EVALUACIÓN DE CUATRO METODOLOGÍAS PARA LA ESTANDARIZACIÓN DE UN BIOENSAYO CON FORMULACIONES COMERCIALES DE Bacillus thuringiensis

PARA EL CONTROL DEL COGOLLERO DEL TOMATE Tuta absoluta Meyrick (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE)

Ramírez Natalia, Ramírez Lorena¹, Fuentes Luz Stella , Jiménez Jaime , Hernández Javier³² ²¹Estudiantes de Microbiología Industrial, PUJ, ²Investigadores, Centro de Investigaciones Agroindustriales, UJTL ³ Docente-Investigador, UJTL.

*Autor para correspondencia: javier.hernandez@utadeo.edu.co

Manejo Integrado de Plagas en Horticultura, CIAA, y Genética, Biología Molecular & Bioinformática, Facultad de Ciencias, Carreras de Biología Marina & Ambiental, Universidad Jorge Tadeo Lozano, Cra 4 No 22-61, Bogotá, D.C. Colombia

El tomate, Lycopersicon esculentum Mill, es la hortaliza más importante en Colombia y en el mundo. Constituye el 30% de la producción hortícola, con aproximadamente 4.0 millones de hectáreas sembradas y 107.972.098 toneladas de frutos cosechados en 2002 (FAO, 2003). En Colombia se cultiva variedades tipo “chonto” y “milano” correspondiendo al 80 y 20% de la producción nacional respectivamente (Varela, 1999). La polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick) es considerada una de las principales plagas endémicas de los países sudamericanos, ocasionando daños que se estiman del orden del 60 al 100% en aquellos cultivos sin protección contra esta plaga (Larraín, 1986; Giustolin et al., 2001). El empleo de diversas combinaciones de insecticidas, y en dosis cada vez más crecientes, podría estar produciendo la aparición de insectos resistentes y adicionalmente la contaminación del producto y del ambiente. Existen pruebas acerca del desarrollo de resistencia a insecticidas clorados y fosforados, y piretroides (Salazar y Araya, 1997). Bacillus thuringiensis (Bt) una bacteria entomopatógena, aeróbica, gram-positiva lidera el mercado mundial de bioplagicidas desde hace mas de 50 años. El objetivo del presente estudio fue estandarizar un bioensayo y evaluar la eficacia de Bt sobre instares de 2do instar de Tuta absoluta utilizando cuatro metodologías y tres formulaciones comerciales (Dipel®, Turilav® y Xentari®).

Tratamiento Día Letra Promedio de

supervivencia

T0, control 2 a 3

T2 2 ab 1.333.333

T3 2 ab 0.6666667

T1, Dipel 2 b 0

T0 4 a 3

T2 4 b 0.6666667

T3 4 b 0.3333333

T1 4 b 0

T0 8 a 2

T2 8 b 0.3333333

T1 8 b 0

T3 8 b 0

Giustolin, T., J. Vendramin, S. Alves, A. Viera, and R. Pereira. 2001. Susceptibility of Tuta absoluta (Meyrick) (Lep., Gelechiidae) reared on two species of Lycopersicon to Bacillus thuringiensis var. kurstarki. J. Appl. Entomol. 125:551556.

Larraín, P. 1986. Plagas del tomate. Investigación y Progreso Agropecuario Nº 39 p. 30-35.

Salazar, E., y J. Araya. 1997. Detección de resistencia a insecticidas en la polilla del tomate. Simiente 67:8-22.

Varela, R., Huertas, C. Varón, F. Estrada, J. F. Valencia, D. Gómez, C. E. Vargas, H.C. 1999. Observaciones sobre la biología y enemigos naturales de la polilla del tomate, Gnorimoschema Absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae). Idesia 1: 75-110.

