premio selección 2011. albert soler

8/3/2019 Premio Seleccin 2011. Albert Soler

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ESCUELA TCNICASUPERIOR DEINGENIEROS

AGRNOMOS

Anexo 4

Autorizacin del director/a,codirector/a o tutor/a

Datos del trabajo de fin de carrera

Autor: Albert Soler Hernndez DNI: 22584259-F

Ttulo: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMAS BIOLGICASAISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LA COMUNIDAD VALENCIANA

rea o reas de conocimiento a las que corresponde el trabajo: Microbiologa y Medio Ambiente

Titulacin: Ingeniero Agrnomo

A cumplimentar por el director/a, codirector/a o tutor/a del trabajo

Nombre y apellidos: Gonzalo Cuesta Amat

Departamento: Biotecnologa

En calidad de: X director/a codirector/a tutor/a

Autorizo la presentacin del trabajo de fin de carrera cuyos datos figuran en el apartado anterior y certifico

que se adecua plenamente a los requisitos formales, metodolgicos y de contenido exigidos a un trabajo defin de carrera, de acuerdo con la normativa aplicable en la ETSIA.

(Firma)* Gonzalo Cuesta Amat Jose Luis Alonso Molina

Valencia, 21 de Julio de 2008

En el caso de codireccin, han de firmar necesariamente los que sean profesores de esta Escuela; si existe tutor o tutora,tiene que ser ste quien firme esta autorizacin.

DIRECCIN DE LA ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS


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ESCUELA TCNICASUPERIOR DEINGENIEROS

AGRNOMOS

Anexo 5

Ficha resumen del Trabajo Fin deCarrera

Datos personales

Nombre y apellidos: Albert Soler Hernndez

Datos del trabajo de fin de carrera

Ttulo del TFC: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMASBIOLGICAS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LACOMUNIDAD VALENCIANA

Lugar de realizacin: ETSIA, Departamento de Biotecnologa Fecha de lectura: Septiembre 2008

Titulacin: Ingeniero AgrnomoEspecialidad: Recursos Naturales y Medio AmbienteDirector/a: Gonzalo Cuesta AmatCodirector/a: Jose Luis Alonso Molina

ResumenLa formacin de espumas de origen biolgico en la superficie de los reactores y de los clarificadores secundarios

en las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDARs) es uno de los problemas de separacin de slidos msimportantes.

Entre las bacterias responsables de estas espumas se encuentran los actinomicetos nocardioformes que contienencidos miclicos (mycolata) que pertenecen al phylumActinobacteria. Este grupo de microorganismos contiene especies

filamentosas que causan problemas de formacin de espumas biolgicas (foaming) en plantas de tratamiento de aguasresiduales con sistemas de fangos activos. Estas espumas interfieren en el proceso de depuracin de depuracin deaguas residuales, ya que retienen hasta el 40% de los slidos en suspensin. La presencia de especies patgenas en estegrupo de microorganismos implica un riesgo para la salud pblica y, por lo tanto, la necesidad de detectar estas especies.

En el presente trabajo se han investigado varias EDARs de la Comunidad Valenciana para identificar a nivel deespecie las bacterias causantes de estas espumas biolgicas. Para ello se han utilizado cuatro tcnicas: caracterizacinmorfolgica, caracterizacin quimiotaxonmica, caracterizacin genotpica y caracterizacin fenotpica.

En la caracterizacin morfolgica se realiz un estudio micro y macroscpico de los asilados.Para caracterizar quimiotaxonmicamente los asilados se llevaron a cabo tres marcadores quimiotaxonmicos:

extraccin de cidos miclicos, extraccin de los ismeros del cido diaminopimlico y extraccin de los azcarespredominantes de la pared celular.

En la caracterizacin genotpica se llev a cabo la extraccin del DNA de los aislados seleccionados y laamplificacin por PCR del 16S rDNA. Los productos de PCR se purificaron y se enviaron a secuenciar. Las secuencias seanalizaron mediante los programas BLAST, CHROMAS y PHYDIT. Posteriormente se realizaron rboles filogenticos ymatrices de similaridad.

En la caracterizacin fenotpica se realizaron una serie de pruebas para completar los resultados obtenidos. Laspruebas se basaron en tests de tolerancia a diferentes temperaturas, tests de degradacin y tests en donde se hacacrecer a los aislados con diferentes fuentes de carbono y/o nitrgeno.

De los 25 aislados seleccionados el 48% pertenece al gnero Gordonia, el 36% al gnero Tsukamurella, el 8% algnero Dietzia, el 4% al gnero Rhodococcusy el ltimo 4% al gnero Mycobacterium. Todas ellas presentaban cidosmiclicos, forma meso-DAP y arabinosa y galactosa como azcares predominantes.

Con ello demostramos que en las EDARs de la Comunidad Valenciana existe una amplia diversidad de especiesformadoras de espumas biolgicas.

Palabras clave

Fangos activos, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium


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Resum

La formaci de bromeres d'origen biolgic en la superfcie dels reactors i dels clarificadors secundaris en lesestacions Depuradores d'Aiges Residuals (EDARs) s un dels problemes de separaci de slids ms importants.

Entre els bacteris responsables d'estes bromeres es troben els actinomicets nocardioformes que contenen cids

miclics (mycolata) que pertanyen al phylum Actinobacteria. Este grup de microorganismes cont espcies filamentosesque causen problemes de formaci de bromeres biolgiques (foaming) en plantes de tractament d'aiges residuals ambsistemes de fangs actius. Estes bromeres interferixen en el procs de depuraci de depuraci d'aiges residuals, ja queretenen fins al 40% dels slids en suspensi. La presncia d'espcies patgenes en este grup de microorganismes implicaun risc per a la salut pblica i, per tant, la necessitat de detectar estes espcies.

En el present treball s'han investigat diverses EDARs de la Comunitat Valenciana per a identificar a nivell d'espcieels bacteris causants d'estes bromeres biolgiques. Per a aix s'han utilitzat quatre tcniques: caracteritzaci morfolgica,caracteritzaci quimiotaxonmica, caracteritzaci genotpica i caracteritzaci fenotpica.

En la caracteritzaci morfolgica es va realitzar un estudi micro i macroscpic dels allats.Per a caracteritzar quimiotaxonmicament els allats es van dur a terme tres marcadors quimiotaxonmics:

extracci d'cids miclics, extracci dels ismers de l'cid diaminopimlic i extracci dels sucres predominants de la paretcellular.

En la caracteritzaci genotpica es va dur a terme l'extracci del ADN dels allats seleccionats i l'amplificaci perPCR del 16S rDNA. Els productes de PCR es van purificar i es van enviar a seqenciar. Les seqncies es van analitzar per

mitj dels programes BLAST, CHROMAS i PHYDIT. Posteriorment es van realitzar arbres filogentics i matrius desimilaritat.

En la caracteritzaci fenotpica es van realitzar una srie de proves per a completar els resultats obtinguts. Lesproves es van basar en tests de tolerncia a diferents temperatures, tests de degradaci i tests on es feia crixer alsallats amb diferents fonts de carboni i/o nitrogen.

Dels 25 allats seleccionats el 48% pertany al gnere Gordonia, el 36% al gnere Tsukamurella, el 8% al gnereDietzia, el 4% al gnere Rhodococcusi l'ltim 4% al gnere Mycobacterium. Tots ells presentaven cids miclics, formameso-DAP i arabinosa i galactosa com a sucres predominants.

Amb aix demostrem que en les EDARs de la Comunitat Valenciana hi ha una mplia diversitat d'espciesformadores de bromeres biolgiques.

Paraules clau

Fangs actius, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium

AbstractThe formation of thick viscous scums layers in activated sludge tanks and secondary clarifiers of wastewater

treatment plants is one of the most important problems of solid separation.The most significant filamentous bacteria of foaming are nocardioform actinomycetes (mycolata), which belong to

phylum Actinobacteria. That group of microorganisms has filamentous species that causes foaming in wastewatertreatment plants. These foams interfere in that process because retain until 40% of suspension solids. The presence ofpathogen species in that group is a danger to public health.

In this study had been study a lot of wastewater treatment plants of the Comunidad Valenciana to identificate thespecies that causes foaming.

We have been use four procedures: morphologic, chemotaxonomy, genotypic and phenotypic characterization.

In the morphologic characterization we did a micro and macro study of the isolates.In the chemotaxonomy characterization we did micolic acids extraction, DAP extraction and Whole-cell sugar.In the genotypic characterization we did the DNA extraction and PCR amplification of the 16s rDNA. The

sequences were analysed trough BLAST, CHROMAS and PHYDIT programs. Later we did the philogenetic trees and thesimilarity values.

In the phenotypic characterization we did a lot of tests to complete the results (tolerance tests and degradationtests).

48% of isolates belongs to the Gordonagenus, 36% belongs to the Tsukamurellagenus, 8% belongs to theDietziagenus, 4% to the Rhodococcusgenus and the last 4% belongs to the Mycobacterium genus. All of these hadmicolic acids, meso-Dap form and galactose and arabinose.

In conclusion, the results obtained show a great diversity of foaming filamentous bacteria in the EDARs of theComunidad Valenciana with the activated sludge process.

