del TCR pero más específica
de LT CD4+, aunque de desaparición más rápida.
Por tanto, para el estudio de la especificidad a nivel de respuesta citotóxica se
estudió la expresión de CD137 en LT CD8+ mientras que para el estudio de la
especificidad de la respuesta cooperadora se estudió la expresión de CD154 en
linfocitos CD4+.
RESULTADOS
127
Teniendo en cuenta los resultados del apartado anterior donde se observaba
escasa producción de INFγ tras estimulación de PBMCs y que la funcionalidad de los
LT en LLC está alterada, en este apartado, lo que hicimos fue una expansión rápida
(REP) de los linfocitos T intentando aumentar la frecuencia de los linfocitos específicos
para ser capaces de ver una respuesta más clara frente a los neopéptidos diseñados.
Una vez obtenidos, se incubaron durante 5h los linfocitos REP junto con DCs
alogénicas que compartían un alelo HLA-DRB1 con los pacientes. Las DCs habían sido
cargadas previamente con los neopéptidos durante 2h. A continuación, se midió el
aumento de expresión de CD137 y CD154 por citometría de flujo y la producción de
IFNγ mediante la técnica de EliSpot. En los experimentos, para determinar el efecto de
aloinmunogenicidad generado por las DCs, uno de los pocillos sólo contenía los
linfocitos del paciente. Como control negativo del experimento se utilizó el co-cultivo
de los linfocitos REP con DCs maduras no cargadas y DMSO.
En el paciente LLC-01 se observó una reactividad basal muy elevada con gran
número de SCF en todas las condiciones (Fig. R26D). No se observa aumento de
expresión de CD137 en ninguna de las condiciones del co-cultivo (Fig. R26A). En
cambio, cabe destacar que la silueta que genera la representación de los SCF y la
expresión de CD137 es similar, por lo que se puede concluir que, aunque no se puede
determinar una reactividad específica clara, existe una relación directa entre la
producción de INFγ y la expresión de CD137 determinada por los péptidos que están en
el co-cultivo. La expresión de CD154 (Fig. R26G), al igual que la producción de INFγ,
en este paciente está aumentada de forma basal. Se observa 1% de linfocitos con
expresión de CD154 en el cultivo de linfocitos solos que se mantiene tras la activación
con PHA. El co-cultivo con las DCs y los péptidos hacen que se inhiba la expresión de
CD154 a pesar de que se mantiene la silueta de expresión que se observaba en la
expresión de CD137 y la producción de INFγ.
En el paciente LLC-305 si se observa producción de INFγ en las condiciones de
co-cultivo con los péptidos a estudio (Fig. R26E). La producción de INFγ coincide con
el aumento de expresión de CD137 (Fig. R26B), situación similar a lo que ocurría en el
paciente anterior. Este paciente no tenía ningún péptido con restricción a HLA-II, por
tanto, no hay aumento de expresión de CD154 en ninguno de los co-cultivos con los
RESULTADOS
128
péptidos. En este paciente, la expresión de CD154 está elevada de forma basal en los
linfocitos cultivados sin DCs. La expresión de CD154 también tiende a disminuir tras el
cultivo con las DCs cargadas con los diferentes péptidos, pero no existe la
homogeneicidad que se observaba en el paciente anterior (Fig. R26H).
En el paciente LLC-778 también se observa inmunogenicidad por parte de los
péptidos estudiados, con producción de INFγ (Fig. R26E) especialmente con los
neopéptidos que se generan a partir de la mutación en ANO4 (170 SCF/106 vs 35
SCF/106 del control negativo). La producción de INFγ coincide con el aumento de
expresión de CD137 (Fig. R26C). En este paciente, la expresión de CD154 también
está elevada en los linfocitos que no están co-cultivados con DCs (MFI mayor,
representada mediante el área de los círculos) y en el péptido específico para HLA-II,
generado también por la mutación en ANO4 y en el pool de los péptidos con restricción
a moléculas HLA-I. Esta situación se podría explicar por un efecto sinérgico de todas
las reactividades, que genera un aumento del porcentaje de células TCD4+CD154+ y de
la MFI (representado por el aumento del área del círculo) (Fig. R26I).
Los resultados obtenidos de forma global (Fig. R26), demuestran que es posible
determinar mediante simulación informática péptidos capaces de generar
inmunogenicidad en pacientes con LLC cuando se hace una expansión de los LT.
Además, el efecto que generan en la expresión de moléculas co-señalizadoras podrían se
utilizados como biomarcadores de respuesta y posibles dianas terapéuticas en la LLC,
enfermedad en la que todavía no existe una terapia curativa.
RESULTADOS
129
RESULTADOS
130
Figura R26: Estudio de inmunogenicidad mediante la expresión de CD137, CD154 y producción de INFγ. La
incubación con péptidos diseñados a partir de simulaciones informáticas y predicciones de afinidad de unión in silico
gerera inmunogenicidad en pacientes con LLC y aumento de la expresión de CD137 y CD154. (A, B, C) Aumento
de la expresión de CD137 tras incubación con los péptidos O/N. (D, E, F) Producción de INFγ tras 5h de incubación
con DCs cargadas con los péptidos. (G, H, I) Aumento de la expresión de CD154 tras 5h de incubación con DCs
cargadas con los péptidos. Se incubaron linfocitos REP con DCs alogénicas con un alelo HLA-DRB1 común al
paciente cargadas con 20 µg/ml de los diferentes péptidos. Incubaciones O/N para los estudios de expresión de
CD137 y 5h para los estudios de expresión de CD154 y EliSpot. La reactividad alogénica se comparó con la
incubación de linfocitos REP sin DCs. Un pocillo con linfocitos, DCs y DMSO se utilizó como control negativo y el
estímulo con PHA (estímulo policlonal) como control positivo. El estudio se realizó en 3 pacientes con LLC (verde,
azul y rojo). En los estudios de expresión de CD137 y CD154 (A, B, C, G, H e I) en el eje Y se representa el % de la
población CD4+CD137/CD154+ y el área de los círculos representa el MFI de esa población. En los estudios de
producción de INFγ (D, E, F) en el eje Y se representa las células formadoras de puntos (SFC, del inglés spot forming
cells) por 106.
En el paciente MEL-SJD1 no se observa inmunogenicidad por parte de los
péptidos utilizados (Fig. R27). la producción de INFγ se relaciona con el efecto
alogénico de las DCs empleadas como APCs. Los LT cultivados sin DCs apenas
producen INFγ, en cambio, en el resto de las situaciones hay una producción constante
de INFγ (Fig. R27B). La expresión de CD137 es variable en las diferentes condiciones
sin que se pueda llegar a ninguna conclusión (Fig. R27A) y no se observa expresión de
CD154 en ninguna condición estudiada (Fig. R27C). Por tanto, la capacidad de generar
respuesta frente en neoAg en pacientes con melanoma puede venir determinada con la
carga mutacional del paciente
RESULTADOS
131
Figura R27: Estudio de inmunogenicidad mediante la expresión de CD137, CD154 y producción de INFγ en
paciente con melanoma y baja carga mutacional. No se observa inmunogenicidad de ninguno de los neopéptidos
estudiados. (A) Expresión de CD137 tras incubación con los péptidos O/N. (B) Producción de INFγ tras incubación
durante 5h de linfocitos REP con DCs cargadas durante 2h con 20 µg/ml de los péptidos a estudio. (C) Expresión de
CD154 tras incubación durante 5h de linfocitos REP con DCs cargadas durante 2h con 20 µg/ml de los péptidos a
estudio. Las DCs utilizadas fueron DCs alogénicas con un alelo HLA-DRB1 común al paciente. La reactividad
alogénica se comparó con la incubación de linfocitos REP sin DCs. Un pocillo con linfocitos, DCs y DMSO se utilizó
como control negativo y el estímulo con PHA (estímulo policlonal) como control positivo. En las gráficas de
expresión de CD137 y CD154 (A y C) el eje Y representa el % de la población CD4+CD137/CD154+ y el área de los
círculos representa el MFI de esa población. En las gráficas de producción de INFγ el eje Y representa las células
formadoras de puntos (SFC, del inglés spot forming cells) por 106.
RESULTADOS
132
3. ESTUDIO DE LA EVOLUCIÓN DEL REPERTORIO CELULAR
T COMO PARÁMETRO PARA LA MONITORIZACIÓN DE LA
RESPUESTA ANTI-TUMORAL
3.1. Estudio del repertorio TCR en pacientes con melanoma infantil
tratados con anti-PD1 y respuesta completa
Debido a que la expansión de los linfocitos mediante REP tampoco nos permite
observar respuestas específicas claras en el paciente MEL-SJD1 en el siguiente estudio
quisimos comparar la evolución del repertorio TCR en 2 pacientes infantiles tratados
con anti-PD1 y respuesta completa para intentar determinar clonas específicas
implicadas en la resolución de la enfermedad. Para ello, estudiamos el repertorio TCR
mediante NGS en 2 muestras pre y post-tratamiento y las comparamos con las clonas de
los TILs.
Ya existen numerosos estudios previos, que muestran el efecto potenciador del
sistema inmunológico que produce el tratamiento con fármacos monoclonales anti-PD1;
el bloqueo de PD1 ha resultado ser un elemento clave en las respuestas contra el cáncer,
aunque no todos los pacientes se benefician de este tratamiento. Por ello, es importante
estudiar los cambios que genera el tratamiento con estos fármacos en el repertorio TCR
para poder llegar a conseguir biomarcadores de efectividad y evolución. En este aspecto
existen muy pocas evidencias y ninguna para pacientes pediátricos.
En el estudio del repertorio TCR, diferentes parámetros estadísticos se midieron:
clonalidad, calculada a partir de la entropía de distribución de las frecuencias de las
secuencias y normalizda por log (# únicas). Los valores de la clonalidad van desde 0,
referida como distribución policlonal a 1, referida como una distribución monoclonal.
Index Richness considerado como el número de secuencias productivas únicas de la
región CDR3 del receptor TCR V-β, el index de evenness (abundancia relativa) para
evaluar la diversidad de los TCR V-β y el index Shannon, que mide la distribución de
las muestras (un número mayor del index, mayor diversidad de la distribución de las
secuencias del CDR3). El index Shannon incorpora la combinación entre Richness y
Evenness. El index Morisita, parámetro estadístico de dispersión, con él se compara la
coincidencia entre las muestras asumiendo que al incrementar el tamaño de la muestra
aumenta la diversidad.