Barrientos ZR, Apablaza HJ, Norero SA & Estay PP (1998) [Threshold temperature and thermal constant for development of the South American tomato moth, Tuta absoluta (Lepidoptera, Gelechiidae).] Ciencia e Investigacion Agraria 25 , 133–137 (in Spanish).

Figura 1. Larvas de 2do instar de Tuta absoluta

Figura 2. Jaulas de cría del insecto plaga Tuta absoluta. Se presentan plantas de tomate mantenidas en condiciones de invernadero

infestadas con adultos de la polilla del tomate.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Inmersión de las hojas. Los productos comerciales, Dipel, Turilav y Xentari se prepararon disolviendo 2,5 g de producto en 500 ml de agua. Las hojas de tomate se sumergieron en estas diluciones y se dejaron secar a temperatura ambiente. Luego, se colocaron en cajas de Petri (6 cm de diámetro) sobre papel adsorbente previamente humedecido y después se introdujeron 3 larvas de 2° instar con un pincel de pelo de marta. Se hicieron 10 repeticiones del experimento. Se utilizó un grupo control sin tratamiento. Cada uno de los tratamientos junto con el testigo absoluto se mantuvo dentro de un cuarto de cría a temperatura controlada (21 ± 2°C), humedad relativa (70±10%) y fotoperiodo 12 h L:O. La lectura del bioensayo se realizó diariamente contando el número de larvas vivas y muertas en cada uno de los tratamientos evaluados.

Cría del insecto plaga Tuta absoluta. La cría de Tuta absoluta se realizó en jaulas de 80 cm de largo por 60 cm de ancho y 60 cm de profundidad, utilizando velo suizo. En la primera jaula se colocaron tres plantas de tomate con aproximadamente 60 adultos, y de esta forma, se aumentó la producción de huevos del insecto (Figura 2). Al siguiente día los huevos puestos por las hembras adultas se pasaron a otra jaula y a partir de ese momento se contaron 13 días para encontrar huevos maduros listos para eclosionar. Larvas de 2do instar se utilizaran en los respectivos bioensayos (Figura 1). Se realizaron 4 experiementos para la estandarización del bioensayo, estos fueron:

2. Aspersión por aerógrafo en cada hoja. Se utilizó un aerógrafo para asperjar los productos comerciales sobre las hojas. Se sirvió 1 ml del producto homogenizado a una distancia de 15 cm sobre el haz y el envés de la hoja procurando cubrir toda la superficie. Luego se dejaron secar en cajas de Petri, y después, se colocaron 3 larvas de 2° instar igual al

3. Frascos con foliolos de plantas de tomate. Foliolos de plantas de tomate (hojas con un tallo pequeño) se colocaron a manera de florero en el interior de otro frasco plástico pequeño, el cual fue cubierto con un dedo de guante quirúrgico para evitar que las larvas cayeran al agua. Los productos biológicos a evaluar se sirvieron de la misma forma que en el experimento 1. Luego, los frascos se colocaron dentro de otro recipiente plástico y se sellaron con tapa.

4. Medio cultivo con extracto de hojas de tomate. Para la realización de la dieta artificial se evaluaron diferentes concentraciones de agar, extracto de hoja y conservante hasta llegar a la consistencia ideal para realizar el bioensayo. Prueba de eficacia. Después de realizados los bioensayos con los productos comerciales, se efectuó la prueba de efectividad para comprobar si la muerte de las larvas fue producida por acción de Bt o por otra causa. Análisis. La cuantificación del porcentaje de eficacia se realizó mediante la fórmula de Henderson y Tilton, adicionalmente, se hizo un Análisis de Varianza para detectar diferencias significativas y una prueba de Tukey para determinar diferencias.

