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ANÁLISIS DE EXOMAS PARA EL DIAGNÓSTICO
GENÉTICO DE LA DISCAPACIDAD
INTELECTUAL
Dra. Sara Alvarez
Director Médico NIMGenetics
Zaragoza, 21 de Octubre 2016
1
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
2
1
…..de la definición
al diagnóstico Genético
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
3
Trastornos del Neurodesarrollo: DSM-5
DSM: Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disorders
Discapacidad Intelectual
Trastornos de la comunicacion
Trastornos del Espectro Autista
Trastorno por deficit de atencion con hiperactividad
Trastorno especifico del Aprendizaje
Trastornos Motores
Otros Trastornos del Neurodesarrollo
Definición: Alteraciones o retrasos en el desarrollo del SNC que repercuten
en el funcionamiento personal, social, académico u ocupacional.
Carácter evolutivo-madurativo
Manifestación en la etapa infantil (no exclusivo)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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“La discapacidad intelectual se caracteriza por limitaciones
significativas tanto en funcionamiento intelectualcomo en la conducta
adaptativa. Esta discapacidad aparece antes de los 18 años”
McKenzie, K., Milton, M., Smith, G. et al. Curr Dev Disord Rep (2016) 3: 104.
Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.
Discapacidad Intelectual
Diagnóstico Clínico: CI <70
Presentación Clínica:
• Aislada
• Asociada a otras manifestaciones clínicas:
• Malformaciones congénitas
• Trastornos neurológicos (pej: Trast. del espectro autista o epilepsia)
Severidad: Leve, moderado, grave ó profundo
Incidencia acumulada: 0.62- 1.58 %
Ratio Hombres/Mujeres: 1.2-1.4
Diagnóstico Etiológico: causas exógenas ó genéticas
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Cromosomopatías (pej: Síndrome de Down) - 15% de los casos
Expansión de tripletes (Síndrome X frágil, FMR1) - 0.5%
Deleciones ó duplicaciones de material cromosómico (CNVs) – 10-15%
Determinan la heredabilidad
Su identificación permite:
Establecer el pronóstico
Anticiparse a las complicaciones
Mejor evaluación de las opciones terapeúticas.
Mefford, et al N Engl J Med 2012; 366:733-743
La dificultad en el Diagnóstico Genético de la DI es debido a su
elevada Heterogenicidad
Mutaciones de Gen único
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El desarrollo de Tecnologías de alto rendimiento han elevado a >60% la
rentabilidad diagnóstica global de los estudios genéticos en DI
*Excluyendo el Síndrome de Down
*
Array CGH ( 15-23%)
CNVs en el Genoma
Sanger + FISH ( 6-8%)
Mutaciones en 1 gen
CNVs en 1 gen
Exoma ( 24-33%)
Mutaciones en
> 19.000 genes
Genoma ( 26%) Mutaciones
y CNVs en el genoma
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Rentabilidad Diagnóstica en DI
Gilissen, C.; Nature (2014); 511: 344-347
De Vries et al.
AJMG 2006
De Ligt et al.
NEJM 2012
Array + Exoma + Genoma ~ 60% DX in ID
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Mutaciones de Gen único.
Patron de herencia Ligado a X (≈ 100 genes) – 0.1% (10% en varones)
Patron autosomico Recesivo (≈ 300 genes)
Patrón autosómico Dominante (≈ 300 genes)
ArrayCGH
Secuenciación Masiva
(NGS, Next Generation Sequencing)
Más de 700 genes se han asociado a Discapacidad Intelectual aislada ó
asociada a otras manifestaciones Clínicas
Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.
Solapamiento significativo de los genes implicados en
los trastornos del Neurodesarrollo
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Del genoma al Diagnóstico Genético
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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El 98% del Genoma NO codifica para proteínas ó RNA funcional
>50% elementos Repetitivos
NO “junk DNA”
1.5%
región codificante
8%
elementos
reguladores
En el exoma se localizan el
85% de las alteraciones
asociadas a enfermedades
Mendelianas
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Hoischen, A. et al. Nat. Genet. 43, 729–731
12
Ng, S. B. et al. Nat. Genet. 42, 30–35.