RESULTADOS
133
En los 2 pacientes se estudiaron los diferentes parámetros en 3 muestras: en el
tumor, en sangre periférica previa al tratamiento con anti-PD1 y en sangre periférica tras
observarse respuesta completa. El paciente MEL-SJD2 tiene una elevada carga
mutacional, en cambio, el paciente MEL-SJD1 como hemos comentados en el apartado
anterior tiene baja carga mutacional.
En el paciente MEL-SJD1 el número de reordenamientos es menor los TILs,
debido a que hay menor número de clonas en el tumor y post-tto, que coincide con una
distribución más monoclonal (Clonality más alejada de 0 que la muestra pre-tto). La
abundancia relativa es similar en las 3 muestras (index de evenness) (Tabla R5).
En el paciente MEL-SJD2 el número de reordenamientos, en cambio es mayor
en la muestra post-tto, con una distribución más monoclonal, que podría ser debido al
aumento de las frecuencias de las clonas reactivas responsables del efecto terapéutico
(Tabla R5).
Una característica que difiere entre los 2 pacientes son los valores de las
frecuencias máximas en las 3 muestras estudiadas. En el paciente MEL-SJD1 la
frecuencia máxima de las clonas en las 3 muestras es de 0,47, en cambio en la muestra
post-tto del paciente MEL-SJD2 existe una clona con una frecuencia de 6,15, aunque
los valores en las otras 2 muestras de este paciente también son altos comparados con
MEL-SJD1.
RESULTADOS
134
Tabla R5: Descripción del repertorio TCR. El cambio en el repertorio de 2 pacientes con melanoma y respuesta
completa al tratamiento con anti-PD1 fue estudiado en una muestra del tumor, en sangre periférica antes del
tratamiento y en sangre periférica después de objetivarse respuesta completa. Los parámetros estadísticos que se
estudiaron fueron: el index Richness, el index de evenness, la clonalidad y el index Shannon que incorpora la tanto
Richness como Evenness. En la tabla también se muestra la clona con mayor representación en las diferentes
muestras (max. frecuencia).
Para estudiar las clonas comunes en las 3 muestras se utilizó el index Morisita.
En la Fig. R28A yR28C se muestra un diagrama de Venn con el número de secuencias
que coinciden entre muestras. MEL-SJD1 posee 274 comunes en las 3 muestras y el
tumor contiene mayor número de clonas comunes con la muestra post-tto, indicando
que las estas clonas podrías se las que se han expandido por el tratamiento y han
conseguido eliminar el tumor. El index de Morisita indica que en el paciente MEL-
SJD1 las muestras con mayor coincidencia son las 2 de sangre periférica (Fig. R28B)
debido a la gran diversidad de LT que posee un individuo con reactividades no
relacionadas con el efecto antitumoral. El index de Morisita confirma lo observado en el
diagrama de Venn en relación en el número de clonas comunes entre las muestras de
sangre periférica y el tumor, siendo más elevado en la pareja post-tto- tumor que en la
pareja pre-tto-tumor (Fig. R28B).
RESULTADOS
135
Figura R28: Dispersión de clonas. En los 2 pacientes existen clonas comunes a las 3 muestras. (A) Diagrama de
Venn que muestra las clonas idénticas comunes en las 3 muestras del paciente MEL-SJD1. El diagrama muestra 274
clonas comunes en las 3 muestras. (B) Index de Morisita de las combinaciones ente las 3 muestras de MEL-SJD1 El
index de Morisita para la pareja post-tto-tumor es mayor que para la pareja pre-tto-tumor. (C) Diagrama de Venn que
muestra 917 clonas idénticas y comunes en las 3 muestras de MEL-SJD2. (D) Index de Morisita de las 3 muestras
estudiadas del paciente MEL-SJD2, la pareja pre-tto-tumor es la que tiene mayor index. El diagrama de Venn muestra
el número declonas comunes entre las diferentes clonas, así como el número de clonas de cada una de las muestras
que no son comunes al resto de muestras. El index de Morisita compara la dispersión entre muestras. Se representa
mediante una escala de color donde el azul es 0 y el rojo 1. Un index de Morisita=0 indica que no existen clonas
coincidentes entre las muestras mientras que un index de Morisita=1 indica coincidencia de clonas con frecuencia
idéntica entre ellas.
En el paciente MEL-SJD2, 917 clonas son comunes a las 3 muestras. Al
contrario que en MEL-SJD1, la pareja con un mayor index de Morisita es la pre-tto-
tumor (Fig. R28D) que correlaciona con el número de secuencias que se observa en el
diagrama de Venn (Fig. R28C), donde la pareja pre-tto-tumor tienen 2625 clonas
comunes y sólo 688 la pareja post-tto-tumor.
RESULTADOS
136
A continuación, estudiamos el número de reordenamientos y los comparamos
entre las diferentes muestras. Este análisis es útil para determinar reordenamientos que
se hayan expandido con el tratamiento. El número de reordenamientos comunes entre el
tumor y la muestra post-tto es mayor que entre el tumor y la muestra pre-tto (Fig.
R29A-B). En la gráfica donde se compara tumor-post-tto (Fig. R29B), se observan
varios reordenamientos frecuentes en ambas muestras que podrían ser las que han
ejercido el efecto anti-tumoral.
Figura R29: Clonas compartidas entre las diferentes muestras. El tumor y la sangre periférica comparten
diferentes clonas que se expanden en sangre periférica tras el tratamiento con anti-PD1 y pueden emplearse en el
seguimiento de la eficacia tratamiento y en la evolución de la enfermedad
RESULTADOS
137
Respecto a MEL-SJD2, como ya ocurría con el index Morisita, los
reordenamientos entre muestra pre-tto-tumor comunes, son más elevados que entre la
muestra post-tto-tumor (Fig. R29C). En la gráfica Fig. R29D, también existen
reordenamientos comunes con alta frecuencia en la muestra post-tto. La frecuencia de
estos reordenamientos sería útil, si se comprueba reactividad, como biomarcador en la
evolución de la enfermedad.
En el seguimiento de las clonas productivas de las 3 muestras, existen diferentes
clonas con una evidente expansión en la muestra post-tto (Fig. R30) en los 2 pacientes.
Tambien se observan clonas, expandidas en el tumor que desaparecen en la muestra
post-tto o reducen su frecuencia, indicando clonas que no se han expandido durante la
resolución de la enfermedad.
Figura R30: Seguimiento de las clonas productivas más frecuentes entre las diferentes muestras. Evolución en
la frecuencia de las clonas productivas. (A) MEL-SJD1; varias clonas presentes en el tumor aumentan su frecuencia
en la muestra post-tto. Esta expansión post-tto indica la implicación de estas clonas en la resolución de la
enfermedad. (B) MEL-SJD2; se observa una clona que presente en el tumor y en la muestra pre-tto que aumenta su
frecuencia en la muestra post-tto de forma clara (color coral).
A continuación, comparamos las diferentes familias TCR-Vβ con controles sanos
y mismos rangos de edad para establecer si algunas de las familias podrían servir como
biomarcador en la evolución de la enfermedad y que estuviese ya alterada en la muestra
pre-tto. En ambos pacientes se observan diferencias notables en las frecuencias de las
diferentes familias TCR-Vβ respecto a los controles. En MEL-SJD1 se mantiene la
frecuencia de las familias TCR-Vβ en las 3 muestras, en cambio, en MEL-SJD2, Vβ-9
aumenta la frecuencia de forma significativa en la muestra post-tto (Fig. R31).
RESULTADOS
138
Algo a destacar que diferencia a los 2 pacientes de los controles es la elevada
frecuencia de la familia Vβ-7 (Fig.R31). La familia Vβ-7 podría ser una familia que
reacciona frente a NeoAg comunes en los pacientes pediátricos de melanoma. Son
necesarios estudios en más pacientes para determinar si la frecuencia de Vβ-7 puede ser
un valor predictivo del melanoma infantil.
Figura R31: Frecuencias de las familias TCR-Vβ en el repertorio TCR. Se comparan las frecuencias de las
distintas muestras con controles pediátricos sanos (281) determinados mediante citometría. Mapa de intensidades de
colores que muestra las diferencias de las frecuencias por la intensidad del color (Blanco= 0% de frecuencia; Negro=
15% de frecuencia). Las cruces indican familias que no han sido determinadas en esa determinada muestra.
RESULTADOS
139
3.2. Caracterización de los neopéptidos generados por simulación a
partir de las mutaciones somáticas del paciente pediátrico con
melanoma y alta carga mutacional
Al contrario que la LLC, el melanoma se caracteriza por su elevada carga
mutacional por ello hemos querido comparar las predicciones de simulación de un
paciente de melanoma, MEL-SJD2, que tenía el mismo número de mutaciones
somáticas que toda nuestra serie de 506 pacientes con LLC.
Los cambios de nucleótidos (nt) más frecuentes que generan las mutaciones en
el paciente con melanoma, al igual que pasaba en la LLC, son los cambios C>T/G/A,
que son los que se asocian a mutaciones provocadas por radiaciones ultravioleta (UV)
(Fig. R35A).
Figura R35: Cambios de nt en las mutaciones somáticas y restricción alélica de los neopéptidos definidos
mediante predicción in silico. (A) Los cambios de nt que se producen en el melanoma son los ocasionados
principalmente por las radiaciones ultravioletas. (B) Distribución de las neopéptidos en función del número de alelos
HLA-I que tienen afinidad de unión por ellos. El paciente MEL-SJD2 posee 14 neopéptidos que son capaces de ser
presentados por sus 6 alelos HLA-I.
El paciente MEL-SJD2 tiene 13369 mutaciones somáticas que generaban 12238
neopéptidos presentables por moléculas HLA. 1444 de estás mutaciones eran capaces de
ser presentadas por las moléculas HLA del paciente. 1293 podías ser presentados por
HLA-I y 1112 por moléculas HLA-II. 897 eran comunes. 14 de estos neopéptidos son
capaces de ser presentados por las 6 moléculas HLA-I propias del paciente y 75 por 5 de
los alelos HLA-I (Fig. R35B).
RESULTADOS
140
Si hacemos una descripción más detallada de las restricciones HLA-I de los
neopéptidos presentables por HLA-I, los alelos con mayor número de neopéptidos
presentables son los 2 alelos HLA-C (Fig. R36A). Los 4 alelos restantes tienen un
número parecido de neopéptidos con capacidad de unión. Si nos centramos en las
uniones SB, los alelo HLA-C son los que también tienen mayor número de uniones SB,
seguidos por HLA-A*33:01 (Fig. R36B).
