LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR20 de Octubre de 2009

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE E. coli POR INSERCIÓN DEL PLÁSMIDO PGLO E IDENTIFICACIÓN DE LAS NUEVAS CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO

Universidad Francisco de Paula Santander, Ingeniería Biotecnológica, Adriana Bautista.

RESUMEN

En esta práctica se realizó un procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la proteína fluorescente (GFP). Tras el procedimiento de transformación, las bacterias pueden expresar sus genes producir la proteína fluorescente y generar un color verde brillante bajo luz ultravioleta, a la vez generar resistencia al antibiótico ampicilina. El objetivo era mover genes de un organismo a otro con la ayuda de un plásmido permitiendo a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plásmido pGLO y el microorganismo a modificar E. coli se rehidrataron por medio de un choque térmico (caliente – frío) y se utilizaron cuatro cajas de petri que contenían el medio Luria Bertani para crecimiento de microorganismos modificados genéticamente. Dos cajas utilizadas como control sin el plásmido y con el microorganismo y las otras dos cajas, una con ampicilina y otra con ampicilina y arabinosa. Los resultados que se deben obtener para la selección de las células que han sido transformadas con ADN pGLO es generar el crecimiento en las placas de los antibióticos. Las células transformadas aparecen de color blanco (fenotipo de tipo salvaje) en cajas que no contengan arabinosa, y verde fluorescente cuando arabinosa está incluida en el medio de Agar nutriente. Para los medios LB con arabinosa y ampicilina y con ampicilina solamente no se reportó crecimiento debido a posibles fallas en la hidratación del plásmido, para los controles hubo crecimiento del microorganismo solamente en una caja.

INTRODUCCION

Los métodos de transformación para las construcciones genéticas son relativamente más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se extrae el fragmento del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir. La Transformación genética literalmente significa un cambio causado por los genes, e implica la inserción de un gen en un organismo para cambiar un rasgo en

particular, Recordemos que un gen es un fragmento de ADN que proporciona las instrucciones para hacer (códigos) proteínas.

En esta práctica se llevará a cabo un procedimiento de transformación genética. Actualmente la transformación genética se utiliza en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura, los genes que codifican rasgos tales como heladas, plagas, o de descomposición pueden ser transformados y causar resistencia genética en las plantas. En la biorremediación, las bacterias pueden ser transformadas genéticamente con genes que les permiten digerir los derrames de petróleo. En medicina, las enfermedades causadas por genes defectuosos están empezando a ser tratados con terapia génica, es decir, por la transformación genética de las células de una persona enferma con copias sanas del gen defectuoso que causa la enfermedad.

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MARCO TEÓRICO

pGLO es un plásmido usado en biotecnología como vector. Se utiliza como marcador de seres modificados genéticamente. Como todo plasmido, pGLO tiene una estructura circular en la que se expresan diversos genes. Entre ellos encontramos la β-Lactamasa, que proporciona resistencia al antibiotico Ampicilina. También aparece el gen de la Arabinosa. Sin embargo, el gen más importante, y por el cual pGLO se usa como marcador, es el gen de GFP: Green Fluorescence Protein. GFP proporciona al ser transgénico fluorescencia al exponerlo a luz Ultravioleta. La proteína verde Fluorescente fue aislada de la medusa Aequorea victoria. Para que se produzca fluorescencia es necesario que el medio de cultivo contenga Arabinosa.

Los plasmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gene de resistencia al

antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.

Luego de realizar la transformación

se crecen las células en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de células transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

METODOLOGÍA

1. Preparación de los medios

Adicionar 500 mL de agua destilada en un erlenmeyer de 1L. adicionar todo el contenido del paquete de agar nutritivo LB. Agitar el erlenmeyer para ayudar a disolver y

calentar en la plancha hasta que el agar se disuelva. Dejar enfriar un poco el medio. Mientras tanto, etiquetar las cajas de petri y preparar la ampicilina y la arabinosa.

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2. Preparar la arabinosa y la ampicilina

La arabinosa se encuentra en un pequeño vial. Con una pipeta estéril, adicionar 3 mL de solución transformadora directamente al vial para rehidratar el azúcar. Mezclar el vial con un vórtex. La ampicilina se rehidrata también añadiendo 3 mL de solución transformadora.

El calor debe estar entre 5º y 27 °C, de otra forma el agar se solidifica.

3. MARCADO DE LAS CAJAS

Las cajas se marcan de la siguiente manera: 1 caja LB LB/AMP LB/ARA/AMP

4 SERVIR LOS MEDIOS:

Primero, se sirve el medio LB preparado en algunas cajas de petri. Luego de esto se adiciona ampicilina al medio restante y se sirve el medio LB+AMP en cajas. Finalmente se adiciona arabinosa al medio y se sirven las restantes cajas de petri. Se dejan durante dos días a temperatura ambiente y envueltas en envoplast. Luego de esto los medios se refrigeran hasta su posterior uso.

