Protenas oligomricas y sus aplicacionesWO 2010122181 A1AbstractLas protenas oligomricas comprenden una pluralidad de protenas de fusin y un marcador, comprendiendo cada protena de fusin un polipptido que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipptido que comprende un dominio de oligomerizacin. Dichas protenas oligomricas pueden utilizarse para detectar, visualizar y localizar dianas de inters.Claims(OCR text may contain errors)REIVINDICACIONES1. Una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador (M), en la que cada protena de fusin comprende:(b) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.2. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho marcador (M) es un fluorforo o un radionucleido.3. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho polipptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce una diana, o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce una diana, en donde dicha diana es un eptopo o determinante antignico de un antgeno.4. Pro tena oligomrica segn la reivindicacin 3, en la que dicho antgeno es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.5. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho polipptido (A) comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento Fab, F(ab')2 o Fab', un fragmento Fv de cadena nica (scFv), un diabody o un anticuerpo monodominio (VHH).6. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1 , en la que dicho dominio de oligomerizacin presente en dicho polipptido (B) comprende el dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV de mamfero, opcionalmente desprovisto total o parcialmente del dominio de endostatina (ES). 7. Pro tena oligomrica segn la reivindicacin 1, constituida por 2 ms protenas de fusin, iguales o diferentes.8. Un procedimiento para la obtencin de una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende poner en contacto una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, en la que cada protena de fusin comprende: i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y ii) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, con un marcador (M) bajo condiciones que permiten la unin de dicho marcador (M) a la protena oligomrica.9. Empleo de una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana.10. Empleo segn la reivindicacin 9, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.11. Un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana que comprende el empleo de una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.12. Mtodo segn la reivindicacin 11, en el que dicho mtodo se basa en una tcnica de imagen.13. Mtodo segn la reivindicacin 11, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.14. Una composicin que comprende una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con, al menos, un medio apropiado. 15. Una composicin farmacutica que comprende una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con, al menos, un vehculo farmacuticamente aceptable.16. Un kit que comprende una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.17. Empleo de un kit segn la reivindicacin 16, para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana.18. Empleo segn la reivindicacin 17, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica. Description(OCR text may contain errors)PROTENAS OLIGOMERICAS Y SUS APLICACIONESCAMPO DE LA INVENCINLa invencin se relaciona con una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador, en la que cada protena de fusin comprende un polipptido que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipptido que comprende un dominio de oligomerizacin. Dichas protenas oligomricas pueden ser utilizadas para detectar, visualizar y localizar dianas de inters.ANTECEDENTES DE LA INVENCINLos procedimientos de imagen en medicina se refieren a tcnicas y procesos no invasivos usados para crear imgenes del aspecto interno del cuerpo de un animal, para propsitos clnicos, por ejemplo, procedimientos mdicos para diagnosticar una enfermedad o para localizar dicha enfermedad. En un sentido amplio, incluye tcnicas tales como ciencias radiolgicas, endoscopia, termografa mdica y microscopa. Tradicionalmente, los estudios de laboratorio para evaluar la actividad de las terapias anticancergenas en ratones han requerido el sacrificio de mltiples animales en cada etapa para proporcionar datos significativos. Las tcnicas de imagen, sin embargo, permiten una evaluacin precisa del crecimiento tumoral y a tiempo real en animales de laboratorio, lo que disminuye de forma considerable el nmero de sujetos requeridos.La tomografa por emisin de positrones, TEP o PET (por las siglas en ingls de Positrn Emission Tomography) es una tcnica propia de una especialidad mdica llamada medicina nuclear y de la radiologa, al combinar imgenes de TAC (ejemplos de imgenes 3D). Se trata de una tcnica no invasiva de diagnstico e investigacin por imagen capaz de medir la actividad metablica de los diferentes tejidos del cuerpo humano, especialmente del sistema nervioso central. Al igual que el resto de tcnicas diagnsticas en Medicina Nuclear, la TEP se basa en detectar y analizar la distribucin que adopta en el interior del cuerpo un radioistopo administrado a travs de una inyeccin. La TEP permite, por ejemplo, localizar los focos de crecimiento celular anormal en todo el organismo, en un solo estudio e independientemente de la localizacin anatmica donde se presente la neoplasia (primaria o metastsica), ya que Ia TEP no evala la morfologa de los tejidos, sino su metabolismo. Por tanto, se ha implantado con mucha fuerza como tcnica diagnstica en oncologa, adems de otras reas, como son la cardiologa, la neurologa y la psicobiologa, dada la posibilidad de cuantificar el metabolismo tanto cardiaco como en el sistema nervioso central. La tcnica de fluorescencia es una tcnica de imagen que permite estudiar las propiedades de sustancias orgnicas o inorgnicas utilizando el fenmeno de fluorescencia. En la mayora de los casos, se marca especficamente un componente de inters en la muestra, con una molcula fluorescente llamada fluorforo. La muestra se ilumina con luz de una determinada/s longitud/es de onda, que es absorbida por los fluor foros, originando una emisin de luz a longitudes de onda mayores (o a diferente color que la luz absorbida). La cantidad y la longitud de onda de la energa emitida dependen del fluorforo y del entorno qumico del fluorforo. Entre los fluor foros ms comnmente utilizados se encuentran la fluorescena isotiocianato (FITC), los derivados de la rodamina (TRITC), comarina y cianina, los fluorforos "Alexa Fluor" y "DyLight Fluor", la familia de la cianina (e.g., Cy3, Cy5 y Cy 7).La tcnica de imagen por fluorescencia in vivo es igual que la microscopa de fluorescencia, difiere nicamente en que trabaja a nivel macroscpico. Los objetos para imagen por fluorescencia son el cuerpo completo de (pequeos) animales. Molculas que absorben en la regin del infrarrojo cercano (NIR), 700-1.000 nm, pueden ser utilizadas para visualizar e investigar dianas moleculares in vivo, ya que la mayora de los tejidos generan poca fluorescencia NIR. Los fluorforos orgnicos NIR ms comunes son las polimetinas (e.g., pentametina y heptametina). Las sondas utilizadas para imagen por fluorescencia in vivo pueden ser dirigidas o no dirigidas. Las dirigidas tienen la ventaja de que se pueden dirigir especficamente a un tejido diana. De esta manera, las sondas se unen a sus dianas, mientras que las no unidas se eliminan de la circulacin. Esta aproximacin es muy til para realizar imgenes de tumores in vivo, ya que en cncer, normalmente se sobreexpresan ciertos receptores de superficie. Un ejemplo de sondas dirigidas pueden ser molculas de anticuerpos conjugadas con cianinas o "quantum dots". Tambin se pueden utilizar molculas ms pequeas dirigidas, en lugar de anticuerpos, por ejemplo cido flico conjugado con un fluorocromo NIR que proporciona imgenes de macrfagos activados implicados en enfermedades inflamatorias de articulaciones. Dichas molculas iran dirigidas al receptor de cido flico. Dentro del grupo de las sondas dirigidas, los anticuerpos presentan la ventaja de su rpido aislamiento y que tienen una alta afinidad por virtualmente, cualquier antgeno.Por otra parte, diferentes ensayos sistemticos in vivo han proporcionado una confirmacin de que el tamao es un parmetro importante en frmaco cintica y biodistribucin de molculas de anticuerpos monoclonales. As, parece ser que molculas grandes de IgG (150 kDa) que reconocen antgenos de superficie expresados por las clulas tumorales penetran en los tumores slidos muy lentamente, con una distribucin no uniforme, y tienen una vida media srica muy larga [Holliger et al. Nature Biotec. 2005; 23: 1126-36]. Por el contrario, pequeos fragmentos de anticuerpo de cadena nica (scFv) monovalentes, con un tamao de 25-30 kDa son mucho ms eficientes en la penetracin al tumor, pero son eliminados demasiado rpido y poseen adems una pobre retencin en el tumor, debido a sus propiedades de unin monovalente. Un anticuerpo ideal para localizar tumores debera ser una molcula multivalente de tamao intermedio, que proporcione una penetracin ms rpida en el tumor, una mayor retencin en el tejido diana y una eliminacin sangunea ms rpida. Estudios recientes indican que anticuerpos bivalentes, tales como los "diabodies" (60 kDa), pueden ser ms apropiados para las tcnicas de imagen [Williams et al., 2001; Cncer Biother. Radiopharm.; 16:25-35]. Los "diabodies" son molculas dimricas no unidas covalentemente, formadas espontneamente en formato scFv con espaciadores cortos que conectan la regin variable de los genes. Debido a su pequeo tamao, se eliminan rpidamente a travs de los rones, limitando, por tanto, su exposicin a la mdula sea, que es frecuentemente el rgano dosis-limitante con los anticuerpos intactos radiomarcados. Molculas ms grandes bivalentes, tales como los "minibodies" (dmeros scFv-CH3) y ScFv2-Fc se pueden acumular en tumores y estos ltimos pueden disearse con un espectro amplio de vidas medias en suero, modulando la interaccin con el receptor FcRn. Los "minibodies" pueden ser ideales para localizar tumores, ya que penetran mejor y tienen una eliminacin rpida con lo que consiguen mejores proporciones tumor-sangre que las inmunoglobulinas intactas (150 kDa) o los fragmentos Fab2 (110 kDa). Sin embargo, a pesar de los buenos resultados obtenidos con estos formatos en varios modelos [Williams et al, 2001; Cncer Biother. Radiopharm.; 16:25-35 y Adams et al, 1998; Br. J. Cncer 77:1405-12], an existen algunas limitaciones que necesitan ser solucionadas con el fin de obtener las mayores ventajas de la capacidad de localizacin de estos anticuerpos recombinantes. Una de las limitaciones es su limitada flexibilidad, y, otra, la necesidad de que el segundo antgeno est orientado de manera precisa en un rea estrictamente definida una vez que el anticuerpo se una al primer antgeno. De esta manera, los antgenos unidos deberan encontrarse casi opuestos al "diabody", y en el caso del "minibody", en una pequea rea circular, que, en algunos casos impide la unin del segundo antgeno. Esto implica que parte de la afinidad observada depende principalmente de la unin y de la capacidad de volverse a unir ("rebinding"), y no de la unin simultnea a diferentes molculas del antgeno.Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar reactivos para diagnstico por imagen, basados en anticuerpos, que permitan la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana de inters, tal como un antgeno asociado con una alteracin patolgica, que superen la totalidad o parte de los inconvenientes previamente mencionados.COMPENDIO DE LA INVENCINLos inventores han desarrollado un nuevo formato de anticuerpo, en forma de protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, comprendiendo cada protena de fusin un dominio de unin de un anticuerpo o de un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, y un dominio de oligomerizacin, marcada posteriormente con un marcador adecuado para su aplicacin en tcnicas de diagnstico por imagen. Dichas protenas oligomricas pueden ser utilizadas para detectar, visualizar o localizar una diana de inters, tal como un antgeno asociado con una alteracin patolgica.Efectivamente, tal y como se ilustra en el Ej emplo 1 , dichas protenas oligomricas son agentes efectivos para la localizacin de depsitos tumorales in vivo. En una realizacin particular, los inventores han generado varias protenas trimricas, en ocasiones identificadas como "trimerbodies", una especfica frente al hapteno NIP, otra frente al antgeno carcinoembrionario (CEA) humano, y otra que reconoce un eptopo de la laminina asociado a angiognesis, y las han caracterizado tanto in vitro como in vivo. Se ha estudiado en detalle su estabilidad, su especificidad y afinidad y sus propiedades de localizacin tumoral, observndose que todas ellas eran multivalentes y posean una excelente caracterstica de unin al antgeno, lo que les proporciona una elevada afinidad funcional (avidez). Asimismo, los trimerbodies anti-CEA conjugados qumicamente con un marcador fluorescente mostraron una eficiente localizacin del tumor en un modelo experimental de carcinoma colorrectal humano en ratones y los trimerbodies anti- laminina mostraron una localizacin excelente en varios tipos de cncer humano, incluyendo fibrosarcomas y carcinomas. Estos resultados demuestran el potencial de este nuevo formato de anticuerpo para aplicaciones teraputicas y diagnsticas. Por tanto, en un aspecto, la invencin se relaciona con una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador (M), en la que cada protena de fusin comprende:(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y (a) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.En otro aspecto, la invencin se relaciona con un procedimiento para la obtencin de dicha protena oligomrica.En otro aspecto, la invencin se relaciona con el empleo de dicha protena oligomrica, en un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana. Un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana que comprende el empleo de dicha protena oligomrica constituye un aspecto adicional de esta invencin.En otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin que comprende dicha protena oligomrica y un medio apropiado.En otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin farmacutica que comprende dicha protena oligomrica y un vehculo farmacuticamente aceptable.En otro aspecto, la invencin se relaciona con un kit que comprende dicha protena oligomrica. El empleo de dicho kit para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana constituye un aspecto adicional de esta invencin. BREVE DESCRIPCIN DE LAS FIGURASLa Figura 1 describe la caracterizacin molecular de los trimerbodies purificados. (A) Perfil de elucin del experimento de filtracin en gel de las construcciones L36 [L36 trimerbody (lneas ms oscura) y L36 scFv (lnea ms clara)]. Los volmenes de exclusin (V0) y total (VT) estn indicados. Los volmenes de elucin de marcadores de peso molecular seleccionados se indican con flechas, as como sus correspondientes pesos moleculares. Para que quede de manera clara, la absorbancia de ambos cromatogramas se ha escalado y movido de posicin en la figura. (B) La funcionalidad de los trimerbodies purificados se demostr por ELISA en placas tapizadas con albmina srica bovina (BSA), laminina-1 murina, hapteno NIP conjugados con BSA (NIPio-BSA) y CEA humano; y (C) mediante citometra de flujo en clulas tumorales CEA-negativas y CEA-positivas. Se muestran control de isotipo (histograma gris), trimerbody anti-CEA (lnea slida) y trimerbody anti-NIP (lnea de puntos). (D) Anlisis de la interaccin del scFv B 1.8 y del trimerbody B 1.8 a NIP10- BSA utilizando BIAcore. Las curvas muestran los datos obtenidos tras la sustraccin de la respuesta de unin a una superficie de referencia tapizada con BSA (1900 UR), para eliminar los efectos de la unin no especfica. Tambin se muestran sensogramas representativos que corresponden con las curvas de unin de afinidad ajustadas de los trimerbodies scFv Bl .8 y trimerbody Bl .8 (dil. 1200 y 800 nM) en buffer HBS-EP inyectado sobre las mismas celdas que anteriormente.La Figura 2 describe actividades de unin de molculas de trimerbody mono- especficas y bi-especficas. Se comparan sobrenadantes de clulas 293T transfectadas con pEGFP-Nl, pCR3.1-L36-NClES", pCEP4-B1.8-NClES" con sobrenadantes de clulas 293T transfectadas con pCR3.1-L36-NClES" y pCEP4-B1.8-NClES", utilizando ELISA directo (A), usando placas tapizadas con BSA, conjugados NIPio-BSA y laminina-1, y por ELISA sandwich (B) utilizando placas tapizadas con laminina.La Figura 3 describe la estabilidad de las molculas de trimerbody en suero. Los trimerbodies L36 purificados se incubaron en suero humano o de ratn a 37 0C, tal y como se detalla en el Ejemplo 1 (materiales y mtodos) y la funcionalidad de las mezclas de reaccin se analizaron por ELISA.La Figura 4 describe la localizacin de anticuerpos conjugados con un fluorforo (cianina 5 ; Cy5) en un modelo de cncer gstrico (C E A-positivo) experimental en ratones desnudos. Imgenes de infrarrojo cercano en ratones desnudos portadores de un carcinoma gstrico MKN45 subcutneos (s.c). Imgenes ventral (A, C) y dorsal (B, D) tomadas 3, 24 y 48h tras la inyeccin intravenosa (i.v.) con trimerbodies (Bl.8, MFE-23 yL36) marcados con Cy5 (A, B), o scFv L36 marcados con Cy5 (C, D). b: bladder, t: tumor.La Figura 5 describe la localizacin de trimerbodies conjugados con un fluorforo (cianina 5; Cy5) en varios modelos de cncer humano (CE A-negativo) experimental en ratones desnudos. Imgenes de infrarrojo cercano de ratones desnudos portadores de fibrosarcomas HT 1080 humanos s.c. (A) o carcinomas de cervix (HeLa) humanos s.c. (B). Las imgenes fueron tomadas 3, 24 y 48h tras la inyeccin intravenosa (i.v.) con trimerbodies marcados con Cy5.La Figura 6 describe un modelo estructural de trimerbody. Vista lateral (A) y superior (B) del modelo molecular del trimerbody de anti-laminina L36.DESCRIPCIN DETALLADA DE LA INVENCIN DefinicionesTal como aqu se utiliza, el trmino "diana" incluye una parte de una macromolcula que es reconocida por un anticuerpo; en una realizacin particular, dicha diana es un eptopo o determinante antignico de un antgeno. Un "antgeno", tal como aqu se utiliza, se refiere a una sustancia que induce la generacin de anticuerpos y puede generar una respuesta inmune. Los antgenos, habitualmente, son protenas o polisacridos, e incluyen partes de clulas, bacterias, virus y otros microorganismos. Atendiendo a su origen, un antgeno puede ser (i) exgeno, es decir, un antgeno que ha entrado en el cuerpo de un sujeto desde el exterior, por ejemplo, mediante inhalacin, ingestin, inyeccin, etc.; (ii) endgeno, es decir, un antgeno generado en el interior celular como resultado del metabolismo celular normal o debido a una infeccin intracelular, e.g., bacteriana, vrica, etc., incluyendo antgenos xenognicos (heterlogos), autlogos e idiomticos o alognicos (homlogos); o (iii) autoantgeno, es decir, una protena (o un complejo de protenas) normal que es reconocida por el sistema inmune de un sujeto que padece una enfermedad autoinmune. Una clase especialmente importante de antgenos tumorales (o neoantgenos), es decir, antgenos que son presentados por molculas del complejo mayoritario de histocompatibilidad de tipo I (MHC I) o de tipo II (MHC II) sobre la superficie de clulas tumorales; cuando dichos antgenos tumorales son presentados nicamente por clulas tumorales pero no por clulas normales se denominan "antgenos especficos de tumor" (TSA, del ingls "tumor-specific antigen") y, en general, proceden de una mutacin especfica del tumor; alternativamente, los antgenos tumorales que son presentados tanto por clulas tumorales como por clulas normales se denominan "antgenos asociados a tumor" (TAA, del ingls "tumor-associated antigen") y, en general, proceden de una mutacin especfica del tumor.El trmino "anticuerpo", tal como aqu se utiliza, se refiere a una inmunoglobulina, o a un fragmento de la misma, con capacidad de unin a un antgeno e incluye todo tipo de anticuerpos, e.g., anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, etc., as como fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, F(ab')2, Fab', fragmentos Fv de cadena nica (scFv, del ingls single chain Fv), anticuerpos monodominio (VHH), diabodies, etc. En una realizacin particular de la invencin, dicho anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fab', scFv o VHH, los cuales pueden producirse directamente mediante clulas hospedadoras recombinantes. En una realizacin particular y preferida, el anticuerpo es un scFv.Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo mnimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antgeno y de unin al antgeno. Esta regin est formada por un dominio variable de una cadena pesada (VH) y un dominio variable de una cadena ligera (VL) asociados no covalentemente.Los fragmentos "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, formando una cadena polipeptdica nica (VH-VL). Preferiblemente, el polipptido Fv comprende adicionalmente un polipptido conector (linker) entre los dominios VH y VL (VH- linker- VL) que permite al scFv formar la estructura deseada para la unin al antgeno. Informacin adicional sobre scFv puede encontrarse en "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, N. Y., pgs. 269-315 (1994).El trmino "diabodies" se refiere a un fragmento de anticuerpo con dos sitios de unin al antgeno, comprendiendo una VH conectada a una VL en la misma cadena polipeptdica (VH- linker- VL). Mediante el uso de un conector que sea demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, y crear dos sitios de unin al antgeno.El trmino "VHH", tal como aqu se utiliza se refiere anticuerpos monodominio [Nguyen et al, Adv. Immunol. (2001), 79:261-96.; Nguyen et al, Embo J. (2000), 19 (5):921-30.; Sheriff & Constantine, Nat. Struct. Biol. (1996), 3 (9):733-6). En especies de camlidos (camellos, dromedarios, llamas, etc.) una parte de sus anticuerpos carece de cadena ligera, estando la zona de reconocimiento de los antgenos constituida nicamente por el dominio VH [Desmyter et al., J. Biol. Chem. (2002), 277 (26):23645- 50]. Este dominio VH se diferencia de los dominios VH de otros anticuerpos en que sus zonas de reconocimiento del antgeno estn formadas por bucles de mayor tamao. As, a los dominios VH de anticuerpos de camlidos se les denomina VHH. Este dominio (VHH) de aproximadamente 15 kDa puede expresarse en el periplasma de E. coli manteniendo la capacidad de unin a su antgeno. Los VHH son molculas ms estables que los scFv, y al contrario que stos raramente agregan. Al igual que los dominios VL y VH de ratn, los dominios VHH poseen un enlace S-S intramolecular que estabiliza su estructura terciaria y es necesario para su correcto plegamiento [Desmyter et al, J. Biol. Chem. (2002), 277 (26):23645-50].El trmino "marcador", tal como aqu se utiliza, se refiere a cualquier tipo de molcula que indica la existencia de un proceso qumico, fsico o biolgico, que se puede introducir en un organismo con el fin de examinar alguna propiedad. Los mareajes pueden ser radiactivos o no radiactivos. El mareaje radiactivo o isotpico se ha empleado con ms frecuencia, aunque va siendo desplazado progresivamente por los mtodos no radiactivos. Aunque no existe consenso acerca del mareaje ideal, en la mayora de los casos se hace con 32P. Puesto que la corta vida media de este istopo (14 das) crea dificultades en la preparacin, comercializacin y uso rutinario de los ensayos, se utilizan tambin otras alternativas (35S, 3H, 125I, 14C, etc.). En cuanto a los marcadores no radiactivos, en funcin del marcador empleado, la deteccin se hace por fluorometra o aadiendo un sustrato especfico cuya transformacin enzimtica por la enzima marcadora puede detectarse por alguno de los siguientes principios: (i) espectrofotometra: medida de la absorcin de luz por los productos de la reaccin, bien solubles o insolubles, en el ultravioleta o el visible (colorimetra), (ii) fluorometra: medida de la luz emitida por productos de la reaccin que poseen un molcula fluorescente, o (iii) quimioluminiscencia: medida de luz emitida como consecuencia de reacciones con esta caracterstica. Estos y otros procedimientos se pueden aplicar a la deteccin de protenas, antgenos o pequeos ligandos.En concreto, la fluorometra se puede utilizar para mareaje in vivo. De esta manera, se puede marcar especficamente un componente de inters en una muestra, con una molcula fluorescente, llamada fluorforo. Uno de los fluor foros ms comnmente utilizados es la fluorescena isotiocianato (FITC), un reactivo derivado de la fluorescena, que se acopla qumicamente a otras molculas para crear nuevas molculas fluorescentes para una variedad de aplicaciones. Otros fluorforos histricamente muy utilizados son los derivados de la rodamina (TRITC), comarina y cianina. Nuevas generaciones de fluorforos incluyen el "Alexa Fluor" y los "DyLight Fluor", ms fotoestables, ms brillantes y menos sensibles a cambios de pH que otros marcadores conocidos. Dentro de la familia de la cianina, se incluyen los marcadores Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7, que son reactivos fluorescentes solubles en agua. Los marcadores Cy3 son amarillo -naranja (excitacin a 550 nm aproximadamente, emisin a aproximadamente 570 nm), mientras que los Cy5 son fluorescentes en la regin del rojo (aproximadamente a 650/670 nm). Normalmente son sintetizados con grupos reactivos en una o en ambas cadenas laterales de nitrgeno, de manera que pueden ser acoplados qumicamente, tanto a cidos nucleicos como a protenas, siendo ampliamente usados en tcnicas de diagnstico por imagen. Por otra parte, dentro de los fluorforos orgnicos para el infrarrojo cercano (NIR), los ms comunes son las polimetinas de frmula general (I)

(I) dondeRi y R2, independientemente entre s, representan alquilo C1-C10, sulfoalquiloC1-C10, cicloalquilo C3-C10, alcoxilo C1-C10, o arilo;R3 y R4, independientemente entre s, representan sulfoalquilo C1-C10, haloalquilo C1-C10, o hidroxicarbonilalquilo C1-C10;Y es C, O, S; y n es un nmero entero comprendido entre 1 y 10.Entre las polimetinas ms tiles se encuentran las cianinas pentametina (n = 1) y heptametina (n= 2) que comprenden un grupo benzoxazol, benzotiazol, indolil, 2- quino lin 4-quinolin.Protena oligomrica de la invencinEn otro aspecto, la invencin se relaciona con una protena oligomrica, en adelante protena oligomrica de la invencin, que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador (M), en la que cada protena de fusin comprende:(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. El marcador (M) presente en dicha protena oligomrica de la invencin puede ser prcticamente cualquier marcador; no obstante, para sus aplicaciones en tcnicas de diagnstico por imagen dicho marcador (M) es un marcador adecuado para dichas tcnicas, por ejemplo, (i) un fluorforo, tal como un fluorforo para diagnstico por imagen por fluorescencia en la zona cercana al infrarrojo, e.g. Cy5, Cy7 etc.; (ii) un radionucleido para radioinmunoescintigrafa [compuestos que emiten partculas gamma: 99mTc, 111In, 131I, renio 186 (186Re)] o para tomografa por emisin de positrones (TEP) (marcador TEP); etc. En una realizacin particular, dicho marcador (M) es un fluorro, tal como Cy5, Cy7, etc., o un marcador TEP, tal como 64Cu, 68Ga, 18F, 86Y, 76Br, 89Zr, 124I, etc. En general, el uso en clnica humana de anticuerpos recombinantes con fines diagnstico requiere el empleo de marcadores tipo TEP ("inmuno-TEP"), los cuales, por sus caractersticas, permitirn detectar lesiones pequeas, incluyendo micrometstasis, localizadas en zonas profundas; alternativamente, para detectar lesiones ms superficiales, se podran utilizar fluorforos, e.g., marcadores fluorescentes NIR, en localizaciones ms accesibles, por ejemplo, piel, fondo de ojo, etc. [Wu & Olafsen. Cncer J. (2008). May-Jun; 14(3):191-7; van Dongen GA et al. (2007). Oncologist. Dec; 12(12):1379-89.La protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador (M), comprendiendo cada una de dichas protenas de fusin comprende un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.En una realizacin particular, dicha protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin iguales; en cuyo caso, cada una de dichas protenas de fusin comprende un mismo polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y un mismo polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.En otra realizacin particular, dicha protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin diferentes, por ejemplo, dos o ms protenas de fusin diferentes. En este caso, una de dichas protenas de fusin comprende un polipptido (Al) que comprende un anticuerpo (1) o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo (1); y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, y otra de dichas protenas de fusin comprende un polipptido (A2) que comprende un anticuerpo (2) o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo (2); y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, en donde dichos anticuerpos (1) y (2) son diferentes. El nmero total de protenas de fusin presentes en la protena oligomrica de la invencin depender del dominio de oligomerizacin, dependiendo del dominio de oligomerizacin siendo posible prcticamente cualquier combinacin entre dichas protenas de fusin iguales o diferentes, siempre y cuando el dominio de oligomerizacin se mantenga. El hecho de que la protena oligomrica de la invencin comprenda dos o ms protenas de fusin diferentes permite reconocer e interaccionar con dos o ms dianas (e.g., antgenos) diferentes. A modo ilustrativo, no limitativo, la protena oligomrica de la invencin puede contener dos protenas de fusin diferentes entre s, tal como se ha mencionado previamente; o, alternativamente, dos protenas de fusin iguales entre s y una protena de fusin diferente; o, alternativamente, dos protenas de fusin iguales entre s y otros dos protenas de fusin diferentes pero iguales entre s; o, alternativamente, dos protenas de fusin iguales entre s y otros dos protenas de fusin diferentes entre s y diferentes a las dos protenas de fusin iguales; o, alternativamente, tres protenas de fusin diferentes entre s; etc.; en general, cualquier combinacin de protenas de fusin que comprendan un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, en las que se mantenga dicho dominio de oligomerizacin.La protena oligomrica de la invencin comprende dos o ms protenas de fusin, iguales o diferentes; por tanto, puede reconocer e interaccionar con una nica diana (antgeno), o, alternativamente, con dos o ms dianas (e.g., antgenos) diferentes, lo que la convierte en un reactivo muy verstil monoespecfico (es decir, cuando reconoce a una nica diana o antgeno), o multiespecfico (es decir, cuando reconoce a ms de una diana o antgeno, e.g., biespecfico, si reconoce dos dianas o antgenos diferentes, triespecficos, si reconoce tres dianas o antgenos diferentes, etc. El polipptido (A) comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo. Dicho anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente, reconoce una diana, tal como un eptopo o determinante antignico de un antgeno; en una realizacin particular, dicho antgeno es un antgeno tumoral, tal como CEA (Begent RH et al. Nat Med. (1996) Sep; 2(9):979-84), o un antgeno no tumoral que se expresa en reas de angiognesis activas en el microambiente peritumoral, tal como el dominio EDB de la fibronectina (Ebbinghaus C et al. Curr Pharm Des. (2004); 10(13):1537-49).En una realizacin particular, el polipptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce una diana o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce dicha diana. Prcticamente cualquier anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente del mismo, que reconozca una diana puede ser utilizado en la presente invencin, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (AcM) o un anticuerpo policlonal (AcP); alternativamente, dicho polipptido (A) puede contener un fragmento funcionalmente equivalente de un anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo que mantiene la capacidad de reconocimiento de la diana reconocida por el anticuerpo completo del que deriva, e.g., un scFv, un anticuerpo biespecfico o diabody que reconoce dicha diana o bien en su formato recombinante completo (Fab + Fc), o un anticuerpo monodominio VHH preferentemente, un scFv (Ejemplo 1).En una realizacin particular, el polipptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce una diana o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce dicha diana. Prcticamente cualquier anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente del mismo, que reconozca una diana puede ser utilizado en la presente invencin, por ej emplo, un anticuerpo monoclonal AcM o policlonal AcP; alternativamente, dicho polipptido (A) puede contener un fragmento funcionalmente equivalente de un anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo que mantiene la capacidad de reconocimiento de la diana reconocida por el anticuerpo completo del que deriva, e.g., un scFv, un anticuerpo biespecfico o diabody que reconoce dicha diana o bien en su formato recombinante completo (Fab + Fc), preferentemente, un scFv (Ejemplo 1).En una realizacin particular, dicho polipptido (A) comprende un scFv recombinante derivado del AcM L36 anti-laminina (Ejemplo 1) [scFv L36] que contiene la regin variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal L36 fusionada, a travs de un espaciador, tal como un pptido que comprende la secuencia (Gly-Ser)4 (o una secuencia de tipo Gly-Ser-Pro-Gly, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser), a la regin variable de la cadena ligera (VL) del AcM L36 y cuya secuencia ya ha sido descrita [Sanz L et al. Cncer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557- 65], en donde el extremo 3' de la secuencia codificante de VH est unido al extremo 5' de la secuencia codificante de dicho linker y el extremo 3 ' de la secuencia de nucletidos codificante de dicho linker est unido al extremo 5 ' de la secuencia codificante de VL. El AcM L36 reconoce lamininas de diferentes especies de animales, por ejemplo, de ratn, rata, humanos, etc., ya que interacciona con una regin que est muy conservada entre diferentes especies de animales [Sanz L et al. EMBO J 2003, VoI. 22(7):1508-1517]. En otra realizacin particular, dicho polipptido (A) comprende un scFv recombinante derivado del AcM Bl .8 especfico del hapteno NIP (Ejemplo 1) que contiene la regin variable de la cadena pesada (VH) del AcM B 1.8 fusionada, a travs de un espaciador, a la regin variable de la cadena ligera (VL) del AcM Bl .8; en una realizacin particular, dicho espaciador comprende una secuencia de tipo Gly-Ser-Pro- GIy, o de tipo (Gly-Ser)4, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly- Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.En otra realizacin particular, dicho polipptido (A) comprende un scFv recombinante derivado del AcM MFE23 especfico del antgeno carcino embrionario (CEA) humano (Ejemplo 1) que contiene la regin variable de la cadena pesada (VH) del AcM MFE23 fusionada, a travs de un espaciador, a la regin variable de la cadena ligera (VL) del AcM MFE23; en una realizacin particular, dicho espaciador comprende una secuencia de tipo Gly-Ser-Pro-Gly, o de tipo (Gly-Ser)4, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp- Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.Dicho polipptido (A) puede reconocer y unirse a una diana, e.g., presente en un antgeno tumoral, y, como resultado de esa unin, localizar la diana (antgeno) y permitir su visualizacin mediante tcnicas de imagen apropiadas (e.g., fluorescencia, TEP, etc.) debido a la presencia del marcador (M) en la protena oligomrica de la invencin.El polipptido (B) comprende un dominio de oligomerizacin. Dicho dominio de oligomerizacin puede ser prcticamente cualquier dominio que permite la formacin de oligmeros, por ejemplo, dmeros, trmeros, tetrmeros, etc., de pptidos o protenas, susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligmero proteico de la protena que lo comprende. No obstante, en una realizacin particular, dicho dominio de oligomerizacin es un dominio de trimerizacin, tal como el dominio de trimerizacin del dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV de mamfero. Como es conocido, dicho dominio NC l del colgeno XVIII (y del colgeno XV) comprende un dominio de trimerizacin y el dominio endostatina (ES) unidos por unos pptidos bisagra. Por tanto, en una realizacin particular, la protena de fusin presente en la protena oligomrica de la invencin comprende un polipptido (B) que comprende el dominio NCl del colgeno XV o el dominio NCl del colgeno XVIII que contiene el dominio de trimerizacin pero al que se le ha eliminado el dominio de ES (NC 1ES") as como la totalidad o parte de los pptidos bisagras existentes entre dichos dominios. Las secuencias de dichos dominios NCl de colgeno XV y de colgeno XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio NCl del colgeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56].Por tanto, a modo ilustrativo, en una realizacin particular, la invencin proporciona una protena oligomrica de la invencin que comprende un marcador (M) y una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, en donde cada protena de fusin comprende:(i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y(ii) un polipptido (B) que comprende el dominio NC1ES" de colgeno XVIII de mamfero.No obstante, cualquier otro dominio similar al dominio NC 1 de colgeno XVIII que comprenda un dominio de oligomerizacin puede ser utilizado en la puesta en prctica de la presente invencin, con el fin de generar la protena oligomrica de la invencin.Debido a la presencia del dominio de oligomerizacin en la protena de fusin presente en la protena oligomrica de la invencin, la protena oligomrica de la invencin puede estar constituida por 2 ms, por ejemplo, 3, 4, 5, o ms protenas de fusin, iguales o diferentes entre s, dando lugar a dmeros, trmeros, tetrmeros, pentmeros, etc. de las protenas de fusin proporcionadas por esta invencin. En una realizacin particular, dicha protena oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin proporcionadas por esta invencin; dado que dichas protenas de fusin incorporan un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, dichos trmeros han sido denominados por los inventores con el nombre genrico de "trimerbody" (singular) o "trimerbodies" (plural). En una realizacin ms concreta, dicha protena oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin iguales proporcionadas por esta invencin; en otra realizacin ms concreta, dicha protena oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin proporcionadas por esta invencin, de las cuales dos son iguales entre s y la otra es diferente; y, en otra realizacin ms concreta, dicha protena oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin diferentes proporcionadas por esta invencin.La protena de fusin proporcionada por esta invencin puede contener, adems, si se desea, un tercer polipptido (C) que comprende la secuencia de aminocidos de un pptido de unin flexible entre dichos polipptidos (A) y (B) y/o un pptido (D) para facilitar el aislamiento o purificacin de la protena de fusin.Dicho polipptido (C) puede comprender prcticamente cualquier secuencia peptdica que defina un pptido de unin flexible. Ejemplos ilustrativos de pptidos de unin flexibles incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly o la secuencia (Gly-Ser)4. No obstante, en una realizacin particular, dicho pptido de unin flexible comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificacin de la protena de fusin de la invencin, dicha protena de fusin puede contener, si se desea, un pptido (D) susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin de la protena de fusin, tal como un pptido etiqueta ("tag"). Dicho pptido (D) puede estar situado en cualquier posicin de la protena de fusin que no altere la funcionalidad de ninguno de los polipptidos (A) y (B); a modo ilustrativo, no limitativo, dicho pptido (D) puede estar situado a continuacin del polipptido (B). Prcticamente cualquier pptido o secuencia peptdica que permita el aislamiento o purificacin de la protena de fusin puede ser utilizado, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptdicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos que pueden servir para purificar la protena de fusin resultante por cromatografa de inmunoafinidad, tales como pptidos etiqueta, por ejemplo, eptopos derivados de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, C-myc, FLAG, V5, etc.La protena oligomrica de la invencin puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende poner en contacto una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, en la que cada protena de fusin comprende:(i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y(ii) un po lip pti do (B ) que comprende un dominio de oligomerizacin, con un marcador (M) bajo condiciones que permiten la unin de dicho marcador (M) a la protena oligomrica. Dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de esta invencin.Las caractersticas de dichos polipptidos (A) y (B) as como las del marcador (M) ya han sido definidas previamente. Las condiciones que permiten la unin de dicho marcador (M) a dicha protena oligomrica dependen del marcador (M) elegido y de la protena oligomrica y, en general, son conocidas por los tcnicos en la materia.La protena oligomrica de la invencin, debido a sus caractersticas propias, puede ser utilizada en numerosas aplicaciones, por ejemplo, en la visualizacin de antgenos mediante tcnicas de imagen, tanto in vitro como in vivo (e.g., fluorescencia, TEP, etc.), en la localizacin de antgenos, etc., en general, en la identificacin de alteraciones patolgicas asociadas con la neoexpresin o sobreexpresin de antgenos, e.g., patologas inflamatorias (e.g., integrinas, etc.), patologas vasculares (e.g., placas de ateroma, etc.), patologas tumorales, etc. En una realizacin particular, dichos antgenos son antgenos tumorales.Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con el empleo de una protena oligomrica de la invencin, en un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana, tal como un antgeno, mediante una tcnica apropiada, por ejemplo, una tcnica de imagen. En una realizacin particular dicha diana es un antgeno que se expresa de novo (es decir, que en condiciones normales no se expresa pero que en una alteracin patolgica se expresa) o sobreexpresa (es decir, que en condiciones normales se expresa en un nivel basal y su expresin aumenta en caso de una alteracin patolgica), por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral. Alternativamente, en otro aspecto, la invencin se relaciona con un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana, tal como un antgeno, mediante una tcnica apropiada, por ejemplo, una tcnica de imagen, que comprende el empleo de una protena oligomrica de la invencin. En una realizacin particular dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica, por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral. Para su empleo en dichas aplicaciones, la protena oligomrica de la invencin se encontrar en un medio apropiado y adecuado para su administracin.Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin que comprende una protena oligomrica de la invencin junto con, al menos, un medio apropiado, tal como un medio que no altera a la estabilidad de dicha protena oligomrica de la invencin, por ejemplo, PBS, solucin salina fisiolgica, etc. Alternativamente, dicha protena oligomrica de la invencin puede encontrarse en un medio constituido por un sistema de suministro y liberacin de compuestos, por ejemplo, un vector viral o no viral (e.g., nanopartculas a base de polmeros biocompatibles, liposomas, etc.). Dichos vectores son, en general, conocidos por los tcnicos en la materia.Para sus aplicaciones in vivo, dicho medio debe ser farmacuticamente aceptable. Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin farmacutica que comprende una protena oligomrica de la invencin junto con, al menos, un vehculo farmacuticamente aceptable. En una realizacin particular, la composicin farmacutica de la invencin comprende, al menos, una protena oligomrica de la invencin en una cantidad eficaz. En el sentido utilizado en esta descripcin, la expresin "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de protena oligomrica de la invencin calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendr determinada, entre otras causas, por las caractersticas propias de la protena oligomrica, la diana (antgeno) a visualizar o localizar, etc. La composicin farmacutica proporcionada por esta invencin puede ser administrada por cualquier forma de administracin apropiada, por ejemplo, por va parenteral. Los vehculos que pueden utilizarse en la elaboracin de la composicin farmacutica proporcionada por esta invencin dependern, entre otras cosas, de la forma de administracin de dicha composicin farmacutica. Una revisin de las distintas formas de administracin de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricacin puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galnica, C. Faul i Trillo, Luzn 5, S.A. de Ediciones, 1993.Las protenas oligomricas de la invencin pueden aislarse y, si se desea, purificarse, fcilmente, por mtodos convencionales conocidos por los tcnicos en la materia, por ejemplo, mediante cromatografa de afinidad. En general, la protena oligomrica de la invencin es oligomrica en solucin y posee una excelente estabilidad y capacidad de unin a la diana (antgeno), reconociendo con alta eficiencia tanto antgenos purificados inmovilizados sobre una placa como antgenos expresados o sobreexpresados en alteraciones patolgicas (e.g., en la superficie de una clula tumoral). Las protenas oligomricas de la invencin poseen una seal de unin mayor que el anticuerpo monomrico (que constituye una unidad estructural de la misma) y, aparentemente, una disociacin menor, consistente con la unin multivalente al antgeno. De hecho, se ha calculado que una protena oligomrica de la invencin (e.g., la protena oligomrica anti-NIP - Ejemplo 1) tiene una afinidad funcional por el antgeno muy superior (NIP-BSA) unas 100 veces mayor que su versin monovalente. Este resultado sugiere, aunque no se desea estar vinculado por ninguna teora, que esta ganancia de afinidad podra ser debida al efecto de avidez de un segundo sitio de combinacin en la molcula de la protena oligomrica de la invencin. La presencia de al menos dos sitios de unin funcionales en una sola molcula de una protena oligomrica de la invencin ha sido posteriormente demostrada mediante la generacin de protenas de oligomricas de la invencin biespecficas (Ejemplos 1); efectivamente, protenas oligomricas (trimerbodies) biespecficas anti-laminina y anti-NIP estables fueron fcilmente producidos por co-expresin de dos construcciones diferentes de protenas oligomricas de la invencin en clulas humanas.Esta ganancia en afinidad a travs de la avidez convierte a las protenas oligomricas de la invencin en unos reactivos muy atractivos para tcnicas de imagen in vzvo como agentes alternativos, y preferidos, a los anticuerpos dimricos (diabodies y minibodies). Como es conocido, para una completa avidez en anticuerpos multivalentes dirigidos a molculas unidas a la superficie, los sitios de unin del antgeno deben apuntar hacia la misma direccin; si la unin mltiple simultnea no es posible estricamente, entonces la ganancia aparente en afinidad funcional es probable que sea menor y debida nicamente al efecto de unin aumentado, que es dependiente en tasas de difusin y la concentracin del antgeno de superficie. El anlisis del modelo de las protenas oligomricas de la invencin, en particular en su formato trimrico (trimerbody), sugiere una estructura con forma de trpode con los dominios scFv orientados hacia fuera. La flexibilidad entre los sitios de unin al antgeno es otro aspecto importante en el diseo de anticuerpos multivalentes, requeridos para el entrecruzamiento de receptores de superficie, bien en la misma clula o en adyacentes. En este sentido, el espaciador flexible presente en algunas realizaciones particulares de esta invencin permite numerosas geometras de unin. Cuando una interaccin antgeno-anticuerpo ocurre, la posibilidad de establecer una segunda interaccin depende de la valencia, orientacin y flexibilidad del sitio de unin del antgeno. Segn los clculos de los inventores, en una molcula de una protena oligomrica de la invencin, tal como un trmero (trimerbody), los scFv que permanecen sin interaccionar tienen un rea de influencia unas 1 1 veces mayor, aproximadamente, que otros formatos bivalentes, tales como los diabodies y los minibodies, aumentando la probabilidad de una segunda interaccin efectiva. La flexibilidad de las protenas oligomricas de la invencin constituye tambin una ventaja frente a otras estructuras ms compactas o rgidas de otros formatos (e.g., collabody), ya que aumenta la accesibilidad de los scFv, que es un parmetro crtico para la localizacin de las dianas in vivo.Por tanto, la multimerizacin de las construcciones scFv presenta numerosas ventajas para las aplicaciones in vivo frente a otros anticuerpos recombinantes (diabodies y minibodies) que han mostrado su potencial como agentes de localizacin in vivo. Las protenas oligomricas de la invencin son molculas multivalentes de tamao intermedio que presentan una alta estabilidad en condiciones fisiolgicas. El potencial de dichas protenas oligomricas de la invencin, en particular de unos trmeros (trimerbodies) para la localizacin in vivo se ha estudiado en modelos experimentales de cncer humano en ratones desnudos (Ejemplo 1). En otro aspecto, la invencin se relaciona con un kit que comprende una protena oligomrica de la invencin. El empleo de dicho kit para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana, e.g., un antgeno, mediante una tcnica apropiada, por ejemplo, una tcnica de imagen. En una realizacin particular dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica, por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral.El kit de la invencin es un producto que contiene los diferentes productos (e.g., protena oligomrica de la invencin, reactivos adicionales, etc.) formando la composicin empaquetada de modo que permita su transporte, almacenamiento y su empleo. Los kits de la invencin pueden contener de este modo una o ms suspensiones, jeringuillas, etc., as como medios para reconstituir la protena oligomrica de la invencin en caso de que esta estuviera en forma liofilizada. Otros componentes que pueden estar presentes en el kit de la invencin es un envase que permite mantener las formulaciones de la invencin dentro de determinados lmites. Los materiales adecuados para preparar tales envases incluyen vidrio, plstico, polietileno, polipropileno, policarbonato y similares, botellas, viales, papel, bolsitas y similares. Adicionalmente, el kit de la invencin puede contener instrucciones para su empleo. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de soporte electrnico que puede almacenar las instrucciones tal que puedan ser ledas por un sujeto, tal como medios de almacenamiento electrnico (discos magnticos, cintas y similares), medios pticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden adicional o alternativamente contener sitios Web en Internet proporcionando dichas instrucciones.Protena de fusin [polipptido ( A)-polipptido (B)ILa protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin (iguales o diferentes), dependiendo del dominio de oligomerizacin presente en el polipptido (B), y cada protena de fusin comprende:(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. Adicionalmente, si se desea, dicha protena de fusin puede incluir un polipptido (C) que comprende la secuencia de aminocidos de un pptido de unin flexible entre dichos polipptidos (A) y (B) y/o un pptido (D) para facilitar el aislamiento o purificacin de la protena de fusin.Las caractersticas de dichos polipptidos (A), (B), (C) y (D) ya han sido descritas previamente, al igual que la posibilidad de que dichas protenas de fusin sean iguales o diferentes.La protena de fusin proporcionada por la invencin puede ser obtenida por mtodos convencionales. A modo ilustrativo, dicha pro tena de fusin puede obtenerse mediante la fusin de dichos polipptidos, obtenidos bien por mtodos de sntesis qumica de pptidos o bien mediante la tecnologa del ADN recombinante. Alternativamente, dicha protena de fusin proporcionada por esta invencin puede obtenerse por mediante el empleo de la tecnologa del ADN recombinante, para lo cual se generarn las construcciones gnicas, cassettes de expresin y vectores correspondientes. En general, cuando las protenas de fusin son iguales, pueden obtenerse mediante incorporacin del ADN que codifica dicha protena de fusin en una clula husped apropiada (e.g., bacterias, levaduras, clulas animales, etc.). Alternativamente, cuando las protenas de fusin son diferentes, pueden obtenerse, en general, mediante incorporacin de los ADN que codifican dichas protenas de fusin en una clula husped apropiada, en donde los distintos ADN pueden formar parte de la misma construccin gnica o de construcciones gnicas diferentes (e.g., mediante co- transformacin o co-transfeccin de clulas husped apropiadas).Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una construccin gnica, en adelante construccin gnica de la invencin, que comprende, al menos: a) una primera secuencia de cido nucleico (A'), que comprende la secuencia de nucletidos que codifica un polipptido (A), en donde dicho polipptido (A) comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y b) una segunda secuencia de cido nucleico (B') que codifica un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de cido nucleico (A') est unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de cido nucleico (B'), o, alternativamente, el extremo 5 ' de dicha primera secuencia de cido nucleico (A') est unido al extremo 3 ' de dicha segunda secuencia de cido nucleico (B').La secuencia de cido nucleico (A') comprende la secuencia de nucletidos que codifica un polipptido (A) que comprende un anticuerpo que reconoce una diana o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce dicha diana. Ejemplos ilustrativos de dicha diana incluyen un eptopo o determinante antignico de un antgeno, por ejemplo, un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica, por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral.Por tanto, en una realizacin particular, la secuencia de cido nucleico (A') codifica un polipptido (A) que comprende un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, que reconoce una diana concreta. Prcticamente cualquier anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente del mismo, que reconozca una diana puede ser utilizado en la presente invencin, e.g., un AcM, un AcP, un scFv, un anticuerpo biespecfico o diabody, un VHH, etc. En una realizacin particular, dicha secuencia de cido nucleico (A') codifica un polipptido (A) que comprende un scFv recombinante derivado del AcM L36 anti-laminina [scFv L36], o un scFv recombinante derivado del AcM Bl.8 especfico del hapteno NIP, o un scFv recombinante derivado del AcM MFE23 especfico del antgeno carcinoembrionario (CEA) humano (Ejemplo 1).En caso de que la protena oligomrica de la invencin comprenda una pluralidad de protenas de fusin diferentes, por ejemplo, dos o ms protenas de fusin diferentes, cada una de ellas estara codificada por la correspondiente secuencia de ADN, las cuales podran estar en una nica construccin gnica o en construcciones gnicas diferentes.La secuencia de cido nucleico (B') comprende la secuencia de nucletidos que codifica un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. Como se ha mencionado previamente, un dominio de oligomerizacin permite la formacin de oligmeros (e.g., dmeros, trmeros, tetrmeros, etc., de pptidos o protenas). Prcticamente cualquier dominio de oligomerizacin, por ejemplo, un dominio de dimerizacin, trimerizacin, tetramerizacin, etc., presente en distintas protenas, tanto de origen eucaritico como procaritico, susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligmero proteico de la protena que lo comprende puede ser utilizado en la presente invencin. En una realizacin particular, dicho dominio de oligomerizacin es un dominio de trimerizacin, tal como el dominio de trimerizacin del dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV; en una realizacin concreta, dicho dominio de oligomerizacin es el dominio de trimerizacin del dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV al que se la ha eliminado la totalidad o parte del dominio de ES. Por tanto, en una realizacin particular y preferida, la secuencia de cido nucleico (B') comprende la secuencia de nucletidos que codifica el dominio NCl de colgeno XVIII de mamfero o el dominio NCl del colgeno XV de mamfero, en el que, opcionalmente, se ha eliminado la totalidad o parte del dominio de ES. Las secuencias de dichos dominios NCl de colgeno XV y XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio NC l del colgeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C- terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56].En la construccin gnica de la invencin, el extremo 3 ' de dicha secuencia de cido nucleico (A') est unido, en una realizacin particular, al extremo 5 ' de dicha secuencia de cido nucleico (B'); alternativamente, en otra realizacin particular, el extremo 5 ' de dicha secuencia de cido nucleico (A') est unido al extremo 3 ' de dicha secuencia de cido nucleico (B').En general, la secuencia de cido nucleico (A') no se fusiona directamente a la secuencia de cido nucleico (B') sino que resulta ventajoso introducir un pptido de unin flexible (o pptido espaciador) entre los polipptidos codificados por dichas secuencias de cido nucleico (A') y (B'). Por tanto, si se desea, la construccin gnica de la invencin tambin puede contener, adems, una tercera secuencia de cido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucletidos que codifica para un pptido de unin flexible situada entre dichas secuencias de cido nucleico (A') y (B'). En una realizacin particular, el extremo 5' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (A') y el extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 5' de dicha secuencia de cido nucleico (B'); alternativamente, en otra realizacin particular, el extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 5 ' de dicha secuencia de cido nucleico (A') y el extremo 5 ' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (B'). Ventajosamente, dicho pptido espaciador (C) es un pptido con flexibilidad estructural. Prcticamente, cualquier pptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho pptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminocidos, en particular de restos de GIy y Ser o cualquier otra repeticin de restos de aminocidos adecuada. Prcticamente cualquier secuencia peptdica que defina un pptido de unin flexible puede ser utilizada en la presente invencin. Ejemplos ilustrativos de pptidos de unin flexibles incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly (GSPG) o la secuencia (Gly-Ser)4. No obstante, en una realizacin particular, dicho pptido de unin flexible comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Por tanto, en una realizacin particular, la construccin gnica de la invencin comprende, adems de dichas secuencias de cido nucleico (A) y (B) una tercera secuencia de cido nucleico (C) que comprende la secuencia de nucletidos que codifica para el pptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. La longitud y composicin del pptido espaciador puede variar; no obstante, en una realizacin particular, se ajustar (mayor o menor longitud, mayor o menor rigidez) en funcin de la naturaleza de la diana (antgeno) reconocida por el anticuerpo para conseguir las mejores propiedades funcionales.Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificacin de la protena de fusin obtenida mediante la presente invencin, la construccin gnica de la invencin puede contener, si se desea, una secuencia de cido nucleico que codifica un pptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin de la protena de fusin. Por tanto, en una realizacin particular, la construccin gnica de la invencin incluye, si se desea, una secuencia de cido nucleico (D') que contiene la secuencia de nucletidos que codifica un pptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin, conocido como pptido etiqueta ("tag"). Dicha secuencia de cido nucleico (D') puede estar situada en cualquier posicin que no altere la funcionalidad de ninguno de los polipptidos [(A) y (B)] expresados por dichas secuencias de cidos nucleicos (A') y (B'). A modo simplemente ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia de cido nucleico (D') puede estar situada aguas abajo del extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (B'). Prcticamente cualquier pptido o secuencia peptdica que permita el aislamiento o purificacin de la protena de fusin puede ser utilizado, por ejemplo, una cola de histidinas (e.g., 6 restos de His), una secuencias peptdica susceptible de ser reconocida por un anticuerpo que pueden servir para purificar la protena de fusin resultante por cromatografa de inmunoafinidad, tales como pptidos etiqueta, etc., por ejemplo, eptopos derivados de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, C-myc, FLAG, V5, etc.La construccin gnica de la invencin puede obtenerse mediante el empleo de tcnicas ampliamente conocidas en el estado de la tcnica [Sambrook et al, "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3]. Dicha construccin gnica de la invencin puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresin de las secuencias de nucletidos que codifican para los polipptidos codificados por las secuencias de cido nucleico (A') y (B'), constituyendo de este modo un cassette de expresin. Tal como se utiliza en esta descripcin, la expresin "operativamente unida" significa que los polipptidos codificados por las secuencias de cido nucleico (A') y (B'), y, en su caso (C), son expresados en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresin.Por tanto, en otro aspecto, la invencin proporciona un cassette de expresin que comprende la construccin gnica de la invencin operativamente unida a una secuencia de control de expresin de la secuencia de nucletidos que codifica la protena de fusin proporcionada por esta invencin que comprende un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripcin y, en su caso, la traduccin de dicha protena de fusin, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unin a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripcin. En una realizacin particular, dicha secuencia de control de expresin es funcional en clulas y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realizacin particular, dicha secuencia de control de expresin es funcional en clulas y organismos eucariotas, por ejemplo, clulas de insecto, clulas vegetales, clulas de mamfero, etc. Ejemplos ilustrativos de promotores que pueden estar presentes en el cassette de expresin proporcionado por esta invencin incluyen el promotor de citomegalovirus humano (hCMV), etc.Ventajosamente, dicho cassette de expresin comprende, adems, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la seleccin de la clula hospedadora transformada con dicho cassette de expresin. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podran estar presentes en el cassette de expresin de la invencin incluyen genes de resistencia a antibiticos, genes de resistencia a compuestos txicos, y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas transformadas genticamente.La construccin gnica de la invencin, o el cassette de expresin proporcionado por esta invencin, pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con un vector, tal como un vector de expresin, que comprende dicha construccin de gnica de la invencin o dicho cassette de expresin. La eleccin del vector depender de la clula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicha secuencia de cido nucleico puede ser un plsmido o un vector que, cuando se introduce en una clula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha clula. La obtencin de dicho vector puede realizarse por mtodos convencionales conocidos por los tcnicos en la materia [Sambrook et al., 1989, citado supra]. En una realizacin particular, dicho vector recombinante es un vector til para transformar clulas animales. Dicho vector puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar clulas susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas clulas pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una clula hospedadora transformada, transfectada o infectada con un vector proporcionado por esta invencin. Dicha clula transformada, transfectada o infectada comprende, por tanto, una construccin gnica de la invencin, o bien dicho cassette de expresin o vector proporcionado por esta invencin. Clulas transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por mtodos convencionales conocidos por los tcnicos en la materia [Sambrook et al., 1989, citado supra]. En una realizacin particular, dicha clula hospedadora es una clula animal transformada, transfectada o infectada con un vector apropiado, siendo dicha clula animal transformada, transfectada o infectada capaz de expresar la protena de fusin proporcionada por esta invencin, por lo que dichos vectores pueden utilizarse para la expresin en clulas animales de la protena de fusin proporcionada por esta invencin.La construccin gnica de la invencin puede ser utilizada para producir dichas protenas de fusin que comprenden un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con un mtodo para producir dicha protena de fusin proporcionada por esta invencin que comprende crecer una clula u organismo proporcionado por esta invencin bajo condiciones que permiten la produccin de dicha protena de fusin. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha clula u organismo dependern de la clula u organismo utilizado. Si se desea, el mtodo para producir un producto de inters proporcionado por esta invencin incluye, adems, el aislamiento y purificacin de dicha protena de fusin. El experto en la materia entender que, si la protena oligomrica de la invencin contiene dos o ms protenas de fusin diferentes, dichas protenas de fusin diferentes pueden expresarse, si se desea, en una clula husped apropiada mediante co- transformacin, co-transfeccin o co-infeccin utilizando los vectores que contienen las secuencias codificantes apropiadas.El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invencin y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.EJEMPLO 1Localizacin y visualizacin in vivo de tumores mediante protenas oligomricas que comprenden fragmentos de anticuerpos y secuencias derivadas de colgenoI. MATERIALES Y MTODOSAnticuerpos y reactivosLos anticuerpos monoclonales (AcMs) utilizados incluyeron el AcM 9E10 (Abcam, Cambridge, R. Unido) especfico de c-myc humano, y el AcM NCRC23 (AbDSerotec, Kidlington, R. Unido) especfico del antgeno carcinoembrionario (CEA) humano. Los anticuerpos policlonales (AcPs) utilizados incluyeron un anticuerpo (Ac) de conejo anti-albmina de suero bovina (BSA); un Ac de cabra anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rbano picante (HRP); y un Ac de cabra anti-IgG de ratn, especfico del dominio constante de la IgG (Fc), conjugado con HRP, todos ellos proporcionados por Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU). La laminina-1 purificada a partir del tumor murino EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) se obtuvo de Becton Dickinson Labware (Bedford, MA, USA). El CEA humano y la BSA fueron proporcionados por Sigma-Aldrich. Para la generacin de conjugados de BSA con el hapteno 4-hidroxi-5-iodo-3-nitrofenil (NIP) (Sigma-Aldrich) en una relacin molar 10: 1 (NIPio:BSA) se sigui un protocolo anteriormente descrito [Reth, M. et al.(1979). Eur. J. Immunol. 9:1004-1013].Clulas y condiciones de cultivo Las clulas HEK-293 (clulas epiteliales de rion embrionario humano; CRL-1573), y sus clulas derivadas 293T (CRL-11268), as como las clulas HT-1080 (fibrosarcoma humano; CCL- 121), MKN45 (adeno carcinoma gstrico humano; JCRB- 0254); y HeLa (carcinoma de crvix humano; CCL-2) fueron cultivadas en medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA), en adelante medio DMEM completo (DCM). Las clulas HeLaCEA (Compte, M. et al. 2007; Cncer Gene Ther. 14:380-388) se cultivaron en DCM suplementado con 750 g/ml de G418 (Invitrogen).Construccin de los vectores de expresinLos vectores de expresin pCR3. 1-L36 y pCR3.1-L36-NClES" fueron construidos siguiendo protocolos conocidos [Sanz L et al. (2002). Gene Ther. 9:1049- 1053; Sanz L et al. (2001). Cncer Immunol. Immunother. 50:557-565].El plsmido pVOMl .C23 que contiene el gen que codifica el Ac MFE-23 (anti- CEA humano) en formato de fragmento variable de cadena nica (scFv), fue proporcionado por el Dr. R. E. Hawkins (University of Manchester, UK). El cassette de expresin del Ac MFE-23 se digiri con HindIII y Notl y se clon en el vector pCEP4.6xHis-myc [Sanz, L. et al. (2002). Gene Ther. 9:1049-1053] para generar el plsmido pCEP4-MFE-23.El plsmido pCEP4-B1.8 que contiene el gen que codifica el Ac B 1.8 (anti-NIP) en formato scFv y las etiquetas (tags) peptdicas de polihistidina (6 His) y c-myc fue construido siguiendo un procedimiento ya descrito [Sanz, L. et al. (2002), citado supra]. Para generar los plsmidos pCEP4-MFE-23-NClES~ y pCEP4-B1.8-NClES~, el fragmento de 252 pares de bases (pb) derivado del plsmido pCR3.1-L36-NClES", obtenido por digestin con Notl, se clon en los plsmidos pCEP4-MFE-23 o pCEP4- B 1.8 respectivamente.Transfecciones celulares y purificacin de anticuerpos recombinantesLas clulas HEK-293 y sus clulas derivadas 293T fueron transfectadas con Superfect segn las recomendaciones del fabricante (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Para la obtencin de lneas celulares (transfectantes) estables, las clulas HEK-293 transfectadas con los vectores pCR3.1-L36 y pCR3.1-L36-NClES", respectivamente, se seleccionaron en DCM suplementado con 0,5 mg/ml de neomicina (G418) (Promega). Las clulas HEK-293 transfectadas con los vectores pCEP4-MFE- 23-NClES~ y pCEP4-B1.8-NClES~, respectivamente, se seleccionaron en DCM suplementado con 100 g/ml de higromicina B (Invitrogen). Los sobrenadantes de las poblaciones celulares transfectadas se analizaron para determinar la expresin de protenas por ELISA, SDS-PAGE y transferencia Western utilizando el AcM anti-myc. Los transfectantes estables de las clulas HEK-293 se utilizaron para obtener medio condicionado libre de suero (MCLS) (aproximadamente 1 litro) que fue concentrado (xlO) con un filtro de 10.000 MWCO Vivaflow 50 (Vivascience AG, Hannover, Germany), dializado frente a tampn fosfato salino (PBS) (pH 7,4) y cargado en una columna HisTrap HP de 1 mi utilizando el sistema KTA Prime plus (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Las protenas (anticuerpos) recombinantes purificadas se dializaron frente a PBS, se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no- reductoras, y se almacenaron a -2O0C hasta su uso.Cromatografa analtica de filtracin en gel Los anlisis se realizaron utilizando columnas Superdex 200 10/300GL (GEHealthcare) equilibradas con PBS (pH 7,4) en un equipo KTA FPLC (GE Healthcare). Las muestras (100 l) de protenas recombinantes purificadas, en una concentracin comprendida ente 0,5 y 1,0 mg/ml, se inyectaron en la columna y se eluyeron con una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. La columna se calibr con marcadores de peso molecular que comprendan desde 16 kDa hasta 655 kDa (GE Healthcare). El azul dextrano se utiliz como volumen de exclusin.ELISALa capacidad de reconocimiento y unin de las protenas recombinantes (trmeros de anticuerpos (scFv) - en ocasiones identificadas en esta descripcin como"trimerbodies") purificadas [L36, MFE23 o Bl.8] a laminina-1 murina, CEA humano o conjugados NIPI0-BSA, fue estudiada mediante ELISA [Sanz, L. et al. 2003; EMBO J.,22:1508-17]. La multivalencia de los trimerbodies se estudi mediante ELISA utilizando el sobrenadante de las clulas 293T transfectadas bien con un slo vector (pCR3.1-L36-NClES" o pCEP4-B1.8-NClES~) o bien con 2 vectores (pCR3.1-L36-NC1ES" y pCEP4-B1.8-NClES"). Placas de 96 pocilios Maxisorp (NUNC BrandProducts, Roskilde, Dinamarca) fueron recubiertas con laminina (0,5 g/pocillo) mediante una incubacin de 16 horas a 40C en PBS (10 g/ml); posteriormente, y, despus de lavar las placas con PBS y se bloquearlas con 200 l de PBS-5% de leche en polvo desnatada, y se aadieron 100 l de sobrenadante procedente de clulas 293T transfectadas bien con un slo vector (pCR3.1-L36-NClES" o pCEP4-B1.8-NClES~) o bien con 2 vectores (pCR3.1-L36-NClES" y pCEP4-B1.8-NClES~) durante 1 hora a temperatura ambiente. Al cabo de 3 lavados, se aadieron 100 l de NIPio-BSA (10 g/ml), incubndose durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, tras 3 lavados, se aadieron 100 l del Ac de conejo anti-BSA (1 :1.000) en 0,05% Tween-20- PBS. Tras tres nuevos lavados, se aadieron 100 l del Ac de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo cual, las placas se lavaron y revelaron.Citometra de flujo, deteccin de antgenos en la superficie celularLa expresin de CEA en las lneas tumorales HeLa y HeLaCEA y la unin de los anticuerpos recombinantes (trimerbodies) se analiz siguiendo un protocolo ya descrito[Blanco B et al, (2003). J. Immunol. 