Con relación a la longitud de los neopéptidos, la longitud de 9aa es la más
frecuente, seguido por los neopéptidos de 10 aa. Hay que destacar, que la longitud más
frecuente para la unión a A*33:01 es la de 11aa y para HLA-B*08:01 es la de 10 aa
(Fig.R36C). Por otro lado, los alelos HLA-C, no tienen ningún neopéptido de 8 aa con
afinidad de unión a ellos.
Figura R36: Descripción de los neopéptidos con capacidad de unión a los alelos HLA-I. (A) Distribución del
número de neopéptidos por alelo HLA-I con afinidad de unión SB y WB. Los alelos HLA-C son los que mayor
número de neopéptidos tienen con capacidad de unión a ellos. (B) Distribución de los neopéptidos con afinidad de
unión SB de los diferentes alelos HLA-I. (C). Distribución de la longitud de aa de los neopéptidos. HLA-A*02:01
(naranja), HLA-A*33:01 (rojo), HLA-B*08:01 (azul), HLA-B*51 (turquesa), HLA-C*03:04 (verde) y HLA-
C*16:01(gris). En la gráfica (B) el área del círculo es proporcional al número de alelos con SB. El área con mayor
número de uniones es para HLA-C*16:01 con 120 neopéptidos y la que menor área tiene es para HLA-B*08:01 con
36.
Las posiciones de los pockets que unen al péptido están establecidas en las
moléculas HLA-I. Los aa que se unen a estas posiciones específicas se mantienen
ampliamente conservados dentro de un mismo alelo HLA-I. El resto de las posiciones
del péptido no necesitan conservar un péptido concreto. Para mostrar la conservación
en la presentación de los neopéptidos simulados informáticamente, hicimos
RESULTADOS
141
representaciones gráficas donde se muestran la proporcionalidad entre frecuencia de aa
y conservación en las diferentes posiciones (logos) logos de los 6 alelos del paciente
(Fig. R37). Los 6 alelos estudiados conservan el aa de la posición P9 y sólo HLA-
A*33:01 y HLA-B*51:01 también conservan el aa en la posición P2. El resto de los
alelos en estas posiciones son más promiscuos en cuanto al aa al que se unen.
Cabe destacar a HLA-B*08:01 que contiene cierta conservación de aa en ciertas
posiciones intermedias, siendo R y K (los 2 aa con carga positiva).
Figura R37: Representación gráfica de las secuencias de los péptidos que se unen a distintos alelos HLA-I.
Representación de los logos de los 6 alelos HLA-I del paciente (HLA-A*02:01, HLA-A*33:01, HLA-B*08:01, HLA-
B*15:01, HLA-C*03:04 y HLA-C*16:01 con las distintas longitudes de aa, de arriba abajo 8 aa, 9 aa, 10 aa y 11 aa.
La última posición del neopéptido es la que contiene el aa más conservado en los 6 alelos del paciente. La altura de
los logos indica la conservación del aa en esa posición y el tamaño del aa indica la frecuencia con la que aparece
dicho aa.
Una vez observado la conservación de las posiciones de unión a los alelos HLA-I,
quisimos definir la posición del aa donde se sitúa el aa que ha generado la mutación
somática de la que proviene. En este sentido, en todos los alelos HLA-I del paciente el
aa nunca se sitúa en la última posición, situándose de forma equitativa en el resto de las
posiciones para los alelos HLA-A*02:01, HLA-A*33:01, HLA-B*08:01 (Fig. R38A).
En cambio, para HLA-B*51:01, la segunda posición tampoco contiene el aa del cambio.
Cabe destacar que para los alelos HLA-C la posición en la que se sitúa el aa de forma
clara es la posición 9.
En relación con las moléculas HLA-II, hay una clara tendencia a situar el aa en las
últimas posiciones del péptido. Como excepción, para HLA-DQB1*02:01, las
posiciones 16, 17 y 18 no contiene el aa de forma frecuente (Fig. R38B).
RESULTADOS
142
Si cuando lo que queremos ver es el aa que cabia, podemos observar que en los
neopéptidos que unen a HLA-I los aa que más aparecen son S, L y F. Un aa alifático
(L), otro polar sin carga (S) y un aa aromático (F) (Fig. R38C).
Figura R38: Localización del aa generado por la mutación dentro del neopéptido y aa mut que es más
frecuente en el neopéptido. (A y B) Distribución mediante mapa de colores la localización del aa que genera la
mutación en el neopéptido en los neopeptidos con restricción a HLA-I y HLA-II respectivamente. (C y D)
Distribución mediante mapa de colores el aa que genera el neopéptido.
Los aa que aparecen en los neopéptidos para clase II son los mismos que para
clase II, L, S y F (Fig. R38D).
En los 2 casos, hay algunos aa que prácticamente no aparecen en las mutaciones,
G, P, H y E (Fig. R38C-D).
3.3. Estudio del repertorio TcR en un paciente con melanoma y
respuesta completa al tratamiento con terapia celular adoptiva
Otro de los tratamientos que alteran el sistema inmunitario del propio
paciente para que actúe frente al cáncer es la ACT con TILs del propio paciente
expandidos ex vivo y administrados de nuevo al paciente. La importancia de los TCR de
estos TILs va más allá de la ACT y son la base para las opciones terapéuticas de
elaborar LT con TCR transgénicos para determinados HLA, la propuesta de máxima
RESULTADOS
143
especificidad en la inmunoterapia. Por ello en este apartado estudiamos la evolución de
un paciente con melanoma que consiguió respuesta completa tras la ACT con TILs.
3.3.1. Evolución de la enfermedad y muestras para el estudio
Figura R32 Línea de tiempo que muestra la evolución del paciente MEL-ALB y las muestras utilizadas en el
estudio. (A) Las progresiones que ha sufrido el paciente y los tratamientos administrados. (B) ACT y muestras
utilizadas en el estudio.
El paciente sufrió 5 progresiones anteriores a la administración de la ACT que
fueron resueltas con diferentes fármacos, algunos de ellos como Ipilimumab (anti-
CTLA4) y Pembrolizumab (anti-PD1), fármacos inmunomoduladores que actúan sobre
el sistema inmunitario del paciente para que éste genere la respuesta frente al tumor
(Fig. R32A). Tras la administración de la ACT se obtuvieron diversas muestras para el
seguimiento del repertorio TCR del paciente. En este periodo también se consiguieron
establecer 2 líneas tumorales para estudiar el efecto citotóxico de los diferentes LT del
paciente (Fig32B).
Tras la administración de la ACT, el paciente sufrió perdida de la melanina que da
color a la piel y respuesta completa.
3.3.2. Estudio de los linfocitos infiltrantes de la zona con albinismo
Por tanto, quisimos ver si los linfocitos que se encuentran en las zonas con
albinismo tenían efecto citotóxico frente a la línea tumoral generada a partir del mismo
tumor de los que se obtuvieron los TILs expandidos para la ACT. Para ello, diferentes
ratios de los TILs administrados en la ACT y los expandidos de la zona afecta de
RESULTADOS
144
albinismo se incubaron durante 12h con la línea tumoral. Los TILs de la zona afecta de
albinismo tienen efecto citotóxico, pero menor que los TILs de la ACT (Fig. R33A).
Figura R33: Caracterización de las poblaciones empleadas en ACT y LT en respuesta completa. (A) Actividad
citotóxica de los TILs empleados en la ACT y los expandidos de una lesión de vitíligo. (B) Comparación del
repertorio Vb en sangre periférica en respuesta completa, los linfocitos infiltrantes de vitíligo y los TILs
administrados en la ACT.
Otro de los objetivos fue comparar las frecuencias de las familias TCR-Vβ en los
TILs administrados y los obtenidos de la zona con albinismo. También se comparó una
muestra de sangre periférica (Fig R33B). No se observa frecuencias similares entre las
muestras, pero se observan 2 familias predominantes en la muestra de la zona del
albinismo. La familia TCR-Vβ-6 es la mayoritaria en los LT CD8+ y la familia TCR-
Vβ-21 en los LT CD4+. Hay que tener en cuenta, que la población CD8+ estaba
representada en los TILs de la ACT en un 87,4%, en cambio, en la expansión de los LT
de la zona con albinismo, los CD4+ eran mayoritarios (91%).
3.3.3. Evolución de las subpoblaciones linfocitarias tras la ACT
Por último, se estudió la evolución de los subpoplaciones linfocitarias en
diferentes muestras de TILs; en los TILs utilizados en la ACT, en linfocitos de un
ganglio sano previo a la progresión que sufrió el paciente tras la ACT y los TILs de la
adenopatía que confirmó la progresión. También se realizaron varias REP para estudiar
el cambio en las subpoblaciones que genera la propia expansión (Fig. R34A) utilizando
feeders irradiadas en 2 condiciones diferentes.
RESULTADOS
145
Figura R34: Evolución de las subpoblaciones T. Las subpoblaciones T generales no cambian durante la
evolución de la enfermedad, en cambio, si se observa diferencias significativas en la población Treg. (A)
Evolución de las subpoblaciones T en diferentes puntos tras la administración de la ACT y comparación con los TILs
de la ACT. Las subpoblaciones fueron definidas: Naïve CCR7+CD45RA+; CM CCR7+CD45RA-; EM CCR7-
CD45RA-; EFF CCR7-CD45RA+. (B) Evolución de los Treg en distintos puntos antes y después de la progresión
tras la ACT. La población Treg se definió como CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+.
El estudio de las Treg compara una muestra antes de la progresión de la
enfermedad (REP 20/08/2018) con diferentes muestras después de la progresión. El
porcentaje de Treg estaba más elevado en la muestra anterior a la progresión al
compararlo con las muestras post-progresión (Fig. R32B). También se observa que la
REP aumenta el % de Treg cuando se compara con TILs expandidos sólo con beads anti
CD28/CD3 a partir de los ganglios de la adenopatía. Por tanto, estos resultados
demuestran que es importante tener en cuenta la caracterización de las subpoblaciones T
previa a la REP para evitar la expansión de células inhibitorias.
.
4. VALORACIÓN DE LA FRECUENCIA EN LOS LINFOCITOS T
CD4+ FRENTE A LOS EPÍTOPOS INCLUIDOS EN LA
VACUNA FRENTE A LA GRIPE
Como se ha demostrado en los apartados anteriores, los estudios in silico son útiles
para determinar neopéptidos capaces de generar inmunogenicidad en los pacientes que
contienen las mutaciones de las que proviene, por ello creemos que los estudios in silico
de los antígenos de las cepas utilizadas en las vacunas frente a diferentes enfermedades
pueden ayudar a mejorar la respuesta frente a estos compuestos.