Hoischen, A. et al.. Nat. Genet. 42, 483–485
Ng, S. B. et al. Nat. Genet. 42, 790–793
2009 Primer estudio que
investiga las Mutaciones
“de novo” en la DI
2010 -2011 Dx de DI Sindrómica
Estudios de pocos pacientes
con Clínica común
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Patrones de Herencia y Rentabilidad diagnóstica
.. Autismo, discapacidad intelectual, Retrasos del desarrollo ó del lenguaje.
...Ataxia, convulsiones..
Yaping Yang et al N Engl J Med 2013;369:1502-11.
Rentabilidad diagnóstica superior a la obtenida mediante secuenciación dirigida
a genes únicos (3-15%) ó en paneles de genes seleccionados (13-20%)
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La importancia de las Mutaciones “de Novo” and the novel mutations
Yaping Yang et al N Engl J Med 2013;369:1502-11.
Mutaciones “de novo”: NO aparecen en los progenitores
Nuevas Mutacions: NO aparecen en la literatura, ni en las bases de datos
Clasificación de las variantes:
1º Individuo: Variante de Significado Incierto ó probablemente patogénica
2º Individuo no relacionado: Mutación Patogénica
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Objetivo: Ayudar a los Médicos a entender el porque de los
trastornos del desarrollo de sus pacientes
Participantes: 24 servicios regionales de Genética de UK e
irlanda, junto a investigadores del Wellcome Trust Sanger
Institute
Pacientes: DNA e información clínica de >12,000 adultos y
niños con retrasos del neurodesarrollo (…y de sus padres)
Financiación: Wellcome Trust and the UK Department of
Health - and the Wellcome Trust Sanger Institute, and is
supported by the NHS National Institute for Health Research.
…Continuo desarrollo del conocimiento Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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For patients referred for genetic identification of rare Mendelian disorders:
“Exome testing is a good primary test for cases with unusual presentations
for which no panel is available or for which currently available tests are very
low yield”
“There is no really good targeted panel that gives you a high-yield answer”
Lee H, et al. JAMA. 2014;312:1880-1887
Yang Y, et al. JAMA. 2014;312:1870–1879
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Aplicación Clínica del Estudio
Genético mediante Exomas
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Demanda creciente de exomas en el entorno clínico
0
20
40
60
80
100
120
140
160
EXOMAS RECIBIDOS 2014EXOMAS RECIBIDOS 2015EXOMAS RECIBIDOS 2016
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1.- Permiten analizar simultáneamente múltiples genes incluidos en el diagnóstico
diferencial a un coste y en un tiempo que se acerca al del estudio de un gen único.
2.- Facilitan el análisis de genes previamente no analizados por tecnologías
convencionales
3.- Permiten identificar genes no incluidos en el diagnóstico diferencial. La posibilidad de
“echar la red” es especialmente importante en:
- En enfermedades raras ó con alteraciones en genes de reciente identificación
- En presentaciones clínicas parciales ó atípicas
Las Técnicas de secuenciación masiva aceleran y
simplifican el diagnóstico Genético
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Aplicación de los exomas al diagnóstico Genético
Retos Técnicos:
- Validadación de la Calidad del Ensayo
- Análisis Bionformático
- Validación de los resultados por técnicas alternativas (sanger)
Problemas del Diagnóstico Clínico:
- Pacientes no seleccionados con fenotipos diversos en laboratorios
centralizados.
- El análisis del exoma puede derivar en Hallazgos Incidentales
- Es necesario determinar la aproximación genética para cada caso.
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Todos los estudios deben incluir….
Los tres principios fundamentales antes de solicitar un Exoma:
1.- Árbol o Pedigree familiar, para determinar el patrón de herencia:
• Autosómica dominante
• Autosómica recesiva
• Ligada a X dominante o recesiva
2.- Descripción detallada del fenotipo del paciente
…..Para tener en consideracion las limitaciones del estudio:
• No detecta las repeticiones de tripletes
• No permite el diagnóstico de CNVs ó aneuploidías
• No identifica reordenamientos balanceados
• No detecta alteraciones epigenéticas.