Key words

Activated sludge, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium


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I

NDICE

INTRODUCCIN 1

1.- Depuracin de aguas residuales 1

1.1.- Sistema de fangos activos 1

1.2.- El flculo 2

2.- Problemas en sistemas de fangos activos 2

2.1.-Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking 2

2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming 3

2.2.1.- Microorganismos productores de espumas 42.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas 5

2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de

espumas 6

2.2.4.- Control del foaming 7

3.- Actinomicetos 8

3.1.- Taxonoma 8

3.2.- Clasificacin actual 9

3.3.- Suborden Corynebacterineae 10

3.3.1.- Familia Corynebacterineae 10

3.3.2.- Familia Dietziaceae 10

3.3.3.- Familia Gordoniaceae 10

3.3.3.1.- Gnero Gordonia 11

3.3.3.2.- Gnero Millisia 12

3.3.3.3.- Gnero Skermania 12

3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae 12

3.3.5.- Familia Nocardiaceae 13

3.3.5.1.- Gnero Nocardia 14

3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus 14

3.3.6.- Familia Segniliparaceae 15

3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae 15

3.3.8.- Familia Williamsiaceae 163.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza 16


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II

3.4.1.- Suelo 16

3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces 17

3.4.3.- Aguas residuales 17

4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos 18

4.1.- Aislamiento y recuento 18

4.2.- Identificacin y caracterizacin 19

4.2.1.- Mtodos clsicos 19

4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos 19

4.2.1.2.- Quimiotaxonoma 20

4.2.2.- Mtodos genotpicos 21

4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA 21

4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 22

4.2.3.- Mtodos fenotpicos 23

OBJETIVOS 24

MATERIAL Y MTODOS 25

1.- Cepas bacterianas de referencia 25

2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 26

2.1.- Toma de muestras 26

2.2.- Caracterizacin morfolgica 27

2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica 28

2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos 28

2.3.1.1.- Materiales 28

2.3.1.2.- Metodologa 292.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) 29


2.3.2.2.- Metodologa 30

2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular 31


2.3.3.2.- Metodologa 31

2.4.- Caracterizacin genotpica 32


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III

2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB. 32

2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa 33

2.4.3.- Amplificacin por PCR 34

2.4.4.- Purificacin del DNA 34

2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA 35

2.4.6.- rboles filogenticos 35

2.4.7.- Matrices de similaridad 36

2.5.- Caracterizacin fenotpica 36

2.5.1.- Tests fenotpicos 36

2.5.1.1.- Degradacin 37

2.5.1.1.1.- Esculina 37

2.5.1.1.2.- L- Tirosina 37

2.5.1.2.- Fuente de carbono (1%) 37

2.5.1.2.1.- -L-Ramnosa 37

2.5.1.2.2.- D-Galactosa 37

2.5.1.2.3.- D-Ribosa 38

2.5.1.2.4.- meso-Inositol 38

2.5.1.3.- Fuente de carbono (0,1%) 38

2.5.1.3.1.- cido Benzoico (sal de Na) 38

2.5.1.3.2.- cido ctrico 39

2.5.1.4.- Fuente de carbono y nitrgeno (0,1%) 39

2.5.1.4.1.- L-Prolina 39

2.5.1.5.- Test de tolerancia 39

2.5.1.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas 39

RESULTADOS Y DISCUSIN 40

1.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 40

1.1.- Caracterizacin morfolgica 40

1.2.- Caracterizacin quimiotaxonmica 43

1.3.- Caracterizacin genotpica 47

1.3.1.- rboles filogenticos y matrices de similaridad 49

1.3.1.1.- Gnero Dietzia 49


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IV

1.3.1.2.- Gnero Rhodococcus 52

1.3.1.3.- Gnero Tsukamurella 55

1.3.1.4.- Gnero Gordonia 58

1.4.- Caracterizacin fenotpica 62

CONCLUSIONES 68

BIBLIOGRAFA 69

ANEXOS 75

ANEXO 1: Medios de cultivo 75

ANEXO 2: Reactivos para biologa molecular 77

ANEXO 3: Abreviaturas empleadas 78


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V

NDICE DE TABLAS

Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuenciasde DNA y RNA ribosmico 16S. (Stackebrandt et al., 1997, Kmpferet al., 1999, Stach et al.,2004, Butleret al., 2005, Soddell et al., 2006) 9

Tabla 2: Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios(Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20

Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios con meso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20

Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizados25

Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS 27Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos 34

Tabla 7:Descripcin macroscpica y microscpica de los aislados 40

Tabla 8:Resultados pruebas quimiotaxonmicas de los aislados 44

Tabla 9:Posible identificacin obtenida mediante BLAST de la secuencias del 16S rDNA 48

Tabla 10: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Dietzia 51

Tabla 11: Matriz de similaridad del gen 16S r DNA del gnero Rhodococcus 54

Tabla 12: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Tsukamurella 57

Tabla 13: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Gordonia 60

Tabla 14: Identificacin obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S

rDNA 62

Tabla 15: Resultados test fenotpicos 64

Tabla 15 (continuacin): Resultados test fenotpicos 65


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VI

NDICE DE FIGURAS

Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos 1

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998)21

Figura 3: Dietzia maris (P26) 41

Figura 4: Gordonia amarae (P152) 41

Figura 5: Gordonia malaquae (P175) 41

Figura 6: Rhodococcus ruber(P135) 42

Figura 7: Tsukamurella pseudospumae (N1) 42

Figura 8: Tsukamurella spumae (P166) 42

Figura 9: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados P46p, P48b, P108, P152, P132.Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardiaasteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomycesalbus (CECT 3077) (5) 45Figura 10: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados N1, N4, N5, N9-1, L2.Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardiaasteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomycesalbus (CECT 3077) (5) 45Figura 11: Cromatoplaca de ismeros del DAP. En los extremos se observan los patrones delas formas L-DAP y meso-DAP 46Figura 12: Cromatoplaca de los azcares predominantes. En los extremos se observan lospatrones de Arabinosa y Galactosa 46Figura 13: Comprobacin extraccin DNA. 1: P26; 2: P72; 3:P108; 4: P132; 5: P166; 6: N1; 7:N4; 8: N9-1 47Figura 14: Gel de PCR con los productos de amplificacin del 16S rDNA.1 y 16: Marcador depeso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: P39; 5: P46p; 6:P48b; 7: P54; 8: P72; 9: P108;10: P135; 11: P141; 12: P145; 13: N5; 14: N16-9; 15: N17-4 47Figura 15: rbol filogentico gnero Dietzia 50

Figura 16:rbol filogentico gnero Rhodococcus 53

Figura 17:rbol filogentico gnero Tsukamurella 56

Figura 18:rbol filogentico gnero Gordonia 59

Figura 19: Test Tirosina 66

Figura 20: Test Esculina 66


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INTRODUCCIN

1

1.- Depuracin de aguas residuales

1.1.- Sistema de fangos activos

El sistema de fangos activos es un proceso que se lleva utilizando durante los ltimos 60

aos para la depuracin de aguas residuales. Este proceso surgi a partir de la observacin de

que cualquier agua residual ya sea domstica o industrial, aireada durante un cierto periodo de

tiempo, reduce su contenido en materia orgnica, al mismo tiempo que se forma un fluido con

flculos de bacterias. Esto flculos se encuentran formados por una poblacin muy heterognea

de microorganismos. (Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999).

Los fangos activos constituyen una mezcla de microorganismos, en su mayora bacterias

hetertrofas, que transforman la materia orgnica biodegradable hasta formas ms simples y

estables. Consiste en un tratamiento aerbico que oxida la materia orgnica hasta CO2, NH3 y

H2O y forma nueva biomasa celular. La biomasa celular obtenida forma flculos que sedimentan

en el tanque de clarificacin o sedimentacin. Este procedimiento se utiliza a escala mundial

como tratamiento biolgico secundario para el tratamiento de aguas residuales domsticas

(Bitton, 1999). Parte de los fangos recogidos en el sedimentador secundario se recirculan alreactor y son los que contienen los microorganismos que llevan a cabo la depuracin biolgica.

(Metcalf y Hed, 2000). (Ver figura 1).

1.2.- El flculo

Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos


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INTRODUCCIN

2

El flculo est formado por la unin de microorganismos, partculas orgnicas e

inorgnicas, teniendo un tamao que oscila entre 1 y 1000 m. Para que el proceso de

depuracin sea llevado con xito es necesaria la formacin de un flculo adecuado de

microorganismos en el tanque de aireacin. Con ello se permite la separacin de los slidos en

suspensin en el tanque de sedimentacin producindose un sobrenadante fluido y claro. A su

vez, parte de estos slidos que contienen los flculos son recirculados al tanque de aireacin

para as aumentar el nivel de actividad microbiana (Soddell y Seviour, 1990).

Las bacterias filamentosas juegan un papel importante ya que gracias a ellas el flculo

adquiere consistencia con lo que se pueden formar flculos de mayor tamao y ms compactos

que resisten mucho mejor las turbulencias del sistema de agitacin. Tambin ayudan a capturar

y mantener atrapadas pequeas partculas durante la sedimentacin (Kerley y Forster, 1995).

Si no existieran bacterias filamentosas o stas estuvieran en una proporcin muy baja se

formaran flculos llamados flculos en punta de alfiler, los cuales son de pequeo tamao y de

consistencia muy dbil con lo que el sistema de aireacin los disgregara, adems la

sedimentacin no se producira correctamente con lo que se originara un sobrenadante turbio

con muchos slidos en suspensin. En cambio, si hubiera un crecimiento excesivo de

microorganismos filamentosos se producira un aumento de volumen de los slidos

sedimentados por compactacin defectuosa denominado bulking (Bitton, 1999). Si por el

contrario se produce un crecimiento excesivo de actinomicetos nocardioformes que contienen

cidos miclicos (mycolata) se produce la formacin de espumas biolgicas, fenmeno conocido

como foaming (Seviour y Blackall, 1998).

2.- Problemas en sistemas de fangos activos

2.1.- Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking

Este fenmeno se produce por el crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos

no mycolata en el lquido de mezcla. Su presencia provoca que los flculos biolgicos del reactor

sean voluminosos y poco consistentes. Estos flculos no sedimentan bien y suelen ser


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INTRODUCCIN

3

arrastrados en grandes cantidades en el efluente de los tanques de sedimentacin con el

consiguiente problema que comporta (Chi Nam Seong et al., 1999).

2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming

Se produce cuando hay un crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos que

contienen cidos miclicos y a Microthrix parvicella(Goodfellow et al., 1996). Aunque pueden

existir otros tipos de espumas producidas por tensioactivos de lenta degradacin (Jenkins et al.,

1993) las espumas producidas por mycolata son espesas, viscosas y muy estables. De todos los

microorganismos que pueden producir el foaming los mycolata son los ms problemticos ya que

las espumas que originan son de gran consistencia y su eliminacin es difcil sin que se altere la

calidad del efluente.

