potencial biotecnológico de hidrolizados proteicos de

SANDY VIVIANNE RUBIO ROMAN

GUASAVE, SINALOA; MEXICO DICIEMBRE DEL 2017

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN

PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA

Potencial biotecnológico de

hidrolizados proteicos de semillas de

frijol y análisis in silico de la familia

de genes de faseolina, su principal

proteína de reserva

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola en el

Laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta del Centro Interdisciplinario de

Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del

Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección de la Dra. Melina López Meyer y

del Dr. José Luis Acosta Rodríguez. El autor Sandy Vivianne Rubio Roman

agradece el apoyo otorgado por el IPN a través del programa de becas

institucionales y del programa BEIFI, así como a CONACYT por el apoyo económico

otorgado durante la realización de los estudios de Maestría.

AGRADECIMIENTOS

A mis directores de tesis: Dra. Melina López Meyer y Dr. José Luis Acosta

Rodríguez, por la paciencia y apoyo. Dra. Meli le agradezco todo su tiempo

dedicado a mí, su paciencia y sus palabras de aliento cuando me miraba

preocupada. No pude llegar a un mejor lugar, le admiro en lo académico y sobre todo

por su calidad humana.

A mi comité tutorial: Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero, Dr. Sergio Medina

Godoy y Dr. Juan Pablo Apún Molina, por todas las aportaciones para el desarrollo

del presente trabajo.

Muchas gracias a usted Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza, por su sincero

interés y tiempo dedicado en la presente tesis.

Al gran equipo que somos en el Lab. IMP, gracias por su valiosa ayuda en todos mis

experimentos, por esos cafés en las mañanas y escucharme cantar todos los días.

A mi familia, Mamá y Papá lo más valioso que tengo, gracias por siempre creer en

mí, por apoyarme en todo, por llorar y reír conmigo.

A mi compañero de Laboratorio los fines de semana Adrián SL, gracias por tú

paciencia, por siempre darme ánimos y por tu genuino interés en tratar de entender

mis experimentos.

Andreyna, Yoldia, Carolina, Paul y Alan me quedo con su amistad, muchas gracias

por todo de corazón. Compartimos tantos momentos de risa-sufre, siempre ideando

una nueva forma de acabar con el estrés, que si por las escaleras o del invernadero.

Nada hubiera sido lo mismo sin cada uno de ustedes, gracias por aparecer en mi

vida.

I

ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1

II. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 3

2.1 Panorama actual y producción de frijol en México ........................................................... 3

2.2 Micorrizas ................................................................................................................................ 3

2.2.1 Micorriza arbuscular ...................................................................................................... 4

2.2.2 Resistencia Inducida por Micorrización ...................................................................... 5

2.3 Faseolina es la principal proteína de almacenamiento de semilla de frijol .................. 6

2.3.1 Estructura de la proteína faseolina ............................................................................. 7

2.3.2 Proteínas vegetativas de reserva................................................................................ 7

III. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 9

IV. HIPOTESIS .............................................................................................................................. 10

V. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 10

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 11

6.1 Obtención y mantenimiento de plantas de frijol micorrizadas y no micorrizadas ...... 11

6.2 Determinación del porcentaje de micorrización .............................................................. 11

6.3 Análisis in silico .................................................................................................................... 12

6.4 Extracción de RNA .............................................................................................................. 12

6.4.1 Síntesis de cDNA ......................................................................................................... 13

6.4.2 PCR en punto final ...................................................................................................... 13

6.5 Obtención de aislados proteicos e hidrolizados de frijol ............................................... 14

6.6 Aplicación del extracto proteico ......................................................................................... 15

6.7 Ensayo de infección por S. sclerotiorum.......................................................................... 15

6.8 Análisis estadístico .............................................................................................................. 15

VII. RESULTADOS ........................................................................................................................ 16

7.1 Análisis moleculares ........................................................................................................... 16

7.1.1 Análisis in silico de secuencias de faseolina a partir de la secuencia inducida

por micorrización en hojas de frijol variedad Azufrado Regional 87 ................................... 16

7.1.2 Diseño y pruebas de amplificación de los oligonucleótidos diseñados .............. 18

II

7.1.3 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en plantas

de frijol Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera ................................................................ 20

7.1.4 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en

cotiledones de semillas de frijol ................................................................................................. 21


plantas de frijol Azufrado Regional 87 ..................................................................................... 22

7.2 Experimento 1. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol................................... 26

7.2.1 Porcentaje de colonización ........................................................................................ 26

7.2.2 Peso fresco de raíces y parte aérea ......................................................................... 27

7.2.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC y

NO MIC 28


NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol ......................................................... 29

7.3 Experimento 2. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol ................................. 31

7.3.1 Porcentaje de colonización ........................................................................................ 32

7.3.2 Peso fresco de raíces y parte aérea ......................................................................... 33

VIII. DISCUSION .............................................................................................................................. 36

IX. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 41

X. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 42

XI. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 43

XII. ANEXOS ................................................................................................................................... 47

III

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Región del cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris en donde se ubican los

parálogos del gen de la faseolina F1, F2 y R1. ................................................... 17

Figura 2. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas deducidas de los cDNAs de

α y β faseolina con FIM. En rojo se muestra la región de homología de los genes

α y β faseolina con FIM. ...................................................................................... 18

Figura 3. Gen de faseolina y ubicación de los oligonucleótidos específicos para el

gen α (A1) y el β (B1, B2 y B3); entre paréntesis se indica el tamaño del

fragmento amplificado esperado para cada par de oligos. Los bloques de colores

representan los exones y las líneas azules los intrones. Las flechas rojas indican

el inicio (izquierda) y final (derecha) de la traducción. Los números debajo de las

barras indican la posición de las bases en donde inician y terminan los intrones y

exones. ............................................................................................................... 19

Figura 4. Análisis electroforético de productos de PCR punto final de ADN genómico

de plantas de frijol. PCR utilizando los juegos de oligonucleótidos: 1) β1F/ β1R,

2) β2F/ β2R, 3) β3F/ β3R, 4) α1F/ α1R; y 5) β3F/β1R. M: Marcador de peso

molecular (1Kb Plus, Invitrogen, Cat. 15628-019). ............................................. 19

Figura 5. Análisis electroforético de productos de PCR en punto final utilizando como

templado cDNA de cotiledones de frijol var. Reg 87 (carriles 1 a 4), y DNA

genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 5). Se utilizaron los

oligonucleótidos β1F/ β1R (carril 1); β2F/ β2R (carril 2); β3F/ β3R (carril 3),

β3F/β1R (carril 4 y 5). ......................................................................................... 21

Figura 6. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como

templado cDNA de hojas de frijol var. Azufrado Regional 87. a) β1F/ β1R, b)

β2F/ β2R, c) β3F/ β3R y d) Factor de Elongación (EF 1α). MIC (carril 1); Hoja de

planta NO MIC (carril 2); Cotiledón de frijol Azufrado Regional 87 (carril 3); ADN

genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 4). ............................................. 23

Figura 7. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como

templado cDNA de hojas de frijol var. Reg 87. Carriles de 1 al 4 (αF/αR),

carriles del 5 al 8 (β3F/ β1R). Carril 1 y 5, cDNA de hojas de plantas MIC; Carril 2

y 6, cDNA de hojas de plantas NO MIC; Carril 3 y 7, cDNA de cotiledón; Carril 4 y

8, DNA genómico. ............................................................................................... 24

Figura 8. Análisis electroforético de productos de PCR punto final en gradiente de

temperatura utilizando como templado cDNA de hojas de plantas MIC de frijol

var. Azufrado Regional 87. Con el oligonucleótido específico Phas1 Forward y el

degenerado Phas2 Reverse. .............................................................................. 25

IV

Figura 9. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de plantas en ensayo de hojas

desprendidas a) Peso fresco (g) de parte aérea, b) Peso fresco (g) de raíces. Los

tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del

5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................................................ 27

Figura 10. Diámetros de lesión 36 horas posteriores de inoculación con S.

sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (No MIC)

de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87.

Los tratamientos representados por barras, con la misma letra, no difieren al

nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. .................................................. 28

Figura 11 . Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S.

sclerotiorum en hojas de plantas de frijol micorrizadas (MIC, barras verdes), no

micorrizadas (NO MIC, barras amarillas), con hidrolizado aplicado (HID-1) y

tratamientos control sin hidrolizado (Control) de las variedades a) Azufrado

Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados

por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba

de Tukey. ............................................................................................................ 30

Figura 12. Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S.

sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC), no micorrizadas (NO MIC)

con tratamiento de hidrolizado (barras rojas) y tratamientos control (agua)

(barras azules) de las variedades Azufrado Higuera, Azufrasin y Azufrado

Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no

difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................. 31

Figura 13. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de las plantas utilizadas en el

ensayo de hojas desprendidas a) Parte aérea (hojas y tallos), b) Raíces. Los

tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del

5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................................................ 33

Figura 14. Cinética de desarrollo de las lesiones en hojas de plantas de frijol

Azufrado Regional 87 micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (NO MIC) (sin

adición de hidrolizado). Los tratamientos representados por barras, con la misma

letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ..................... 34

Figura 15. Diámetros de lesión a las 48 horas posteriores a la inoculación con S.

sclerotiorum en hojas de plantas de frijol MIC y No MIC sin hidrolizado, así como

MIC y NO MIC con los hidrolizados HID-1 (de semilla de frijol Azufrado Higuera)

y HID-2 (de semilla de frijol Azufrado Regional 87). Los tratamientos

representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de

acuerdo a la prueba de Tukey. ........................................................................... 35

V

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Parálogos a faseolina ubicados en el cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris,

F, secuencia en sentido; R, secuencia en anti-sentido o reverso. ...................... 16

Cuadro 2. Tamaños esperados de los amplicones con los oligonucleótidos

específicos para α y β faseolina. ........................................................................ 20

Cuadro 3. Porcentaje de colonización micorrízica de tres variedades de frijol

empleadas para el ensayo de infección en hoja desprendida. El inóculo consistió

en 500 esporas y 100 mg de raíces transformadas de zanahoria colonizadas con

R. irregularis por planta. ...................................................................................... 26

Cuadro 4. Porcentaje de colonización en plantas de frijol empleadas para el

Experimento 2 de infección en hoja desprendida. El inóculo micorrízico consistió

en 500 esporas de R. irregularis. ........................................................................ 32

VI

GLOSARIO

DNA (ácido desoxiribonucleico): Es una molécula de ácido nucleico que consiste

de largas cadenas de desoxiribonucleótidos polimerizados. En una doble cadena de

DNA, las dos hebras se mantienen unidas mediante enlaces puente de hidrógeno

entre las pares de bases de nucleótidos complementarios.

DNA complementario (ADNc): DNA sintetizado por la transcriptasa reversa a partir

de una hebra o molde de ARN.

Esclerocio: Masa compacta de hifas, por lo común con una cubierta oscura, y capaz

de sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas.

Fotobionte: Todo organismo capaz de absorber la energía de la luz y transformarla

en energía química.

GEN: Porción lineal del cromosoma que determina o condiciona uno o más

caracteres hereditarios. La unidad funcional más pequeña del material genético.

Genoma: Conjunto de genes y disposición de los mismos en la célula.

Inoculación: Contacto inicial de un agente infeccioso con un sitio de la planta donde

la infección es posible.

Lesión: Efecto nocivo ocasionado por un ataque, daño mecánico, enfermedad o

factor ambiental.

Micorriza: Asociación simbiótica que se establece entre un hongo micorrízico y las

raíces de una planta.

Modificaciones postraduccionales: Modificaciones que sufren las proteínas

después de ser sintetizadas.

Modificaciones postranscripcionales: Procesos de modificación por los que

tienen que pasar los mRNA, rRNA y tRNA para poder ser funcionales.

VII

Patógeno: Agente biológico externo que se aloja en un ente biológico determinado y

produce una enfermedad.

Resistencia: Capacidad que tiene un organismo para superar total o parcialmente el

efecto de un patógeno o factor perjudicial.

RNA (ácido ribonucleico): Un ácido nucleico involucrado en la síntesis de

proteínas, también el ácido nucleico más común en los virus de plantas.