• Coberturas incompletas
3.- Consentimiento Informado
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Pero antes............El consentimiento Informado!!!!!!!
Debe Incluir:
Objetivos, limitaciones y beneficios del estudio
Información relativa a los hallazgos INCIDENTALES no relacionados
con la indicación clínica de la prueba:
oAceptación obligatoria a recibir la información relativa a las patologías
recogidas en la guía de la ACMG que incluyen cardiomiopatías, canalopatías,
ó cáncer hereditario.
oActitud a seguir en el caso de identificar VUS no relacionadas con el
fenotipo de la enfermedad ó variantes patogenicas en heterocigosis en
enfermedades de HAR
Estudios genéticos alternativas
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Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma
(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
Cuantificación y determinación de
la calidad del DNA
Captura de las regiones de interés
Ligación de Adaptadores
Preparación del DNA molde
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Categorización DE MUTACIONES:
Mutaciones Patogénicas
Mutaciones de Significado Incierto (VUS)
Mutaciones probablemente Benignas
Mutaciones Benignas
Filtrados en bases de datos de SNPs
>40.000 Variantes
Filtrado y Clasificación de de variantes NGS
400 a 700 Variantes
Filtrado en función de la Variante:
-Localización
-Efecto en la proteína
-Predictores
-Etc…
Filtrado en función del Fenotipo:
- Historia Clínica Detallada
- Acceso a Bases de datos profesionales
- Bases de datos propias
- Revisión de la literatura
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Aproximación al Diagnótico basado en exomas
Ventaja: Identificación de mutaciones
filtrando en función del patrón de herencia
Desventaja: Precio
Dirigido a la identificación de
mutaciones GERMINALES “de Novo” en en enfermedades genéticas con
presentación clínica variable e inéspecífica y
con elevada heterogenicidad genética.
Indicaciones: Estudio de enfermedades
Mendelianas asociadas a fenotipos complejos
y progresivos
Ventaja: Precio
Desventaja: No permite determinar el
patrón de herencia. No se identifican
variantes en NUEVOS genes.
Dirigido al estudio de múltiples genes
en enfermedades con heterogenicidad
genética, para la identificación de
mutaciones GERMINALES
Indicaciónes: Estudio de
enfermedades Mendelianas con un
diagnóstico preciso.
Análisis de Paneles Dirigidos (secuenciaciónsolo del probando)
Análisis en Trios (secuenciación del paciente y sus progenitores)
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Dos Diferentes Aproximaciones en función del Fenotipo
N genes
Selección de Genes
19.000 genes
Secuenciación Exónica Análisis de Variantes
EXOMA DIRIGIDO
Genes seleccionados
Panel Virtual
>5700 Genes OMIM
Exoma Clínico
Indicación: - Fenotipo bien definido - Enfermedad No progresiva
Indicación: - Fenotipo > complejo y severo - Enfermedad progresiva
EXOMA TRIO
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Motivo de Consulta:
Varón de 5 años con:
retraso del desarrollo psicomotor (en seguimiento desde los 6 meses)
Marcadas esterotipias (TEA?)
EEG, Analítica completa, estudio metabólico Normal
RM cerebral: Atrofia cortico-subcortical. Resto Normal
4 años: Encefalopatía epiléptica progresiva (EEG: Sdr. de Lenox)
Indicación de Estudio genético mediante Exoma Dirigido
Cariotipo
NORMAL
Array de CGH 180K
NORMAL
Secuenciación Exónica con Análisis
Dirigido a Genes de DI y epilepsia
Genes Candidatos a
Estudio:
MECP2 (Cobertura: 95%)
FOXG1 (Cobertura: 81%)
CDKL5 (Cobertura: 97%)
MEF2C (Cobertura: 100%)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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IQSEC2 c.4160_4173delACTTCATCTTCAGC; p.His1387Profs*215
Sanger Validation
IGV visualization
FENOTIPO CLÍNICO:
Retraso mental
Autismo
Hipotonía
Movimientos estereotipados Rett-like
Estrabismo
Microcefalia
Epilepsia.
