Micro Resonancia Magnética e Imágenes Moleculares para la biotecnología y la farmacéutica.

Caso de la Isquemia Cerebral.

Dr. Carlos Cabal MirabalInvestigador Titular. Académico de Mérito

Unidad de RM Cneurocarlos.cabal@cneuro.edu.cucarlos.cabal@infomed.sld.cu

Agradezco al Prof. Dr. Carlos O Della Védova y a la Prof. Dra. Cristina Caracoche

¡Gracias a todos Ustedes!

Comparación entre los Métodos de Imágenes

¿?

[Rudin 2003]

Literatura científica sobre ensayos y RM

R2 = 0.9486

050

100150200250300350400450500550600650700750800

1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

Años

Can

tidad

de

publ

icac

ione

s

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

1988198919901991199219931994199519961997199819992000200120022003200420052006200720082009

Año

s

Cantidad de publicaciones

Modelo de cáncer en animal Modelo de stroke en animal

Biomundi julio 2009

Definiciones de μRM e ImRM• Las μRM son imágenes de estructuras biológicas vivas

con resoluciones espaciales del orden de decenas de micras, elevado contraste y tiempos de imágenes que permiten estudiar los detalles anatómicos y los procesos fisiológicos a nivel de células, tejidos y órganos, sin alterar estos.

• Las ImRM in vivo y no invasivas han sido definidas como la representación visual, la caracterización (estructural y funcional) y la cuantificación de procesos biológicos a niveles celulares y moleculares.

• Las ImRM y μRM detectan, cuantifican y visualizan fenómenos dinámicos moleculares y celulares, en tejidos y órganos, con resoluciones espaciales de hasta decenas de micras y temporales de milisegundos.

μRM

0.0

0.6

1.2

1.8

2.4

3.0

3.6

15-18 months 19-22 months

lumen perimeter (mm)

0.18

0.23

0.28

0.33

0.38

0.43

0.48

wall thickness (mm)

mean lumen perimetermean wall thick

μRM

La isquemia.Precede de una severa disminución de flujo:

60 mL/min/100g humano adulto90-105 mL/min/100g roedor adulto

2020--25 ml/min/100 g 1825 ml/min/100 g 18--20 ml/min/100 g20 ml/min/100 g

EEG lento Aparecen síntomas (Preocuparse) neurológicos

Desaparecen respuestas Eléctricas “Umbral de

Fallo eléctrico”

Zona de penumbra Núcleo o “Core”

1616--18 ml/min/100mg18 ml/min/100mg

Rápida muerte celular

10ml/10ml/minmin/100mg/100mg

Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones BiológicasInstituto de Farmacia y Alimentos, UH

La Zona de penumbra es RESCATABLE y si logramos restablecer las condiciones normales de funcionamiento el área de infarto puede reducirse.

Ventana terapéutica

Ventana reperfusión

Ventana neuroprotección

+

3-12h

• Buscar métodos más acordes con la ventana • Ampliar la ventana para el diagnóstico y la terapéutica adecuadas.

T2T2 ADCADC DWIDWI MTTMTT CBFCBF

Curso de la Oclusión de la ACM en una rata

• Volumen y evolución temporal del infarto.• Flujo sanguíneo local en el área infartada.

• Estudios sobre reperfusión.• Farmacología del ictus.

• Influencia de la duración de la hipoxia en la talla y localización del infarto.

• Respuestas inflamatorias después del infarto.• Necrosis y apoptosis celular.

• Actividad fagocítica y microglial en la zona de teijdoinfartado.

• Homeostasia de la barrera hematoencefálica.

Déficit de perfusión • Perfusión

HemorragiaPerturbaciones hemodinámicas

• BOLD

Degradación del tejidoEdema vasogénico

• MT

Edema Citotóxico Lisis Tisular

• DW

Perturbaciones del flujo• MRA

Daño de la barrera hemato-encefálica

• Contraste T1W

Edema vasogénico• Densidad protónica • T1W• T2W

FisiopatologíaMétodo de MRI

Métodos, condiciones fisio patológicas con μRM en modelos animales(Dijkhuizen 2003)

M Cambia de orientación

Muestra

Magnetización M

Imán

Excitación RF

Relajación Magnética T1, T2

Fem Inducida

Señal de RM

S

N

M0

S

NSCL

S

NSCLtP

B1

X´

SCL

Y´

S

N Z´

N

Y´

S

Z´

X´ 050

050t

SCL

00

2 %37)( Me

MTM XY ≈=

2Tt =

1=n

2=n

001 %6311)( Me

MTM Z ≈⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ −=

Tiempo de correlación del agua (s)

Agua libreτc = 10-12

Proteina

Agua enlazadaen superficieτc = 10-10

Agua internaτc = 10-5

( )CfT

τ∝2,1

1

% H2O

100

80

60

20

40

Sust

anci

a gr

is

Riñ

ones

Pulm

ón

Híg

ado

Tipo de tejido

Sust

anci

a bl

anca

Piel

Hues

o

Cor

azón

Agua de los diferentes tejidos.