La primera vez que se describi la formacin de estas espumas fue en el ao 1969. En

el mismo se realiz un estudio en donde se describe el llamado misterio de Milwaukee, por ser

sta la localidad en donde se observaron por primera vez estas espumas que contenan gran

cantidad de actinomicetos ramificados Gram-positivos. Estas bacterias fueron posteriormente

identificadas como pertenecientes al gnero Nocardia, concretamente N. amarae y N.

rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas espumas se les empez a

conocer como Nocardia foams (Jenkins et al., 1993). Posteriormente esta especie fue

transferida al gnero Gordonia como G. amarae (Klate, 1994). Sin embargo actualmente este

trmino hace referencia al problema de espumas producidas por mycolata, ya que otros

microorganismos tambin pueden causar este problema, entre ellos Rhodococcus, y

Tsukamurella (Nam et al., 2003).

La aparicin de espumas causa una serie de problemas (Seviour y Blackall, 1998):

Las espumas pueden llegar a tener ms de un metro de espesor y, por tanto, desbordarse enlas pasarelas y reas circundantes donde se originan peligrosas zonas resbaladizas.

Se pierden gran cantidad de slidos sedimentables, ya que las espumas pueden retener msdel 40% de los slidos en suspensin.

Son las responsables de la disminucin de oxgeno transferido a la superficie de los tanquesaireados mecnicamente.


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INTRODUCCIN

4

Los sistemas de eliminacin de espumas pueden verse bloqueados y stas pueden entrar enalgunos casos en el tanque de sedimentacin, reduciendo as la calidad del efluente.

La espuma puede congelarse en climas fros o pudrirse en climas clidos.La espuma puede introducirse en los digestores anaerobios y ocasionar tambin problemas defoaming.

Los aerosoles de los organismos formadores de espumas constituyen un peligro potencial parala salud (Goodfellow et al., 1998). Algunos organismos hallados en las espumas son

patgenos oportunistas, tales comoNocardia asteroides y Rhodococcus equi(Prescott, 1991).

2.2.1.- Microorganismos productores de espumas

Antes de los 80s, los nicos microorganismos reconocidos como formadores deespumas eran los actinomicetos nocardioformes aunque actualmente se conocen otros tipos de

microorganismos filamentosos productores de espumas como Microthrix parvicella(Blackall et

al., 1994; Blackall et al., 1996). Los mycolata son la causa ms importante de foaming en

Australia, Sudfrica, Los Pases Bajos o Francia. En EE.UU., Nocardia (Gordonia) es la bacteria

filamentosa cuya presencia es ms comn en fangos activos y la mayora de espumas biolgicas

estn producidas por este gnero, sin embargo, estudios recientes en otros pases indican que la

situacin es ms compleja (Jenkins et al., 2003). En Espaa, este problema esta poco estudiado

ya que no existen estudios detallados que muestren la diversidad de los productores de

espumas.

Los microorganismos dominantes identificados por microscopa en espumas de fangos

activos son:

Gordonia amarae (GALO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, al gneroGordonia. Fue transferida desde el gnero Nocardia a este gnero (Klate, 1994) por sus

propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del 16S rRNA. Desde su primera

descripcin como N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en

gran cantidad de plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los

mycolata ms frecuentes implicados en problemas de espumas biolgicas.

Nocardia sp. (NALO / GALO): perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de sta, algnero Nocardia. Debido a que durante 20 aos el principal productor de espumas biolgicas

era conocido como N. amarae y debido a su similitud morfolgica todava existe la tendencia

de llamar a estas bacterias NALO (Nocardia amarae-Like Organism).Su abundancia provoca


16/89

INTRODUCCIN

5

disgregacin flocular y presentan una cubierta crea que forma una suspensin en medio

lquido, ya que atrapan burbujas de aire, que causa la aparicin de espumas densas en el

sobrenadante clarificado. Su abundancia est asociada a bajas cargas msicas, alta edad del

fango y altas temperaturas.

Skermania piniformis (PTLO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, algnero Skermania. Es la nica especie con morfologa lo suficientemente caracterstica como

para identificarla correctamente. Originariamente se llamaba PTLO (Pine Tree Like

Organism) porque sus ramificaciones se asemejan a las hojas de un pino (Eales et al., 2003 y

Ramrez et al., 2005).

Rhodococcus: perteneciente a la familia Nocardiaceae. Cocos Gram-positivos que producenespumas no filamentosas en diversas plantas de fangos activados australianas.

Microthrix parvicella: es muy frecuente en plantas de Europa, Australia y Sudfrica, peromenos frecuente de EE.UU. Su ubicacin taxonmica no est clara todava aunque su

secuencia de 16S rDNA indica un parentesco con los actinomicetos (Blackall et al., 1994).

Aunque los principales actinomicetos formadores de espumas como Gordonia amarae y

S. piniformis no son conocidos como patgenos otros, como N. asteroides, R. equi y T.

paurometabolum, pueden causar enfermedades, particularmente en pacientes que usan

medicacin inmunodepresiva o infectados por el virus VIH (Castelli et al., 1994). Las

micobacterias, tambin detectadas en fangos activos aunque no causantes de espumas, pueden

representar un serio peligro potencial para la salud (Dailloux et al., 1999). Adems, el personal

de la planta se encuentra expuesto a los aerosoles producidos por los nocardioformes que son

potencialmente patgenos y cuya ruta de infeccin es probablemente la inhalacin (Goodfellow,

1992).

2.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas

La formacin de una espuma biolgica estable y viscosa en los tanques de aireacin en

las plantas de tratamiento de aguas residuales implica el enriquecimiento selectivo de los

organismos en el licor de mezcla mediante un proceso de flotacin (Seviour y Blackall, 1998) y

resulta de la combinacin de elementos relacionados con la flotacin de los microorganismos y

mecanismos para estabilizar la espuma producida.


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INTRODUCCIN

6

Para que se originen estas espumas biolgicas es necesaria la presencia conjunta de

burbujas de aire, partculas hidrofbicas. Estos componentes estn presentes en la mayora de

plantas de fangos activos con problemas de espumas. Las burbujas de aire son producidas por

el sistema de aireacin y retenidas por la matriz de bacterias filamentosas. Las partculas

hidrofbicas ms importantes en espumas biolgicas son los cidos miclicos contenidos en la

pared celular de los mycolata.

2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de

espumas

Requisitos nutricionales: diversos estudios taxonmicos han demostrado que losmycolata son capaces de utilizar un amplio rango de sustratos que va desde los azcares

simples hasta componentes orgnicos complejos, lpidos complejos, esteroides, fenoles (Klatte

et al., 1994). Los gneros Rhodococcus y Gordonia, son extremadamente verstiles en su

capacidad para degradar sustratos complejos derivados de hidrocarburos (Kmpferet al., 1995).

Requisitos de oxgeno: los mycolata son aerobios estrictos y por ello no crecen si eloxgeno no se encuentra presente (Goodfellow, 1992). Esto no significa necesariamente que

algunos mycolata no sean capaces de metabolizar bajo condiciones anaerobias, como ciertas

especies de Rhodococcus que pueden metabolizar anaerbicamente clorofenoles (Uotila et al.,

1992).

Temperatura: en climas clidos es ms probable la aparicin de mycolata formadoresde espumas (Eikelboom, 1994). Los mycolata crecen en un amplio rango de temperaturas.

Algunos, principalmente Rhodococcus, crecen a temperaturas de 5 C, mientras que la

temperatura mnima de crecimiento para G. amarae es de 15 C o superiores. La temperaturaptima de estos microorganismos es de 25 C, mientras que las temperaturas mximas de

crecimiento son, al igual que las mnimas, muy variadas, algunos no pueden crecer con

temperaturas de 30 C o superiores y, sin embargo, otros lo hacen a ms de 40 C.

pH: el pH en el licor de mezcla influye de forma importante en el crecimiento de losfilamentos. Se ha determinado que los niveles de pH recomendados para el desarrollo de los

mycolata se encuentran entre 6 y 8, aunque dejan de crecer a pH superior a 8. Especies de


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INTRODUCCIN

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Rhodococcus,Gordonia y Tsukamurella crecen a pH alcalinos superiores a 9 (Goodfellow et al.,

1991).

2.2.4.- Control del foaming

La formacin de espumas en los sistemas de fangos activos tiene lugar en muchas

plantas de tratamiento, las cuales difieren unas de otras en sus parmetros operacionales. La

temperatura, los mtodos de aireacin, la edad del fango, el nivel de slidos, etc. pueden

determinar qu microorganismos crecen particularmente en una planta, y resulta pues difcil

determinar los factores especficos que favorezcan el crecimiento de las grandes cantidades de

organismos formadores de espumas. Las medidas comnmente empleadas son:

Manipulacin de la edad del fango: debido a que los actinomicetos son consideradosmicroorganismos de lento crecimiento, una reduccin en la edad del fango eliminara al

organismo del sistema. Sin embargo, sta no resulta ser una medida totalmente efectiva ya que

los organismos nocardioformes difieren en la velocidad de crecimiento. Aunque esta medida

controle el problema en situaciones adversas, la calidad del efluente se ve afectada (Seviour y

Blackall, 1998).

Cloracin: la cloracin es normalmente utilizada como un mtodo de control noespecfico para los problemas de bulking y tambin se emplea en el control de espumas, aunque

hoy en da se cree que perjudica a los flculos que contienen los mycolata. Un uso ms efectivo

de la cloracin en el control de espumas originadas por Gordonia reside en su aplicacin en

spray directamente sobre la espuma en el tanque de aireacin (Jenkins et al., 1993).