Gandomi, S.K. et al. J Genet Counsel (2014)
Patrón de Herencia: Ligado a X
¿Consejo Genético?
Variante “de Novo”
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Mutación
“de novo”
19.000 genes 19.000 genes
500 variantes
Enf. Autosómicas recesivas
Dobles heterocigotos Mutación en hemicigosis
Madre Padre
Diferentes Aproximaciones en función del Fenotipo: EXOMA TRIO Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
30 30
Motivo de Consulta:
Varón de 3 años con:
sinostosis craneal
Hipertelorismo
retraso del desarrollo motor y del lenguaje
Indicación de Estudio genético mediante Trios
Cariotipo
NORMAL
Array de CGH
NORMAL
Análisis mutacional de FGFR3
NORMAL
Secuenciación Exónica con Análisis de Tríos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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PACS1:
-Proteína que regula el tráfico a
través de la membrana de Golgi.
-Se expresa durante el desarrollo
embrionario del SNC. Sus niveles
de expresión descienden
significativamente tras el
nacimiento.
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32 Janneke H.M The American Journal of Human Genetics 91, 1122–1127, December 7, 2012
Mutación patogénica
“de novo”
CAUSAL el fenotipo del
paciente
MRD17 Syndrome
“mental retardation, autosomal
dominant 17”
(MIM# 615009).
Incidencia: 6 casos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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Las Respuestas que aporta un diagnóstico Genético.... Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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1 3
5
4
6 7 8
11 13 15 16
Clinical delineation of the PACS1-related syndrome-Report on 19 patients.
Schuurs-Hoeijmakers JH et al. Am J Med Genet A. 2016 Mar;170(3):670-5.
1.Rasgos faciales carácterísticos
2.Retraso del desarrollo motor
3.El 31% de los pacientes TEA
4.Hipotonía en fases precoces del desarrollo.
5.DI leve o moderada con un marcado retraso en el desarrollo del leguaje.
6.Crisis epilépticas en 62% de los casos. Controladas en 100% de los casos con fármacos
7.Problemas de alimentación en el 25% de los casos por alta sensibilidad orofacial.
PACS1 c.607C>T
Síndrome MRD17
(N=19 pacientes)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
3
5
Exoma dirigido (Paneles Virtuales)
Ampliación de Estudio
Diagnóstico
SI NO
Cobertura completa de Genes de Interés
Exoma dirigido
Exoma trio
Exoma clínico
Validación Sanger
Estudios de Segregación familiar (patrón de herencia de la variante)
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N= 40 casos analizados por exoma SIN diagnóstico Genético
Nº de casos diagnosticados tras el reanálisis: 4 (10%)
Wenger AM, et al Genet Med. 2016 Jul 21.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
37 Wenger AM, et al Genet Med. 2016 Jul 21.
Mayor automatización y Desarrollo de bases de datos actualizadas son las bases para asegurar una máxima rentabilidad de los estudios de NGS
Incremento progresivo de la información genética
*HGMD: Database of human gene mutation data
Fenotipos OMIM con base molecular conocida
Fen
oti
po
s O
MIM
Variantes Patogénicas
en HGMD*
Va
rian
tes P
ato
gén
ica
s
> Genes Candidatos confirmados Mejor interpretación de las variantes
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4
Rentabilidad Diagnóstica y económica
del Análisis en Tríos
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Enero, 2014
> 500 casos secuenciados
Octubre, 2016
Exomas dirigidos
370 casos
Analisis de Trios
204 casos
Base de datos de >1000 exomas
Desarrollo de Scripts Bioinformáticos de priorización
Rentabilidad Diagnóstica:
Variantes Diagnósticas (Patogénicas y probablemente patogénicas): 34%
Variantes Probablemente Diagnósticas (VUS): 19%
Casos no
diagnósticados tras
realización de Array
CGH y secuenciación
de genes ó paneles
dirigidos.