Sistémico: Que se difunde internamente por toda la planta.

Susceptible: Que carece de la capacidad inherente de resistir a las enfermedades o

al ataque de un cierto patógeno.

Simbiosis: Asociación íntima de organismos de especies diferentes para

beneficiarse mutuamente en su desarrollo vital

Tolerancia: Capacidad que tiene una planta de soportar los efectos de una

enfermedad sin que muera o sufra daños serios.

VIII

RESUMEN

El frijol (Phaseolus vulgaris) es una especie dicotiledónea anual que pertenece a la

familia de las leguminosas, fue domesticado en América hace aproximadamente

8,000 años, y es considerado como el grano de leguminosa mayormente consumido

en el mundo. El frijol tiene la capacidad de interaccionar con microrganismos

presentes en el suelo. Dentro de las interacciones benéficas microorganismo-planta

más importantes están la simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis

con hongos micorrízicos arbusculares (HMA). En la simbiosis MA, el hongo le provee

a la planta compuestos poco móviles en el suelo principalmente fósforo, además de

nitrógeno y zinc, entre otros. También induce en la planta una mayor tolerancia al

ataque por patógenos. A cambio de estos beneficios, la planta le brinda al hongo

carbohidratos, producto de la fotosíntesis, y un micro-habitat para que pueda

completar su ciclo de vida. En un estudio previo se observó la acumulación

diferencial de una proteína tipo-faseolina en hojas de plantas de frijol micorrizadas.

Dichas plantas presentaron una mejor respuesta al ataque por patógenos en

comparación con las no micorrizadas. En el presente trabajo, mediante análisis in

silico, se logró definir que la faseolina está codificada por una familia de genes de

únicamente dos miembros, los cuales han sido previamente clonados y nombrados

como α y β faseolina. Esto indica que las múltiples formas proteicas reportadas para

faseolina deben derivarse de modificaciones postranscipcionales y

postraduccionales. La faseolina inducida por micorrización (FIM) previamente

descrita corresponde a una β-faseolina. Además de los análisis in silico, se

realizaron esfuerzos por amplificar el cDNA de la faseolina inducida por micorrización

identificada en un estudio previo en hojas de plantas micorrizadas. Sin embargo, no

se logró la amplificación esperada. Esto podría indicar que el o los genes de

faseolina expresados bajo esta condición se encuentran en muy baja concentración o

que haya habido algún condición en nuestros experimentos que haya ocasionado la

no expresión o la degradación de los RNAm correspondientes. Además, en este

trabajo se investigó la efectividad de hidrolizados proteicos de semillas de frijol

adicionados exógenamente para inducir defensa contra un patógeno foliar en plantas

de frijol, y se encontró que dichos hidrolizados son capaces de inducir defensa en

IX

plantas de frijol al ser aplicados de manera exógena. La efectividad de los

hidrolizados parece depender del nivel de colonización micorrízica, el estado

fenológico de la planta y la variedad de frijol tratada y utilizada para la obtención del

hidrolizado. Los hidrolizados proteicos de semillas de frijol tienen potencial para ser

utilizados como inductores de defensa en plantas de frijol.

X

ABSTRACT

Common bean (Phaseolus vulgaris) is an annual dicotyledonous species that belongs

to the Leguminosae family; it was domesticated in America about 8,000 years ago,

and is considered the most consumed grain legume in the world. Common bean

interacts with microorganisms present in the soil. Among the most important

microorganism-plant beneficial interactions are the symbiosis with nitrogen-fixing

bacteria, as well as with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). In the AM symbiosis, the

fungus provides the plant with compounds with low mobility in the soil, mainly

phosphorus, as well as nitrogen and zinc, among others. It also reduces susceptibility

of the plant to pathogen attacks. In exchange for these benefits, the plant gives the

fungus carbohydrates, which are products of photosynthesis, and a microhabitat for

the fungus to complete its life cycle. In a previous study, the accumulation of a

phaseolin-type protein was observed in leaves of mycorrhiza-colonized common bean

plants. These plants showed a better defense response to pathogen attack in

comparison to nonmycorrhiza plants. In the present work, by using an in silico

analysis approach, it was possible to define that phaseolin is encoded by a gene

family of only two members, which have been previously cloned and named as α and

β phaseolin. This indicates that the multiple protein forms previously reported for

phaseolin must derive from post-transcriptional and post-translational modifications.

Analysis described in this work indicates that the phaseolin induced by mycorrhiza

colonization (or FIM) previously described, corresponds to β phaseolin. In addition to

the in silico analyzes, efforts were made to detect this phaseolin at the mRNA level.

However, RT-PCR assays using RNA from leaves of mycorrhiza-colonized plants, did

not render an amplified product. This could indicate that the phaseolin gene or genes

expressed under this condition are in very low concentration, or that some condition

in the experiments caused low expression or degradation of the corresponding

mRNAs. In addition, the effectiveness of protein hydrolysates of common bean seeds

added exogenously to common bean plants in order to induce defense against a foliar

pathogen, was investigated. It was found that the hydrolysates were able to induce

defense in common bean plants, when applied exogenously. The effectiveness of the

hydrolysates seems to depend on the percentage of mycorrhizal colonization, the

XI

phenological state of the plant, and the variety of common bean to be treated, as well

as on the variety used to obtain the hydrolyzate. The protein hydrolysates of common

bean seeds have the potential to be used as defense inducers in common bean

plants.

1

I. INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris) fue domesticado en América cerca de 8,000 años

atrás, es una especie dicotiledónea anual, pertenece a la familia de las Leguminosae.

Es uno de los granos de leguminosas mayormente consumidos en el mundo,

principalmente en América del Sur y África. Las semillas de frijol común tienen

valiosas propiedades nutricionales debido al hecho de que son una fuente importante

de fibra, minerales y vitaminas, así como a su bajo contenido de grasa y de sodio (De

La Fuente, 2012). Las semillas presentan una alta diversidad de colores y tamaños.

En México existen alrededor de 70 variedades de frijol asignadas a los siguientes

siete grupos: negros, amarillos, blancos, morados, bayos, pintos y moteado. En

conjunto con el maíz, el frijol constituye uno de los principales alimentos de la

canasta básica de los mexicanos. En México, el 7.4% de la superficie sembrada del

país se dedica al cultivo del frijol. Los principales estados productores de frijol son

Zacatecas, Sinaloa, Durango y Chihuahua. En Sinaloa se dedicaron 83,031 Ha para

siembra de frijol en el ciclo agrícola otoño–invierno 2016, obteniéndose un total de

140,977 toneladas (Ton) de grano, convirtiéndolo en un cultivo de importancia

económica para el estado (SIAP 2017).

Cada año la producción de frijol se ve afectada por diversos factores, que pueden ser

de tipo bióticos y abióticos. Entre los factores bióticos se incluyen ataque por

microorganismos, plagas, enfermedades y malezas. Los factores abióticos incluyen

el estrés hídrico, temperaturas ambientales extremas, así como niveles de salinidad y

pH del suelo. Con respecto al factor biótico, las interacciones de las plantas con

microorganismos presentes en el suelo, se pueden dar de diversas maneras, siendo

en algunos casos benéficos para la planta y en otros dañinos, actuando los

microorganismos como patógenos (Azcón y Barea, 1996). Dentro de las

interacciones benéficas microorganismo-planta más importantes se encuentra la

simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis con hongos micorrízicos

arbusculares (HMA). La micorriza arbuscular es una simbiosis planta-HMA. Cerca del

80% de las plantas tienen la capacidad de establecer este tipo de asociación (Smith

2

y Read, 2008). En esta simbiosis, el hongo le provee a la planta compuestos poco

móviles en el suelo principalmente fósforo, nitrógeno y zinc, además de una mayor

tolerancia al estrés hídrico y al ataque por patógenos. A cambio de esto, la planta le

brinda carbohidratos producto de la fotosíntesis y un micro-habitat para que pueda

completar su ciclo de vida (Mora-Romero, 2008).

En trabajos anteriores se ha sugerido que la micorrización promueve la resistencia

de las plantas a patógenos mediante la acumulación de proteínas pero en estado

inactivo; una vez que la planta se ve atacada por un patógeno, estas proteínas se

activarían produciendo una respuesta de defensa más efectiva, comparado con

plantas no micorrizadas (Salzer y Boller, 2000). En un estudio previo en nuestro

grupo de investigación se observó la acumulación diferencial de una proteína

identificada como faseolina en hojas de plantas de frijol micorrizadas. Dichas plantas

presentaron una mejor respuesta al ataque por patógenos en comparación con las

no micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010). En el presente trabajo se planteó realizar

esfuerzos para identificar a nivel de transcrito el gen de la faseolina y determinar su

posible relación con la defensa inducida por micorrización en plantas de frijol

colonizadas con el hongo Rhizophagus irregularis (antes Glomus intraradices).

Además, con base en la observación de que la proteína faseolina se acumula

diferencialmente en plantas micorrizadas, se probó la adición exógena de

hidrolizados de proteína provenientes de semillas, en donde se acumula faseolina en

grandes cantidades, como estrategia práctica para la inducción de defensa. Esto con

la idea de proponer al hidrolizado de semilla de frijol como un inductor de defensa

novedoso y con potencial aplicación biotecnológica.

3

II. ANTECEDENTES

2.1 Panorama actual y producción de frijol en México

Cultivado desde hace ocho mil años, el frijol es una semilla comestible de la familia

de las leguminosas, originaria de América. Nuestro país es considerado como uno de

los centros de origen de varias especies de frijol, siendo la principal Phaseolus

vulgaris (SHCP, 2014). El frijol es una rica fuente de proteínas e hidratos de carbono,

además de ser una buena fuente de vitamina del complejo B como es la niacina, la

riboflavina, el ácido fólico y la tiamina. Igualmente proporciona hierro, cobre, zinc,

fósforo, potasio, magnesio y calcio y tiene un alto contenido en fibra. También es

una excelente fuente de ácidos grasos poliinsaturados (SHCP, 2014).

El frijol es un alimento fundamental en la dieta de la población mexicana, sobre todo

para las clases más desprotegidas del país, ya que constituye la principal fuente de

proteínas para ese sector, siendo un alimento que no puede sustituirse con algún

otro (SHCP, 2011). El frijol participa con el 2% del valor de la producción agrícola

(cerca de 14 mil mdp) y concentra entre 1.7 y 1.8 millones de hectáreas, el 7.4% de

la superficie sembrada en México. En 2015, la producción de frijol alcanzó

969,146.28 toneladas con un valor de producción de 9,469,052.46 miles de pesos.

2.2 Micorrizas

Se conoce con el nombre de micorriza (del griego “myco”, hongo y “rhiza”, raíz) a la

asociación mutualista establecida entre las raíces de la mayoría de las plantas y un

grupo de hongos del suelo (Smith y Read, 2008). En esta asociación, la planta le

proporciona al hongo carbohidratos (azúcares, producto de su fotosíntesis) y un

micro-hábitat para completar su ciclo de vida; mientras que el hongo, a su vez, le

permite a la planta una mejor captación de agua y nutrimentos minerales con baja

disponibilidad en el suelo, como el fósforo, así como defensas contra patógenos

(Pozo y Azcón-Aguilar, 2007). Se cree que las micorrizas fueron fundamentales para

que las plantas colonizaran los ambientes terrestres hace más de 400 millones de

años (Remy et al., 1994). Existen dos tipos de micorrizas, las ectomicorrizas, en las

4

que el tejido fúngico micelial coloniza la raíz de la planta de manera extracelular y las

endomicorrizas o micorrizas arbusculares, en donde las hifas que invaden el tejido

radical penetran las células de la raíz para establecer una simbiosis intracelular

(Smith y Read, 2008). En este trabajo nos enfocaremos en la simbiosis micorriza

arbuscular.