Tuta absoluta posee un alto potencial reproductivo, produciendo entre 10-12 generaciones por año. El ciclo biológico se completa en 29-38 días dependiendo de las condiciones ambientales. El desarrollo se da hasta en 76, 3 días a 14°C, 39,8 a 19,7°C y 23,8 a 27,1°C (Barrientos et al., 1998). Las hembras ponen sus huevos en partes aéreas sobre las plantas de tomate, pueden poner cerca de 260 huevos durante su ciclo de vida (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2005). Observaciones en campo coinciden con estas descripciones, sin embargo, las jaulas mantenidas en el CIAA están sometidas a temperaturas variables, altas durante el día y muy bajas durante la noche, condición que prolonga el desarrollo de las larvas, llegando a estar entre 50-60 días. Las Figuras 1 y 2 presentan el montaje de cría y larvas de Tuta absoluta.

Los tres productos comerciales basados en Bt mostraron eficacia en el control de larvas de Tuta absoluta en todos los experimentos realizados. La evaluación del método 1 produjo con Dipel el 100% de mortalidad de las larvas, Turilav el 83% y Xentary 100%. El análisis estadístico mostró al 8 día de evaluación diferencias altamente significativas entre los tratamientos evaluados y el testigo (P>F=0.00007.456), lo cual se corroboró con la prueba de Tukey (Tabla 1, Figura 3)). La evaluación del método 2 produjo con Dipel el 100% de mortalidad de las larvas, Turilav el 85% y Xentary el 69%. De igual manera, al 8 día se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados y el testigo, (P>F=1.073e-05), que se corroboró con la prueba de Tukey (Figura 3). El método 3 produjo con Dipel el 100% de mortalidad de las larvas, con Turilav 0% y con Xentary el 33%, pero también se presento 33% de mortalidad en el grupo control, lo que invalida la prueba (Figura 4). El método 4 presentó una mortalidad del 100% sobre el grupo control e igualmente sobre los tres productos evaluados, presentando adicionalmente contaminación, resultado que invalida la prueba.

La metodología óptima para realizar los bioensayos con Tuta absoluta fue el método 1, en el que se sumergen las hojas en el producto, con un 96% de supervivencia del testigo y 100% de eficacia con Dipel. La mortalidad del testigo fue inferior al 20% en las metodologías 1 y 2, por lo cual se validan estas pruebas (Figura 4). En los métodos 2 y 3 se presentó mortalidad superior al 20% en el testigo absoluto, por lo que se invalidad las evaluaciones. La prueba de eficacia evidenció crecimiento de cepas de Bt conf irmado por microscopia óptica. El producto comercial Dipel (Bacillus thuringiensis var.kurstaki) con una concentración de 2.5 g/L produjo un 100% de eficacia a los 8 días en las tres metodologías evaluadas y representa un producto potencial para el control de larvas de Tuta absoluta.

Figura 3. Porcentaje de eficacia de los productos Dipel, Turilav y Xentari sobre la mortalidad de larvas de 2do instar de Tuta absoluta. De arriba hacia abajo: metodo 1 (anaranjado), método 2 (azul) y método 3 (verde). No se presenta el método 4 por

invalidarse.

Tabla 1. Prueba de comparación de Tukey para el métodos 1 a los 2, 4 y 8 días de evaluación (letras

distintas significan diferencias significativas) (Nivel de Significancia á=0.05)

Figura 4. Larva de 2do instar de Tuta absoluta después de la ingestión de cristales y esporas del bioinsecticida DipelR Se observa tejidos necrosados y color rojizo produciendo la muerte del insecto por inanición y septicemia.

BILIOFRAFIA

Los componentes edáficos mostraron que el suelo estaba compuesto en su mayoría por sedimento arenoso y grava. La materia orgánica tuvo un promedio de 2.13, valor medio para clima cálido y el promedio de nitrógeno total fue de 0.11. La muestras de tierra aledañas a R. mangle obtuvieron los mayores valores de porcentaje de humedad, carbono, materia orgánica y nitrógeno total (Tabla 2). Los componentes edáficos mostraron valores mayores lejos de la raíz que cerca de éstas

El ecositema de manglar presenta una opción interesante para estudios de Bt, ya que se caracteriza por una gran biodiversidad microbiana de la cual es parte Bacillus thuringiensis.