METODOLOGÍA TRANSFORMACIÓN

1. Marcar dos microtubos: uno con pGLO (-) y otro con pGLO (+). Con una pipeta estéril, adicionar a cada tubo 250 microlitros de la solución transformadora (CaCl2). Poner los tubos en hielo

2. Luego de esto, usando un asa estéril se toma una colonia de la caja inicial de E. Coli y se lleva hasta el tubo pGLO (+). Se agita un poco hasta que la colonia quede dispersa en la solución transformadora. Se realiza el mismo procedimiento con otra asa estéril en el tubo pGLO (-).

pGLO (+)

pGLO (-)

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3. Con otra asa estéril, adicionar el plásmido al tubo pGLO (+)

4. Incubar los tubos en hielo durante 10 min asegurando que los tubos estén en contacto con el hielo.

5. Etiquetar las cajas de la siguiente manera:

6. Choque térmico: Transferir los dos tubos a baño maría a 42°C por 50 segundos. Seguidamente llevar al hielo durante dos minutos.

7. Remover los tubos del hielo y con una pipeta estéril adicionar 250 microlitros de

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caldo nutritivo LB a cada uno. Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.

8. Cerrar los tubos y agitar. Luego de esto, con una pipeta estéril para cada tubo se toman 100 microlitros y se siembran en los respectivos medios.

9. Extender las suspensiones celulares con un asa en cada caja. Cambiar de asa cada vez que se vaya a realizar el extendido en las cajas.

10. Envolver las cajas y marcarlas con los respectivos nombres. Llevar a incubación a 37°C hasta el día siguiente.

RESULTADOS

No se observó crecimiento del microorganismo en ninguna de las cajas pGLO (+), ni en la caja que contenía LB + AMP, ni en la caja que contenía LB + AMP+ARA.

En las placas control los resultados fueron los esperados. Se observó crecimiento abundante en medio LB y no hubo crecimiento en la caja con LB+AMP.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

pGLO (+)

LB+AMP LB+AMP +ARA

LB LB+AMP

pGLO (-)

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Esta práctica tuvo en cuenta el manual de transformación bacteriana pGLO de BIO –RAD. Para la inserción del plásmido se utilizó una colonia de E.coli liofilizada, se rehidrató y se insertó un plásmido que también venía liofilizado; la activación e inserción del plásmido, fue realizado en dos prácticas por 3 grupos de laboratorio, la característica fundamental es que el plásmido confiere brillo a la bacteria en presencia de arabinosa y a la vez genera resistencia a la ampicilina.

El procedimiento se repitió debido a contaminación, se realizó la siembra de la bacteria con el plásmido en dos medios: uno con ampicilina y otro con ampicilina y arabinosa, se sembraron otras dos cajas control con E. coli a las cuales no se adicionó el plásmido, una caja con LB y otra con LB y ampicilina. Al obtener los resultados no se observó crecimiento posiblemente debido a la inactivación del plásmido.

Las posibles causas por las cuales no se activó el plásmido posiblemente se deben a errores en el procedimiento, manipulación en la hidratación del plásmido liofilizado, o en el choque térmico de las partículas, también pudo haber fallas en la manipulación del kit, descartamos que el medio LB pudiera estar contaminado ya que es un medio sólido nutritivo utilizado para crecimiento de microorganismos modificado genéticamente o fallas en el aislamiento de la bacteria, solamente hubo crecimiento de E. coli en una caja control con LB lo que significa que la bacteria no insertó el plásmido.

BIBLIOGRAFÍA

Transformación bacteriana. Disponible en http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFORMACIÓN%20%20%20BACTERIANA.htm

pGLO.2007. Disponible en http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/pGLO

pGLO TRANSFORMATION. Disponible en http://www.ebbep.org/docs/pglo/pglostudent.pdf

Genetic transformation of bacteria with the gene for green fluorescent protein (gfp). Disponible en http://www.westminster.edu/acad/sim/pdf/SpGLOTransformation.pdf

PREGUNTAS

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1. Para transformar genéticamente un organismo completamente, se debe insertar el nuevo gen en cada célula del organismo. Cuál organismo está mejor adaptado para una trasformación genética total: uno compuesto de muchas células o un organismo unicelular?

Rta: El mejor organismo sería el unicelular, ya que sólo se debe insertar el nuevo gen en una célula, facilitando el trabajo del investigador.

2. los científicos frecuentemente desean conocer si el organismo genéticamente transformado puede pasar sus nuevos rasgos a las futuras generaciones. Para conseguir esta información, quién sería un mejor candidato para la investigación: un organismo en el que cada generación crece y se reproduce rápidamente, o uno que lo hace más lentamente?