Uso de selectores: se basa en la manipulacin del crecimiento del filamento a travs deuna zona de seleccin previa al tanque de aireacin. En esta zona se crea un ambiente

anaerbico donde los aireadores dejan de funcionar durante determinados periodos de tiempo,

favorecindose as el crecimiento de bacterias formadoras de flculos a expensas de los

mycolata (Seviour y Blackall, 1998).

Eliminacin fsica: existen varias tcnicas de eliminacin fsica utilizadas para controlarel foaming que incluyen desde la eliminacin mecnica de la capa superficial del licor de mezcla(Pagilla et al., 1996).


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INTRODUCCIN

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3.- Actinomicetos

Los actinomicetos forman un grupo de microorganismos morfolgicamente muy

heterogneo, pertenecientes al dominio Bacteria, formado por bacterias generalmente aerobias,Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Muchos de ellos forman filamentos ramificados o

hifas y esporas asexuales. Su diversidad morfolgica es considerable, desde formas bacilares

hasta formas filamentosas ramificadas. Dos de las propiedades ms significativas de los

actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos que no pueden

ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar

numerosos metabolitos bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable

del metabolismo celular de este grupo microbiano (Goodfellow et al., 1997).

El inters por los actinomicetos comenz a raz del descubrimiento de la capacidad de

estos microorganismos para producir antibiticos. Aunque la bsqueda de compuestos

bioactivos sigue en auge, el inters por los actinomicetos se ha diversificado y actualmente

ocupa reas muy variadas. Pueden ser patgenos de plantas, de animales, de humanos,

descomponer productos del caucho, crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones

depuradoras de aguas residuales causan espumas densas que llegan a obstruir las

instalaciones. Por la diversidad de hbitats que pueden colonizar este grupo de microorganismos

tiene un enorme inters ecolgico (June et al., 1999).

3.1.- Taxonoma

La taxonoma de los actinomicetos ha evolucionado considerablemente durante las

ltimas dcadas al mismo tiempo que se ha incrementado el nmero de gneros. Los

actinomicetos nocardioformes aparecen descritos por H. A. Lechevalier en la Seccin 26 de la 1

edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Williams et al., 1989). En esta edicin

se describen once gneros de nocardioformes de los cuales slo Nocardia y Rhodococcus

contienen cidos miclicos. En la 9 edicin del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology

(Holt et al., 1994) los actinomicetos nocardioformes estn incluidos en el Grupo 22, el cul est

dividido en 4 subgrupos. El subgrupo 1 rene los actinomicetos que contienen cidos miclicos

(mycolata).


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INTRODUCCIN

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3.2.- Clasificacin actual

Desde hace algn tiempo se ha observado que las secciones del Volumen 4 del

Bergeys Manual of Systematic Bacteriology de 1989 no son homogneas y que no coincidencon los datos de la secuencia del 16S rRNA. Con el fin de corregir este problema se realiz una

propuesta para una nueva clasificacin jerrquica basada en el estudio filogentico de las

secuencias del 16S rRNA. En 1997 se propone la clase Actinobacteria (Stackebrandt et al.,

1997) compuesta por los actinomicetos y sus parientes filogenticos con un alto contenido en

G+C. Contiene cinco subclases de las cuales la ms extensa es Actinobacteridae, compuesta a

su vez por dos rdenes; Actinomycetales y Bifidobacteriales. Los gneros incluidos en estetrabajo estn en el orden de Actinomycetales , que se divide en 10 subrdenes. El suborden

Corynebacterineae engloba a 8 familias, de las que parte estudiaremos en el presente trabajo,

conteniendo todos ellos cidos miclicos (tabla 1).

Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuenciasde DNA y RNA ribosmico 16S.(Stackebrandt et al., 1997, Kmpferet al., 1999, Stach et al.,

2004, Butleret al., 2005, Soddell et al., 2006)

Suborden Familia Gnero

Corynebacteriaceae Corynebacterium

Dietziaceae Dietzia

Gordonia

Gordoniaceae Millisia

Skermania

Corynebacterineae Mycobacteriaceae Mycobacterium

Nocardiaceae Nocardia

Rhodococcus

Segniliparaceae Segniliparus

Tsukamurellaceae Tsukamurella

Williamsiaceae Williamsia

La segunda edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology(Boone et al., 2001)

recoge la clasificacin actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum.

Dentro del phylum se reconoce una nica clase, Actinobacteria, que mantiene la estructura

jerrquica propuesta por Stackebrandt et al., (1997).


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INTRODUCCIN

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3.3.- Suborden Corynebacterineae

Este suborden se compone de 8 familias: Corynebacteriaceae, Dietziaceae,

Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Segniliparaceae, Tsukamurellaceae yWilliamsiaceae (Euzby, J. P.).

3.3.1.- Familia Corynebacterineae

Es la familia tipo del suborden Corynebacterineae. Contiene un nico gnero,

Corynebacterium (Stackebrandt et al., 1997).Corynebacterium est incluido en el grupo 20 del

Bergeys Manual of Determinative Bacteriology(Holt et al., 1994).

El gnero Corynebacterium contiene bacilos rectos o levemente curvados, aerobios y

anaerobios facultativos, catalasa positivos, a menudo de extremos afilados. Se suelen observar

formas en maza. Las corinobacterias poseen un quimiotipo de pared celular tipo IV (cido meso-

diaminopimlico, arabinosa y galactosa). Contienen cidos miclicos de 22-36 tomos de

carbono (Collins y Cummins, 1986).

3.3.2.- Familia Dietziaceae

Solamente posee un nico gnero, Dietzia. Este gnero apareci como resultado de la

reclasificacin de Rhodococcus maris a Dietzia maris basndose en la secuencia del 16S rRNA

(Rainey et al., 1995). El gnero Dietzia est constituido por cocobacilos, Gram-positivos, catalasa

positivos, aerobios y no formadores de esporas. La pared celular contiene cido meso-

diaminopimlico y los azcares que predominan son la galactosa y la arabinosa (quimiotipo de

pared celular IV). Contiene cidos miclicos de 34-38 tomos de carbono. Su contenido en G+C

expresado en mol% es del 73% (Rainey et al., 1995). Actualmente se conocen seis especies

vlidas descritas de este gnero (Euzby, J. P.).

3.3.3.- Familia Gordoniaceae

En la publicacin de Stackebrandt et al. (1997) esta familia contena un nico gnero,

Gordonia, ubicado en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del


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INTRODUCCIN

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Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). En la edicin del Bergeys

Taxonomic Outline de 2002 esta familia incluye el gnero Skermania y el gnero Millisia.

3.3.3.1.- Gnero Gordonia

Originariamente, este gnero fue propuesto por Tsukamura en 1971 para algunos

actinomicetos dbilmente cido-alcohol resistente aislados del suelo y de esputos de pacientes

con enfermedades pulmonares. Las tres especies originales G. bronchialis, G. rubropertincta y

G. terrae fueron trasferidas en 1977 por Goodfellow y Alderson al gnero Rhodococcus

desapareciendo como tal el gnero Gordonia. Posteriormente, el descubrimiento de que en el

gnero Rhodococcus existan dos grupos filogenticamente distintos segn el anlisis de la

secuencia del 16S rRNA condujo a Stackebrandt et al. (1988) a recuperar el gnero Gordonia.

Actualmente existen 25 especies de Gordonia vlidamente descritas y al menos dos en

proceso de clasificacin (Euzby, J. P.). Gordonia amarae fue transferida desde el gnero

Nocardia a este gnero en base a sus propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del

16S rRNA (Klate et al., 1994, Goodfelllow et al., 1994). Desde su primera descripcin como N.

amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en gran cantidad de

plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata ms

frecuentemente implicados en problemas de espumas biolgicas(Iwahori et al., 2001).

El gnero incluye pequeos bacilos y formas cocceas, pueden formar hifas con

ramificaciones en ngulo recto, son aerobios, Gram-positivos o Gram-variable, catalasa positivos

y normalmente parcialmente cido-alcohol resistentes. Forman colonias marronceas, rosas,

naranjas o rojas cuyas clulas se encuentran en algunos casos formando agregados. La pared

celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son galactosa yarabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 48-66 tomos de carbono

(Arenskteret al., 2004).

El gnero Gordonia ha sido considerado como patgeno oportunista aislado de esputos

de pacientes con afecciones pulmonares como G. sputiy G. bronchialis (Tsukamura, 1982). La

etimologa del gnero fue corregida por Stackebrandt en 1997 quedando como Gordonia y no

Gordona (Stackebrandt et al., 1997).


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INTRODUCCIN

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3.3.3.2.- Gnero Millisia

Este gnero fue propuesto por Soddell et al. en 2006 y fue aislado de espumas

procedentes de plantas de fangos activados. Actualmente la nica especie de este gnero es,

Millisia brevis. Est constituido por bacilos con ramificaciones en ngulo recto, aerobios, Gram-

positivos o Gram-variables, cido-alcohol resistentes, catalasa positivos y con grnulos de

polifosfato. Forman colonias rosceo-asalmonadas, irregulares y con escasos filamentos. La

pared celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son

galactosa y arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 44-52 tomos

de carbono. Su contenido en G+C expresado en mol% es del 64,7%

3.3.3.3.- Gnero Skermania

Nocardia pinensis fue propuesta como una de las principales especies de actinomicetos

que ocasionan espumas en las superficies de los tanques de aireacin de las plantas de

tratamiento de aguas residuales de Australia (Blackall et al., 1989). La secuencia completa del

16S rDNA y la estructura de los cidos miclicos representativos de los mycolata ha sido

determinante para clarificar la posicin taxonmica de esta especie, ya que pone de manifiesto el

error al clasificarla en el gnero Nocardia, a pesar de estar relacionada filogenticamente con las

distintas familias que integran la clase Actinobacteria. En base al estudio realizado por Chun et

al. (1997), Nocardia pinensis fue reclasificada como un gnero nuevo dentro de la familia

Nocardiaceae, renombrndose como Skermania piniformis,la nica especie del gnero.