BIODIVERSIDAD DE GENES INSECTICIDAS cry1, cry2, cry3 y cry4 EN CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis AISLADAS DEL ECOSISTEMA DE MANGLAR DE

LA CIÉNAGA GRANDE DE SANTA MARTA

Echeverri Ángela , Bolívar Blanca , y Hernández Javier¹ ¹ ²1.Estudiantes Tesistas, Biología Marina, UJTL, 2. Docente-Investigador, UJTL.

*Autor para correspondencia: javier.hernandez@utadeo.edu.co

Genética, Biología Molecular & Bioinformática

Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Carreras de Biología Marina & Ambiental, Universidad Jorge Tadeo Lozano, Cra. 4 No 22-61, Bogotá, D.C. Colombia

INTRODUCCIÓNEl uso indiscriminado de insecticidas químicos utilizados para el control de insectos plaga, ha provocado serias implicaciones en la salud humana y problemas medioambientales (ICMR, 2001), por lo cual, se han venido estudiando y desarrollando métodos alternativos para el control de plagas, entre los que se encuentran bioinsecticidas y parasitoides (Rosas y De Luna santillana, 2006). Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria entomopatógena que lidera el mercado mundial de bioplaguicidas. Se caracteriza por poseer proteínas Cry codificadas por genes localizados en plasmídos altamente diversos, identificándose más de 424 genes cry en 55 familias, y 121 subgrupos de proteínas Cry (Crickmore, 2008). Este es el primer reporte de aislamiento de cepas de Bt en el ecosistema de Manglar en América. El objetivo del presente estudio fue aislar y caracterizar a nivel microscópico y molecular cepas nativas de Bacillus thuringiensis identificando genes cry1, cry2, cry3, y cry4 activos contra insectos lepidópteros, coleópteros y dípteros, procedentes de muestras de suelo del sector “Boca de la Barra” en la Ciénaga Grande de Santa Marta (CGSM) Caribe colombiano. Este estudio se realizó como paso previo al ensayo biológico permitiendo clasificar y seleccionar las cepas con mayor potencial insecticida.

METODOLOGÍA

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se recolectaron 24 muestras de suelo de 4 tipos de árbol de mangle (Rhizophora mangle, Avicennia germinans, Laguncularia racemosa, y Conocarpus erectus) a 0 y a 1.5 m de distancia de las raíces (Figura 1). De éstas muestras se aislaron bacilos esporulados y se caracterizaron en microscopio óptico de luz (100X) identificando forma y número de esporas y cristales. Un análisis más detallado se realizó en microscopio de contraste de fases (400X), revelándose mejor las diferentes formas de cristales. Posteriormente, a los aislamientos positivos para la presencia de cristales se les extrajo ADN total e inmediatamente se sometieron a una caracterización molecular por PCR múltiplex, utilizando 2 mezclas con 4 oligonucleótidos generales cada una, previamente descritas (Ben-Dov et al., 1997), que identifican genes cry1, cry2, cry3, y cry4 activos contra insectos lepidópteros, coleópteros y dípteros. Las 24 muestras de suelo se evaluaron a nivel de componentes edáficos (granulometría, humedad, materia orgánica y nitrógeno total).

De las 24 muestras de suelo evaluadas se obtuvo un total de 115 aislamientos de bacilos esporulados, los cuales presentaron una distribución diferente en cada uno de los arboles evaluados, como se muestra en la Figura 2. En A. germinans se aisló el mayor número de bacilos (40), seguido por L. racemosa (30), C. erectus (24) y R. mangle (21). Se halló un mayor número de bacilos esporulados lejos de las raíces (55%) que cerca de éstas (45%) .

Figura1. Área de muestreo de suelos en este estudio. En verde (E1) Boca de la Barra en la CGSM (Fuente: Torres et al., 2004).