Rta: El mejor candidato sería un microorganismo que se reproduzca rápidamente, para así será más fácil y rápido observar si las siguientes generaciones adquirieron la nueva característica.

3. La seguridad es otra consideración importante escoger un organismo para experimentos. Qué características debe tener o no tener un organismo para asegurar que no produce daño a los investigadores o al ambiente?

Rta:El organismo con el que se desee trabajar no debe producir toxinas u otros componentes dañinos al ser humano o a la naturaleza. El organismo debe crecer exponencialmente en condiciones de laboratorio, pero no debe sobrevivir fuera de este. Además no debe ser capaz de infectar plantas o nimales.

4. Basado en pregunta anterior, quién debe ser la mejor elección para una transformación genética: una bacteria, una lombriz de tierra, un pez o un ratón?

Rta: La mejor elección sería la bacteria, debido a que son organismos unicelulares que se reproducen rápidamente.

PREGUNTAS DE CONSIDERACIÓN

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1. El objetivo de la transformación genética es cambiar los rasgos características de un organismo (fenotipo) antes de que cualquier cambio en el fenotipo pueda ser detectado se debe realizar un examen exhaustivo de su usual fenotipo. Observe las colonias de E. coli en el cultivo inicial y describa sus características.

Rta: Crecimiento abundante, colonias de color crema, incontables.

2. Describa cómo podría usar dos cajas de agar nutritivo, E. coli y ampicilina para determinar cómo las células de E. coli son afectadas por la ampicilina.

Rta: Se realiza la siembra de E. coli en los dos platos: uno que sólo contenga agar nutritivo y otro que contenga agar nutritivo mas la ampicilina. Lo que se realizará será la comparación de los crecimientos. Si la ampicilina afecta negativamente a la bacteria, ésta no crecerá –o crecerá muy poco- en el medio con ampicilina. Si la ampicilina no tiene efecto en la bacteria, se observará un buen crecimiento en las dos cajas.

3. ¿Qué resultado esperaría que indicara su experimento sobre el efecto de la ampicilina en células de E. coli?

Rta: Debido a que la ampicilina es un antibiótico, el resultado que se esperaría sería que éste matara a la bacteria. Si hay crecimiento del microorganismo quiere decir que éste es resistente a la ampicilina.

LECCIÓN DOS: PREGUNTAS DE REPASO

1. En qué cajas esperaría encontrar colonias parecidas al crecimiento original (sin transformar) de E. coli? Rta: Esperaría encontrar ese crecimiento en la caja de LB en la que se sembró el microorganismo sin el plásmido pGLO.

2. Si hubieran algunas células transformadas de la bacteria, en qué caja se encontrarían?Rta: Se encontrarían en dos cajas: en la que tiene medio LB con ampicilina, o en la que contiene LB, ampicilina y arabinosa. Esto se debe a que el plásmido se insertó con éxito y le confirió resistencia a la ampicilina a la bacteria.

3. Qué cajas se deberían comparar para determinar si ocurrió la transformación genética?

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Rta: Las cajas que se deben comparar son las de los dos crecimientos (E. coli sin el plásmido y E. coli con el plásmido) en el medio LB con ampicilina. Las células que no fueron trasformadas no deben crecer en medio LB con ampicilina, mientras que las células en las que se insertó el plásmido deberían crecer en el medio con ampicilina ya que éste les confiere resistencia al antibiótico.

4. Qué significa “caja control”? Para qué sirve?

Rta: Una caja control ayuda al momento de interpretar los resultados. Por ejemplo, en este caso, las cajas control serían las sembradas con la bacteria E. coli sin transformar, es decir, pGLO negativas. Éstas nos sirven al momento de leer las cajas sembradas con el microorganismo transformado, así se comparan las cajas positiva y negativa del microorganismo en medio LB con ampicilina. Sin las cajas control no se podría observar la diferencia entre las células que insertaron el plásmido y las células que no.

LECCIÓN TRES: RECOLECCIÓN DE DATOS Y ANÁLISIS

1. Observar y dibujar lo que se ve en cada una de las cuatro cajas.

2. Cuánto crecimiento de la bacteria se observa en cada caja? No se observó ningún crecimiento en las cajas de LB con ampicilina y LB con ampicilina y arabinosa. La única caja en la que creció E. coli fue en la de LB negativo, es decir, en la que no se insertó el plásmido.

3. De qué color es la bacteria?

Rta: En la caja en que creció la bacteria se observaron colonias color crema, lo que se espera normalmente pues es E. coli sin transformar.

NOTA: De aquí en adelante no es posible seguir respondiendo las preguntas debido a que no se pudo observar ningún crecimiento en las cajas que contenían los medios en los que se llevaron a cabo las pruebas de laboratorio.