RESULTADOS
146
En el desarrollo del cuarto objetivo del presente trabajo hemos estudiado la
evolución la frecuencia de los LTh específicos a péptidos de la cepa del virus de la gripe
A/California/7/2009(H1N1)pdm09-like virus simulados informáticamente y con
afinidad de unión a HLA-DRB3*02:02. La cepa A/California/7/2009(H1N1) pdm 09-
like virus se ha utilizado en la composición de las vacunas frente a la gripe del
hemisferio norte desde la campaña 2010/2011 a 2016/2017. Para ello hemos utilizado
muestras de un sujeto HLA-DRB3*02:02 que se ha ido vacunando frente a la gripe de
forma consecutiva los últimos 9 años. Se obtenían muestras pre-vacuna a los 7, 15, 30
días, y a los 3 y 6 meses. La frecuencia de los LTh específicos se obtuvo mediante la
determinación del aumento de expresión de CD154 tras incubación durante 5h con los
péptidos de interés.
Mediante las predicciones in silico se determinaron 12 péptidos del virus
A/California/7/2009(H1N1)pdm09-like virus con capacidad de unión a HLA-
DRB3*02:02.
4.1. Estudio de las frecuencias de los linfocitos específicos frente a
péptidos de la gripe tras la administración de la vacuna
En el experimento de la figura R39 se muestra la expresión de CD154 en
10 muestras del paciente. La primera muestra es una muestra histórica del paciente,
anterior a la vacunación con el virus de interés para observar si las vacunas de años
anteriores contenían algún péptido con capacidad de generar respuesta cruzada con los
péptidos de interés.
RESULTADOS
147
Figura R39: Evolución del % y la expresión de LTh específicos para los péptidos de la gripe. Se estudió la
evolución de los LTh específicos a los péptidos con afinidad a las moléculas HLA-DRB3*02:02 determinada
mediante estudios in silico que formaban parte de la cepa A/California/7/2009(H1N1)pdm09-like virus incluida en la
vacuna de la gripe desde 2010/2011 a 2016/2017. Las PBMCs se descongelaron y se dejaron O/N a 37ºC para que
recuperaran las funciones basales. Al día siguiente, se cultivaron con 20 µg/ml de péptidos específicos durante 5h.
Tras la incubación los LTh específicos se purificaron por selección de la población CD154+ mediante beads
magnéticas. Tras la separación se analizaron mediante citometría de flujo.
Los LTh específicos a los péptidos de estudio no somos capaces de determinarlos
hasta 1 año después de la primera vacunación (15/11/2012), la frecuencia consigue un
pico máximo a los 15 días de la segunda vacuna y se mantiene hasta un año después de
la 2 vacunación. En la muestra previa a la tercera vacunación (04/11/2013) ya no se
observan LTh específicos de los péptidos del virus de la gripe estudiados.
4.2. Estudio del repertorio TcR pre y post administración de la
vacuna
También se estudió las frecuencias de las diferentes familias TCR Vβ en varias
muestras del seguimiento (Fig. R40), tras la incubación con los péptidos. En cuanto a
los LT CD8+ no se observa el mantenimiento de las frecuencias de ninguna de las
familias TCR Vβ, como era de esperar ya que los péptidos de estudio tienen restricción
a moléculas HLA-II.
RESULTADOS
148
Figura R40: Distribución las familias TCR-Vβ en PBMCs de un sujeto vacunado de forma tras incubación con
los péptidos durante 5h. Mapa de intensidades de colores donde se representan las frecuencias de las diferentes
familias TCR-Vβ en las poblaciones CD3+CD8+ y CD3+CD4+. La intensidad de color indica el aumento de las
frecuencias cuyo intervalo va de 0%= blanco a negro =15,7%.
En cambio, cuando nos referimos a LT CD4+ se observa en las 4 muestras que la
familia TCR Vβ-2 se mantiene constante a lo largo del tiempo (Fig. R40).
5. EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD DE PRESENTACION
ANTÍGÉNICA MEDIANTE RECONOCIMIENTO ALOGÉNICO
Como quinto objetivo específico queríamos estudiar la reactividad frente a los
loci secundarios en su papel de aloantígenos. Para ello, estudiamos la capacidad de
generar anticuerpo contra las moléculas HLA-DR en pacientes inmunizados de la lista
de espera de trasplante renal y la diversidad en la presentación de las moléculas HLA-
DRB como aloantígenos por parte de los distintos alelos HLA-I y HLA-II.
La estimulación alogénica se da cuando hay reconocimiento de moléculas MHC
alogénicas o con variaciones alélicas pertenecientes a individuos de la misma especie.
Dicho alo-reconocimiento por parte del TCR de linfocitos T alo-reactivos, induce la
RESULTADOS
149
activación y proliferación de estos, gracias también a la interacción de moléculas
accesorias con sus respectivos ligandos. En este sentido, el reconocimiento alogénico,
se presenta como una forma de estudiar la activación vía TCR de manera contacto-
dependiente.
5.1. Estudio de los anticuerpos anti-HLA-DRB para determinar
la reactividad anti-HLA-DRB
Para este objetivo, se estudiaron 83 pacientes hiperinmunizados y se compararon
las MFI (intensidades medias de fluorescencia) de los anticuerpos generados frente a
HLA-DRB1 y frente a sus correspondientes moléculas accesorias HLA-
DRB3/DRB4/DRB5 en todos los pacientes de forma global y de forma específica. Para
la última situación se tuvieron en cuenta la tipificación HLA-DRB de cada paciente.
Los datos obtenidos demuestran que los distintos alelos HLA-DR exhiben
distintas aloreactividades (Fig R41A), siendo los alelos HLA-DR asociados a DRB4 los
que los que, de forma global, tienen mayores MFIs. En el análisis global, agrupando los
alelos HLA-DRB1 asociados a sus diferentes loci secundarios, observamos que no
existen diferencias en las MFI entre los anticuerpos anti-DRB3 y anti-DRB1 asociados
a DRB3 (DRB1*03, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 y DRB1*14), en cambio las MFI
anti-DRB5 son mucho más altas que las anti-DRB1 asociados a DRB5 (DRB1*15 y
DRB1*16). Finalmente, DRB4 es el locus que produce menos reactividad respecto a los
alelos DRB1 asociados a él (DRB1*04, DRB1*07 y DRB1*09) (Fig 41RB).
RESULTADOS
150
Figura R41: Distribución de las MFI de los anticuerpos anti-HLA-DR. Los anticuerpos anti-HLA-DR fueron
determinadas mediante el kit LSA Clase II (Immucor) y la tecnología Luminex® 200TM. (A) Distribución de los
niveles de MFI para todos los alelos HLA-DRB que dispone el kit LSA Clase II (Immucor) con la que se estudió los
anticuerpos anti-HLA en nuestra serie de pacientes. (A) Distribución de los niveles de MFI para los alelos HLA-DRB
agrupando los alelos HLA-DRB1 en función de las moléculas accesorias con las que se expresan. Los alelos HLA-
DRB1 que no tienen ninguna molécula accesoria no se representan en esta imagen. El nivel de positividad para los
anticuerpos anti-HLA-DR está establecido en 1500. En nuestra serie de pacientes la media en los valores de MFI es
superior debido a que nuestros pacientes son pacientes hipersensibilizados. HLA-DRB1 asociados a DRB3 (verde
claro), HLA-DRB3 (verde oscuro), HLA-DRB1 asociados a DRB4 (naranja claro), HLA-DRB4 (naranja oscuro),
HLA-DRB1 asociados a DRB5 (azul claro), HLA-DRB5 (azul oscuro), alelos HLA-DRB1 sin ninguna molécula
accesoria asociada (gris).
Por otro lado, se analizaron los datos teniendo en cuenta la tipificación HLA-
DRB1 de los pacientes, los resultados difieren de los obtenidos de forma global. En este
caso, los pacientes que tienen un alelo DRB1-DRB3 asociado son menos reactivos que
los pacientes que tienen los 2 alelos asociados a DRB1-DRB3 frente a todos los alelos
asociados a este grupo (HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*12, HLA-
DRB1*13 y HLA-DRB1*14), y también tienen más reactividad frente al resto de alelos
DRB1, siendo, DRB5 el grupo alélico (HLA-DRB5*01:01 y HLA-DRB5*02:02) el más
inmunogénico (Fig. 42RA). Cuando nos referimos a los alelos asociados a HLA-DRB4,
los pacientes HLA-DRB1*07 positivo tienen una reactividad mayor anti-DRB1*04 que
los pacientes HLA-DRB1*04 frente a DRB1*07. Este grupo de pacientes (HLA-DRB1
RESULTADOS
151
Figura R42: Representación de aloreactividades anti-HLA-DR. Representación de las aloreactividades teniendo
en cuenta la tipificación HLA-DRB1 de los pacientes en relación con los alelos asociados a su grupo HLA-DRB
asociado (gráficas de la izquierda) y a los grupos en los que no existe ninguna relación con su HLA-DRB accesorio
(gráficas de la derecha). (A) Representación de las MFI para los pacientes HLA-DRB3 positivos frente a las
moléculas asociadas a éste (gráfica de la izquierda) y al resto de moléculas que tienen una molécula HLA-DRB
accesoria (gráfica de la derecha). Pacientes con un solo alelo asociado a HLA-DRB3 (verde claro), pacientes con los
2 alelos HLA-DRB1 asociados a HLA-DRB3 (verde oscuro). (B) Representación de las MFI para los pacientes HLA-
DRB4 positivos frente a las moléculas asociadas a éste (gráfica de la izquierda) y al resto de moléculas que tienen
una molécula HLA-DRB accesoria (gráfica de la derecha). Pacientes con un alelo HLA-DRB1*04 (círculos
naranjas), pacientes con un alelo HLA-DRB1*07 (cuadrados naranjas) y pacientes con los alelos HLA-DRB1*04 y
HLA-DRB1*07 (triángulo naranja oscuro). (C) Representación de las MFI para los pacientes HLA-DRB5 positivos
frente a las moléculas asociadas a éste (gráfica de la izquierda) y al resto de moléculas que tienen una molécula HLA-
DRB accesoria (gráfica de la derecha). Pacientes con el alelo HLA-DRB1*15 (azul claro), pacientes el alelo HLA-
DRB1*16 asociados a HLA-DRB3 (azul oscuro).
RESULTADOS
152
asociado a DRB4) tienen la mayor reactividad frente a los alelos DRB1-DRB3
relacionados, como por ejemplo DRB1*13:03 o DRB3*02:02 (alelos bastante
frecuentes en la población caucásica) (Fig.R42B). Por último, los pacientes DRB1*15 y
DRB*16 no tienen reactividad entre ellos, mientras que si muestran reactividad frente a
DRB1*13:03 o DRB3*02:02 como ocurría en los pacientes con alelos DRB1-DRB4
asociados (Fig.R42C).
