2007 Desarrollo Profesional

Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein)

Instructores

Essy Levy, M.S.Coordinadora de Programas de Hughes

ScholarsUCSD, San Diego CA

Julie MathernBioEducation Product ManagerBio-Rad Laboratories, Hercules CA

¿Para que enseñar la transformación genética?

• Una herramienta poderosa para el aprendizaje

• Parte de los estándares nacionales curriculares

• Varias extensiones de practicas de laboratorio

• Conexiones con el mundo real

• Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria

Dogma Central de la Biología Molecular

ADN ARN Proteína Característica

Conexiones con el mundo real

• GFP es un marcador visual

• Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas)

• Localización y regulación de la expresión de un gen

• Movimiento celular

• El destino celular durante el desarrollo

• Formación de los diferentes órganos

• Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad

• Basado en los estándares curriculares

• Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento

• Compatible con un periodo de clase de 50 minutos

• Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo)

• Costo económico

• Resultados exitosos en las manos de los estudiantes

• Seguro para uso en el aula

• ¡Resultados tangibles!

Procedimiento Transformación

Day 1

Day 2

Horario para el Taller de GFP

• Introducción

• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO

• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

¿Que es una transformación?

Absorción deADN exógeno;frecuentemente un plásmido circular

GFP

Lactamasa beta

Resistencia a la

Ampicilina

¿Que es un plásmido? Un pedazo circular deADN que se replica autónomamente

Evolucionado originalmente enbacterias

Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede

ser modificado paraexpresar una proteína de interés

Las diferentes caras de un plásmido

Micrografía de transmisión de electrones

Gel de agarosaRepresentación Grafica

Plásmido pGLO

• Lactamasa Beta -Resistencia a la

ampicilina

• La proteína GFP (Green Fluorescent Protein)– Aequorea victoria gen

de medusa

• araC: Regulador Regula la trascripción de GFP

Transformación con pGLO

Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)

Plásmidos de pGLO

Cromosoma Bacteriano (ADN)

Pared celular

GFP

ADN Bacteriano

Plásmido de ADN

Célula de Bacteria

ADN Geonómico

Regulación de Trascripción

• Operón de lactosa

• Operón de Arabinosa

• Plásmidos de pGLO

Regulación de Trascripción

B A DaraC

B A DaraC

ARN Polimerasa

Efector (Arabinosa)

araC B A D

Operón ara

ARN Polimerasa

Z Y A

Z Y ALacI

Efector (Lactosa)

Z Y ALacI

Operón lac

Regulación de la expresión del gen

ARN Polimerasa

araC

Operón GFP

Gen de GFP

araC Gen de GFP

araC Gen de GFP

Efector (Arabinosa)

B A DaraC

B A DaraC

ARN Polimerasa

Efector (Arabinosa)

araC B A D

Operón ara

Métodos de Transformación

• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que

la célula sea permeable al plásmido ADN

• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente

competentes absorben el ADN después del choque térmico

Proceso de Transformacion

• Suspender las colonias en la Solución de Transformación

• Añadir el plásmido pGLO ADN

• Incubar los tubos en hielo ice

• Choque térmico a 42°C y colocar en hielo

• Incubar con caldo nutriente LB

• Extienda la suspensión por la superficie de las placas

¿Porque es importante cada paso de la transformación?

• La solución de transformación = CaCI2

La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN

Ca++

Ca++

OCH2

O

P O

O

O Base

CH2

O

P

O

O

O

Base

OH

Azúcar

Azúcar

OCa++

¿Porque es importante cada paso de la transformación?2. Incubación en hielo

-disminuye la fluidez de la membrana celular

3. Choque térmico -incrementa la

permeabilidad de la membrana celular

4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta

Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)

Pared Celular

GFP

¿Que es el caldo nutriente de LB?

• Caldo Luria-Bertani (LB)

• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés

– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– Sales– Vitaminas

¿Crecer? ¿Brillar?

Siga el protocolo

¿En que placas crecerán colonias?

¿Que colonias brillarán?

Medida de Volumen