El gnero Skermania lo componen bacterias filamentosas Gram-positivas, no cido-

alcohol resistentes con un metabolismo oxidativo y catalasa, oxidasa y ureasa positivos. Los

componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Elnmero de tomos de carbono de sus cidos miclicos oscila entre 58 y 64, y su DNA tiene un

porcentaje muy alto en G+C (Chun et al., 1997).

3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae

Contiene solamente el gnero Mycobacterium del cual se han contabilizado 95 especies

en la edicin del Bergeys Taxonomic Outline de 2002. Mycobacterium est compuesto porbacilos ligeramente curvos o rectos, que a veces se ramifican o forman filamentos que se


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INTRODUCCIN

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3.3.5.1.- Gnero Nocardia

La primera Nocardia fue aislada en 1888 por el veterinario y bacterilogo francs

Edmond Nocard y fue caracterizada un ao despus por Trevisan, el cual le dio el nombre de

Nocardia farcinica.Desde la transferencia de N. amarae al gnero Gordonia como G. amarae

(Goodfellow et al., 1994) y de N. pinensis al gnero Skermania como S. piniformis (Chun et al.,

1997)el gnero Nocardia ha quedado como un taxn homogneo. El gnero Nocardia contiene

71 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Se ha demostrado que una de estas

especies, N. farcinica, es una de las responsables de formacin de espumas en plantas de

fangos activos (Stratton et al., 1996).

Son aerobios, catalasa positivos, parcialmente cido-alcohol resistentes, Gram-positivas

o Gram-variables. Forman un micelio areo, aunque nicamente visible al microscopio, que se

eleva por encima del agar, donde ocasionalmente se pueden encontrar conidios. Las hifas del

micelio del sustrato adquieren unas dimensiones de 0.5-1,2 m de dimetro y la principal

caracterstica morfolgica de este gnero es la tendencia a fragmentarse con facilidad en bacilos

y elementos cocoides. Las hifas forman ramificaciones caractersticas en ngulo recto. Las

colonias tienen un aspecto aterciopelado o calcreo y pueden ser marrones, rosas, rojas,

naranjas, prpuras, grises o blancas y, adems, pueden producir pigmentos solubles de color

marrn o amarillo. Los componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP,

arabinosa y galactosa. Contienen cidos miclicos de 44-60 tomos de carbono y su contenido

en G+C expresado en mol% es del 64-72%.

3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus

El gnero Rhodococcus abarca actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasapositivos y parcialmente cido-alcohol resistentes en alguno de sus estados de crecimiento. Son

coco-bacilos que pueden formar micelio de sustrato que da lugar a la aparicin de extensas

hifas, mientras que tan slo en algunas especies es caracterstico un micelio areo visible al

microscopio. Las colonias de Rhodococcus pueden ser aterciopeladas, rugosas o mucosas, de

color rojo, naranja, amarillo o crema. Los componentes mayoritarios del peptidoglicano de la

pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Contiene cidos miclicos de 32-66

tomos de carbono y su contenido en G+C expresado en mol% es del 73%.


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INTRODUCCIN

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El hbitat de Rhodococcus es muy amplio y frecuentemente es aislado de suelos,

medios acuticos y excrementos de animales herbvoros. Existen 29 especies de Rhodococcus

vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Algunas especies como R. equi son patgenos para

hombres y animales. Otras especies tienen inters medioambiental ya que son capaces de

degradar herbicidas y otros compuestos (Finnerty, 1992, Briglia et al., 1996).

3.3.6.- Familia Segniliparaceae

Esta familia est integrada por un nico gnero, Segniliparus y actualmente contiene

nicamente do especies validadas, Segniliparus rotundus y Segniliparus rugosus.

Estas bacterias estn caracterizadas por tener forma bacilar. Producen colonias no

pigmentadas (de blancas a beiges), lisas o arrugadas. Su contenido en G+C se encuentra

comprendido entre un 68 y un 72 mol%. La pared celular contiene cido meso-DAP y cidos

miclicos (Butleret al., 2005).

3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae

Aparece en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del

Bergeys Manual of Determinative Bacteriology de 1994. Est integrada por un nico gnero,

Tsukamurella, el cul fue introducido en 1988 para acomodar dos organismos previamente

clasificados como Corynebacterium paurometabolum y Rhodococcus auranticus y reducirlos a

una sola especie T. paurometabola mediante el anlisis de la secuencia del 16S rRNA (Collins et

al., 1988). Actualmente el gnero contiene 8 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.).

El gnero incluye actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa positivos, dbilmentecido-alcohol resistentes y de forma bacilar, que pueden observarse solos, en parejas o en

masa. Tambin pueden aparecer elementos cocobacilares. Forman colonias convexas que son

secas pero ligeramente emulsificables y cuyos colores van desde el blanco o crema hasta el

naranja. El componente mayoritario del peptidoglucano es el cido meso-DAP, galactosa y

arabinosa. La envoltura celular posee cidos miclicos de 62-78 tomos de carbono y su

contenido en G+C expresado en mol% es del 68%. Han sido aisladas mayoritariamente del suelo

y de esputos humanos. La especie T. spumae ha sido aislada en espumas de fangos activos(Nam et al., 2003) al igual que la especie T. pseudospumae (Nam et al., 2004).


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3.3.8.- FamiliaWilliamsiaceae

Esta nueva familia se describi en 1999 con un gnero nuevo, Williamsia, aislado de las

paredes de una guardera en Finlandia. Est formada por un nico gnero y dos especies

Williamsia muralis y W. maris (Stach et al., 2004).Los componentes mayoritarios de la pared

celular son el cido meso-DAP, arabinosa, galactosa, manosa y ribosa. El nmero de tomos de

carbono de sus cidos miclicos oscila entre 50 y 56. La secuencia del 16S rDNA indica que

representa un taxn dentro del suborden Corynebacterineae. Aunque las propiedades

morfolgicas y quimiotaxonmicas son parecidas a las del gnero Gordonia, pueden ser

diferenciadas por la secuencia del 16S rRNA y la longitud de las cadenas de cidos miclicos

(Kmpfer et al., 1999). Este taxn es reconocido como familia en la edicin del Bergeys

Taxonomic Outline (2002).

3.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza

Los actinomicetos son microorganismos muy extendidos que se encuentran sobre todos

los sustratos naturales corrientes. Aunque las primeras cepas de actinomicetos fueron aisladas

de fuentes humanas y animales por Cohn en 1875 y Nocard en 1888, respectivamente, el mayor

reservorio de actinomicetos es el suelo, y a partir de aqu estos pueden invadir numerosos

biotopos. Otra ubicacin importante es el medio acutico: medios marinos, aguas dulces y aguas

residuales. (Williams et al., 1989).

3.4.1.- Suelo

Los actinomicetos estn presentes en todo tipo de suelos tanto en las capas ms

superficiales como en horizontes profundos disminuyendo su concentracin con la profundidad.

Suelen ser el segundo grupo de microorganismos ms abundantes en el suelo, despus de las

bacterias no actinomicetos. Los actinomicetos comienzan su actividad cuando las bacterias y los

hongos no pueden descomponer las molculas ms complejas que quedan en el suelo. Utilizan

como fuente de carbono compuestos simples y muy complejos tales como cidos orgnicos,

azcares, polisacridos, lpidos, protenas e hidrocarburos alifticos. Muchos pueden degradar

protenas, lpidos, almidn y quitina.


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Estos microorganismos participan en muchos procesos del suelo, tales como la

descomposicin de los compuestos ms resistentes procedentes de plantas y animales,

formacin de humus, fermentacin del compost, causantes de fitopatologas, infecciones en

animales y humanos y simbiosis con plantas.

3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces

Hay mucha controversia acerca de la poblacin de actinomicetos en medios marinos ya

que mientras unos afirman que las cepas de estos microorganismos slo seran formas terrcolas

adaptadas al medio marino, otros aseveran que son una flora propia de medio acutico. Los

actinomicetos estn bien representados en este medio de donde se pueden aislar fcilmente

cepas de Micromonospora, Actinoplanes y Streptosporangium. Estos estn presentes en

sedimentos fluviales o lacustres donde juegan un papel importante en la descomposicin de los

restos vegetales (Stach et al., 2003).

3.4.3.- Aguas residuales

Los actinomicetos que contienen cidos miclicos son los mximos responsables de la

aparicin del foaming en el proceso de depuracin por fangos activados. Estos microorganismos

generalmente proliferan en los tanques de aireacin pero tambin se pueden encontrar en el

sedimentador.

Como ya hemos visto anteriormente, varios gneros de este grupo han sido observados

en la espuma, tales como Nocardia, Gordonia y Rhodococcus, aunque tambin se han detectado

otros organismos filamentosos como son Microthrix parvicella, Streptomyces spp. y

Micromonospora (de los Reyes et al., 1997). Sin embargo, estudios realizados demuestran que,a pesar de que problema del foaming no est causado por un solo gnero, hay que hacer una

mencin especial al gnero Gordonia ya que se han encontrado gran cantidad de especies en

las espumas de las depuradoras (Goodfellow et al., 1996).

Hay que destacar que las especies ms comnmente encontradas en los fangos activos

son Gordonia amarae y Skermania pinensis, sobretodo en plantas depuradoras de Australia y

Estados Unidos. En Europa, el gnero predominante es el Rhodococcus, sin embargo, Microthrixparvicella es la especie que ms predomina ltimamente en Francia (Bitton, 1999).


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Otras ventajas de este tipo de bacterias sobre otras que puedan crecer en las aguas

residuales son su alta resistencia a la desecacin y a la radiacin ultravioleta adems de su

capacidad para almacenar polifosfatos y poli--hidroxibutrico (Lemmer y Baumann, 1988b). Su

deteccin resulta interesante en cuanto a que ciertos actinomicetos aislados de las espumas de

fangos activados son patgenos oportunistas de humanos y animales, tales como Nocardia

asteroides (nocardiosis humana), Rhodococcus equi(bronconeumona en caballos) y Gordonia

bronchialis (afecciones pulmonares).