2.2.1 Micorriza arbuscular

El tipo más común de micorriza son las arbusculares (MA) (Smith y Read, 2008;

Hause et al., 2002). Recientemente los hongos micorrízicos arbusculares (HMA)

fueron reubicados filogenéticamente al filum Mucoromycota, subfilum

Glomeromycotina (Spatafora et al., 2016). Estos hongos son simbiontes obligados, lo

cual significa que solo pueden completar su ciclo de vida mientras colonizan una raíz

(Smith y Read, 2008). Las esporas de estos hongos germinan en el suelo y colonizan

las células corticales de una planta huésped. El hongo, dentro de la raíz, se invagina

por el plasmalema de la célula vegetal y produce una estructura profusamente

ramificada llamada arbúsculo, que es el sitio de intercambio de nutrimentos entre el

hongo y la planta. Conforme la colonización micorrizíca comienza a envejecer, el

hongo produce sobre las raíces o dentro de ellas, estructuras de almacenamiento

llamadas vesículas, las cuales contienen abundantes lípidos y se consideran

reservorios de nutrimentos para el hongo (Smith y Read, 2008), así como esporas

necesarias para su propagación.

Actualmente son bien conocidos algunos de los efectos benéficos de los HMAs. Se

ha observado que estos hongos influyen en la diversidad y productividad de sus

plantas hospederas en diferentes ecosistemas. Uno de los principales beneficios

comprende la mayor absorción de elementos poco móviles en el suelo como el

fósforo, cobre y zinc por parte de las plantas colonizadas por HMAs en comparación

con las no colonizadas (Smith y Read, 2008). A cambio de recibir algunos nutrientes

minerales, la planta le brinda al hongo una fuente de carbono en forma de glucosa y

otros carbohidratos de tipo hexosa, para que éste pueda desarrollarse y completar su

ciclo de vida (Smith y Read, 2008).

5

2.2.2 Resistencia Inducida por Micorrización

Además de las ventajas nutricionales que un hongo micorrízico arbuscular confiere a

la planta, existe evidencia en la literatura que indica que esta asociación aumenta la

habilidad del fotobionte para tolerar diferentes tipos de estrés tanto abióticos, tales

como el hídrico y salino, así como bióticos, tal como el ataque por patógenos,

disparando la inducción de resistencia, tanto de manera local (en raíz), como de

manera sistémica (en hojas). A esta resistencia se le denomina resistencia inducida

por micorrización o MIR (por sus siglas en inglés, Mycorrhiza Induced Resistance)

(Pozo, 2007). A la fecha, se ha publicado bastante evidencia referente a la existencia

de la resistencia inducida por micorrización en varios sistemas hongo micorrízico-

planta-patógeno, tales como la resistencia de plantas de tomate micorrizadas con R.

irregularis al patógeno bacteriano Xanthomonas campestris pv vesicatoria (Galindo-

Flores, 2008) y en plantas de frijol al hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum

(Mora-Romero, 2008). Por otra parte se ha observado que plantas de arroz

colonizadas por R. irregularis muestran una clara reducción en la gravedad de la

enfermedad tizón del arroz causada por el hongo Magnaporthe oryzae (Talbot, 1984

y en tomate la resistencia a Alternaria solani por el hongo micorrízico Funneliformis

moseae (Song et al., 2015), además de otros.

En nuestro grupo de investigación, se ha demostrado que plantas micorrizadas de

variedades de frijol, tales como Azufrado Regional 87, Jamapa y Azufrasin, son

menos susceptibles al ataque por el patógeno S. sclerotiorum, aunque la variedad

Higuera, no mostró dicha protección (Mora-Romero et al., 2015). En un trabajo previo

de proteómica diferencial se observó que plantas de frijol variedad Azufrado Regional

87 mostraron la acumulación diferencial de una proteína en hojas de plantas

micorrizadas, misma que fue identificada como faseolina. De manera interesante, la

variedad Azufrado Higuera, la cual no manifestó protección contra S. sclerotiorum, no

mostró la acumulación diferencial de esta proteína en plantas micorrizadas o no

micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010).

6

2.3 Faseolina es la principal proteína de almacenamiento de semilla de frijol

Faseolina es una glicoproteína que pertenece a la clase vicilina 7S, es la principal

proteína de almacenamiento de la semilla de frijol común, representa del 40-60% del

total de las proteínas del grano de frijol (Bollini y Vitale, 1981), por lo tanto, se

considera determinante en el valor nutricional de las proteínas de semillas de frijol,

tanto por su cantidad como en su calidad alimenticia (Camacho et al., 2010). Las

proteínas de reserva de semilla se acumulan en niveles altos en tejidos específicos,

como endospermo y cotiledones (Petruccelli, 2010). Estas se sintetizan y acumulan

durante la etapa media del desarrollo del grano y se almacenan en grandes

cantidades en forma de agregados subcelulares llamados “cuerpos proteicos” hasta

que se hidrolizan durante la maduración y germinación de la semilla (Camacho et al.,

2010).

Las proteínas de almacenamiento son la principal fuente de nitrógeno y energía para

las semillas y el fruto durante el crecimiento reproductivo y la rápida expansión de las

estructuras vegetativas después del periodo de dormancia y durante la germinación

(Sandoval, 2012). En 1924, Osborne clasificó las proteínas de semilla en cuatro

grupos en base a su solubilidad en diferentes agentes extractantes: en agua

(albúminas), soluciones salinas (globulinas), mezclas de alcohol/agua (prolaminas) y

soluciones ácidas o alcalinas (gluteínas) (Petruccelli, 2010). Osborne fue el primero

en darse cuenta que si bien las semillas de frijol contienen proteínas globulinas, la

principal proteína de almacenamiento difiere significativamente de legumina y vicilina

de guisantes y soya en términos de solubilidad, estabilidad al calor y la composición

química, por lo cual llamó a esta importante proteína de almacenamiento de semilla

de frijol como "faseolina" (Emani, 2008).

Las globulinas son el grupo de proteínas de reserva más ampliamente distribuido en

la naturaleza, conforman la mayor parte de las proteínas en ciertos granos (Shewry,

1995), encontrándose tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas

(Petruccelli, 2010). Y aunque estructuralmente son similares, son clasificadas con

base en su coeficiente de sedimentación en gradiente de sacarosa en: globulinas 7S

y 11S. (Petruccelli, 2010).

7

En general, son deficientes en aminoácidos azufrados metionina y cisteína, (Shewry,

1995). Las globulinas 7S suelen estar glicosiladas, entre éstas se encuentran la

faseolina de frijol.

En estudios anteriores, mediante análisis electroforéticos se logró observar la

acumulación de proteínas durante el desarrollo de la semilla de frijol, mostrando en

un inicio una discreta acumulación de faseolina 12 días después de la antesis y

seguido de una dramática acumulación durante los siguientes días (Emani, 2008).

Estos resultados sugirieron que el embrión en desarrollo de frijol pudiera ser un tejido

ideal para el aislamiento del RNAm de este gen, esto hizo que la faseolina fuera una

de las primeras proteínas vegetales para ser traducida in vitro (Hall et al., 1978).

La clonación de dos genes de faseolinas y los cDNA correspondientes mostraron que

esta proteína está codificada por una familia de genes. Las faseolinas α y β son muy

similares y solo se distinguen entre ellas por dos regiones repetidas en el gen α que

codifican para 14 aminoácidos adicionales con respecto al gen β (Slightom et al.,

1985).

Las faseolinas forman una familia de proteínas similares pero ligeramente

heterogéneas en su composición de polipéptido no sólo causado por la divergencia

en su secuencia de DNA, sino también por las modificaciones co- y post-

traduccionales (Talbot et al., 1984).

2.3.1 Estructura de la proteína faseolina

Faseolina contiene un péptido señal de 24 aminoácidos, que abarca desde la Met 1 a

la Ala 24 con residuos de arginina cargados positivamente en las posiciones 2 y 4,

seguido de un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que es característico de los

péptidos señal que ayuda en el secuestro de proteínas solubles en el retículo

endoplasmático.

2.3.2 Proteínas vegetativas de reserva

Además de encontrarse preponderantemente en la semilla, existen algunos reportes

donde este tipo de proteínas han sido encontradas en tejidos vegetativos como en

8

hojas. A estas proteínas se les ha denominado proteínas vegetativas de reserva

(PVR, o VSP por sus siglas en inglés, por “Vegetative Storage Proteins”) (Staswick,

1994). Aunque el papel de estas proteínas en tejidos vegetativos aún no es claro, su

función parece ser otra a la de una proteína de reserva de semilla. Por ejemplo, en

un trabajo silenciaron el gen de una VPR en plantas de soya, y la planta produjo

semillas de manera normal, indicando que el gen silenciado no era esencial para el

desarrollo de semilla (Staswick, 2001). Existe un reporte en donde demostraron que

una VSP de Arabidopsis thaliana posee actividad insecticida (Liu et al., 2005). Tal

como se mencionó con anterioridad, la faseolina inducida por micorrización fue

acumulada diferencialmente en hojas de plantas micorrizadas de frijol comparadas

con plantas no micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010). De manera interesante, dicha

expresión diferencial fue encontrada en la variedad Azufrado Regional 87, la cual

mostró inducción de bioprotección por micorrización contra un hongo fitopatógeno,

pero no en la variedad Higuera, la cual no fue capaz de inducir su acumulación por

micorrización.

Con el objetivo de estudiar la expresión a nivel transcripcional del gen de la faseolina

en tejido vegetativo, particularmente en hojas, en el presente estudio se realizaron

esfuerzos por detectar el gen de faseolina inducido por micorrización en hojas de

plantas de frijol. Por otro lado, un experimento preliminar en nuestro laboratorio

indicó que la adición exógena de hidrolizados proteicos de semilla de frijol,

tentativamente conteniendo predominantemente péptidos de faseolina, a plantas no

micorrizadas de frijol Azufrasin (variedad capaz de inducir protección contra

patógenos por micorrización) indujo protección a niveles similares a lo observado en

plantas micorrizadas. Con base en todo esto, se hipotetiza que la faseolina inducida

por micorrización en hojas podría tener un papel asociado con la defensa inducida

por micorrización, y también que la adición exógena de hidrolizados proteicos de

semillas de frijol podría tener una aplicación biotecnológica para la inducción de

defensa en esta importante especie de cultivo.

9

III. JUSTIFICACIÓN

Actualmente, el control de enfermedades de cultivos agrícolas se lleva acabo

principalmente por el uso de pesticidas sintéticos, por lo cual es necesario encontrar

alternativas a estas prácticas que no dañen al medio ambiente y a la salud humana.

El uso de micorrizas puede inducir defensa sistémica contra algunos patógenos. En

el caso de frijol, se ha asociado esta defensa a la acumulación de la proteína

faseolina en hojas de plantas micorrizadas de la variedad Azufrado Regional 87, sin

embargo se desconoce a qué nivel se lleva a cabo la regulación de esta proteína.

Por otro lado, la adición exógena de hidrolizados proteicos de semillas de frijol (el

cual contiene un alto porcentaje de faseolina) indujo defensa contra un patógeno en

una variedad de frijol que presentó resistencia inducida por micorrización, por lo

tanto, es importante también definir si la adición exógena de hidrolizados puede

inducir protección contra patógenos independientemente del estado micorrizado y de

la variedad del frijol. Esto permitiría determinar el potencial biotecnológico de estos

hidrolizados como inductores de protección en cultivos de importancia agrícola como

el frijol, representando una alternativa más sustentable para el control de

enfermedades.

10

IV. HIPOTESIS

Existe una familia de genes de faseolina en el genoma de frijol y la

micorrización induce la expresión de uno de sus miembros en hojas de frijol

micorrizado.

La adición exógena de hidrolizados proteicos a plantas de frijol posee

potencial biotecnológico para el control de moho blanco en frijol.

V. OBJETIVOS

Objetivo 1

Analizar in silico la familia de genes de faseolina y confirmar su expresión en hojas

de frijol como respuesta a la micorrización.

Objetivo 2

Evaluar el efecto de la adición exógena de hidrolizados de proteína de frijol en la

respuesta de inducción de protección contra el moho blanco en frijol.