δδ χχ

T2*T1ρ

DTIDWI ADC

T1 T2ρ

ContrasteContraste

Tiempo de relajación Spin-retículo T1(ms)

Órgano Tejido

A 1,5 T A 0,2 T

Tiempo de relajación Spin-spin T2(ms)

Cerebro Sustancia Gris 921 495 101

Sustancia Blanca 787 390 92

Líquido encéfalo raquídeo 3000 1200 1500

Edema 1090 627 113

Meningioma 979 549 103

Glioma 957 832 111

Astrocitoma 1109 864 141

Hígado Tejido normal 493 229 43

Hepatomas 1077 580 84

Bazo Tejido normal 782 400 62

Páncreas Tejido normal 513 283 62

Riñones Tejido normal 652 395 58

Pulmón Tejido normal 830 79

Músculo Tejido normal 868 372 47

Grasa Tejido normal

Imagen sopesada en T1 (TR corto, TE corto)

IMÁGENES Sopesadas en T1

Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo)Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo)

IMÁGENES Sopesadas en T2

Contraste depende del tejido, su estado

fisiológico, molecular. Se hace mas o menos evidente dependiendo de los parámetros del

experimentoρρ(TE corto y (TE corto y TR largo)TR largo)

TT11(TE corto y (TE corto y TR corto)TR corto)

TT22(TE largo y (TE largo y TR largo)TR largo)

Contraste SEContraste SE

RF

TR

TE

Eco Ecoo

ImImáágenes T1 y T2 de ratagenes T1 y T2 de rata

Axial plano de 49 mm y 1 mm de espesorAxial plano de 49 mm y 1 mm de espesor

Sagital 59 mm Sagital 59 mm TT11 TT22

La difusión restringida

Difusión anisotrópica

Difusión isotrópica

TamaTamañño, Forma Orientacio, Forma Orientacióónn

Dt6 Dt6

Alta difusión Baja difusión

Difusión en las células

Imágenes DWI, ADC en ratas

Utilización del tiempo

Ejemplo 1. Dos valores de b, b= 0 (imagen base) y con b=1000 s/mm2 seleccionamos seis orientaciones de los gradientes y para cada una de las orientaciones hacemos tres acumulaciones con el fin de incrementar la relación señal/ruido tardaríamos 19 minutos en realizar el estudio.

Ejemplo 2. Fijamos tres valores de la b; b=500; b= 1000 y 1500 s/mm2 y obtenemos 7 planos para esos valores. TI = 21 minutos.

Ejemplo 3. Un corte para 20 orientaciones con un valor fijo de b=1000s/mm2

TI = 1minuto. 20 imágenes en 20 minutos implica varias opciones de empleo de esos 20 minutos → óptima planificación del experimento para aprovechar el tiempo

Tierras Raras:Ce, PrCe, Pr, Nd, Pm, Sm, EuSm, Eu, Gd, TbTb,

Dy, , Ho, Er,

326f146d106p66s2

325f145d105p65s2

324f144d104p64s2

183d103p63s2

82p62s2

21s2

1s2 2s22p6 3s23p6 4s2 3d10

Metales de Transición:Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, CuFe, Co, Ni, Cu,,

El magnetismo molecular dependede la intensidad del campo de

ligados y de su simetría alrededor del ion central

M = M = χχ ··BoBo

Susceptibilidad MagnSusceptibilidad Magnééticatica

icoParamagnét⇔⟩0χcoDiamagnéti⇔⟨0χ

ImImáágenes moleculares y celulares . genes moleculares y celulares .

Mecanismos de contrasteI. Intrínsecos.