El gnero Tsukamurella y, ms concretamente la especie T. paurometabola, es un claro

ejemplo de patgeno oportunista de humanos. Est asociada principalmente a desechos clnicos

y se ha encontrado en fangos activos, de ah su importancia, ya que puede representar un

peligro para la salud pblica debido a la difusin de patgenos mediante aerosoles (Goodfellow

et al., 1998).

La especie Nocardia farcinica tambin es un patgeno oportunista de humanos ya que

puede provocar neumona y infecciones cutneas en personas inmunodepresivas. Adems es

conocida su alta resistencia a la mayora de antibiticos. El problema asociado a esta especie es

que la mayora de las veces su identificacin por tcnicas convencionales es errnea (Stratton

et al., 1996).

4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos

4.1.- Aislamiento y recuento

Para aislar nocardioformes se utiliza la tcnica de dilucin y siembra en medios

selectivos suplementados con antibiticos, como el cido nalidxico que inhibe la flora

acompaante Gram-negativa (Goodfellow et al., 1996). Adems es necesario resaltar que la

morfologa de algunos organismos formadores de espumas puede variar en cultivo puro debido a

las influencias en su ritmo de crecimiento y estado fisiolgico y hay que tener en cuenta tambin

que los nocardioformes no crecen a temperaturas superiores a los 30C. Sin embargo, recientes

avances en biologa molecular estn permitiendo el desarrollo de pruebas ms rpidas y exactas

en la identificacin in situaunque el aislamiento por mtodos clsicos es necesario como primer

peldao en este tipo de investigaciones.


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Uno de los inconvenientes de sta tcnica es que la gran cantidad de microbiota

acompaante enmascara el crecimiento de los nocardioformes ms lentos como Skermania

piniformis. Debido a esta limitacin con ste mtodo slo pueden ser aislados los nocardioformes

ms abundantes y de crecimiento ms rpido, siendo inadecuado este mtodo para

nocardioformes de crecimiento lento. Las cepas de Gordonia difcilmente son detectadas por

ste mtodo ya que tardan alrededor de dos semanas en crecer.

4.2.- Identificacin y caracterizacin

4.2.1.- Mtodos clsicos

Para identificar los diversos grupos de actinomicetos se ha utilizan tradicionalmente

criterios fisiolgicos, morfolgicos y quimiotaxonmicos. Los criterios fisiolgicos se limitan al tipo

de metabolismo oxidativo o fermentativo. Los caracteres morfolgicos y quimiotaxonmicos son

los ms importantes. Estos ltimos se han utilizado tanto para distinguir grupos supragenricos

como para distinguir especies (Williams et al., 1989).

4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos

Los caracteres morfolgicos son todava muy utilizados para caracterizar el gnero. Los

principales tratan sobre el modo de septacin de las hifas, la estabilidad o fugacidad, importancia

y disposicin de las hifas del micelio del sustrato o del micelio areo, la presencia de

esporangios o de las diversas formas de los conidios, la presencia de esporas, su nmero, su

movilidad, su disposicin en las hifas y su forma. La observacin microscpica de estos

caracteres debe realizarse alterando lo menos posible las estructuras morfolgicas de las cepas

examinadas. Esto es posible empleando objetivos a gran distancia focal que permiten el estudio

de las colonias desarrolladas sobre medios slidos translcidos. Pero, aunque a veces sea

posible clasificar una cepa en base a criterios morfolgicos completamente evidentes, estos no

son suficientes para establecer una determinacin correcta y es indispensable considerar otros

caracteres (Lechevalieret al., 1980).


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INTRODUCCIN

20

4.2.1.2.- Quimiotaxonoma

El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos ha

mostrado que estos microorganismos se pueden dividir en ocho tipos, de los cuales los ms

importantes son los cuatro primeros. (Tabla 2)

Tabla 2:Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios(Lechevalier y Lechevalier, 1980)

Tipo dePared

Constituyentes mayoritarios Ejemplo de gneros

I L-DAP, glicina Streptomyces

II Meso-DAP, glicina Micromonospora

III Meso-DAP Actinomadura

IV Meso-DAP, arabinosa, galactosa Nocardia, Gordonia, Saccharopolyspora

V Lisina, ornitina Actinomyces

VI Acido asprtico y galactosa Oerskovia

VII DAB, glicina Agromyces

VIII Ornitina Cellulomonas

Los actinomicetos con paredes celulares del tipo I poseen principalmente cido

diaminopimlico de la forma L, mientras que la forma meso de este mismo cido es

caracterstica de los tipos II, III y IV. Por otra parte, la presencia o ausencia de cuatro azcares

arabinosa, galactosa, xilosa y madurosa en los hidrolizados cidos de clulas enteras permite

clasificar los actinomicetos de los tipos II, III o IV que contienen meso-diaminopimlico. Sobre

esta misma base, es posible repartir en dos grupos los actinomicetos con pared celular tipo III

segn la presencia o ausencia de madurosa. (Tabla 3)

Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios conmeso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980)

Tipo de paredConstituyentes

distintivosmayoritarios

Tipoglucdico

celular

Constituyentesglucdicos

caractersticosII Glicina D Xilosa, arabinosa

III NingunoB MadurosaC Ninguno o ramnosa

IV Arabinosa, galactosa A Arabinosa, galactosa


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INTRODUCCIN

21

Los cidos miclicos tienen un inters particular en la definicin de los gneros incluidos

en el suborden Corynebacterineae (Stackebrandt et al. 1997). Estos son nicos y constituyentes

caractersticos de la pared celular de los gneros Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia,

Tsukamurella, Corynebacterium y Mycobacterium, Skermania y Williamsia. Los nicos

actinomicetos que contienen cidos miclicos pertenecen al suborden Corynebacterineae al que

corresponden todos los microorganismos estudiados en el presente trabajo.

El modelo propuesto por Minnikin para la estructura de la cubierta celular los mycolata est

descrito en el trabajo de Sutcliffe (1998). En este modelo, los cidos miclicos pueden llegar al

30% del peso de la pared celular.

4.2.2.- Mtodos genotpicos

4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA

En la actualidad est demostrado que ciertas macromolculas son cronmetros evolutivos,

es decir, medidas del cambio evolutivo. As pues, la distancia evolutiva entre dos organismos

puede determinarse por las diferencias en la secuencia de aminocidos o nucletidos de

macromolculas homlogas aisladas de cada uno de ellos.

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998)


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INTRODUCCIN

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Para determinar las verdaderas relaciones evolutivas entre organismos, es esencial elegir

las molculas adecuadas para los estudios de secuenciacin. Esto es importante por varios

motivos. Primero, la molcula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para ser

estudiado. Segundo, deben ser funcionalmente homlogos en cada organismo; las

comparaciones filogenticas deben realizarse con molculas de idntica funcin. Tercero, resulta

crucial poder alinear apropiadamente las dos molculas a fin de identificar regiones tanto con

homologa como con variacin de secuencia. Finalmente, la secuencia de la molcula elegida

debera cambiar con una velocidad proporcional a la distancia filogentica que se va a

determinar. Y, de hecho, cuanto mayor sea la distancia filogentica a determinar, menos ser la

velocidad de cambio de la molcula; demasiado cambio tiende a enturbiar el registro evolutivo.

Se han evaluado muchas molculas como cronmetros evolutivos, y entre ellas, los genes

que codifican los RNAs ribosmicos, componentes clave del sistema de traduccin, son los que

han proporcionado la informacin gentica ms significativa sobre los microorganismos. La

mayor parte de la atencin se ha centrado en las secuencias del rRNA 5S y 16S aislados

respectivamente de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas procariotas. Los rRNA son

prcticamente ideales para los estudios de evolucin y parentesco microbianos, puesto que son

imprescindibles para un orgnulo esencial que se encuentra en todos los microorganismos. Su

papel funcional es el mismo en todos los ribosomas. Adems, su estructura se modifica muy

lentamente en el tiempo, debido probablemente a la funcin esencial y constante que

desempean. Debido a que el rRNA contiene secuencias variables y estables, es posible

comparar tanto microorganismos estrechamente relacionados como de parentesco muy lejano.

Esto constituye una importante ventaja, ya que los microorganismos de parentesco lejano slo

pueden estudiarse utilizando secuencias que sufren pocas modificaciones con el tiempo.

(Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002)

4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR es un proceso de amplificacin enzimtica in vitro del DNA, iniciada por unos

fragmentos cortos de DNA llamados iniciadores o cebadores (primers). Este proceso se lleva a

cabo cclicamente. Cada ciclo est dividido temporalmente en tres fases trmicas:

desnaturalizacin de la doble cadena de DNA, acoplamiento o unin de los iniciadores y

polimerizacin mediante la adicin de dNTPs por la enzima Taq polimerasa. Los productos de laPCR, se detectan por electroforesis en gel de agarosa y se visualizan bajo luz ultravioleta.


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INTRODUCCIN

23

Muchos problemas derivados de la identificacin de microorganismos mediante las

tcnicas tradicionales pueden obviarse mediante la PCR, lo que ha hecho que esta tcnica

suponga una alternativa muy eficaz en microbiologa. Adems, la versatilidad de esta tcnica ha

permitido su aplicacin a otros campos de inters econmico, como la identificacin gentica, la

medicina forense o el control de calidad en las industrias.

Para poder disear los iniciadores es necesario conocer la secuencia del fragmento o

gen de DNA o RNA que se va amplificar. En muchos casos conocer la secuencia completa del

organismo que nos interesa es un proceso caro y difcil, por lo que se recurre a informacin

generada por otros investigadores y almacenada en los numerosos bancos de datos para esta

finalidad (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002).