NIMGenetics es un CENTRO DE DIAGNÓSTICO ANALÍTICO CON UNIDAD DE
GENÉTICA, autorizado y habilitado para emitir diagnósticos clínicos por la Comunidad de Madrid
(Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Licencia de Actividad Sanitaria con nº de registro CS10673)
ESHG 2015 (50 casos) J. Botet et al PM08.20
ESHG 2016 (130 casos) M. Pena-Vilabelda P08.24
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40 JAMA. 2014;312(18):1880-1887
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0
5
10
15
20
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Diagnóstico DiagnósticoProbable
Diagnóstico DiagnósticoProbable
DI NO SINDRÓMICA (n=32) DI SINDROMICA (n=70)
Cas
os
Homocigotos
Heterocigotas compuestas
Hemicigotas
de novo
Rentabilidad Dx: 18% (6/32) Rentabilidad Dx: 50% (45/70)
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AL MEDICO RESPONSABLE una intervención clínica definida: seguimiento,
tratamientos, procedimientos diagnósticos basados en el conocimiento de la enfermedad
A LOS PADRES les reduce la ansiedad y permite establecer un riesgo de
recurrencia más ajustado para futuros embarazos.
AL PACIENTE una atención médica dirigida con posibilidades de acceso a
nuevos fármacos, evitando procedimientos diagnósticos innecesarios, ofreciendole una
explicación del curso de su enfermedad (pronóstico, riesgos asociados, etc..)
Un diagnóstico de Certeza tiene consecuencias tanto para el
paciente como para sus familias
¿ CUAL ES EL IMPACTO ECONÓMICO AL SISTEMA DE SALUD LA
APLICACIÓN DE ESTAS TECNOLOGÍAS?
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Sarah, E. Soden et al, Sci Transl Med 6, 265ra168 (2014)
Impacto Económico del Diagnóstico Genético
Los estudios previos al estudio genético, incluían:
Analíticas,
Procedimientos radiológios
electromiogramas, estudios
de conducción nerviosa.
Los procedimientos diagnósticos realizados fuera de la institución fueron omitidos
Coste Total
$19,100 por familia
(rango: $3248 a $55,321)
Asumiendo la realización de 2,55 WES por familia (puesto que se habían realizado
tanto casos de exoma dirigido como de tríos) se demostro que este estudio era coste
efectivo dado que suponía un gasto de $2996 por individuo.
Análsisi de 100 familias con 119 niños con trastornos del neurodesarrollo
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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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El diagnóstico mediante Exomas es una herramienta
actualmente disponible en la práctica clínica
Esta aproximación diagnóstica NO es más dificil de manejar que la
situación actual con pacientes sin diagnosticar ó mal diagnósticados
Es actualmente una herramienta diagnóstica disponible, asequible y
rentable.
Permite centrar el diagnóstico evitando la confusión, las pruebas
diagnósticas innecesarias mejorando la calidad de vida del paciente y de su
familia.
Facilita la identificación de genes causales, punto de partida para el
desarrollo de terapias dirigidas.
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Laboratorio de NGS:
Javier Botet
Paolo Maietta
Mº del Mar Peña Vila-Belda
Mónica Martinez García
Irene Díez
Rocío Sánchez
Celia Rodriguez
Marta Carcajona
David Rodríguez
Noelia Sánchez
Gema Benito
… A nuestros Médicos y Genetistas:
Hospital Universitario Quiro n, Madrid
Hospital Universitario de Getafe, Madrid
Hospital Ruber Internacional, Madrid
Hospital Niño Jesus, Madrid
H. Universitario Gregorio Marañón, Madrid
Hospital Clínico San Carlos, Madrid
Hospital Universitario de la Princesa, Madrid
Hospital Miguel Servet, Zaragoza
Cli nica Universidad de Navarra, Pamplona
Hospital Universitario Reina Sofi a, Cordoba
Hospital Universitario Materno Infantil de Canarias, Las Palmas
Centro de Estudios Geneticos de Andaluci a, Granada
Hospital Virgen del Rocío, Sevilla
Complejo Hospitalario Universitario de Albacete
Hospital El Angel, Ma laga
Instituto Neurolo gico Dr. Mateos, Oviedo
Hospital Sant Joan de Deu, Barcelona [email protected]
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