II. Extrínsecos.

Δ

yzxzxy ddd ;;

222 ; yxz dd−

Simetría tetraédrica

Simetría octaédrica

Δ = EL ( intensidad del campo de Ligando)I-<Br-<Cl-<F-<H2O<C2O4

2-<piridina~NH3< Etilendiamina<NO2-<CN-

SimetrSimetrííaa e Intensidade Intensidad del Campo de ligandosdel Campo de ligandos

EnergEnergíía de apareamientoa de apareamiento

Alto spinAlto spinΔ<δBajo spinBajo spinΔ>δ

Δ

yzxzxy ddd ;;

222 ;yxz

dd−

S = 0S = 0

Bajo spinBajo spinΔ<δ

S = 2S = 2Alto spinAlto spinΔ>δ

DiamagnDiamagnééticoticoParamagnParamagnééticotico

Oxi HbDesoxi Hb

Resonancia MagnResonancia Magnéética funcional.tica funcional.

Zonas Zonas activadasactivadas

Imagen Base Imagen con estímulo Imagen funcional

A. MotoraA. MotoraA. SensorialA. Sensorial A. CognitivaA. CognitivaMETABOLISMO AUMENTADO

VASODILATACIONIncremento

Flujo sanguíneoIncremento

Consumo de O2

Agentes contrastantes exógenos

ácido dietilenotriaminopentaacético

ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecane 1,4,7,0 acido tri acético

La dificultad fundamental: acumular suficiente cantidad en el área de interés mantener el mínimo nivel de esta en otros órganos o tejidos.

S=7/2S=7/2

Mecanismo de acciMecanismo de accióón Gd(DTPA)n Gd(DTPA)

• No pasa a través de la BHE en cerebros sanos.

• Disminuye los T1 dentro del sistema vascular y por ende aumenta la intensidad de la señal de RM en imágenes sopesadas en T1.

• Crea gradientes de χ entre lo intra vascular y extra vascular → T2* GRE y SE

Gd (DTPA)

Agentes contrastantes exógenos

Polímeros biocompatibles:poliaminas, polisacáridos, PLL, albúminas, alteran sus propiedades biofísicas y farmacológicas.

Los biopolímeros reducen la toxicidad, aumentan la persistencia en sangre e incrementan el contraste

J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053

ácido dietilenotriaminopentaacético

Actividad enzimActividad enzimááticatica

Marcador del Gen lac Z

Afinidad por el [CaAfinidad por el [Ca2+2+ ] ~ ] ~ µµmm

Afinidad proteAfinidad proteíínas, pH, COnas, pH, CO2, 2, OO22

b) La identificación de los tractos neuronalesa) El estudio de la cito arquitectura cerebral

c) La determinación de las regiones de excitación neuronal.

• Mn2+ se introduce en células nerviosas excitadas por mecanismos de transporte de Ca2+ . Su comportamiento intracelular ha sido estudiado.

• Mn2+ metal pesado esencial como cofactor de enzimas incluyendo la superoxidimutasa , Piruvato carboxilasa , Glutamina sintetasa.

• La relación T1/ T2 es similar a la de los tejidos.

Mn2+

2211

3344

11 2233

44

PartPartíículas super paramagnculas super paramagnééticas = Nano partticas = Nano partíículas culas magnmagnééticas (npm).ticas (npm).Dominios magnDominios magnééticos y partticos y partíículas monodominioculas monodominio

dc

SuperficieSuperficie

NNúúclecleoo

NanopartNanopartíícula cula MagnMagnéética (MNP)tica (MNP)

Cubrimiento Cubrimiento polimpolimééricorico

PartPartíícula monodominio, cula monodominio, dd < < ddcc

EnergEnergíía de anisotropa de anisotropííaaEEaa = KV= KV

TTcc

TTBB

Sistema de MNP con anisotropía uniaxial, d < dc , Sistema de MNP con anisotropSistema de MNP con anisotropíía uniaxial, a uniaxial, d < dd < dcc , , Hext = 0HHextext = 0= 0

Encapsulado de nano partículas magnéticas

a) SPIO superiores a 50 nm.b) USPIO menores de 50 nm.

Sus propiedades magnéticas cambian con las dimensiones.

J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053

MPI = ImMPI = Imáágenes de Partgenes de Partíículas Magnculas Magnééticasticas, , Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009 Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009

Funciones d e las Nano partículas supermagnéticas (NPM)

Mejorar permeabilidad

Agente terapéutico Núcleo nano partícula

Agente diana

cápsula de Biopolímero

• Aumento de contraste.• Direcciona a la diana.

• Mejorar permeabilidad.• Transportador y dosificador de agente terapéutico. • Marcaje, direccionamiento y seguimiento celular .