Estos datos sugieren que las diferencias entre MFI para cada alelo podrían
explicarse por la especificidad asociada a regiones estructuralmente definidas (epítopos
HLA) y su caracterización podría agrupar las reactividades de estos alelos de forma más
concreta.
5.2. Evaluación de la diversidad de presentación antigénica
mediante la capacidad de unión de los péptidos de las moléculas
HLA-DRB por otros alelos HLA
Para ello, hicimos un estudio de las reactividades frente a las moléculas HLA-
DRB in silico y determinamos la capacidad de unión a las distintas moléculas HLA.
Con este estudio queríamos comprobar si la predicción in silico puede ayudar a predecir
la generación de anticuerpos por pacientes con una determinada tipificación HLA y
poder ayudar en la selección del receptor más compatible en el trasplante renal.
El estudio in silico de unión de los péptidos de las moléculas HLA-DRB se
realizó tanto en las moléculas HLA de clase I, HLA-A, HLA-B y HLA-C como con las
moléculas HLA de clase II, HLA-DRB y HLA-DRQB1/DQA1 y la afinidad de unión se
clasificó en función del %Rank en uniones fuertes (SB<0,5) y uniones débiles
(WB=0,5-2) para las moléculas HLA-I y %Rank<20 para SB y %Rank=20-90 para
moléculas HLA-II.
Si nos centramos en la capacidad de unión SB (Fig R43A) de las moléculas
HLA-A (Fig. R43.1-2) a los péptidos de las moléculas HLA-DRB, las moléculas HLA-
DRB1*04 son las que generan mayor número de péptidos con unión SB. Las moléculas
RESULTADOS
153
HLA-A que menos se unen péptidos de HLA-DRB son HLA-A*02, HLA-A*03 y
HLA-A*11(Fig. R43.a).
Figura R43: Distribución de las uniones a las moléculas HLA-I los diferentes péptidos de las moléculas HLA-
DRB. En el mapa de la izquierda se observan las uniones SB (%Rank<0,5) y en el mapa de la derecha se muestran
las uniones WB (%Rank=0,5-2). Los rectángulos en rojo (a-g) muestran los alelos HLA-I con mayor capacidad de
presentar péptidos de las moléculas HLA-DRB1 de forma general. Los rectángulos en verde (1-5) indican los alelos
HLA-DRB frente a los que existe mayor reactividad por parte de determinados alelos HLA-I. Escala de color: SB (0-
14), WB (0-43).
En cuanto a la unión de las moléculas HLA-B, en conjunto se observa un
número menor de uniones, aunque cabe destacar HLA-B*15:03 y HLA-B*27, que
tienen alrededor de 10 péptidos de las moléculas del alelo HLA-DRB1*04 y los
asociados con HLA-DRB5; HLA-DRB1*15 y HLA-DRB1*16 (Fig. R43.3c). La
molécula HLA-B con menor unión a péptidos de HLA-DRB es HLA-B*51:01
Si tenemos en cuenta las uniones de HLA-C, algunos de los alelos HLA-C
tienen bastante capacidad de unión a los péptidos de HLA-DR, como son HLA-
C*04:01, HLA-C*05:01, HLA-C*07 y HLA-C*14:02 (Fig. R43d). Las moléculas
HLA-DR con más péptidos de unión a moléculas HLA-C son el grupo de HLA-
DRB1*04 y HLA-DRB1*11 (Fig. R43.4.5).
RESULTADOS
154
También hay gran número, HLA-C*05:01 de alelos que tienen afinidad de unión
WB a los péptidos HLA-DR, entre los que destacan HLA-A*29:01 y HLA-A*29:02
(Fig. R43e), HLA-B*27:02 y HLA-A*27:05 (Fig. R43f) y HLA-B*57:01 y HLA-
B*58:01 (Fig. R43g).
El alelo con menor capacidad de generar péptidos que pueden unirse a las
moléculas HLA-I es HLA-DRB1*08:01. A pesar de esto, los pacientes
hipersensibilizados generan anticuerpos con MFI por encima de la media de la serie a
estudio.
En cuanto a la reactividad de las moléculas HLA-DR con las propias moléculas
HLA-DR, hay muchas moléculas que no se unen de forma fuerte con ninguna molécula
de HLA-DR, como son varios miembros del alelo HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*08 y
HLA-DRB1*13 (Fig. R44A), en cambio, las moléculas del grupo alélico HLA-
DRB1*04 con capaces de unirse a alrededor de 10 péptidos de las diferentes moléculas
HLA-DRB (Fig. R44a). El grupo de alelos HLA-DRB1 asociados a HLA-DRB5
también son capaces de unirse a varios péptidos de las moléculas HLA-DR (Fig. R44b),
lo que también ocurre con las moléculas HLA-DRB3 (Fig. R44c). Frente a los péptidos
de estas moléculas accesorias también tenía afinidad de unión distintos alelos HLA-DR
(Fig. R44.1). Como había gran número de alelos sin ninguna unión SB, también se
incluyó en el estudio de uniones WB (%Rank 20-90), que también son capaces de
generar respuesta a nivel de los linfocitos TCD4+ (Fig. R44B). En esta situación, las
moléculas del alelo HLA-DRB1*11, que no unen péptidos de forma fuerte, si son
capaces de unir bastantes péptidos de forma débil, al igual que HLA-DRB1*08. Dos
grupos de alelos HLA-DQB presentan gran capacidad de unión WB a los péptidos
generados por la mayoría de las proteínas HLA-DR (Fig. R44d-e). A pesar de las
predicciones in silico, se necesitan estudios experimentales para confirmar que los
péptidos de unión débil son capaces de ser presentados por las moléculas HLA y
generar respuesta, por tanto, se necesitan estudios DONANTE-RECEPTOR para
comprobar si la especificidad epitópica es un enfoque clínicamente útil en el estudio del
rechazo, lo que podría ayudar a la selección de receptores más idóneos.
RESULTADOS
155
Por otro lado, la distinta aloreactividad (diferencia de unión) de los loci
secundarios indica un papel diferencial de estas moléculas complementarias (HLA-
DRB3, HLA-DRB4 y HLA-DRB5). Por ejemplo, HLA-A*33 es capaz de unirse tanto
con uniones SB como WB con los péptidos de HLA-DRB3 con un gran número de
uniones; en cambio no lo hace con HLA-DRB4 ni con las moléculas HLA-DRB5 (Fig.
R45A y C). En cambio, las moléculas HLA-DR se unen a pocos péptidos de las
moléculas accesorias con uniones SB, pero si lo hacen con uniones WB (Fig. R45B y
Figura R44: Distribución de las uniones de las moléculas HLA-II a los diferentes péptidos generados por las
moléculas HLA-DRB. En el mapa de la izquierda se observan las uniones SB (%Rank<20) y en el mapa de la
derecha se muestran las uniones WB (%Rank=20-90). Los rectángulos en rojo (a-e) muestran los alelos HLA-II con
mayor capacidad de presentar péptidos de las moléculas HLA-DRB1 de forma general. El rectángulo en verde (1)
indica los alelos HLA-DRB frente a los que existe mayor reactividad por parte de determinados alelos HLA-II.
Escala de color: SB (0-12), WB (0-39).
D). Dentro del grupo de moléculas accesorias, las que contienen mayor número de
péptidos con capacidad de unión al resto de moléculas HLA-DRB1 son el grupo de
HLA-DRB3. Esta capacidad de unión coincide con la capacidad de generar anticuerpos
de estas mismas moléculas.
En esta comparación hay que tener en cuenta que los anticuerpos son capaces de
reconocer los Ag en su forma nativa, por tanto, la comparación entre capacidad de
presentación de las moléculas HLA con la producción de Ac tiene que hacerse con
precaución.
RESULTADOS
156
Figura R45: Distribución de las afinidades de unión a los diferentes péptidos generados por las moléculas
accesorias HLA-DRB por los diferentes alelos HLA-I y HLA-II. (A) Uniones SB (%Rank<0,5) a moléculas HLA-
I (B) Uniones SB (%Rank<20) a moléculas HLA-II. (C) Uniones WB (%Rank=0,5-2) a moléculas HLA-I (D)
Uniones WB (%Rank20-90) a moléculas HLA-II. Escala de color: SB (0-12), WB (0-39).
RESULTADOS
157
6. EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD EN LA PRESENTACIÓN
ANTIGÉNICA DERIVADA DEL CNV DE LAS MOLÉCULAS
ACCESORIAS DE DRB1; DRB3, DRB4 Y DRB5 EN
DIFERENTES ENFERMEDADES: TNA, ESCLEROSIS
MÚLTIPLE Y DIABETES.
El siguiente objetivo de esta tesis es determinar si los loci secundarios de las
moléculas HLA-DRB tenían variación en el número de copias (CNV) y si la variación
en el CNV podría estar implicada en la incidencia o en la evolución en enfermedades
donde se ha visto la implicación de estas moléculas HLA accesorias.
6.1. CNV en pacientes con esclerosis múltiple
Para llevar a cabo este estudio, se determinó la tipificación HLA-DRB1 (Fig.
R46A) y la frecuencia de HLA-DRB5 en 96 pacientes con Esclerosis Múltiple y 84
controles. Se observo una mayor frecuencia de HLA-DRB5 en el grupo de pacientes
con Esclerosis Múltiple (37,9%), relación ya establecida, cuando se compara con los
controles (29,7%).
Lo más llamativo es la alta frecuencia de pacientes con Esclerosis Múltiple que
son HLA-DRB1*04 (19,7%), frente al 8,3% en el grupo control, relación que no ha sido
establecida en la bibliografía (Fig R46B).
Al cuantificar la variación en el número de copias (CNV) para HLA-DRB5 en
los 36 pacientes y 25 controles con el locus HLA-DRB5, se observa que en el grupo de
Esclerosis Múltiple hay 3 pacientes con 2 CNVs y 1 paciente con 3 CNVs. En el grupo
control, 2 individuos mostraron 2 CNVs, pero ninguno de ellos 3 CNVs. Tras el análisis
de los datos, el riesgo relativo (RR) de tener más de 1 CNV como riesgo de Esclerosis
Múltiple fue de 1.146, mientras que el análisis mediante regresión logística no indicó
asociación estadísticamente significativa entre HLA-DRB5 y Esclerosis Múltiple
(p=0.688) (Fig R46C).