4.2.3.- Mtodos fenotpicos

Actualmente, para clasificar correctamente un microorganismo se utiliza la taxonoma

polifsica, es decir, utilizar gran cantidad de informacin. Esta informacin se divide en

informacin genotpica e informacin fenotpica. La informacin genotpica comprende todo lo

relacionado con el DNA, el RNA y las protenas. La informacin fenotpica comprende todo lo

que son marcadores quimiotaxonmicos as como la morfologa y fisiologa del microorganismo.

ste tipo de taxonoma intenta asimilar muchos niveles de informacin, desde

moleculares a ecolgicos para as poder clasificar e identificar de una manera ms correcta a los

microorganismos. El estudio del 16S solamente abarca una pequea porcin del genoma de la

bacteria, con lo que estaramos despreciando un alto contenido de informacin. Como datos de

apoyo se utilizan los marcadores quimiotaxonmicos y las pruebas fenotpicas son las que nos

dan una visin ms global del genoma (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2 Ed.,2001).


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OBJETIVOS

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OBJETIVOS

La depuracin de aguas residuales por el sistema de fangos activos es un proceso

biotecnolgico donde intervienen multitud de parmetros operacionales, todos ellos

interrelacionados. Tradicionalmente se han controlado los parmetros fsico-qumicos como si de

un sistema inerte se tratara aunque actualmente se conoce el papel crucial que realizan los

microorganismos.

Segn se ha explicado en la introduccin, el crecimiento indeseado de actinomicetos

productores de cidos miclicos (mycolata) puede interferir seriamente en el funcionamiento

correcto del sistema de fangos activados. En muchas plantas de tratamiento europeas,

australianas y americanas se han estudiado con detalle estos microorganismos; sin embargo en

las plantas de tratamiento espaolas se est empezando a estudiar desde hace escasos aos.

Por ello es importante conocer la diversidad de especies que nos encontramos en las

plantas de tratamiento potencialmente productoras de espumas. Por lo tanto, en el presente

trabajo nos planteamos utilizar la taxonoma polifsica para estudiar la biodiversidad de los

microorganismos productores de espumas. Los objetivos parciales son:

1.- Caracterizacin morfolgica de los aislados obtenidos de muestras de espumas biolgicas

provenientes de plantas depuradoras. Seleccin de los aislados ms representativos.

2.- Caracterizacin quimiotaxonmica de las cepas mediante la extraccin y anlisis de cidos

miclicos, la determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) y la extraccin y

anlisis de los azcares predominantes de la pared celular.

3.- Caracterizacin fenotpica de las cepas mediante la realizacin de una serie de tests

fenotpicos.

4.- Identificacin a nivel de especie mediante anlisis de la secuencia del 16S rRNA por medio

de la realizacin de rboles filogenticos para establecer las relaciones evolutivas entre los

aislados y anlisis de las matrices de similaridad de nucletidos.


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MATERIAL Y MTODOS

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1.- Cepas bacterianas de referencia

En el presente trabajo se han utilizado un total de 22 cepas de referencia suministradas

por la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Esta coleccin de cepas contiene especiespertenecientes a todas las familias del suborden Corynebacterineae. Entre las cepas del gnero

Gordonia se encuentra la especie G. amarae que es la especie aislada con ms frecuencia en

muestras de espumas. De los gneros Nocardia y Rhodococcus se incluyen las especies

patgenas N. asteroides y R. equi. En la tabla 4 se muestra la relacin de cepas de referencia

utilizadas.

Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizadosCepa Nmero de la coleccin

Corynebacterium xerosis CECT 4160

Dietzia maris CECT 4617

Gordonia amarae CECT 5704

Gordonia rubropertincta CECT 5393

Gordonia terrae CECT 5707

Gordonia nitida CECT 7017

Gordonia hirsuta CECT 7018

Gordonia hydrophobica CECT 7021

Mycobacterium phlei CECT 3009

Nocardia asteroides CECT 3051

Nocardia brasiliensis CECT 3052

Nocardia carnea CECT 3374

Nocardia farcinica CECT 3053

Nocardia nova CECT 3056

Nocardia soli CECT 3375

Rhodococcus coprophilus CECT 5751

Rhodococcus equi CECT 555

Rhodococcus erythropolis CECT 3013

Rhodococcus rhodnii CECT 5750

Rhodococcus rhodochrous CECT 5749

Skermania piniformis CECT 3057

Tsukamurella spumae DSM 44113


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MATERIAL Y MTODOS

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Todas las cepas se incubaron en medio YEME en condiciones de aerobiosis de 5 a 10

das dependiendo de la cepa. En el caso de Skermania piniformis se utiliz el medio 180 segn

recomienda la CECT. Esta especie necesita un tiempo de incubacin de 20-25 das para obtener

colonias visibles.

Todas las cepas se mantuvieron en crioviales con caldo nutritivo con un 20% de glicerol

a 20C. Antes de proceder a su congelacin, as como despus de recuperar una cepa, se

comprob la pureza del cultivo mediante tincin Gram, para comprobar que no ha habido ningn

tipo de contaminacin. El estudio previo de estas cepas de referencia, tanto a nivel macroscpico

como a nivel microscpico, facilit la posterior caracterizacin morfolgica de los aislados

estudiados en este trabajo.

2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos

2.1.- Toma de muestras

La toma de muestras se realiz por el propio personal de la planta. Se tomaron muestras

de espumas del reactor biolgico en recipientes estriles y se enviaron al laboratorio donde seguardaron en refrigeracin a 4 C y se procesaron dentro de las 24 horas siguientes. Todas las

plantas estudiadas realizan el proceso basado en el sistema de fangos activos y realizan la

depuracin de aguas residuales urbanas.

En el presente trabajo se ha realizado una seleccin de aislados que fueran lo ms

representativos posibles seleccionando aquellos que presentaron mayor diversidad morfolgica.

En la tabla 5 se presentan las plantas estudiadas en el presente trabajo. En esta tabla se

muestran todas las muestras de fangos activos que fueron recibidas, as como los aislados que

se obtuvieron a partir de ellas en trabajos anteriores. Se resaltan en negrita los aislados

utilizados en el presente estudio.


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MATERIAL Y MTODOS

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Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS

EDAR FECHA AISLADOS

Alcoy 2004 P54

Algemes 2004 P145, P162Algors 2004 P152, P153, P155, P157, P163Bemsa 2004 P102, P103, P105, P107, P108, P110

Benidorm 2004 P60, P61, P63, P72, P73, P74, P80, P81, P84Camp de Turia 2004 P134, P135, P136,P138

Carcaixent 2004 P132Castelln 2005 N16-9, N22-7, N22-11

Denia 2004 P158, P159, P160Formentera 2005 N4

Mancomunada 2004 P175Mora dEbre 2005 N5

Pinedo 2004 P48a, P48b, P51, P52Quart 2004 P26, P28, P38

Rincn de Len 2004 P39Rojales 2005 N1, N2

Torres Torres 2004 P165, P166, P167, P168, P169, P177Torrevieja 2004 P141Vall dUx 2005 N7, N9-1, N9-3, N20-1Vinalop 2004 P42, P46, P46p

Viver 2005 N17-4, N17-8, N17-11Lloc Nou 2005 L2, L10, E9

2.2.- Caracterizacin morfolgica

Para cada aislado se realiz una observacin macroscpica y una observacin

microscpica. Con esto se comprob que los resultados obtenidos coincidieran con el trabajoprevio realizado. La observacin macroscpica se fundamenta en el aspecto de las colonias

aisladas: dimensin, color, contorno regular o irregular, textura, superficie lisa o rugosa,

opacidad, color reverso, consistenciaetctera. Adems, se efectu la prueba de la catalasa

para comprobar que fueran catalasa positivos.

Para la observacin microscpica se realiz una tincin Gram para comprobar que

tuvieran una morfologa tpicamente nocardioforme.


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MATERIAL Y MTODOS

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La microscopa directa est basada en que determinados grupos de mycolata tienen una

morfologa peculiar que se puede utilizar para identificarlos:

* Morfologa GALO (Gordonia amarae- like-organism). Presenta ramificaciones en ngulo

recto producida por especies de Gordonia y de Nocardia.

* Morfologa PTLO (Pine-Tree-Like-Organism). Presenta ramificaciones en ngulo agudo

para el caso de Skermania.

2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica

Para esta caracterizacin se llevaron a cabo tres pruebas fundamentales:

Extraccin y anlisis de cidos miclicos,

Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico

Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular.

Estos tres marcadores quimiotaxonmicos son lo que mejor definen al grupo de los

mycolata.

2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos

2.3.1.1.- Materiales

Para realizar este anlisis se prepar previamente:

TBAH (hidrxido de tetrabutil amonio) al 5% mediante la dilucin, con agua destilada y

estril, de TBAH al 40%.

cido molibdofosfrico al 5% mediante la dilucin de cido molibdofosfrico al 10% con

etanol absoluto. La solucin adquiere un color verdoso. Es necesario mantener a 4 C.

En el ensayo se emple una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05554).


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MATERIAL Y MTODOS

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2.3.1.2.- Metodologa

La deteccin de cidos miclicos se ha realizado siguiendo el mtodo propuesto por

Hamid et al. (1993). En primer lugar se aadi, en criotubos de 2 ml., 1000 L de TBAH y

aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (< 106 ). Posteriormente, a partir de los cultivos

en ISP-2 de los actinomicetos, se agreg un asa de siembra de cada muestra a cada criotubo y,

tras agitar en vrtex durante 30 segundos como mnimo, se incubaron en termoblock a 100 C

durante 4 horas.

Tras las 4 horas de incubacin, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5

minutos. Seguidamente se transfiri el sobrenadante a un nuevo criotubo, al que se le aadi 1

ml de diclorometano y 25 L de yodometano (todo ello se realiz en la cmara de extraccin de

gases) para, posteriormente homogeneizarlo en un tuborotador a 40 rpm durante 30 minutos.

Pasados estos se centrifug a 2000 rpm durante 3 minutos y se transfiri la capa de abajo a un

nuevo tubo eppendorf. Esos tubos eppendorf se depositaron en el termoblock a una temperatura

constante de 55 C hasta que estuvieron completamente secos y, seguidamente, se

redisolvieron con 75 L de ter de petrleo. Una vez preparadas las muestras se procedi a

aplicar 5 L de cada una de ellas en una placa de celulosa.