Figura 2. Porcentaje de bacilos esporulados aislados de muestras de suelo de la CGSM, según el tipo de árbol de mangle estudiado y la distancia a la raíz.

Figura 4. Morfologías de cristal observadas en los bacilos esporulados aislados en el ecosistema de Manglar (Microscopio de contraste de fases, 400X).

Figura 5. Productos de amplificación por M-PCR, de genes generales de las familias cry1, cry2, cry3 y cry4 utilizando mezclas de 4 oligonucleótidos generales (Ben-Dov et al., 1997). Carril 1: Mezcla 1, fragmentos de los genes cry1 y cry4, ADN var. kurstaki HD1 y var. israeliensis; carril 2: Mezcla 2, fragmentos de los genes cry2 y cry3, ADN var. kurstaki HD1 y var. san diego; carril 3: control negativo; carril 4: MW Hyperladder II, (Bioline). Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (GelDoc-ITTM Imaging System).

Figura 3. Número de cristales por campo óptico observados en los bacilos esporulados aislados de los 4 tipos de arboles en el ecosistema de Manglar.

Figura 6. Porcentaje de los de genes cry amplificados en las cepas de Bacillus thuringiensis aisladas de la CGSM.

El número de cristales por campo óptico fue variable en cada tipo de árbol, predominando en la mayoría de los casos el rango asignado por “+” (entre 1 y 10 cristales por campo óptico), seguido por “++” (10-20) y por último “+++” (más de 20 cristales). Rhizophora mangle presentó el mayor número de cepas con el rango de “+++” (Figura 3)

Se obtuvo ADN total de buena calidad y concentración, entre 15-50 ng/µl para las 99 cepas seleccionadas (Figura 5).

Los resultados muestran una alta biodiversidad de genes cry en las 99 cepas aisladas, que se evidencia por la presencia de los 4 tipos de genes estudiados: cry2 (40.4%), cry3 (34,3 %), cry1 (27.3%) y cry4 (27.3%) (Tabla 1). El mayor número de genes cry1 se halló en Avicennia germinans, el gen cry2 en L. racemosa y los genes cry 3 y cry 4 en R. mangle.

El 67.7% de los bacilos aislados tenían por lo menos un gen cry, mientras que sólo el 32.3% no reaccionó con los primers cry evaluados, estas cepas podrían contener genes nuevos con actividades diferentes a las descritas. Se halló un 38.4% de bacilos aislados que contenían entre dos y cuatro genes cry (Figura 6). Se encontró un mayor número de bacilos aislados con genes cry lejos de las raíces que cerca de éstas .

Tabla 1. Biodiversidad y distribución de genes cry1, 2, 3, 4 en bacilos esporulados aislados del ecosistema de Manglar de la CGSM.

Tabla 2. Valores de los componente edaficos estudiados en las muestars de tierra obtenidad del ecositema de manglar de la CGSM.

BIBLIOGRAFÍA· BEN-DOV, E., ZARITSKY, A., DAHAN,E., BARAK, Z., SINAI, R., ROBERT MANASHEROB, R., KHAMRAEV, A., ROITSKAYA, E., DUBITSKY, A., BEREZINA, N., & MARGALITH1, Y. 1997. Extended

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· TORRES, L., ACERO, A., & SANTOS, A. 2004. Ecología trófica de la Carrura Bairdiella ronchus (Pisces: Sciaenidae) en la Ciénaga Grande de Santa Marta, Caribe colombiano. Rev. Acad. Colomb.

Cienc, Vol. 28 No.109, pp. 529-534

1 2 3 MW pb

300

200

400

500

600

700

277 (Cry1)

439 (Cry4)

589 (Cry3)

689 (Cry2)

Se obtuvo cristales de forma y tamaños variables, entre las que predominaron el patrón circular (67,7%), seguido por bipiramidal (23,1%), cuadrangular (7,25%) y amorfo (1,19%) (Figura 4).