RESULTADOS
158
Figura R46: Determinación del CNV en pacientes con esclerosis múltiple. (A) Tipificación HLA-DRB1 (B)
Número homocigosis para HLA-DRB1*15-16, para HLA-DRB1*04 y con un alelo asociado a DRB5 y el alelo HLA-
DRB1*04. (C) Determinación de los CNV. Pacientes (negro) y controles (gris).
Para concluir, nuestros resultados no sugieren asociación entre el CNV de HLA-
DRB5 y la incidencia de Esclerosis Múltiple. Estos datos podrían ser debidos al número
bajo de muestras; por esta razón, más estudios son necesarios para aclarar la influencia
del CNV HLA-DRB5 y la susceptibilidad o severidad de la Esclerosis Múltiple,
también sería importante determinar el CNV de DRB4 e incluso la simultaneidad de
DRB4 y DRB5 y su asociación con la enfermedad.
6.2. CNV en madres con hijos que han sufrido trombocitopenia
neonatal autoinmune (TNA)
En relación con la asociación entre HLA-DRB3 y TNA hay estudios que
demuestra la implicación de la molécula HLA-DRB3*01:01 en la presentación del
péptido del padre que ha heredado el feto por las moléculas HLA-DRB3*031:01 de la
madre. Por tanto, en este apartado de la presente tesis queríamos determinar si las
madres con hijos que han sufrido TNA poseen CNV en sus alelos HLA-DRB3*01:01,
para ello, se realizó la tipificación HLA-DRB en 32 pacientes y 32 controles, todos ellos
RESULTADOS
159
con un alelo como mínimo asociado a HLA-DRB3. Del grupo de 32 pacientes con TNA
y 32 controles positivos para HLA-DRB3 se cuantificó el CNV para este locus. En el
grupo de pacientes, 8 (6,2%) pacientes mostraron 1CNV en 16 pacientes (50%) 2
CNVs, 5 (15,6%) de los pacientes 3 CNVs y sólo en 1 (3,1%) paciente se determinaron
4 CNVs. 2 pacientes eran HLA-DRB3 negativo (6,25%). Por el contrario, en el grupo
control un 68,7% de los pacientes tenían 1 CNV y el resto (31,2%) 2CNV. Se observa
una diferencia estadísticamente significativa entre tener 1 CNV-DRB3 o tener más de 1
(p=0,001) y un RR= 2,578.
Figura R47: Determinación del CNV en madres HLA-DRB3*01:01 en madres con hijos que han sufrido TNA
y un grupo control. (A) Tipificación de HLA-DRB1 (B) Determinación del CNV. Pacientes (negro), controles
(gris).
6.3. Determinación de la diferente capacidad de presentación en
función del CNV
En un grupo de pacientes con CNV conocidas para HLA-DRB4 se determinó la
frecuencia de LTh específicos para diferentes péptidos que se unen a HLA-DRB4
mediante citometría de flujo con tetrámeros HLA-DRB4 cargados con los péptidos de
interés. Las frecuencias más elevadas se observaron para el grupo de pacientes con 2
CNV para DRB4 (Fig. R48A). En la figura R48B se muestra un ejemplo de citometría
para determinar la frecuencia de LTh específicos para TTHCp44.
RESULTADOS
160
Figura R48: Frecuencia de LTh específicos para determinados péptidos con capacidad de unión a HLA-
DBR4*01:01 (A) Frecuencia por millón de LTh a determinados péptidos en función del CNV. (B) Ejemplo de
marcaje con tetrámeros DRB4 a LTh específicos frente TTHC p44. CNV1 (negro), CNV2 (gris claro), CNV4 (gris
oscuro). n (CNV1=2; CNV2=1; CNV4=2). No se determinó la frecuencia frente a GAD p45 y TTL p33 en los
pacientes con CNV4.
7. ESTUDIO DE LA FRECUENCIA, ESPECIFICIDAD Y
MAGNITUD DE LTH PARA EL EPÍTOPO HPA-1A
La aloimunidad es generalmente importante en trasplante y las moléculas HLA
es uno de los sistemas más aloantigénicos, pero la aloinmunidad puede ser una
complicación en transfusiones o en el embarazo.
Las madres que son DRB3*01:01 y homocigotas para HPA-1b son capaces de
generar anticuerpos frente a la molécula HPA-1a diferenciada por 1 aa en la secuencia
de la proteína HPA-1b (P/L) del feto procedente del padre, con implicación de los
linfocitos T CD4+ en la producción de estos anticuerpos.
7.1. Selección in silico de los péptidos HPA-1a
Estudios de péptidos de unión a la molécula DRB3*01:01 sugieren que los aa
ácidos en la P4 y los residuos hidrofóbicos en la P1 y P9 son muy importantes.
Algunos estudios muestran como core que se une a la molécula HLA
DRB3*01:01: 25
WCSDEALPL33
mostrando que el 25
Trp, 28
Asp y 33
Leu son importantes
para la unión a los pockets P1, P4 y P9 de la molécula HLA mientras que Pro
obstaculiza estéricamente el acoplamiento en P9, con algunos extra residuos a ambos
lados del core que no afectan al reconocimiento por parte de los LTh (282).
RESULTADOS
161
No se conoce la secuencia exacta frente a la que se generan los anticuerpos, por eso se
hizo un estudio in silico mediante el software NetMHCIIpan 3.1 de la región de la
proteína donde se encuentra la diferencia (Tabla R6) para definir los péptidos con
mayor probabilidad de unión a HLA-DRB3*01:01 y se sintetizaron 2 péptidos; el de
mejor %Rank y el de peor, MCAWCSDEALPL/PGSPR y AWCSDEALPL/PGSPR
para los estudios in vitro y ex vivo.
Tabla R6: Predicción de la afinidad in silico. Los péptidos generados en la región de la proteína HPA-1 donde se
incluye el cambio de aa entre HPA-1a y HPA-1b y tienen afinidad de unión con DRB3*01:01.
7.2. Respuesta específica LTh en donantes sanos DRB3*01:01
En el estudio in vivo en un control sano sólo se vio respuesta en el péptido con
mejor %Rank, MCAWCSDEALPLGSPR (Fig. R49A) tras la depleción de la población
CD4+CD25+.
RESULTADOS
162
Figura R49: Comparación de frecuencia en 2 muestras con LTCD4+ totales o sólo con LTconv. (A) Ejemplo de
un paciente negativo tanto para LTCD4+ totales como para LTconv (B) Ejemplo de una muestra negativa para
LTCD4+ totales y positiva para LTconv.
7.3. Caracterización de la respuesta de los LTh frente al péptido
HPA-1a
Una vez establecido el péptido que es capaz de generar respuesta, se estudiaron
10 controles sanos (datos no mostrados), de los cuales ninguno generó reactividad tras
el estudio in vivo con PBMCs totales, en cambio, en 2 controles se observó reactividad
al depleccionar la población CD4+CD25+ (Fig. R49A). Por otro lado, queríamos
establecer la frecuencia de esta población; para ello, se hizo un estudio ex vivo en 2
controles DRB3*01:01 y HPA-1a/1a donde se observaron frecuencias de: 11,2/mill y
4,7/mill (Fig. R50A). Al caracterizar la población tetrámero+ mediante un marcaje por
citometría con distintos marcadores para las principales poblaciones T CD4+ [basadas
en (a) CXCR3 que caracteriza los linfocitos Th1, (b) CCR6 como marcador de los
linfocitos Th17, (c) CXCR5 que determina los linfocitos foliculares Tfh y (d) CCR4
usado como marcador de los Th2], se observa que la mayoría de la población
tetrámero+ es principalmente CCR4, marcador de población Th2 (Fig. R50A).
RESULTADOS
163
Figura R50: Caracterización de la población HPA-1a positiva. (A) Estrategias de selección para la determinación
de la frecuencia de linfocitos específicos para el péptido de HPA-1a. (B) Caracterización de la población positiva
frente al péptido de HPA-1a.
La eliminación a nivel central de auto-Ag de LT autoreactivas incluso cuando el TCR
muestra moderada o alta afinidad es incompleta. Por eso la auto-reactivadad de Ag
específicos es un componente normal de los LTh y la manipulación de la población
Treg puede ser beneficiosa para individuos con enfermedad autoinmunes y cancer
(283).
V. DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
167
Existen numerosos trabajos que demuestran la correlación entre la carga
tumoral, la carga de neoantígenos específicos de paciente con el beneficio a diversos
tratamientos entre los que se encuentran los anti-CTLA-4 y anti-PD1 en el contexto de
melanoma y cáncer de pulmón. Por eso en los últimos años se ha hecho imprescindible
el estudio de toda la información que proviene de la carga tumoral siendo
fundamentales los neoantígenos que generan para intentar encontrar biomarcadores que
nos ayuden a predecir qué pacientes se beneficiarán de estos tratamientos. A pesar de
que los tratamientos que modulan el sistema inmune para generar respuesta están
consiguiendo tasas de respuesta muy altas, existen pacientes que no se benefician de
esos tratamientos. Las causas por la que unos pacientes si responden al tratamiento con
inmunoterapia y otros no sigue sin estar establecida.
La evaluación de la respuesta antígeno específica siempre ha sido compleja por
la alta variabilidad antigénica (millones de opciones) y por la también elevada
variabilidad de las moléculas HLA (miles de alelos). Sin embargo, en los últimos años
los avances en las técnicas de secuenciación junto con los avances informáticos han
permitido un claro avance en el estudio de respuestas frente a antígenos concretos.
Las nuevas técnicas de secuenciación, encabezadas por la secuenciación masiva
(NGS) han permitido reducir los costes de la secuenciación de genomas y exomas.
Además, los tiempos en conseguir dicha información también se han reducido
notablemente. La NGS nos permite obtener la secuencia de un genoma completo en el
plazo de días. La característica fundamental que a logrado este gran avance consiste en
la utilización de identificadores únicos de muestra, que permiten que en un solo run se
puedan secuenciar al mismo tiempo miles de secuencias diferentes. Estas tecnologías
van asociadas a complejos programas informáticos que permiten las alineaciones de las
secuencias obtenidas. y la comparación con secuencias de referencias. Otra de las
ventajas de esta tecnología es que es capacz de secuenciar secuencias nuevas sin la
necesidad de referencias a las que compararse. Por ejemplo, la NSG a tiempo real
permite, secuenciar fragmentos de gran tamaño (Mbp) sin la necesidad de
amplificaciones previas que podrían conducir a la generación de errores, por lo que nos
encontramos con secuencias precisas con baja tasa de error. Otra de características de
esta nueva tecnología es la capacidad en la cuantificación, que permite la determinación
del CNV dentro de la propia secuenciación sin la necesidad de procedimientos extra.