(Wiart et al., 2007)

ratas Wistar

Marcaje con nano partMarcaje con nano partíículas sculas súúper paramagnper paramagnééticasticas

Tumor en un ratón transgénico.(Cherry 2004)

••EvaluaciEvaluacióón de dan de dañño de la Barrera Hematoencefo de la Barrera Hematoencefáálicalica..•• DeterminaciDeterminacióón de la Densidad celular y los espacios n de la Densidad celular y los espacios intracelulares.intracelulares.••Micro vascularizaciMicro vascularizacióón en el tumor y sus alrededores.n en el tumor y sus alrededores.••FracciFraccióón del volumen sanguino.n del volumen sanguino.••Efectividad de la terapia( quirEfectividad de la terapia( quirúúrgica, radio quirrgica, radio quirúúrgica, rgica, ACM,...)ACM,...)••Marcaje y rastreo de las cMarcaje y rastreo de las céélulas cancerlulas canceríígenasgenas..

Npm multifuncionales. Otras estructuras

Bicapa Fosfolipidica

Polyetilen glycol

Droga

npm multifuncionales = propiedades super paramagnéticas + colorantes fluorescentes ↔ detección a nivel celular con imágenes ópticas de fluorescencia y de las IRM. IRM realiza la planificación quirúrgica y se asiste el acto quirúrgico con la visualización por ambos métodos de las fronteras del tumor en modelos animales para su extirpación precisa.

Ligandos

Los ACM primeros agentes dianas.Dimensiones→ paso dificultoso por la BBB

Restricciones de los agentes contrastantes.

•• Caros.Caros.•• Compleja su sCompleja su sííntesis.ntesis.•• Bio disponibilidad. Bio disponibilidad. •• Sitio de acciSitio de accióón selectiva.n selectiva.•• Efectividad del paso a travEfectividad del paso a travéés de la Barrera s de la Barrera

HematoencefHematoencefáálica y las membranas lica y las membranas celulares.celulares.

•• Relativa invasividad. Relativa invasividad.

Control genético del contraste de RM

GenGen

Proteína

Iones metálicosendógenos

Enzima

Agente contrastante

exógeno

Proteínas superficiales

Agente contrastante

exógeno

Vesícula

Proteína

Molécula diana

Tipos de Flujo. Medición de velocidad

Velocidad del flujoConducto

Fino 1 Medio 2 Semi grueso 3 Grueso 4

V = ddTRTR

1 23 4

H2OH2O H2O

Eritrocito Capilar

Gran vaso sanguíneo

Coeficiente de DifusiCoeficiente de Difusióón n Aparente. Aparente.

ADC. ADC. DifusiDifusióón media.n media.

Difusión anisotrópica

Difusión isotrópica

TamaTamañño, Forma Orientacio, Forma Orientacióónn

Métodos de Perfusión MR

PMR

EndEndóógenosgenos

ExExóógenosgenos

ASL Arterial Spin LabelingAST Arterial Spin Tagging

↓CBF

DSC Dinamic Suceptibility Contrast → CBV

Pulso Pulso PASLPASL

Continuo CASLContinuo CASL

2D y 3D2D y 3D _

Cerebro sano CBV=CBF

Isquemia cerebral CBV↑≠CBF↓

DSC Dinamic Suceptibility Contrast

agente exógeno

ASL Arterial Spin LabelingAST Arterial Spin Tagging

agente endógeno

Lugar de marcadoLugar de marcado

arteria Vena

Tejido

capilares

Imagen

Imagen

Marca

NoMarcado

Imagen Marcada

Imagen control

Lugar de Imagen Lugar de Imagen

Perfusión

WFPer =

Razón de PerfusiónPf ρ=

Tiempo Medio de Tránsito

mttmtt TqV

TVF 0==

0VVq ≡

Fracción de volumen de sangre

Modelo de Perfusión

Modelo CapilaresRadio promedio: 3 µm

Largo promedio: 750 µmVelocidad media a través del capilar : 300-500 µm/s.