11

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Obtención y mantenimiento de plantas de frijol micorrizadas y no

micorrizadas

Semillas de frijol (Azufrado Higuera, Azufrado Regional 87 y Azufrasin) fueron

desinfectadas con hipoclorito de sodio al 0.5% durante 3 minutos, seguido de una

inmersión en etanol al 50 % durante 1 minuto y enjuagadas cuatro veces con agua

destilada estéril. Las semillas fueron sembradas en semilleros de polietileno,

utilizando como sustrato vermiculita-arena (1:1; v/v) previamente esterilizado a 121

°C, durante una hora. Ocho días posteriores a la germinación, cada planta fue

inoculada con aproximadamente 500 esporas de R. irregularis, y transplantadas a

macetas individuales. Para el tratamiento control no micorrizado se empleó el último

lavado de la suspensión de esporas. Las plantas fueron fertilizadas tres veces por

semana con 50 mL de solución nutritiva Hoagland (Ca(NO3)2.4H2O 2.5 mM; KNO3

2.5 mM; MgSO4.7H2O 1 mM; NaFe 50 μM; KH2PO4 20 μM; H3BO3 10 μM;

Na2MoO4.2H2O 0.2 μM; ZnSO4.7H2O 1.0 μM; MnCl2.4H2O 2.0 μM;CuSO4.5H2O 0.5

μM; CoCl2.6 H2O 0.2 μM; HCl 25.0 μM; Buffer MES 0.5 mM descrita por Millner y Kitt,

1992) (con bajo fosfato (20 µM) para favorecer el establecimiento de la simbiosis).

Las plantas se mantuvieron en cuarto de crecimiento a 25ºC con un fotoperiodo de 8

h luz/16 h oscuridad. En el Experimento 1, las plantas se mantuvieron durante 6

semanas, dentro del periodo de enero a marzo de 2017. Para el Experimento 2, de

junio a julio del 2017.

6.2 Determinación del porcentaje de micorrización

Las raíces fueron lavadas con agua destilada, colocadas en tubos de 50 mL (Marca

Falcon) con etanol al 50 % durante 24 horas y después enjuagadas con agua

destilada. Posteriormente se les adicionó KOH al 20% y se mantuvieron en esta

solución por tres días para clarificar las raíces, después fueron enjuagadas con agua

destilada cuatro veces e incubadas con HCl al 1% durante una hora. Posteriormente

se adicionó azul de tripano al 0.33% durante un día para teñir el tejido fúngico. El

colorante fue eliminado por decantación y en seguida se les añadió lactoglicerol

(agua, glicerina y ácido láctico 1:1:1). Una vez teñidas, las raíces se mantuvieron a

12

temperatura ambiente hasta su análisis (Phillips y Hayman, 1970). Para determinar el

porcentaje de colonización, 50 fragmentos de raíces de 2 cm de cada muestra fueron

dispersadas en una caja Petri cuadriculada y analizada bajo el microscopio

compuesto para determinar el porcentaje de colonización por el método de

intersección a la línea (Giovanetti y Mosse, 1980).

6.3 Análisis in silico

Se realizó una búsqueda de parálogos de faseolina en el genoma de frijol BAT93,

utilizando el programa BLAST de la base de datos de NCBI

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov). De las secuencias obtenidas se seleccionaron las que

presentaron una mayor cobertura y porcentaje de identidad con la secuencia de

faseolina, además tomando en cuenta que el genoma de frijol se encuentra

incompleto se tomó como referencia la secuencia del PDB (Protein Data Bank) de la

proteína de faseolina.

6.4 Extracción de RNA

Tejido foliar de frijol previamente congelado con nitrógeno líquido y almacenado a

-80°C se pulverizó en mortero y pistilo de porcelana con nitrógeno líquido.

La extracción y purificación del RNA total se extrajo a partir de tejido foliar congelado

y pulverizado, y se realizó por el método de TRIZol (Ambion) de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Para cada 100 mg de tejido se adicionó 1 mL de reactivo

de TRIZol, se mezcló con vortex y se incubó por 5 minutos, se adicionaron 200 µL de

cloroformo grado molecular y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente,

después se centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4°C. 400 µL de la fase acuosa se

transfirieron a un tubo nuevo, al cual se le adicionó 400 µL de cloroformo, se mezcló

con vortex por 10 segundos y se centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4°C.

Posteriormente se transfirieron 300 μL de la fase acuosa a un tubo nuevo, se

adicionaron 300 μL de isopropanol frío, se mezcló bien y se dejó precipitar el RNA en

hielo por 10 minutos. Se centrifugó nuevamente a 12,000 g por 15 minutos a 4°C, se

retiró el isopropanol por decantación, se adicionó 1 mL de etanol frio al 75% y se

13

incubó por 10 minutos en hielo. Se centrifugó durante 5 minutos a 7,500 g a 4°C,

se retiró el etanol por decantación y se dejó secar al aire la pastilla por 5 minutos. El

RNA fue resuspendido con 50 μL de agua ultrapura (Ambion) para posteriormente

aplicar un tratamiento con ADNasa que consistió en agregar directamente en el tubo

4 µL de buffer 10X y 1 µL de Turbo-DNAfree (invitrogen by Thermo Fisher Scientific)

para incubarse a 37 °C por 30 minutos. Posteriormente, se agregó 5 μL del reactivo

de inactivación, se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se

centrifugó a 10,000 g por 1.5 minutos. Finalmente, el sobrenadante fue transferido a

un tubo nuevo. El RNA fue cuantificado espectrofotométricamente, y la integridad se

examinó mediante gel de agarosa al 1%.

6.4.1 Síntesis de cDNA

El RNA total fue empleado para sintetizar cDNA por transcripción reversa con la

enzima SuperScript III (Invitrogen), cada reacción contenía 1 µL de oligo-dT (50 µM),

1 µL de 10 mM de una mezcla de desoxinucleótidos (dA, dC, dG y dT), 1 μg de

RNA total y agua ultrapura para llegar a 13 µL. La mezcla se incubó a 65 °C durante

10 min, colocándose inmediatamente en hielo por al menos 5 minutos,

posteriormente se adicionaron por reacción 4 µL de 5X First Strand buffer, 1 µL de

0.1 M DTT y 0.5 µL de la enzima RNAout (40 U/ µL) y 1 µL de la enzima Super

Script III RT y agua ultrapura (Ambion) para llevar a un volumen final de 20 µL. Se

incubó la reacción por 60 min a 50 °C y posteriormente 15 min a 75 °C para inactivar

la enzima.

6.4.2 PCR en punto final

Las mezclas de reacción contenían concentraciones finales de 200 nM de cada

oligonucleótido, 1 mM de una mezcla de desoxinucleótidos (dA, dC, dG y dT), 2 mM

de MgCl2, 1X buffer de reacción (proporcionado por el fabricante) y 50 ng de cDNA y

0.2 µL de Taq polimerasa (Invitrogene 5U/µL). Los programas utilizados en el

termociclador variaron dependiendo de la Tm de cada uno de los oligonucleótidos, al

igual que el tamaño del producto esperado y son especificados en la sección de

resultados y discusiones.

14

6.5 Obtención de aislados proteicos e hidrolizados de frijol

Se utilizó grano de frijol variedad Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera para

obtener los hidrolizados. El grano fue pulverizado utilizando un molino pulverizador

Retch MM 301 (Retsch GmbH-Haan, Alemania). El producto de la molienda del

grano se tamizó empleando un tamiz de luz de malla 246 μm, la harina que pasó a

través de la malla se utilizó en el proceso de obtención del concentrado proteico. Se

preparó una solución proteica de harina de frijol en agua destilada al 10% (p/v). La

proteína se solubilizó bajo condiciones alcalinas (pH 8-9) utilizando NaOH 2M, una

vez ajustado el pH en la solución se mantuvo en agitación durante 1 hora a

temperatura ambiente. Posteriormente se centrifugó por 30 min a 4500 rpm a una

temperatura de 4°C. Se extrajo la pastilla y se recuperó el sobrenadante para

continuar con la precipitación isoeléctrica bajo condiciones ácidas ajustando el

sobrenadante a un pH de (4.3-4.6) con HCl 4M y se dejó en reposo durante toda la

noche a 4°C para permitir la precipitación de las proteínas. Transcurrido el tiempo se

centrifugó bajo las siguientes condiciones: 4500 rpm a una temperatura de 4°C por

15 min. Una vez obtenida la pastilla (concentrado proteico) ésta fue liofilizada y

posteriormente pulverizada con un mortero. El extracto fue mantenido a -20°C, hasta

su utilización.

Para los hidrolizados se preparó una solución de 5 g de concentrado proteico con

100 mL de agua destilada, ajustando la solución a condiciones alcalinas (pH 8-9) con

NaOH 2M a 50°C, al alcanzar las condiciones mencionadas se adicionó la enzima

proteasa de Bacillus licheniformis (Sigma) en una relación de 4% en función de la

proteína de frijol. Se dejó actuar la enzima durante dos horas manteniendo las

condiciones alcalinas y temperatura constante, posteriormente se acidificó el medio

con HCl a pH 4 y se centrifugó a 4500 rpm por 15 minutos. Por último, se realizó la

ultrafiltración del líquido en Stirred Ultrafiltration Cell (marca y modelo), empleando

membranas de celulosa con poros de 5000 KD.

15

6.6 Aplicación del extracto proteico

El extracto proteico fue agregado de manera exógena a las plantas de frijol por

aspersión utilizando un atomizador (2 mL por planta). Para el tratamiento control, las

plantas fueron asperjadas con agua destilada. Una vez asperjadas, las plantas

fueron mantenidas en el cuarto de cultivo por 24 h y posteriormente utilizadas para

los ensayos de infección con S. sclerotiorum.

6.7 Ensayo de infección por S. sclerotiorum

El patógeno S. sclerotiorum se obtuvo a partir de esclerocios colectados en campo,

los cuales fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 0.5% durante un minuto,

seguido por un minuto con agua destilada estéril, secados perfectamente con papel y

sembrados en cajas de Petri con PDA. Los esclerocios desinfectados fueron

incubados a 19°C para inducir su germinación. De las cajas con el patógeno

germinado se cortaron discos de 0.5 cm de diámetro con la ayuda de un

sacabocados previamente estéril. Los discos de agar se colocaron en el envés de

foliolos escindidos de plantas de frijol, y para mantener las condiciones de humedad,

los foliolos fueron colocados en una cámara húmeda construida en una caja de Petri

con papel filtro y dos portaobjetos en cruz. El monitoreo del nivel de infección por el

patógeno mediante la medición del halo necrótico se llevó a cabo cada 6 horas,

utilizando una regla.

6.8 Análisis estadístico

Se realizó el análisis de varianza ANOVA y comparación de medias con Tukey, con

un intervalo de confianza del 95 % utilizando el programa estadístico para

computadoras SAS (Statistical Analysis System), con la finalidad de observar las

posibles diferencias entre los diámetros de las lesiones ocasionadas por el patógeno

en los tratamientos empleados en los experimentos fisiológicos de infección.

16

VII. RESULTADOS

7.1 Análisis moleculares

7.1.1 Análisis in silico de secuencias de faseolina a partir de la secuencia inducida

por micorrización en hojas de frijol variedad Azufrado Regional 87

Con el objetivo de identificar todas aquellas regiones en el genoma de frijol

homólogas al gen de la faseolina, se llevó a cabo un análisis en el programa BLAST

(tblastn) utilizando la secuencia del PDB de faseolina disponible en el GeneBank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) y se comparó con el genoma de frijol (no. referencia

CM003672.1). De este análisis, se obtuvieron 11 parálogos, los cuales fueron todos

ubicados en el cromosoma 7, el cual es de un tamaño de 51,758,522 nucleótidos. En

el Cuadro 1 se muestran las coordenadas de los 11 parálogos en el cromosoma.

Cuadro 1. Parálogos a faseolina ubicados en el cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris, F, secuencia en sentido; R, secuencia en anti-sentido o reverso.