DISCUSIÓN
168
Como consecuencia, estas nuevas tecnologías, generan grandes cantidades de
datos que necesitan de nuevas herramientas bioinformáticas para su análisis. Esto ha
hecho que también se haya generado una revolución a nivel informático para el
desarrollo de potentes programas de análisis.
Como ya hemos comentado, la carga tumoral esta asociada a la carga de
neoantígenos. La caracterización de estas cargas es fundamental a la hora de plantearse
terapias personalizadas.
Existen diferentes estrategias para la identificación de neoantígenos que combinan
técnicas bioquímicas junto con programas predictivos computacionales (284).
Dentro de las técnicas bioquímicas, la espectrometría de masas se utiliza para
identificar y cuantificación fragmentos peptídicos. Mediante esta técnica se pueden
identificar neoepítopos tanto de LT CD4+ como de los LT CD8+.
Si nos referimos a la determinación de la carga mutacional de los tumores mediante
técnicas indirectas, y teniendo en cuenta que, de los aproximados 3 billones de
nucleótidos que hay en el genoma humano, solo un porcentaje pequeño (30Mb o 1%) de
esos nt codifican para genes que codifica para proteínas, incluyendo mutaciones sin
sentido, inserciones, deleciones o nuevos marcos de lectura. Hacer la secuenciación del
exoma puede reducir costes y también reducir la cantidad de datos para el posterior
análisis. Estas secuencias alteradas se pueden expresar mediante técnicas de biología
molecular en APC para su estudio experimental. Este sistema tiene la desventaja de que
no se puede hacer una selección a la hora de priorizar unas mutaciones sobre otras. En
cambio, existen técnicas computaciones denominados in silico mediante los cuales se
pueden seleccionar péptidos que se unen a moléculas de HLA y posteriormente se
evalúa su capacidad de desencadenar la activación de los LT. Estos sistemas in silico
reducen el número de mutaciones a estudio.
Estas potentes herramientas informáticas son capaces de predecir de forma
efectiva y fiable la afinidad de unión de grandes cantidades de secuencias péptidas a las
diferentes moléculas HLA. Uno de los problemas a la hora del desarrollo de estas
herramientas informáticas es la falta de datos empíricos necesarios para que los sistemas
de predicción sean fiables. Existen datos que establecen en 50-200 medidas
experimentales de unión para HLA-I y entre 100-200 para HLA-II las medidas
DISCUSIÓN
169
experimetnales para generar modelos predictivos fiables (285). Debido a la falta de
estos datos experimentales, diversos modelos de predicción definidos como pan-specific
utilizan los datos experimentales que están descritos para generar predicciones teóricas
sobre los alelos que no tienen datos experimentales. Estos modelos agrupan los alelos
en supertipos, y basándose en la secuencia de nt, extrapolan los resultados de los alelos
con datos empíricos a aquellos alelos que carecen de éstos. Una de las limitaciones de
estos algoritmos es la carencia de información de la interación p-MHC, sobre todo en
las moléculas HLA-II. La mayoría de modelos consideran que sólo existe un único
motivo de presentación, aunque cabe la posibilidad de que un mismo péptido pueda
tener diferentes motivos de unión a una misma molécula HLA-II. A parte de los aa que
generan el core de unión a las moléculas HLA-II, diferentes modelos de predicción
tienen en cuenta la posible interacción entre los aa que sobresalen del core y la molécula
HLA, Uno de estos modelos es el modelo utilizado en la presente tesis, netMHCIIpan.
Los modelos actuales de predicción pueden predecir neoantigenos que
provengan de inserciones o delecciones pequeñas, pero no pueden predecir
neoantígneos que vengan de grandes inserciones o delecciones, de aberraciones del
splicing, de genes de fusión, alteraciones epigeneticas o post-traslacionales o por
fosforilación o deglicosilación.
Otra de las limitaciones de todos estos modelos de predicción es que ninguno de
ellos contempla la posibilidad de variaciones en la estructura del propio péptido que
puedan modificar los puntos de anclaje a las moléculas HLA-II.
Los algoritmos de predicción tienen alta sensibilidad, sin embargo, la
especificiad es difícil de establecer. El uso simultaneo de múltiples algoritmos para
establecer una única puntuación (Index), que priorice los neoantígenos podría mejorar la
especificidad de los algoritmos.
También hay que tener en cuenta que algunos neoepitopos pueden ser
eliminados o tolerados debido a su similitud con su epitopo no mutado (271)
Como el RNAseq estudia todo el transcriptoma, es el único método que permite
la identificación de péptidos que surgen de procesos de edición de RNA como el
DISCUSIÓN
170
empalme alternativo, las fusiones de genes y la modificación postranscripcional(286).
Por tanto, las predicciones a partir de RNAseq reduciría el número de neopéptidos para
la predicción y permitiría predicciones más precisas y
En la actualidad, debido a las limitaciones descritas de estos modelos de
predicción existen grupos en contra de su aplicación (287) pero múltiples publicaciones
demuestran su valor predictivo., y los resultados de esta tesis también los avalan.
En concreto, nuestros estudios in silico nos ha permitido diseñar péptidos
responsables de diferentes respuestas en LLC, gripe, trasplante, melanoma y TNA que
se han podido confirmar mediante estudios tanto in vivo como in vitro.
En el estudio del mutanoma en pacientes con LLC, donde hemos estudiado
mediante la predicción de la afinidad de unión las uniones de todos los posibles
neopéptidos generados por las más de 6000 mutaciones somáticas determinadas en estos
pacientes, observamos que miles de mutaciones somáticas pasan a generar millones de
péptidos capaces de ser presentados por miles de moléculas HLA que están descritas. El
incremento del número de péptidos de debe a la generación de todas las posibilidades de
secuencia de los neopéptidos de longitudes compredidas entre 8 a 11 aa para los alelos
HLA-I y de 9 a 19 aa para los alelos HLA-II, es decir, el aa que genera la mutación
somática puede estar localizado en cualquiera de estas posiciones. De todas esas
combinaciones se seleccionaron los neopéptidos con afinidades de unión SB y WB.
Nuestros resultados demuestran que a pesar de que la LLC es una enfermedad con baja
carga mutacional, tiene un rico espectro de neopéptidos presentables por moléculas
HLA-I terapéuticamente relevantes con la posibilidad de generar neopéptidos con
afinidad de unión a moléculas HLA y que la terapia moduladora del sistema inmunitario
es posible.
Si nos centramos en nuestros estudios in silico en los pacientes con LLC, los
avances a nivel informático nos han permitido predecir las variantes alélicas de HLA
capaces de unirse a neoepítopos tumorales específicos (en promedio sólo 2-3 por tumor
DISCUSIÓN
171
y HLA-clase I específico) con afinidad alta (%rank<0.5) con opciones para conferir
función biológica y generar respuesta citotóxica en pacientes con CLL.
Es importante hacer análisis generales de presentación antigénica que generan el
espectro de mutaciones de las diferentes enfermedades, como en este caso en la LLC, ya
que, a pesar que la mayoría de mutaciones no son drívers, y son específicas de las
mutaciones concretas del paciente estudiado, estas mutaciones se van repitiendo entre
pacientes y estos estudios nos muestran la importancia de conocer la potencia de tienen
las moléculas de HLA en su capacidad de presentar los neopéptidios que generan todas
las mutaciones específicas de una enfermedad para poder llegar a conseguir baterias de
mutaciones que se puedan emplear como vacunas enfermedad-específicas.
Estos estudios también permiten caracterizar ciertos alelos que son relativamente
ineficientes en términos de afinidad de unión a neopéptidos de las diferentes
enfermedades de estudio, en este caso alelos HLA ineficientes a la hora de presentar
neopéptidos de la LLC.
La peor capacidad de presentación de estos alelos no viene asociada a la
homocigosis en estos pacientes, debido a que no existe diferencia en homocigosis de los
pacientes con LLC y los controles del estudio.
Por otro lado, a pesar de que son los tumores con mayor número de mutaciones
son los que pueden responder mejor a un tratamiento donde se module el sistema
inmunitario del paciente para que actúe contra el tumor, también son los que más
rápidamente generan resistencias a los mismos (271), por lo que la posibilidad de
utilizar inmunoterapia en pacientes con enfermedades con baja carga mutacional
también se ha considerado. En relación a estas situaciones, la utilización de
inmunoterapia en la LLC, enfermedad caracterizada por su baja carga mutacional, se ha
propuesto por la inmunogenicidad que revela los efectos del injerto contra leucemia tras
la reconstitución del trasplante alogénico de médula ósea, los casos de remisión
espontánea, como también las ratios favorables entre linfocitos efectores y células diana
en situaciones de enfermedad resiual medible (MRD).
DISCUSIÓN
172
En nuestros estudios de afinidad, se observó que solo 2 pacientes no tenían
capacidad de unir ningún neoantígeno con sus moléculas HLA. Se vió que estos 2
pacientes tenían sólo 1 mutación somática, el resto de los pacientes tienen moléculas
HLA con capacidad de presentar sus neopéptidos diferida de la predicción de las
afinidades de unión de estas moléculas mediante el algortimo bioinformático utilizados
en este estudio.
Si tenemos en cuenta los principios básicos de la inmunología, los LT
reactivos frente a diferentes neoepítopos serían capaces (al ser utilizados en un sistema
autólogo estricto de tratamiento en pacientes con cáncer) de generar una respuesta
inmunitaria antitumoral. En principio, esta respuesta no se vería bloqueada por
mecanismos de auto-tolerancia debido a que estos péptidos no han sufrido tolerancia
central. Por otro lado, ha sido demostrado que los antígenos juegan un papel relevante
en la generación de la respuesta frente a el cáncer y que existen epítopos restringidos a
las moléculas HLA del paciente que podrían desencadenar la respuesta en esos
pacientes. Los avances que se han llevado a cabo en esta dirección en pacientes con
melanoma determinan que muchos de estos neopìtopos son homólogos a antígenos
virales y bacterianos.
Por tanto, nuestro siguiente objetivo consistió en observar la respuesta que eran
capaces de generar los neoepítopos en los LT de los pacientes, ya que esta ampliamente
descrito la disfuncionalidad de los LT en pacientes con LLC.