Esta placa de celulosa se coloc en una cubeta de vidrio que contena ter de petrleo y

acetona (95:5) y se mantuvo all hasta que el frente estuvo aproximadamente a 1 cm del final de

la placa. A continuacin se dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases,

con cido molibdofosfrico al 5%. Finalmente se incub en estufa a 100 C durante 5-10 minutos

y se procedi a su lectura.

2.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP)


Para realizar esta prueba se tuvo que preparar anteriormente:

50 ml de sistema disolvente, aadiendo 33,3 ml de metanol, 11 ml de agua destilada y

esterilizada, 1,6 ml de HCl 6 N y 4,1 ml de piridina. La mezcla se conserv a 4 C en cmarafrigorfica hasta su utilizacin.


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MATERIAL Y MTODOS

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dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases, con ninidrina en acetona al

0,2%. A continuacin, se incub en estufa a 100C durante 5-10 minutos y se procedi a su

lectura.

2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular


Para realizar esta prueba se prepar anteriormente:

Reactivo de eftalato de anilina: se prepar con 3,25 g de cido eftlico, que se aadieron

a 100 ml de agua saturada en butanol y 2ml de anilina. Se mantuvo a 4 C en cmara frigorfica

hasta su utilizacin.

Agua saturada en butanol: se aadieron agua y n-butanol en una proporcin de 1:1.

Azcar estndar en piridina al 1% (en nuestro caso arabinosa y galactosa).

En el ensayo se utiliz una placa de celulosa TLC de 10x20 cm (Merck 1.05552).

2.3.3.2.- Metodologa

El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos tiene

una importancia taxonmica considerable. Es por ello por lo que consideramos que esta prueba

es fundamental. Para llevarla a cabo se utiliz el protocolo propuesto por Hasegawa et al., 1983.

En primer lugar se aadieron 0,1 ml de HCl 0,25 N a cada criotubo. Posteriormente, y a

partir de los cultivos puros de cada cepa, se aadi media asa de siembra a cada criotubo y seautoclavaron durante 15 minutos a 121 C.

Despus de dejar enfriar a temperatura ambiente se aadieron, a la placa de celulosa

TLC, 1 L de la preparacin estndar de los azcares (arabinosa y galactosa) y 3 L de cada

muestra.

Hecho esto, la placa se introdujo en una cubeta de vidrio conteniendo 10 n-butanol : 6H2O : 6 piridina: 1 tolueno y se dej desarrollar hasta que el frente estuvo a 1 cm del final de la


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MATERIAL Y MTODOS

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placa. Posteriormente se dej secar fuera de la cubeta y se meti de nuevo en la cubeta durante

2 horas aproximadamente.

Una vez transcurridas esas 2 horas se dej secar la placa fuera de la cubeta y se roci, en

la cmara extractora de gases, con el reactivo de eftalato de anilina. A continuacin se incub en

estufa a 100 C durante 4 minutos.

2.4.- Caracterizacin genotpica

Para ello, partiendo de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedi a la

extraccin del DNA siguiendo el protocolo del CTAB (Bromuro de Cetil-trimetil-amonio). Adems

tambin se utiliz un kit de extraccin de DNA (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante,

que asegura un contenido ms puro aunque una menor cantidad. El DNA extrado de las

muestras fue amplificado mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) utilizando los

iniciadores especficos 27f (5AGAGTTTGATCMTGGCTCAG, siendo M = C,A) y 1492r

(5TACGGYTACCTTGTTACGACTT, siendo Y = C,T) (Lane, 1991). Finalmente, los productos

obtenidos de la PCR se purificaron y secuenciaron, para posteriormente analizar la secuencia e

identificar cada cepa a nivel de especie.

2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB.

Los actinomicetos forman agrupaciones de hifas fuertemente unidas que es necesario

disgregar para conseguir rendimientos adecuados en la extraccin de DNA. Adems, muchas

especies crecen adheridas al agar debido al micelio de sustrato que producen.

En primer lugar se aadi 500 L de tampn TE (Tris-ClH 10 mM, EDTA 1mM) a cada

tubo eppendorf, a los que previamente se haban aadido perlas de vidrio (< 106 ).

Posteriormente se lisaron las clulas aadiendo 100 L de lisozima (50 mg/mL) y se incubaron

durante 1 hora a 37 C en un termoblock agitando cada 5-10 minutos en vrtex para deshacer

agregados y facilitar la accin de la lisozima. A continuacin se aadieron 30 L de dodecil

sulfato sdico (SDS) al 10% y 3 L de proteinasa K (20 mg/mL). Los tubos eppendorf se agitaron

y se incubaron nuevamente, esta vez durante 30 minutos a 37 C.


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MATERIAL Y MTODOS

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Pasado este tiempo, se aadieron 100 L de NaCl 5 M y 80 L de una solucin de

CTAB/NaCl (CTAB 10% en NaCl 0,7 M), se agitaron las muestras en vrtex y se incubaron a

65C durante 10 minutos.

La purificacin del DNA se realiz aadiendo un volumen de 700 L de

fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1), agitando y centrifugando a 12000 rpm durante 5

minutos para eliminar los complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfiri a un

nuevo tubo eppendorf y se aadi un volumen de 700 L de cloroformo/alcohol-isoamlico

(24:1). Se agit la mezcla y se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos

de complejos con el CTAB (protenas y polisacridos).

A continuacin, el sobrenadante, que contiene los cidos nuclicos, se transfiri a otro

tubo eppendorf y se adicion el mismo volumen de isopropanol fro para precipitar el DNA. El

DNA precipitado se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar el isopropanol y se

lav el precipitado con 500 L de etanol fro al 70%. Finalmente, se centrifug para eliminar el

etanol, se sec en una secadora de vaco durante 15 minutos y se resuspendi en 50 L de

tampn TE. Para eliminar los restos de RNA extrado se aadi 1 L de RNAsa (25 mg/mL). Las

muestras se conservaron a 4 C durante 24 horas, tras las cuales, se realiz un gel de

comprobacin de la extraccin.

2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa

Para comprobar la adecuada extraccin del DNA se analizaron las muestras (3 L de cada

una de ellas) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en tampn TAE 1X. Para ello se

aadi 1,2 g de agarosa en 100 ml de TAE 1X, preparado a partir de la adicin de 20 ml de TAE

50X (48,9 g de Tris base, 7,44 g de Na2EDTA 2H2O y 1,42 mL de cido actico glacial a 1000

mL de agua MiliQ, ajustando el pH a 8,5) y 980 ml de agua MiliQ.

Una vez solidificado el gel se procedi a cargarlo con los 3 L de cada muestra, a los que

anteriormente se mezclaron un tampn de carga. Adems se debe disponer en los extremos del

gel un marcador que, en nuestro caso, es de 100 pb. Una vez cargado el gel, se le somete a un

voltaje de 90 V durante 45 minutos. Los fragmentos de DNA se visualizaron con un


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MATERIAL Y MTODOS

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transiluminador de UV tras teirlos con bromuro de etidio. Finalmente, las muestras se

conservaron a -20 C hasta su utilizacin.

2.4.3.- Amplificacin por PCR

La amplificacin del 16S rDNA se realiz mediante PCR, utilizando los iniciadores 27f y

1492r (Lane, 1991). La reaccin se realiz en un volumen total de 50 L conteniendo 1,5 M de

MgCl2, 0,2 mM de dNTPs (mezcla equimolar de los cuatro nucletidos), 0,4 M de cada iniciador,

1,25 U del enzima Taq polimerasa (Ecogen) con su correspondiente tampn y 3 L de DNA. En

cada reaccin de amplificacin se incluy un control negativo en el que el DNA se reemplaz por

agua estril.

A continuacin, se realiz la reaccin de amplificacin que comienza con una fase inicial

de desnaturalizacin (95 C durante 5 minutos), seguida de 35 ciclos compuestos por la

desnaturalizacin (95 C durante 1 minuto), la unin de iniciadores (54 C durante 1 minuto) y la

elongacin (72 C durante 1 minuto). Por ltimo, se produce un ciclo final de extensin (72 C

durante 10 minutos) (Tabla 6).

Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos

1 ciclo 95 C 5 min. Desnaturalizacin

95 C 1 min. Desnaturalizacin

35 ciclos 55 C 1 min. Unin de iniciadores

72 C 1 min. Elongacin

1 ciclo 72 C 10 min. Extensin

El DNA amplificado por la PCR (8 L) se visualiz mediante electroforesis en gel de

agarosa del modo descrito anteriormente.

2.4.4.- Purificacin del DNA

El 16S rDNA obtenido tras la PCR se purific utilizando el kit de purificacin GenElute

(Sigma), siguiendo las indicaciones del fabricante. A continuacin, los productos purificados

(3 L) se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa del modo descrito anteriormente

(punto 2.4.2.).


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MATERIAL Y MTODOS

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2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA

La secuenciacin de los productos obtenidos tras la PCR fue realizada en el Laboratorio

de Secuenciacin de Sistemas Genmicos S.L. Para la realizacin de las reacciones de

secuenciacin se utiliz el kit ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction

(versin 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador

automtico Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer.

La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproximada de 600 a 700

nucletidos, se obtuvo en un archivo de texto electrnico desde el electroferograma mediante la

aplicacin cientfica CHROMAS (versin 1.43). Las secuencias del 16S rDNA fueron

ensambladas manualmente, utilizando el programa informtico PHYDIT, a partir de la

combinacin de fragmentos separados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican

el segmento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucletidos

de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron

eliminados antes de ensamblar la secuencia completa. Las secuencias parcialmente alineadas

se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA.

La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se determin mediante la

herramienta informtica BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a

partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Jones, 2006).

2.4.6.- rboles filogenticos

A partir de las secuencias se obtienen los rboles filogenticos de cada gnero, para as

po

premio selección 2011. albert soler

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