Parálogos de PDB

(Coordenadas en el cromosoma 7)

Sentido

1 5081211 5080705 R

2 5080616 5080182 R

3 4959919 4960425 F

4 4960508 4960594 F

5 4961095 4961319 F

6 5080053 5079829 R

7 5064390 5064845 F

8 5065499 5065729 F

9 5065126 5065395 F

10 5064902 5065027 F

11 4960719 4960964 F

Las 11 secuencias parálogas se localizaron en tres regiones principales en el

cromosoma 7. Ya que las secuencias se ubicaban en sentidos contrarios, se

nombraron inicialmente como secuencia F1 y F2 (Forward), y R2 (Reverse), por su

orientación. En la Figura 1, se esquematiza las regiones de las secuencias F1, F2 y

R1 en el cromosoma 7. Un análisis más cercano de cada uno de los parálogos indicó

que éstos correspondían a exones dentro de la secuencia genómica.

17

Figura 1. Región del cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris en donde se ubican los parálogos del gen de la faseolina F1, F2 y R1.

La comparación de la secuencia F1 y R1 con los genes de faseolina previamente

clonados (Slightom et al., 1983; 1985) indicaron que la secuencia F1 correspondía al

gen la α-faseolina, mientras que el R1 al de la β-faseolina. Además de la F2, el

análisis de la comparación de secuencias no arroja ninguna otra región homóloga a

la faseolina en todo el genoma del frijol. La región F2 corresponde a un gen que

contiene regiones homólogas a las faseolinas, sin embargo es claramente diferente,

no solo porque tiene un mayor tamaño y es mucho menos homólogo que F1 y R1

entre sí (Anexo 1).

En un trabajo previo, se identificó como faseolina una proteína acumulada

diferencialmente en hojas de frijol micorrizado con respecto a las proteínas de hojas

de frijol no micorrizado (Quintero-Zamora, 2010). Posteriormente, pequeños péptidos

correspondientes a esta proteína se secuenciaron para diseñar, a partir de estos

péptidos, oligonucleótidos degenerados. Se llevó a cabo entonces una reacción de

PCR usando dichos oligonucleótidos degenerados y como templado cDNA obtenido

a partir de hojas de plantas micorrizadas. El fragmento amplificado se secuenció. A

esta secuencia se le denominó “faseolina inducida por micorrización” o FIM

(Quintero-Zamora y Medina-Godoy, comunicación personal). En la Figura 2, se

muestra la comparación de la secuencia de FIM y las secuencias deducidas de

4,9

50 x

10

3

4,9

60 x

10

3

4,9

70 x

10

3

4,9

80 x

10

3

4,9

90 x

10

3

5,0

00 x

10

3

5,0

05 x

10

3

5,0

10 x

10

3

5,0

30 x

10

3

5,0

40 x

10

3

4,9

55 x

10

3

4,9

65 x

10

3

4,9

75 x

10

3

4,9

85 x

10

3

4,9

95 x

10

3

5,0

15 x

10

3

5,0

25 x

10

3

5,0

35 x

10

3

5,0

45 x

10

3

5,0

90 x

10

3

5,0

50 x

10

3

5,0

55 x

10

3

5,0

60 x

10

3

5,0

65 x

10

3

5,0

70 x

10

3

5,0

75 x

10

3

5,0

80 x

10

3

5,0

85 x

10

3

4,959,769-4961,353 5,063,844-5,066,258 5,081,211-5,0799792

Cromosoma 7 Phaseolus vulgaris

5,0

20 x

10

3

F1 F2 R1

18

aminoácidos de α y β-faseolina. Las secuencias de α y β-faseolina muestran una

homología del 98% entre sí a nivel de aminoácidos. Sin embargo, el gen de la α-

faseolina contiene repeticiones directas que codifican 14 aminoácidos adicionales

(Slightom et al., 1985). Como puede observarse en la comparación de secuencias de

la Figura 2, FIM resultó homóloga a β faseolina.

α 1 MMRARVPLLLLGILFLASLSASFATSLREEEESQDNPFYFNSDNSWNTLFKNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVE 79

β 80 MMRARVPLLLLGILFLASLSASFATSLREEEESQDNPFYFNSDNSWNTLFKNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVE 79 FIM --------------------------------------------------------------------------------

α 81 FRSKPETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTS-DNPIFSDHQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLA 159

β 81 FRSKPETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTQGDNPIFSDNQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLA 160

FIM 1 ------------LADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFLLTQGDNPIFSDHQTIPAGTIFYLINPDPKEDLRIIQLA 71

α 160 MPVNNPQIHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQEegqqeGVIVNIDSEQIEELSKHAKSS 239

β 161 MPVNNPQIHEFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVIVNIDSEQIKELSKHAKSS 235

FIM 72 MPVNNPQIHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVTVNIDSEQIKELSKHAKSS 146

α 240 SRKSHSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEFESY 319

β 236 SRKSLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEFESY 315

FIM 147 SRKSKSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEYESY 226

α 320 RAELSKDDVFVIPAAYPVAIKATSNVNFTGFGINANNNNRNLLA------- 363

β 316 RAELSKDDVFVIPAAYPVAIRATSNVNFTGFGINANNNNRNLLAgiyiyyi 366

FIM 227 RAELF---------------------------------------------- 231

Figura 2. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas deducidas de los cDNAs de α y β faseolina con FIM. En rojo se muestra la región de homología de los genes α y β faseolina con FIM.

7.1.2 Diseño y pruebas de amplificación de los oligonucleótidos diseñados

Una vez identificado el gen de FIM se diseñaron oligonucleótidos específicos

para los genes α y β faseolina con el fin de confirmar la expresión de la β faseolina

en hojas de plantas de frijol micorrizadas. La ubicación de cada uno de los

oligonucleótidos diseñados se muestra en la Figura 3.

19

Figura 3. Gen de faseolina y ubicación de los oligonucleótidos específicos para el gen α (A1) y el β (B1, B2 y B3); entre paréntesis se indica el tamaño del fragmento amplificado esperado para cada par de oligos. Los bloques de colores representan los exones y las líneas azules los intrones. Las flechas rojas indican el inicio (izquierda) y final (derecha) de la traducción. Los números debajo de las barras indican la posición de las bases en donde inician y terminan los intrones y exones.

Primeramente, cada par de oligonucleótidos fue probado en reacciones de PCR en

punto final utilizando una muestra de DNA genómico de la variedad Azufrado

Regional 87 como control positivo con la finalidad de corroborar la obtención de un

amplicón del tamaño esperado.

En la Figura 4 se presenta la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos para

los oligonucleótidos β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R para el gen de la β faseolina, y

α1F/ α1R para el gen de la α faseolina; además se probó el par β3F/β1R (Figura 3).

Los oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto

esperado en el control de DNA, en el Cuadro 2 se presentan los tamaños esperados

de los amplicones obtenidos.

Figura 4. Análisis electroforético de productos de PCR punto final de ADN genómico de plantas de frijol. PCR utilizando los juegos de oligonucleótidos: 1) β1F/ β1R, 2) β2F/ β2R, 3) β3F/ β3R, 4) α1F/ α1R; y 5) β3F/β1R. M: Marcador de peso molecular (1Kb Plus, Invitrogen, Cat. 15628-019).

20

Cuadro 2. Tamaños esperados de los amplicones con los oligonucleótidos específicos para α y β faseolina.

Par de

oligonucleótidos

Secuencia 5’ 3’

Tamaño

DNAc (pb)

Tamaño DNA (pb)

β1F/ β1R ACAGAGTGGATGGTACTTTGTGGATGG/CTGTTACATGGTCGGATACAATA

158 158

β2F/ β2R GCAGAGAGTACTTCTTCCTTACGCAAG/GGATTATTCTGAGATCCTCTTTGGG

119 119

β3F/ β3R GTTTGAAGAGGAGGGACAGCAAGAGGG/AATTGTGTTATGTTGTTTGGAAGG

94 94

α1F/ α1R GGGACAGCAAGAGGAGGGAC/CATCTCTATAGAACTGATTAATACATTCAAGG

194 194

β3F/ β1R GTTTGAAGAGGAGGGACAGCAAGAGGG/CTGTTACATGGTCGGATACAATA

728 958


plantas de frijol Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera

Una vez corroborada la efectividad de los oligonucleótidos, se decidió probarlos en

cDNA obtenidos de hojas MIC (de plantas micorrizadas) y NO MIC (de plantas no

micorrizadas) de las variedades Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera. Este

tejido fue colectado a las seis semanas posteriores de la inoculación del HMA.

Inesperadamente, no se detectó ningún fragmento de amplificación para ninguno de

los pares de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R, α1F/ α1R,

β3F/ β1R) (datos no mostrados).

Para explorar la posibilidad de que el gen pudiera estar siendo expresado en otro

tejido y la proteína transportada y acumulada en hoja, se obtuvo cDNA de raíces de

plantas MIC y NO MIC y se llevó a cabo PCR con los oligos específicos para los

genes α y β faseolina. Se probaron las variedades Azufrado Higuera y Azufrado

Regional 87. En ninguno de los casos se obtuvo amplificación (β1F/ β1R, β2F/ β2R,

β3F/ β3R, α1F/ α1R, β3F/ β1R) (datos no mostrados).

21


cotiledones de semillas de frijol

A pesar de que los oligonucleótidos ya habían sido probados exitosamente en DNA

genómico, se decidió obtener RNA de cotiledones de semillas germinadas, en donde

se ha reportado una alta expresión de la faseolina a nivel de RNA (Burow-Mark,

1992).

Se obtuvo RNA de cotiledones de semillas cinco días posteriores a la germinación, y

a partir de este se sintetizó el cDNA, mismo que fue utilizado como templado en una

reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para β-faseolina. En la

Figura 5 se muestra la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos. Los

oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto esperado

en cDNA de cotiledones, corroborando de esta manera la expresión del gen β-

faseolina en semillas germinadas, y confirmando que la metodología y los

oligonucelótidos utilizados eran adecuados.

Figura 5. Análisis electroforético de productos de PCR en punto final utilizando como templado cDNA de cotiledones de frijol var. Reg 87 (carriles 1 a 4), y DNA genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 5). Se utilizaron los oligonucleótidos β1F/ β1R (carril 1); β2F/ β2R (carril 2); β3F/ β3R (carril 3), β3F/β1R (carril 4 y 5).

22


plantas de frijol Azufrado Regional 87

En este ensayo se trabajó con tejido de Azufrado Regional 87 colectado cuatro

semanas posteriores a la inoculación del HMA R. irregularis. Se obtuvo el cDNA de

hojas de plantas MIC y NO MIC y se utilizó como templado en una reacción de PCR

utilizando el juego de oligonucleótidos específicos para β-faseolina. De los tres

juegos de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R y β3F/ β3R) únicamente el

juego β3F/ β3R amplificó de manera apropiada el producto esperado (Figura 6c).

Cada juego de oligonucleótidos fue diseñado en una región distinta del gen β-

faseolina. De manera adicional, se probó el par de oligonucleótidos β3F/β1R, cuyo

amplicón esperado era de 728 pb (ver Figura 3). También se probaron los

oligonucleótidos específicos para el gen α-faseolina, sin embargo, este gen tampoco

presentó amplificación. En la Figura 7 se muestran los amplicones obtenidos con

este juego de oligonucleótidos en cDNA de cotiledón y de DNA genómico, sin

embargo, no se observaron productos de PCR en las muestras de hojas.

23

Figura 6. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Azufrado Regional 87. a) β1F/ β1R, b) β2F/ β2R, c) β3F/ β3R y d) Factor de Elongación (EF 1α). MIC (carril 1); Hoja de planta NO MIC (carril 2); Cotiledón de frijol Azufrado Regional 87 (carril 3); ADN genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 4).

M 1 2 3 4 a)

b)

c)

d)

24

Figura 7. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Reg 87. Carriles de 1 al 4 (αF/αR), carriles del 5 al 8 (β3F/ β1R). Carril 1 y 5, cDNA de hojas de plantas MIC; Carril 2 y 6, cDNA de hojas de plantas NO MIC; Carril 3 y 7, cDNA de cotiledón; Carril 4 y 8, DNA genómico.