Los ensayos experimentales realizados en estre trabajo, demuestran la capacidad
de generar respuesta frente a los neopéptidos sintetizados a partir de las secuencias
simuladas informáticamente con afinidades de unión a las moléculas HLA de los
pacientes por parte de los LT cuando éstos son expandidos. Por tanto, la posibilidad de
terapias empleando neopéptidos en pacientes con LLC puede ser posible.
Además, las inmunoterapias personalizadas con neoantígenos pueden ser
potenciadas junto a la combinación con diferentes agentes que modulen el sistema
inmunitario del paciente como los bloqueantes de moléculas co-señalizadoras (check
point inhibitor), adyuvantes, moduladores del microambientes para hacer que todos los
cáncer respondan a la inmunoterapia (271).
DISCUSIÓN
173
El hipotético antígeno tumoral que haría la respuesta inmunitaria más efectiva
debería estar expresado en la mayoría de los cánceres, incluir secuencias peptídicas que
se unan a las moléculas MHC, ser presentados por las células tumorales como péptidos
antigénicos, ser reconocidos por el repertorio de células T de manera restringida por el
MHC y permitir la expansión de los precursores de LT específicos, tanto LTc como
LTh.
Se están explorando diversos formatos para utilizar en las vacunas de
neopéptidos (274) como son péptidos sintéticos, mRNA, plásmidos de DNA, diversos
vectores o la carga ex vivo. Otra estrategia consiste en vacunas con péptidos alterados
con mayor afinidad del TcR frente a los neopéptidos que frente a los péptidos naturales.
De esta forma se rompe la inmunidad con una alta especificidad de uno o varios TcRs
(288).
El estudio con tetrámeros es una de las aporximación más sensibles y específicas
para el estudio de la especificidad de los LTh, pero una de las grandes limitaciones es
que se necesita tener tetrámeros con las molécuals HLA-II de todas las restricciones
HLA-II determinadas por el algoritmo de predicicón, situación difícil de conseguir, por
ello, en nuestros estudios hemos utilizado el aumento de expresión de CD154 para el
estudio de la especificidad de los LTh. Una de las limitaciones de esta aproximación es
que la activación de CD154 puede ser debida a activación inespecífica y no solo al
péptido, pero con los diferentes controles negativos resolvemos parcialmente esta
limitación.
Diversos estudios demuestran que el repertorio TCR no viene determinado por
compartir las moléculas HLA-I (289). A pesar de que el repertorio T en un individuo
está en constante influenciado por las respuestas y desafíos inmunológicos, está
afectado de forma negativa por las enfermedades y algunos estudios demuestran que
una baja diversidad en el repertorio TCR esta a menudo asociada con peores respuestas
clínicas(290).
DISCUSIÓN
174
Como la respuesta frente a los antígenos tumorales son generados por los LT
infiltrantes de tumor, demostramos la evolución del repertorio TCR tras una respuesta
completa tras el tratamiento con fármacos bloqueantes de moléculas co-señalizadoras
(anti-PD1), que alteran el propio sistema inmunitario para que sea éste el que genere la
respuesta frente al cancer. La evolución del repertorio TCR viene condicionado con la
carga mutacional del paciente, es decir, en pacientes con baja carga mutacional y
respuesta completa, la evolución del repertorio no se encuentra tan modificada como en
los pacientes con alta carga mutacional, donde existe expansión de ciertas clonas de
linfocitos que podrían relacionarse con las clonas que han generado el efecto
antitumoral.
Las frecuencias de las familias TCR Vβ también se ve alterada en estos pacientes
y se observa alterada, incluso, antes del tratamiento, por tanto, el estudio de las
frecuencias de las familias TCR Vβ podrían tener un valor predictivo a la hora de
seleccionar un tratamiento inmunoterápico concreto en los pacientes con cáncer.
Las frecuencias de las diferentes familias TCR Vβ también son de importancia
en las ACT con TILs expandidos, pues la respuesta viene asociada a los LT que sean
capaces de reconocer los Ag específicas de tumor.
Las terapias que utilizan el sistema inmunitario para ejercer el efecto también
ocasionan efectos adversos relacionados con la modulación del propio sistema
inmunitario. Uno de los efectos a nivel cutáneo que generan son vitíligo y/o albinismo,
ocasionado posiblemente con una respuesta inespecífica por similitud de secuencia entre
los neoantígenos frente a los que reacciona los LT en el tumor y los antígenos de la
melanina o de la vía que la produce.
Debido a los efectos adversos que genera la inmunoterapia, es importante
caracterizar los LT que se utilizan en estas terapias, con el fin de ser capaces de predecir
los efectos adversos. Esta importante asociación queda demostrada al observar una alta
DISCUSIÓN
175
frecuencia de una de estas familias en las lesiones de los efectos adversos que generan
estas
En 2 de los 3 pacientes con melanoma que se estudian en este trabajo tienen
efectos adversos relacionados con los melanocitos, por lo que el estudio en más
profundidad de esta relación podría contribuir a identificar nuevas dianas terapéutics
contra el melanoma.
Una de las posibles soluciones para evitar estos efectos adversos, sería la
selección previa a la administración sólo de las clonas reactivas a los neopéptidos que se
definan mediante modelos de simulación y predicción similares al que se ha definido en
este trabajo.
Los LTc efectores del infiltrado tumoral son un excelente modelo natural para el
estudio de las señales que se requieren en el tumor para que la ACT funcione, ya que los
aLTc presentes en el microambiente tumoral tienen defectos en su función lítica (291).
Los repertorios de LT de donantes sanos pueden generar respuesta y pueden ser
una fuente de linfocitos para lleva a cabo terapias personalizadas, independientemente
de la función inmune endógena (248). Los ensayos clínicos con combinación de
vacunas e inmune checkpoint inhibitor se están llevando a cabo.
Los linfocitos T desempeñan una función crucial en la respuesta inmunitaria
adaptativa en la inmunovigilancia del cáncer y también está ampliamente demostrada su
contribución contra las infecciones (292,293)
Con relación a la contribución de la respuesta inmunitaria adaptativa contra las
infecciones, una aproximación efectiva hacia una estrategia para la vacunación de la
gripe debe incluir una vacuna que genere LT de memoria contra múltiples proteínas del
core del virus además de anticuerpos. Para generar las vacunas más efectivas también se
han utilizados modelos de predicción de afinidad de unión a moléculas HLA.
DISCUSIÓN
176
Diversos estudios se han llevado a cabo a partir de lo péptidos con mayores
afinidades de unión con resultados poco concluyentes. Que la mayoría de estudios sean
a partir de sangre periférica puede que haga que los resultados no reflejen las
poblaciones que responden en el pulmón y en los ganglios linfáticos (144).
Estudios a partir de muestras longitudinales recogidas a partir de la infección o
la primera vacuna pueden ser esenciales para entender mejor el repertorio LTh, y poder
desarrollar nuevas y potentes cross-reactive vacunas universales (156).
En este sentido nuestro estudio muestra que el empleo de péptidos con
afinidades de unión a moléculas altamente representadas en la población como HLA-
DRB3, DRB4 y DRB4 puede ser relevante a la hora de diseñar una vacuna efectiva en
la mayoría de la población y con capacidad de generar memoria.
Por otro lado, las predicciones de afinidades de unión también pueden ayudar a
la selección de receptores en el trasplante renal. Debido a que podemos conocer la
presentación de los péptidos generados por las propias moléculas de HLA del donante
por las moléculas HLA del receptor, que correlacionan con la generación de
aloanticuerpos en el estudio retrospectivo realizado.
También se ha utilizado la predicción de afinidad de unión para determinar el péptido
que difiere entre HPA-1a y HPA-1b para el estudio de la especificidad de los LTh en la
TNA. Con estas prediciones podemos definir que en la TNA el péptido
inmunodominante corto podría ser suficiente para tolerabilizar a las madres sensibles,
para reducir la respuesta que generan con Ab frente a HPA-1a (294) de forma
específica.
DISCUSIÓN
177
Debido a la naturaleza cuantitativa de la selección tímica, una variación en la
expresión de alelos de clase II asociados a enfermedades podría resultar en un repertorio
T CD4+ distinto y con él, quizás la pérdida de tolerancia (lo que provocaría un exceso
de reactividad).
VI. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
181
1. Disponemos de un algoritmo informático propio que permite definir en pocas
horas, todas las posibilidades neopeptídicas a través de la predicción de
afinidades de unión a las moléculas HLA descritas. Los neopéptidos diseñados
con dicho algoritmo generan respuestas T in vitro. Por tanto, los neopéptidos
diseñados por predicción del “mutanoma” pueden servir para el estudio de la
magnitud de la respuesta y la evolución de la enfermedad.
2. Es posible determinar que parte del “mutanoma LLC” de los pacientes del
proyecto “CLL genome” es capaz de ser presentable con mayor afinidad de
unión en el contexto de sus moléculas HLA para plantear estrategias de
inmunoterapia antitumoral: se puede concluir de este estudio que la LLC tiene
un espectro rico de HLA- I terapéuticamente relevante, siendo dependiente de la
diversidad alélica HLA, con casos relativamente ineficientes en términos de
presentación de neoantígenos y otros alelos con un mayor potencial repertorio de
neoepítopos.
3. El estudio de la evolución del repertorio del TcR permite determinar la magnitud
de la respuesta a check-point inhibitors con la detección de clonas responsables
de la respuesta. El estudio de la respuesta en el melanoma infantil sólo permite
ver respuesta específica in vitro frente a neopéptidos con carga mutacional alta,
no es posible definirla ante una situación con baja carga mutacional.
4. Las diferencias de alo-reactividad anti-HLA, definida por los MFI de los
diferentes alelos parecen explicarse por la especificidad asociada a regiones
estructuralmente definidas (epítopos HLA):
a. Los péptidos que generan las moléculas HLA tienen diferente capacidad de
unión al resto de moléculas HLA. La caracterización de los epítopos de las
moléculas HLA podría agrupar las reactividades de estos alelos de forma
más concreta.
b. La aloreactividad de los loci accesorios indica un papel diferencial de estas
moléculas complementarias.
CONCLUSIONES
182
5. La vacunación repetida con un determinado antígeno de la gripe hace que
aumenten los linfocitos específicos frente a esos antígenos, siendo posible
definir los péptidos implicados
6. Los diferentes alelos de la molécula HLA-DRB han evolucionado en la
presentación antigénica que se ve incrementada por la presencia de CNV en
estos alelos que pueden definir:
a. Para HLA-DRB3, los LT generadores de la respuesta frente a HPA-1a
definen con un perfil Th2.
b. El estudio de la respuesta específica frente a péptidos de HPA-1a pre y post
parto determinan la magnitud de la respuesta.
VII. BIBLIOGRAFÍA
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