protocolo para la extracción de proteínas aqps
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Protocolo para la extracción de proteínas AQPs
Las proteínas totales fueron extraídas pulverizando 200 mg de frondes (sin pecíolo) en un
mortero previamente enfriado y mantenido en hielo. Se agregó N2 líquido a la molienda
hasta obtener un polvo.
Se recupera el tejido en un tubo eppendorf y se congela en N2 líquido.
El macerado es disuelto en 1ml de TCA/Acetona y centrifugado 16000xg por 3 min. a 4ºC.
Se descartó el sobrenadante y se repitió el procedimiento 3 veces.
El pellet fue disuelto en 1 ml de solución metanol/Acetato de amonio al 10% y
centrifugado 16000xg por 3 min. a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y se repitió el
procedimiento 3 veces.
El pellet fue disuelto en 1ml de solución Acetona al 80% y centrifugado 16000xg por 3 min.
a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y se repitió el procedimiento 3 veces.
Luego el pellet es secado a temperatura ambiente por 30 min, con el tubo eppendorf
abierto.
Para extraer las proteínas del pellet de macerado se disuelve en 1ml de solución SDS:Fenol
(1:1) en el cual se dejó por 5 min. a temperatura ambiente. Luego es centrifugado 16000xg
por 3 min. a 4ºC comprobando que el sobrenadante se haya separado en dos fases.
Para la precipitación de proteínas, se extrae la fase superior del sobrenadante y se
disuelve en solución de metanol/acetato de amonio al 10%. Esta solución se almacenó por
48 horas a -20°C. Luego es centrifugado 16000xg por 3 min. a 4ºC, descartándose el
sobrenadante.
El pellet es lavado dos veces en metanol al 100% y en acetona al 80%, donde después de
centrifugar a 16000xg por 3 min. a 4ºC se recupera el pellet.
El pellet fue resuspendido dos veces en buffer fosfato con Twen 80 e inhibidor de
proteasas.