7.1.6 Experimentos de confirmación de la amplificación con los oligonucleótidos

degenerados

Con el objetivo de corroborar la amplificación de la faseolina inducida por

micorrización (FIM) a partir de cDNA de hojas de plantas de frijol micorrizado, se

llevó a cabo un PCR con los oligonucleótidos degenerados originalmente utilizados

en un trabajo preliminar (Phas1 Forward: GGC TGA TGC TGA GTT ACT CCT;

Phas2 Reverse; CCN AMG CTG CTN AMG ACA TT). Para ésto, se llevó a cabo un

gradiente de temperatura de 30 a 54°C. Como se muestra en la Figura 8, en las

temperaturas de 32.7 y 35.9°C se observó una banda de amplificación, sin embargo,

dicho fragmento no corresponde a la banda esperada de 837 bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

25

Figura 8. Análisis electroforético de productos de PCR punto final en gradiente de temperatura utilizando como templado cDNA de hojas de plantas MIC de frijol var. Azufrado Regional 87. Con el oligonucleótido específico Phas1 Forward y el degenerado Phas2 Reverse.

La expresión del gen β-faseolina ha sido estudiada en detalle y se conoce que

sucede muy específicamente en tejido embrionario en frijol (Li et al., 1999; 2001). Sin

embargo, se ha reportado también que el promotor de la β-faseolina puede activarse

en tejidos vegetativos expuestos a la fitohormona ABA siempre y cuando el factor de

transcripción ABI3 (PvAlf en frijol) esté siendo expresado (Li et al., 1999; Ng et al.,

2006).

Con base en esta información, se planteó el siguiente modelo: la condición de

micorrización podría estar causando un aumento en la concentración de ABA en los

tejidos de las plantas micorrizadas, así como un aumento en la expresión de PvAlf,

de tal manera que la β-faseolina se exprese en tejidos vegetativos como hoja.

Plantas no micorrizadas no estarían expresando PvAlf, por lo tanto, serían incapaces

de responder a un aumento en ABA y no expresarían el gen de la faseolina.

Para probar este modelo, cDNA proveniente de hojas de plantas MIC y NO MIC

fueron utilizado como DNA molde en reacciones de PCR con los oligonucleótidos

PvAlfFor/PvAlfREv. De igual manera, hojas de plantas MIC y NO MIC fueron

asperjadas con ABA (200 µM) y mantenidas por 24 h, para después congelarse en

nitrógeno líquido y procesarse. Sin embargo, en ninguno de los casos (hojas de

plantas MIC y NO MIC, tratadas con y sin ABA, fue detectada la expresión ni de

PvAlf, ni de β-faseolina (datos no mostrados).

oC

26

7.2 Experimento 1. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol

La sospecha de que la proteína β-faseolina u oligopéptidos derivados de su hidrólisis

pudieran estar participando en la inducción de defensa observada en hojas de

plantas micorrizadas contra patógenos foliares llevó a la idea de probar de manera

exógena la adición de hidrolizados de esta proteína a hojas de plantas de frijol, y con

esto, la inducción de defensa.

Para esto se diseñó un primer ensayo de infección de S. sclerotiorum en plantas de

frijol de tres variedades (Azufrado Higuera, Azufrado Regional 87 y Azufrasin),

micorrizadas y no micorrizadas. A las seis semanas post-inoculación de las plantas

de frijol con el HMA R. irregularis, se les aplicó HID-1 (proteína hidrolizada de

semilla de frijol Azufrado Higuera), teniendo un control para cada variedad

micorrizada y no micorrizada con H2O destilada.

7.2.1 Porcentaje de colonización

En el Cuadro 3 se presentan los porcentajes de colonización de las plantas

colonizadas con R. irregularis y utilizadas en el ensayo de infección con S.

sclerotiorum en donde se observa que los porcentajes de colonización fueron muy

similares para las tres variedades de frijol.

Cuadro 3. Porcentaje de colonización micorrízica de tres variedades de frijol empleadas para el ensayo de infección en hoja desprendida. El inóculo consistió en 500 esporas y 100 mg de raíces transformadas de zanahoria colonizadas con R. irregularis por planta.

Tratamiento Colonización (%) DS*

Azufrado Higuera/ HID-1 43.33 9.60

Azufrasin/ HID-1 39.33 16.00

Azufrado Regional 87/ HID-1 43.66 1.52

Azufrado Higuera/ Control 42.00 9.53

Azufrasin/ Control 39.00 2.64

Azufrado Regional 87/ Control 44.33 12.09

*Desviación estándar

27

7.2.2 Peso fresco de raíces y parte aérea

En ninguna de las variedades de frijol estudiadas, se observó efecto de la

micorrización en el crecimiento, ya que cada una de las plantas tuvo un crecimiento

similar en las plantas MIC y NO MIC, tanto en raíces como en tejido aéreo (Figura

9).

a)

b)

Figura 9. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de plantas en ensayo de hojas desprendidas a) Peso fresco (g) de parte aérea, b) Peso fresco (g) de raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.

a a

b

a a

b

0

2

4

6

8

10

12

14

a

ab

bc

ab

ab

c

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Az. Higuera Azufrasin Az. Regional

NO MIC

MIC

Pe

so f

resco (

g)

28


NO MIC

Las plantas MIC y NO MIC (control, sin hidrolizados) fueron utilizadas en un ensayo

de infección con S. sclerotiorum en hojas desprendidas. La Figura 10 muestra las

lesiones ocasionadas por S. sclerotiorum a 36 horas post- inoculación con el

patógeno. En este experimento se observó que la micorrización indujo tolerancia en

la variedad Azufrado Higuera y Azufrasin con respecto al control no micorrizado. Sin

embargo en la variedad Azufrado Regional 87 no se observó este efecto de manera

significativa, aunque sí se pudo observar una tendencia.

Figura 10. Diámetros de lesión 36 horas posteriores de inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (No MIC) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra, no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.

Diá

me

tro d

e le

sió

n (

mm

)

29

7.2.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC

y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol

Se aplicaron hidrolizados provenientes de semillas de frijol variedad Azufrado

Higuera. Los resultados se muestran en la Figura 11. El efecto del tratamiento con el

hidrolizado proteico dependió de la variedad a la que fue aplicado. Para Azufrado

Higuera, el tratamiento causó una menor área de lesión en hojas de plantas NO MIC,

pero no se observaron diferencias en las plantas MIC. En contraste, las hojas de las

variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 MIC respondieron al tratamiento con

los hidrolizados mostrando una menor área de lesión, pero no las NO MIC.

30

Figura 11 . Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol micorrizadas (MIC, barras verdes), no micorrizadas (NO MIC, barras amarillas), con hidrolizado aplicado (HID-1) y tratamientos control sin hidrolizado (Control) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.

a

c

ab b

0

2

4

6

8

10 Azufrado Higuera

a a a

b

0

2

4

6

8Azufrasin

NO MIC

MIC

a a

a

b

0

1

2

3

4

5

6

Control HID-1

Azufrado Regional 87

a)

c)

b)

Diá

me

tro d

e le

sió

n (

mm

)

31

Figura 122. Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC), no micorrizadas (NO MIC) con tratamiento de hidrolizado (barras rojas) y tratamientos control (agua) (barras azules) de las variedades Azufrado Higuera, Azufrasin y Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.

7.3 Experimento 2. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol

En el Experimento 1, los porcentajes de colonización en las plantas de las tres

variedades de frijol fueron relativamente altos, sin embargo no se logró observar una

clara respuesta a la micorrización en el ensayo de infección de Azufrado Regional

87. Esta variedad ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo y está

comprobado que la micorrización es capaz de inducir defensa. El Experimento 1 se

llevó a cabo a las seis semanas de colonización, a este tiempo, las plantas de frijol

ya están en plena floración. Con el objetivo de descartar la posibilidad de que en esta

etapa fenológica la respuesta de inducción de defensa por micorrización ya no se

a

abc

bcd

ab

bcd

d

e

dc

d

bcd

e

e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87

Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87

Dia

me

tro d

e la lesió

n (

mm

)

Control

HID-1

NO MIC

36 horas posteriores a la inoculación de S. sclerotiorum

MIC

32

observe, se decidió repetir el ensayo de colonización pero en esta ocasión, el ensayo

de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida se llevó a cabo a las cuatro

semanas de colonización, de manera similar a como ha sido llevado a cabo en

trabajos previos (Mora-Romero, 2008; 2015). Este ensayo se realizó con plantas de

frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC. En este Experimento 2 se probaron

hidrolizados de semillas de dos variedades de frijol diferentes, Azufrado Higuera

(HID-1) y el de frijol Azufrado Regional 87 (HID-2), mismos que fueron aplicados a

las cuatro semanas de colonización micorrízica. Las plantas control fueron tratadas

con agua.

7.3.1 Porcentaje de colonización

El Cuadro 4 presentan los porcentajes de colonización de plantas colonizadas con

R. irregularis y utilizadas en el Experimento 2 de aplicación de hidrolizados de

proteína de frijol.

Cuadro 4. Porcentaje de colonización en plantas de frijol empleadas para el Experimento 2 de infección en hoja desprendida. El inóculo micorrízico consistió en 500 esporas de R. irregularis.

Tratamiento Colonización (%) DS*

Control 6.34 3.18

HID-1 5.26 3.05

HID-2 1.67 0.48

*Desviación estándar

33

7.3.2 Peso fresco de raíces y parte aérea

En las plantas utilizadas en este ensayo no se detectaron diferencias significativas en

el peso fresco de parte aérea o raíces de las plantas MIC y NO MIC de la variedad

Azufrado Regional 87 en los tres tratamientos (Figura 13).

Figura 13. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de las plantas utilizadas en el ensayo de hojas desprendidas a) Parte aérea (hojas y tallos), b) Raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.


y NO MIC

La Figura 14 muestra el curso temporal del desarrollo de las lesiones ocasionadas

por S. sclerotiorum en la variedad de frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC sin la

adición de hidrolizado alguno. En este experimento se observó que la micorrización a

partir de la inoculación con 500 esporas de R. irregularis induce tolerancia con

respecto al control NO MIC a las cuatro semanas posteriores de la inoculación del

HMA.

a a

0

1

2

3

4

5

6

7 a

a

0

1

2

3

4

5

6

7

NO MIC

MIC

Pe

so f

resco (

g)

a) b)

34

Figura 14. Cinética de desarrollo de las lesiones en hojas de plantas de frijol Azufrado Regional 87 micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (NO MIC) (sin adición de hidrolizado). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.


y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol

En este experimento, el hidrolizado HID-1 (obtenido de semilla de Azufrado Higuera)

tuvo efecto en las plantas de Regional 87 NO MIC induciendo una defensa

equivalente a la observada en las plantas las micorrizadas. Por su parte el

hidrolizado HID-2 (obtenido de semillas de Azufrado Regional 87) mostró inducción

de protección en ambas condiciones, MIC y NO MIC, pero de manera más intensa

con respecto a HID-1 (Figura 15).

a

a

a a

a

a

b b

0

5

10

15

20

25

30

35

24horas 36horas 48horas 52horas

Diá

me

tro d

e le

sió

n (

mm

)

NO MIC

MIC

35

Figura 15. Diámetros de lesión a las 48 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol MIC y No MIC sin hidrolizado, así como MIC y NO MIC con los hidrolizados HID-1 (de semilla de frijol Azufrado Higuera) y HID-2 (de semilla de frijol Azufrado Regional 87). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.

a

b

c

b b

c

0

5

10

15

20

25

30

Control HID-1 HID-2

NO MIC

MIC

36

VIII. DISCUSION

La comparación de la secuencia aminoacídica de faseolina del PDB (Protein

Database Data Bank) con el genoma de frijol disponible en el GeneBank (NCBI)

arrojó la existencia de tres secuencias homólogas principales. Dos de las secuencias

homólogas principales correspondieron a los genes previamente descritos como α y

β faseolina (Slightom et al., 1983; 1985). La tercera secuencia, aunque presenta

regiones homólogas, no tiene la estructura típica de los otros dos genes de

faseolinas. Las faseolinas poseen dos sitios de glicosilación y eso hace que puedan

tener mucha diversidad a nivel postraduccional, y también a nivel de funcionalidad.