171 :1070-1077] mediante inmuno fluorescencia indirecta. Brevemente, las clulas se incubaron con AcM anti-CEA humano (5 g/ml), o con los trimerbodies purificados (anti-NIP o anti-CEA, 10 g/ml) y el AcM 9E10 (4 g/ml) en 100 l durante 45 minutos. Tras lavado, las clulas fueron tratadas con las diluciones apropiadas de Ac de cabra anti-IgG de ratn conjugado con FITC (Sigma-Aldrich). Los estudios se realizaron en un citmetro EPICS XL (Coulter Electronics).Estudios de afinidad mediante resonancia de plasmen superficieTodos los estudios de afinidad mediante resonancia de plasmn de superficie (SPR, del ingls "Surface Plasmon Resonance") se realizaron a temperatura ambiente utilizando un sistema Biacore 3000 (GE Healthcare). Se utilizaron chips sensores de dextrano carboximetilado (CM5) (GE Healthcare) y tampn HBS-EP (HEPES 0,01 M; pH 7,4; NaCl 0,15 M; EDTA 3 mM; Surfactante P20 0,005%) previamente filtrado a travs de un filtro de 0,22 m y desgasificado antes de su uso. Las protenas recombinantes (trimerbodies) se disolvieron en acetato sdico 10 mM (pH 4,5). El conjugado NIPio-BSA se inmoviliz directamente sobre la superficie del chip sensor siguiendo las instrucciones del fabricante en celdas de flujo independiente a, aproximadamente, 100, 1.800 y 8.500 unidades de resonancia (US). La BSA, utilizada como control negativo de la interaccin, se inmoviliz a 1.900 UR sobre la celda de flujo de referencia. Despus de cada experimento, las superficies se regeneraron con HCl 30 mM, permitiendo la vuelta de las seales de resonancia a niveles bsales. Los anlisis se realizaron por duplicado.Para los anlisis cinticos se utiliz una celda de flujo con cantidades pequeas de NIPio-BSA (aproximadamente 100 UR) con el fin de minimizar los efectos de transporte de masa y re-unin. Las muestras individuales, constituidas por scFv o trimerbodies purificados, se pasaron sobre la superficie del chip a una velocidad de flujo de 20 l/minuto y se midieron las velocidades de asociacin/disociacin. Los cambios en el ndice de refraccin se eliminaron mediante la sustraccin de las respuestas de los chips de referencia y la respuesta media de un control negativo se rest a todos los sensogramas. Los resultados cinticos se obtuvieron utilizando el software BIAevaluation v4.1, proporcionado con el biosensor, y los datos cinticos se ajustaron a un modelo de interaccin de Langmuir 1 :1.Modelado comparativo de protenasLa estructura del dominio de unin del anticuerpo L36 en formato scFv (scFv L36) fue modelada mediante modelado comparativo utilizando como molde la estructura 2GHW.B obtenida del Protein Data Bank (PDB) [Berman, H. M. et al. 2000; Nucleic Acids Res. 28:235-42]. La estructura del subdominio de trimerizacin NCl del extremo amino terminal del colgeno XVIII murino fue obtenido a partir de ModBase [Pieper, U. et a l. 2004, Nucleic Acids Res.; 32:D217-22]. Ambos dominios se encuentran unidos por un espaciador de 21 aminocidos para formar un monmero del anticuerpo L36 en formato trimerbody. Las coordenadas de los monmeros restantes se obtuvieron mediante la aplicacin de un eje triple de simetra de rotacin. El modelo del trimerbody L36 se form mediante la suma de las coordenadas de los tres monmeros. La estructura fue optimizada con GROMACS [Van Der Spoel, D. et al. 2005; J. Comput. Chem.; 26:1701-18] y su energa evaluada con DFIRE [Zhou, H. et al. 2002; Prot. Sci., 11 : 2714-26]. Con el objetivo de comparar los valores de DFIRE entre el monmero y el trmero, las energas fueron normalizadas dividindolas por la longitud de la secuencia. Ensayos de estabilidad en presencia de sueroPara determinar si el trimerbody mantena su capacidad funcional en suero, 500 ng de trimerbody L36 purificado se incubaron a 370C, durante 72 horas, con 12,5% de suero murino de ratones BALB/c (Haran Ibrica, Barcelona, Espaa). Se retiraron muestras para su anlisis a las 3 h, 24 h y 72 h contadas desde el comienzo de la incubacin y se congelaron hasta que se complet la totalidad del estudio. Como control, se congel inmediatamente un segundo conjunto de muestras expuestas al suero para representar el tiempo "cero". A continuacin, se analiz la capacidad de los trimerbodies de retener su unin funcional a laminina murina por ELISA.Conjugacin de anticuerpos recombinantes con daina 5 scFv L36 y los trimerbodies purificados se marcaron con el fluorocromo Cianina 5 (Cy5) NHS esteres siguiendo las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). La reaccin de mareaje se realiz a temperatura ambiente durante 30 minutos, aadiendo 200 l de una solucin de Cy5 (2 mg/ml) en dimetilsulfxido (DMSO). Las molculas de Cy5 no unidas se eliminaron mediante cromatografa de exclusin en Sephadex G25- M (columnas PD-IO, GE Healthcare) y se concentraron en un filtro 10.000 MWCO Vivaspin 500 (Vivascience) a aproximadamente 1 mg/ml. La relacin (molar) de Cy5 a anticuerpo (Cy5: anticuerpo), calculada segn el procedimiento descrito por Birchler y col. (Birchler, M. et al. 1999; J. Immunol. Methods; 231 :239-48), era prxima a 1 :1. La funcionalidad de los Acs conjugados con Cy5 fue verificada mediante ELISA frente a los antgenos especficos.Ensayos de localizacin de tumores en ratones portadores con anticuerpos recombinantes mediante imagen molecular - Inmunofotodeteccin infrarroja en ratones portadores de tumoresSe implantaron subcutneamente (s.c.) clulas MKN45, HT 1080 o HeLa (1-2x106) en la regin dorsal de ratones hembra atmicos desnudos nu/nu de 6 semanas Hsd (ratones atmicos Nude-Foxi"" - Haran Ibrica). Las dimensiones de los nodulos se utilizaron para calcular el volumen tumoral utilizando la frmula: (anchura)2 x(longitud) x 0,52. Cuando los tumores alcanzaron un tamao apropiado (0,2-0,4 cm ), se administraron por va intravenosa (i.v.), en la vena de la cola, 100 l de una solucin de anticuerpo recombinante purificado en formato trimerbody marcado con Cy5 en PBS (5 mg/kg). Las imgenes de fluorescencia in vivo se tomaron a diversos tiempos (3, 24 y 48 horas) despus de la administracin i.v. del anticuerpo marcado, con un sistema Hamamatsu dotado de una cmara digital de alta resolucin con dispositivos de cargas acopladas (CCD) ORCA-2BT (Hamamatsu Photonics). Para el anlisis y procesamiento de las imgenes se emple el software Wasabi (Hamamatsu Photonics). Los protocolos utilizados para la manipulacin de animales que a continuacin se detallan, han sido aprobados por el por el Comit de tica Animal del Hospital Universitario Puerta de Hierro.II. RESULTADOSDiseo y expresin de las construcciones trimricas Los anlisis estructurales del dominio NCl del colgeno XVIII murino sugieren que consiste en tres segmentos: un dominio de trimerizacin amino terminal implicado en el autoensamblaje de los homotrmeros; una regin flexible sensible a proteasas; y un dominio compacto carboxiterminal de endostatina (ES) [Sasaki, T. et al. 1998; EMBO J. 17:4249-56]. Los investigadores han demostrado previamente que un Ac recombinante conteniendo el scFv L36 anti-laminina fusionado al dominio amino terminal NC l del colgeno XVIII murino era producido y secretado en forma funcionalmente activa por clulas HEK-293 [Snchez- Ar valo, LV et al. (2006). Int. J. Cncer 119:455-462]. Adems, para proporcionar la suficiente flexibilidad espacial al scFv situado en la regin amino terminal, se insert un conector artificial de 21 aminocidos [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra].La naturaleza trimrica de la protena de fusin scFv-NCl fue demostrada por ultracentrifugacin [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra] y cromatografa analtica de filtracin en gel (Figura IA). La elucin del scFv L36 mediante cromatografa analtica de filtracin en gel pone de manifiesto que es un monmero. La calibracin de la columna segn los marcadores utilizados proporciona un peso molecular de 24,2 kDa, acorde con el terico (26,9 kDa). Por el contrario, la elucin de la fusin scFv L36-NC1 se corresponde con un peso molecular de 109,3 kDa, indicando su naturaleza trimrica (el peso terico del trmero es de 111,4 kDa), acorde con los datos anteriores de ultracentrifugacin [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra]. Este formato de anticuerpo trimrico ha sido designado como "trimerbody".En la presente invencin, se ha ampliado el concepto mediante el diseo de trimerbodies con especificidades diferentes para el hapteno NIP o el CEA humano. Los genes codificantes de los scFvs derivados de los Acs anti-NIP (B 1.8) y anti-CEA humano (MFE23) se ensamblaron de forma similar y se expresaron como protenas solubles en clulas HEK-293 en forma funcionalmente activa. Las protenas recombinantes fueron purificadas mediante columnas de afinidad (IMAC) y el rendimiento de las mismas fue superior al 95%, segn se verific en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Tanto los trimerbodies Bl.8 como MFE-23 eluyeron de la columna con picos nicos (datos no mostrados) comparables a los mostrados en laFigura IA.Estudios de unin a su antgenoLa funcionalidad de los trimerbodies purificados se demostr mediante ELISA frente a los antgenos inmovilizados conjugados NIP-BSA (NIPio-BSA), laminina EHS murina y CEA humano (Figura IB). Su capacidad para detectar a su antgeno en un contexto celular fue investigada mediante el mareaje por inmuno fluorescencia de clulas tumorales humanas que expresan el antgeno CEA en su superficie celular. La fluorescencia se observ tras la incubacin con el trimerbody MFE-23, seguido de reaccin con el AcM anti-myc y deteccin con el Ac de cabra anti-IgG de ratn conjugado con FITC. Por el contrario, la incubacin de clulas que expresan CEA (CEA+) con el trimerbody B 1.8 o la incubacin con clulas HeLa que no expresan CEA (CEA ) con el trimerbody MFE-23 no mostr fluorescencia alguna (Figura IC). Estos resultados indican que los trimerbodies no slo reconocen al antgeno inmovilizado, sino que tambin reconocen el antgeno nativo expresado en la superficie de clulas tumorales.Los ensayos de SPR sirvieron para determinar la influencia del formato de scFv o de trimerbody sobre la funcionalidad del Ac Bl.8. Se compararon las cinticas de unin de cada formato de Ac utilizando tres densidades diferentes del NIPio-BSA inmovilizado sobre la superficie del chip. Se utiliz BSA acoplado a dextrano como referencia de inespecificidad. Para comparar las respuestas de unin durante los procesos de asociacin-disociacin, se inyectaron varias concentraciones de Ac B 1.8 (desde 9 a 1.200 nM para el scFv y de 6 a 800 nM para el trimerbody). Bajo estas condiciones, solo el trimerbody alcanz la saturacin de la superficie del antgeno, mientras que el scFv se uni lentamente y con una disociacin aparente ms rpida. Los sensogramas indican que el trimerbody tiene una mayor capacidad de unin que su versin monovalente (Figura ID).Para los estudios cinticos, se utiliz un chip recubierto con aproximadamente 100 UR de NIPio-BSA. En estos ensayos, el scFv Bl.8 se comport de forma muy diferente al trimerbody Bl.8, con cocientes de asociacin ms lentos y de disociacin ms rpidos. Las constantes cinticas de asociacin (ka) y de disociacin (ka) se determinaron mediante ajuste simultneo utilizando el modelo de interaccin Langmuir 1 :1. Para el scFv B 1.8, las constantes cinticas de asociacin (ka) y de disociacin (ka) aparentes fueron ka: 1,0 x 104 1,7 x 102 M'V1 y kd: 2 x 10~3 4 x 10"5 s"1 (Chi2 = 0,189). Utilizando KD = kd/ka, la constante de disociacin en equilibrio para scFv Bl.8, se estim en 2 x 10"7 M. Dependiendo de la concentracin de Ac utilizado en cada ensayo, el trimerbody inyectado en condiciones de baja densidad de NIPio-BSA inmovilizado podra probablemente unirse de forma mono- y multivalente, e incluso las constantes cinticas de unin aparentes podran incluir efectos de avidez por unin multivalente. Usando un modelo de interaccin 1 :1 en el que las fases de asociacin y disociacin se tratan de forma separada para cada concentracin, se ajustaron los resultados experimentales para la unin de B 1.8 trivalente. Los datos de las curvas con valores de resonancia que se aproximan a Rmax seran prximos a los obtenidos para la unin monovalente. En este caso,