Distancia recorrida en 100ms: 30-50 µmDensidad de capilares: 400-500/mm3

Número de capilares en un vóxel de 1x1x7 mm3: 3000

31cm OH 222103× D = 3,4 · 10-5 cm2 /stiene moléculas de

μ1001210,266 5 =××== −DtL

μ10=celulad

Secuencia de experimentos para ASLSecuencia de experimentos para ASL

Plano de imagen marcada

Banda de inversión con

pulso 1800

Momento 1Momento 1

Momento 2Momento 2 Banda de inversión de

compensación con pulso 1800

Momento 3Momento 3

Imag

en d

e C

ontro

l

Momento 4Momento 4

ΔΔt =T It =T I

Las flechas azules indica la dirección del flujo

Mapas de Perfusión

tiempo

inte

nsid

ad

• La integral = Volumen Sanguíneo Crebral

(CBV)

Inyeccion de contraste

0

• Deconvolucionar esta función da el Flujo Sanguíneo Cerebral (CBF)

Tiempo Medio de Tránsito (MTT)

Área =λ

10

Tiempo (s)

Área α CBV

Tiempo (s)

10 20 30 40

10 20 30 40

Proceso real

Proceso de medición

Señales de SE y GRE con agente contrastante

Spin Eco

Gradiente de Eco

100 %

80

60

40

20

0

50 ml

40

30

20

10

0↑ K++

↓ síntesis proteica

↑ expresión genética selectiva

pérdida neuronal selectiva

↑ [lactato]

liberación de glutamato , ↓ pH

infarto

↓ ATP , ↓ PCr

Umbrales de flujo sanguíneo cerebral

Los umbrales de daño cerebral por isquemia son dinámicos.

Principales eventos de la cascada isquémica

1. DisminuciDisminucióón n Glucosa y ATPGlucosa y ATP

2. Acidosis celular (desnat. Prot. Altera función de prot. dependiente de PH y la re captación de neuro trasmisores, promueve radicales libres.)

3. Liberación de Glutamato neurotransmisor excitatorio

Receptores.

NMDA: N-metil-D-Aspartato (entrada de Ca2+ y Na+)KA: KainateAMPA: alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazol-4-propionato (entrada de Ca2+ y Na+)Trans-ACPD: 1S,3R-trans-1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxilatoL-AP4: L-2-amino-4-acido fosfonobutanóico.

4. Influjo de Ca2+ (activación de enzimas proteasas, fosfolipasas, lipasas y endonucleasasas).

5. Degradación de fosfolípidos de membrana.6. Inflamación y edema.7. GeneraciGeneracióón de radicales libresn de radicales libres..

Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones BiológicasInstituto de Farmacia y Alimentos, UH

MRS in vivo. Metabolitos

Decrecen durante la isquemiaDecrecen durante la isquemia

r

r

r

r

BBBppm

ωωωδ −

=−

= 00)(

Ejemplo de ensayo de trombolíticos para Ictus

μPliPli= Microplasmin= Microplasmin

tPAtPA = = Activador delActivador delPlasminPlasminóógenogeno

Tisular Tisular

Radiology: Vol244: N 2—August 2007

Modelo Isquémico 1.5T (22 Oct 2009)

Coronal T2. Espesor 2 mm, Resolución 140 x 140 µm.

La lesión se muestra hiperintensa

0 2 4 6 8 10 12 14 160

10

20

30

40

50

60

70

80

Planos

RS

R (U

R)

Phantom B2

Flex S coronalExtremity coronal

Instrumentos y aditamentos

Diámetros fibras nerviosas entre 1 - 10µm. Células Betz tienen diámetros entre10 - 22 µm.

( ) ( ) 627

0

2

21 −− Δ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∝ rB

TT

RSTimag

Bobinas, Electrónica, Criogénia,Secuencias de impulsos.

Agentes contrastantes, secuencias de impulsos.

Imanes, Transferencia de Magnetización.

Para una ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

RS ( ) min51 36 =⇒⟩⟨=Δ − Timagmmr

( ) añosTimagmr 101 36 =⇒⟩⟨=Δ − μ

Resoluciones límites ≈10- 20μ

Posibilidades de las μRM e ImRM

• Herramienta efectiva en el establecimiento de la relación metabólica y genotípica con la expresión fenotípica y para comprobar diseños de moléculas activas, su relación estructura-función e interacción con blancos terapéuticos.

• Aceleran y abaratan los ensayos preclínicos y clínicos. En breve los estudios por imágenes serán ineludibles para el diseño, desarrollo y validación de nuevas drogas.

• Las técnicas y métodos de IRM desarrollados en animales son trasladables a humanos y viceversa.

• Menor consumo de animales, reactivos.• Precisión y cuantificación mayores.• Menor laboriosidad.

Unidad RMUnidad RM

Proyecto constructivo de la Unidad de Resonancia Magnética Polo

9,4 T9,4 T3,0 T3,0 T