Además, hay evidencia que sugiere que las faseolina pueden estar también

reguladas por proteólisis dando como resultado fragmentos polipeptídicos

posiblemente funcionales (Li et al., 1999). Es por esto que, a nivel de proteínas, la

familia de las faseolinas pareciera estar formada por alrededor de 6 a 10 miembros.

Sin embargo, el análisis in silico aquí presentado indica que son únicamente dos

genes de faseolina en el genoma del frijol. Toda la diversidad adicional observada a

nivel de proteína se deriva de modificaciones postraducccionales de los transcritos

expresados en estos dos genes.

De manera interesante, el análisis in silico, arrojó que ninguno de los parálogos

identificados correspondió al último exón de los genes de las faseolinas, mismos que

ya habían sido identificados mediante la clonación de los genes y sus

correspondientes cDNAs (Slightom et al., 1983; 1985). En la versión del genoma

actualmente liberado, en la secuencia que correspondería al último exón, aparecen

regiones de varias decenas de “Ns”. Es posible que estas correspondan a una región

del genoma con una estructura que represente dificultades para su secuenciación.

Versiones posteriores mejoradas del genoma de frijol posiblemente resuelvan estas

incosistencias.

Una vez corroborada la identidad de la FIM como una β-faseolina, se procedió a

tratar de detectar y cuantificar el gen a nivel de transcripción en tejido foliar de

plantas micorrizadas.

37

Las faseolinas son acumuladas a nivel de transcrito y de proteína en los embriones

de frijol (Sun et al., 1981), sin embargo, su acumulación en hoja u otros tejidos

vegetativos no se ha reportado en esta especie. La faseolina de frijol, sin embargo,

ha podido ser expresada a nivel de transcrito y de proteína en plantas transformadas

de tabaco en donde el gen de la β-faseolina fue clonado bajo la regulación del

promotor constitutivo 35SCaMV (Li et al., 1999). De manera interesante, en dicho

trabajo se observó que aunque el nivel de transcrito en hojas, tallos, y nódulos era

muy abundante, la acumulación de proteína era mucho menor en estos tejidos que

en embriones.

También, ha sido reportado que el promotor de la β-faseolina está regulado por la

acción conjunta entre un factor de transcripción denominado PvAlf en frijol (o ABI3 en

Arabidopsis) y la fitohormona ABA. A esta conclusión se llegó ya que la adición de

ABA solo fue capaz de inducir la transcripción del gen en plantas que expresaban

ectópicamente el gen PvAlf (Ng et al., 2006). Por lo tanto, la detección en tejido foliar

de una faseolina inducida por micorrización resulta relevante.

Desafortunadamente, en este trabajo no se pudieron replicar los resultados

preliminares obtenidos previamente en los cuales se identificó a una proteína tipo

faseolina en hojas de plantas micorrizadas. Con el objetivo detectar el gen de la

faseolina supuestamente inducida por micorrización, se usó cDNA extraído de hojas

de plantas micorrizadas de frijol, y utilizando los oligos degenerados (Phas1Forward

y Phas2Reverse) se llevaron a cabo PCRs bajo un gradiente de temperaturas de 30

a 54 °C para la temperatura de hibridización (Figura 8). Sin embargo, y en contraste

a lo observado en experimentos preliminares, solo se logró detectar una banda en

las reacciones con temperatura de anillamiento de 32.7 y 35.9 °C de alrededor de

500 bp, cuando el fragmento esperado era de alrededor de 850 pb.

Se utilizaron también los oligonucleótidos específicos tanto para β-faseolina como

para α-faseolina. En este caso, solamente el fragmento de 124 pb obtenido con los

oligos B3F/B3R fue amplificado; sin embargo, este producto era amplificado tanto en

cDNA de hojas plantas micorrizadas como no micorrizadas. Se tiene la certeza que

los oligonucelótidos son capaces de amplificar el fragmento esperado ya que los

38

controles en donde se usaba cDNA de cotiledones o DNA genómico amplificaban

productos del tamaño predicho (Figuras 4, 5).

Derivado del reporte de Ng et al. (2006), se hipotetizó que quizás la condición de

micorrización podría estar induciendo la expresión del factor de transcripción PvAlf,

pero quizás los niveles alcanzados de ABA no era suficientes para inducir la

expresión del gen de la faseolina. Entonces, se decidió hacer un experimento en el

que plantas no micorrizadas y micorrizadas fueron tratadas con ABA por 24 h. Este

tejido fue utilizado para aislar RNA y sintetizar cDNA, con el cual se hicieron PCRs

con los genes específicos de faseolinas y también de PvAlf. Desafortunadamente, en

ninguno de los casos se observó producto de amplificación (resultados no

mostrados).

Una posible explicación a estos resultados negativos puede deberse al hecho de que

los niveles de micorrización de las plantas de frijol eran bajos. Sin embargo,

decidimos utilizar este material vegetal ya que sí se observó la inducción de defensa

por micorrización. Por lo tanto, y a manera de explicación alternativa, quizás, la

expresión de la faseolina pueda estar asociada a un nivel alto de micorrización y a

una etapa fisiológica también definida. Sin duda, se necesitan análisis adicionales

para tratar de corroborar los resultados observados con anterioridad. Por otro lado,

los logros alcanzados en el análisis in silico de este trabajo permiten conocer con

mayor detalle la estructura de los genes que codifican para la principal proteína de

reserva de frijol, la faseolina.

En este trabajo, también se exploró el potencial biotecnológico de la aplicación de

hidrolizados proteicos de semillas como potencial inductor de defensa contra S.

scleorotiorum. Primeramente se evaluó el comportamiento de diferentes variedades

ante S. sclerotiorum, comparando la respuesta de cada variedad bajo condiciones

de micorrización y no micorrización. En el ensayo preliminar se observó que las

lesiones ocasionadas por el patógeno fueron menores en Azufrado Higuera y

Azufrasin en la condición micorrízada, por su parte en la variedad Azufrado Regional

87 no se observó este mismo efecto no habiendo diferencias significativas

estadísticamente entre la condición MIC y NO MIC.

39

En estudios previos, la variedad Azufrado Regional 87 había mostrado inducción de

resistencia por micorrización (Mora-Romero et al., 2016), donde Azufrado Higuera

no mostró inducción de tolerancia por micorrización mientras que Azufrado Regional

87 sí lo mostró. En el Experimento 2 la variedad Azufrado Regional 87 presentó

inducción de tolerancia por micorrización ante S. sclerotiorum no obstante los

porcentajes de colonización del HMA fueron mucho más discretos que los obtenidos

en el bioensayo preliminar y en el Experimento 1, siendo 6.43% y 44.33%,

respectivamente.

No existe a la fecha información que sustente si la bioprotección sistémica contra S.

sclerotiorum dependa del grado de colonización con hongos micorrízicos

arbusculares, o si es suficiente un porcentaje mínimo de colonización para encender

el mecanismo de bioprotección (Mora-Romero, 2008), aunque estos resultados

sugieren que es el caso.

Los resultados obtenidos pudieran explicarse tomando en cuenta otros factores

como el estado fisiológico de las plantas, ya que para en el Experimento 1 las plantas

tenían seis semanas de edad cuando fueron expuestas a la infección por S.

sclerotiorum, mientras que en el Experimento 2 tenían cuatro semanas.

En cuanto a los tratamientos con hidrolizados proteicos, en el Experimento 1 las

plantas MIC de las variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 tratadas con HID-1

(hidrolizado de proteína de Azufrado Higuera) mostraron un halo de lesión menor con

respecto a los otros tratamientos, mientras que en el Experimento 2 los tratamientos

que desarrollaron menores halos de lesión fueron las plantas NO MIC, donde solo se

evaluó en la variedad Azufrado Regional 87. En Azufrado Higuera, HID-1 indujo una

respuesta de defensa de manera importante en las plantas no micorrizadas, lo cual

no fue observado en las otras variedades.

Ya que Azufrado Regional 87 es la variedad que en estudios previos ha respondido a

la inducción de defensa por micorrización, en el Experimento 2 se utilizó solamente

esta variedad para probar los hidrolizados HID-1 (hidrolizado de proteína de Azufrado

Higuera) y el HID-2 (hidrolizado de proteína de Azufrado Regional 87). Estos dos

40

hidrolizados indujeron una respuesta de defensa contra S. sclerotiorum, sin embargo,

el HD2 fue más efectivo para disparar la respuesta de defensa (Figura 15).

Una comparación de la composición proteica de las semillas de Azufrado Regional

87 y Azufrado Higuera arroja que 33 proteínas están presentes de manera cualitativa

(esto significa que una proteína está presente en un genotipo y en otro no) y 50 de

manera cuantitativa (que están presente en mayor o menor abundancia) (Camacho

et al., 2010), lo cual sugiere que los dos hidrolizados contienen péptidos

diferenciales, mismo que pudiera explicar sus distintos efectos. A la fecha existen

muchos estudios sobre la aplicación de hidrolizados proteicos a plantas, pero no

como inductores de protección contra patógenos sino como bioestimulantes los

cuales mejoran la eficiencia de los nutrientes, la tolerancia al estrés abiótico y la

calidad de los cultivos (Colla et al., 2014)

Existe considerable evidencia del potencial que pueden tener algunos extractos de

plantas o compuestos derivados de plantas como disuasivos comerciales de hongos

patógenos (Shuping, 2017), pero poco se sabe sobre el uso de hidrolizados de

proteína para este fin. Dichos estudios están mayormente dirigidos a compuestos

fenólicos, taninos, alcaloides, entre otros (Gurjar et al., 2012).

El método de extracción de proteínas utilizado en este trabajo no descarta la

posibilidad de arrastrar otros compuestos. La ventaja de los extractos de plantas es

que con frecuencia contienen una mezcla de productos químicos que pueden

trabajar en sinergia para inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos. Muchos

extractos de plantas contienen también más de un compuesto antifúngicos (Masoko,

2005). Así que no podemos descartar la posibilidad de que en los hidrolizados de

proteína se encuentren presentes otros compuestos y que estos de manera

autónoma causen el efecto protector ante S. sclerotiorum.

41

IX. CONCLUSIONES

1. El análisis in silico demuestra que la familia de la faseolina está constituida

únicamente por dos genes ubicados en el cromosoma 7 del genoma de frijol

de tal manera que las variantes proteicas observadas por otros autores deben

ser el resultado de modificaciones postranscripcionales y postraduccionales.

2. En este trabajo no se logró detectar la expresión del gen de faseolina

previamente detectado en hojas de plantas micorrizadas. Es posible que el

nivel de expresión en el tejido utilizado no haya sido suficiente para ser

detectado.

3. Hidrolizados proteicos de semillas de frijol son capaces de inducir defensa en

tejido foliar de plantas de frijol al ser aplicados de manera exógena. La

efectividad de los hidrolizados parece depender de las condiciones de

micorrización, el nivel de colonización micorrízica, el estado fenológico de la

planta y la variedad de frijol tratada y utilizada para la obtención del

hidrolizado.

4. Los hidrolizados de semillas de frijol tienen potencial de aplicación

biotecnológica para la inducción de defensa en frijol contra S. sclerotiorum.

42

X. RECOMENDACIONES

Continuar con la determinación de la expresión del gen de faseolina en hojas

de plantas de frijol micorrizadas, en plantas que presente porcentajes de

colonización micorrízica más altos.

Sintetizar de nuevo los oligonucleótidos degenerados del trabajo previo para

corroborar su funcionalidad.

Diseñar nuevos oligonucleótidos para el gen β-faseolina buscando que estos

abarquen distintas zonas del gen.

Continuar realizando experimentos de aplicación de hidrolizados buscando

determinar el tiempo óptimo para su aplicación y cuidando siempre realizarlos

en la misma etapa fenológica de la planta.

Realizar un ensayo de dosis respuesta de los hidrolizados para optimizar su

aplicación.

Realizar una purificación de faseolina y un hidrolizado de ella para aplicarla a

plantas micorrizadas y no micorrizadas, y confirmar si el efecto observado en la

aplicación de los hidrolizados es por acción de la faseolina.

43

XI. BIBLIOGRAFIA

1. Azcón, C., y Barea, J. M. 1996. Arbuscular mycorrrhizas and biological control

of soil-borne plant pathogens-an overview of the mechanisms involved.

Mycorrhiza. 6:457-464.

2. Bollini, R., Vitale, A. 1981. Genetic variability in charge microheterogeneity and

polypeptide composition of phaseolin, the major storage protein of Phaseolus

vulgaris; and peptide maps of its three major subunits, Physiol. Plant. 52: 96–

100.

3. Burow, Mark., et al., 1992. Developmental control of the β-phaseolin gene

requires positive, negative, and temporal seed-specific transcriptional

regulatory elements and a negative element for stem and root expression. The

Plant Journal. 2: 537-548.

4. Camacho, MK., Peinado, LI., López, JA., et al., 2010. Caracterización

proteómica de granos de frijol azufrado (Phaseolus vulgaris) cultivado en el

estado de Sinaloa. Revista Ra Ximhai. 6: 24-25.

5. Colla, G., Svecova, E., et al., 2014. Biostimulant action of a plant-derived

protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis. Frontiers in Plant

Science. 5: 448.

6. De La Fuente, M. et al., 2012. In-Depth Characterization of the Phaseolin

Protein Diversityof Common Bean (Phaseolus vulgaris L.) Based on Two-

Dimensional Electrophoresis and Mass SpectrometryFood Technol.

Biotechnol. 3: 315–325

7. Emani, C., y Timothy, C. 2008. Phaseolin: Structure and Evolution. The Open

Evolution Journal. 2: 66-74.

8. Galindo-Flores, H. 2008. Resistencia inducida por micorrización en tomate

(Lycopersicon esculentum Mill.) ante Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

Tesis de Maestría. Instituto Politécnico Nacional.

9. Giovanetti, M., y Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring

vesiculararbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytol. 84: 489-500.

10. Gurjar, S. et al., 2012. Efficacy of plant extracts in plant disease management.

Agricultural Sciences. 3: 425-433.

44

11. Hall, T.C., Ma, Y., Buchbinder, B.U., Pyne, J.W., Sun, S.M., Bliss, F.A. 1978.

Messenger RNA for G1 protein of French bean seeds: Cell free translation and

product characterization. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 75: 3196-3200.

12. Hause, B., Maier, W., Miersch, O., Kramelland, R., Strack D. 2002. Induction of

jasmonate biosynthesis in arbuscular mycorrhizal barley roots. Plant

Physiology 130: 1213-1220.

13. Li, G. et al., 1999. β-Phaseolin gene activation is a two-step process:

PvALFfacilitated chromatin modification followed by abscisic acid-mediated

gene activation. Plant Biology. 96: 7104–7109.

14. Masoko, P. et al., 2005. Antifungal activities of six South African Terminalia

species (Combretaceae). Journal of Ethnopharmacology. 99: 301-308.

15. Millner, PD., Kitt, DG. 1992. Modified Hoagland´s solution for sorghum plants

growing in sand. Mycorrhiza 2: 9-15.

16. Mora-Romero, GA. 2008. Efecto de la micorrización con Glomus intraradices

en la tolerancia al moho blanco causado por Sclerotinia sclerotiorum en tres

líneas de frijol. Tesis de Maestría. Instituto Politécnico Nacional.

17. Mora, GA., Cervantes, RG., Maldonado, IE., López, M. et al., 2015.

Mycorrhiza-induced protection against pathogens is both genotype-specific

and graft-transmissible. Symbiosis 66: 55–64.

18. Ng, WK. et al., 2006. Ordered Histone Modifications Are Associated with

Transcriptional Poising and Activation of the phaseolin Promote. The plant cell.

1: 119-132.

19. Petrucelli, S. 2010. Direccionamiento de proteínas recombinantes a vacuolas

de reserva. Tesis de maestría. Centro de Investigación y Desarrollo en

Criotecnología de Alimentos.

20. Phillips, JM., Hayman, DS. 1970. Improved procedures for clearing roots and

staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrizal fungi for rapid

assessment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55: 158-161.

21. Pozo, MJ., Azcon, C. 2007. Unraveling mycorrhiza-induced resistance Current

opinion in plant biology 10: 393-398 doi:10.1016/j.pbi.2007.05.004

45

22. Quintero-Zamora, E. 2010. Análisis proteómico de la resistencia inducida por

micorrización al patógeno foliar Sclerotinia sclerotiorum en frijol (Phaseolus

vulgaris L.). Tesis de maestría. Instituto Politécnico Nacional.

23. Remy, W., Taylor,T.N., Hass H., Kerp, H. 1994. Four hundred million year old

vesicular arbuscular mycorrhizae. Proc Natl Acad Sci 91: 11841-11843.

24. Salzer, P., Boller, T. 2000. Elicitor induced reactions in mycorrhizae and their

supresión. En Arbuscular Mycorrhizas: Physiology and Function. (Y. Kap ulnik

y D.D. Douds Jr. eds.). Kluwer Academic Publishers. Pp:1-10.

25. Sandoval, MR., 2012. Aislamiento y caracterización de las proteínas de

reserva de chía (Salvia Hispanica L.). Tesis de maestría. Universidad

Autónoma de Querétaro.

26. SHCP. (2011) Monografía del frijol. [Internet] Disponible en:

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Panoramas/Panoram

a%20Frijol%20(may%202014).pdf

27. SHCP. (2014) Panorama del frijol. [Internet] Disponible en:

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Documents/Monograf

ias/Monograf%C3%ADa-Frijol-2011_vc.pdf

28. Sherwry, P. R. 1995, Plant storage proteins. Biology Review 70: 375-426.

29. Shuping, DSS. 2017. The use of plants to protect plants and food against

fungal pathogens: a review. Afr J Tradit Complement Altern Med. 14 (4): 120–

127.

30. SIAP. 2017.

http://infosiap.siap.gob.mx:8080/agricola_siap_gobmx/ResumenDelegacion.do

31. Slightom, LJ., Sun, MS., Timothy, CH. 1983. Complete nucleotide sequence of

a French bean storage protein gene: Phaseolin. Botany 80: 1897-1901.

32. Slightom, LJ, et al. 1985. Nucleotide sequences from phaseolin cDNA clones:

the major storage proteins from Phaseolus vulgaris are encoded by two unique

gene families. Nucleic Acids Research 13: 6483-6498.

33. Smith, S.L., Read, D. 1997. Mycorrhizal symbiosis. 2ª edición. Capítulo 1.

Academic Press.Stein E., Molitor A., Kogel K. H. y Waller F. (2008). Systemic

resistance in Arabidopsis conferred by the mycorrhizal fungus Piriformospora

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Panoramas/Panorama%20Frijol%20(may%202014).pdf

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Panoramas/Panorama%20Frijol%20(may%202014).pdf

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Documents/Monografias/Monograf%C3%ADa-Frijol-2011_vc.pdf

http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Documents/Monografias/Monograf%C3%ADa-Frijol-2011_vc.pdf

http://infosiap.siap.gob.mx:8080/agricola_siap_gobmx/ResumenDelegacion.do

46

indica requires jasmonic acid signaling and the cytoplasmic function of NPR1.

Plant Cell Physiology 49: 1747-1751.

34. Staswick, PE. 1994. Storage proteins of vegetative plant-tissue. Annu Rev

Plant Physiol Plant Mol Biol 45: 303–322.

35. Staswick, PE., Zhang, Z., Clemente, TE., Specht, JE. 2001. Efficient

downregulation of the major vegetative storage protein genes in transgenic

soybean does not compromise plant productivity. Plant Physiol 127: 1819–

1826

36. Song, Y., Chen, D., Sun, Z., Zeng, R. 2015. Enhanced tomato disease

resistance primed by arbuscular mycorrhizal fungus. Front. Plant Sci.

37. Spatafora, JW., Chang, Y., Benny, GL., Lazarus, K. 2016. A phylum-level

phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genome-scale data.

Mycologia. 108 (5): 1028-1046.

38. Sun, S.M., Slightom, J.L., Hall, T.C. 1981. Intervening Sequences in a Plant

Gene-Comparison of the Partial Sequence of cDNA and Genomic DNA of

French Bean Phaseolin. Nature. 289: 37-41.

39. Yilin, Liu., Ji-Eun, Ahn., Sumana, Datta., Ron A, Salzman., et al. 2005.

Arabidopsis Vegetative Storage Protein Is an Anti-Insect Acid Phosphatase.

Plant Physiology.139: 1545–1556.

40. Talbot, D.R., Adang, M.J., Slightom, J.L., Hall. T.C. 1984. Size and

organization of a multigene family encoding phaseolin, the major seed storage

protein of Phaseolus vulgaris L., Mol. Gen. Genet. 198: 42–49.

47

XII. ANEXOS

F1 1 mMRARVPLL-LLGILFLASLSASFATSL---------------------------------------------------- 27

F2 1 -MGSRFPLLmLLGIVFLASVSESLTEKPsrrkcvkicesekdlsrgqtcqlrckhvsepggkeeeereipephlsheerv 79

R1 1 mMRARVPLL-LLGILFLASLSASFATSL---------------------------------------------------- 27

FIM 1 -------------------------TSL---------------------------------------------------- 3

F1 --------------------------------------------------------------------------------

F2 rrerghqegekkkkevekeerekprpfppphptehereeeqwtgrhrrgdpeerervrqrereeeeirererkkkkgekh 159

R1 --------------------------------------------------------------------------------

FIM --------------------------------------------------------------------------------

F1 28 -------------------REEEESQDNPFYFNSDNSWNTLF---KNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVEFRSKP 85

F2 160 wrrekkekweeieedpgfpNSDSQTQNNPFHFSS-NRFRTLFknkHGHIRVLQRFDQ--RSSTKLQNLQDYRVVEFKSRP 236

R1 28 -------------------REEEESQDNPFYFNSDNSWNTLF---KNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVEFRSKP 85

FIM 1 -----------------------------------------------------------------------------NSP 3

F1 86 ETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTS-DNPIFSDHQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLAMPVNN 164

F2 237 HTLLLPHRADADFLLVVLSGRALINFVEPEDR-DCYYLDP------GYAQIIPAGTTFYLVNPERNKNLRVIKLAIPVNK 309

R1 86 ETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTQgDNPIFSDNQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLAMPVNN 165

FIM 4 L-------ADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFLLTQgDNPIFSDHQTIPAGTIFYLINPDPKEDLRIIQLAMPVNN 76

F1 165 PQ--IHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQEegqqeGVIVNIDSEQIEELSKHAKSSSR 241

F2 310 PGkfDENFFLSRTQDQQFYLQGFSG-ILEASFDdSKFEEINKVLFGEERPQE-----GVIVELSNEKIRKLSRSAESSSR 383

R1 166 PQ--IHEFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVIVNIDSEQIKELSKHAKSSSR 237

FIM 77 PQ--IHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVTVNIDSEQIKELSKHAKSSSR 148

F1 242 K---------SHSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 306

F2 384 KinsfeykpfDLRSSSPIYSNKFGAFYEITPDKnphlrkLNILLNYVDINKGGLLLPHYNSKAIVILVVSEGEANIELLG 463

R1 238 K---------SLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 302

FIM 149 K---------SLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 213

F1 307 --PKGNKETLEFESYRAELSKDDVFVIPAAYPVAIKATSNVNFTGFGINANNNNRNLLA--------------------- 363

F2 464 lrEQQQEERREVQKYRAELSEDDVFIIPAAYPVAINATSNLNFIAFGINAENNQRNFLAGekenviseipr-----qvle 538

R1 303 --PKGNKETLEFESYRAELSKDDVFVIPAAYPVAIRATSNVNFTGFGINANNNNRNLLAG-------------------- 360

FIM 214 --PKGNKETLEYESYRAEL-----------FRRCILSQQHI--------------------------------------- 241

48

F1 ----------------------------------------------------

F2 539 vn-------veklikkqresyfvdaqpqqqqkentgrnGRKVplssilgaly 583

R1 361 --------------------------------------IYIYyi-------- 366

FIM ----------------------------------------------------

Figura A1. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas ubicadas en el

cromosoma 7 del genoma de frijol; F1, F2 y R1 con FIM. En rojo se muestra la

región de homología de los genes a FIM.